CN109276575B - miR-9在制备治疗急性冠脉综合症的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及miR‑9在制备治疗急性冠脉综合症的药物中的用途。miR‑9可以作为急性冠脉综合症患者的生物标志物，并在急性冠脉综合症的动脉粥样硬化斑块和血管重塑中起着重要的作用，其中涉及p38MAPK通路的基础机制。miR‑9可以作为急性冠脉综合症的潜在治疗靶点。

Description

miR-9在制备治疗急性冠脉综合症的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及miR-9在制备药物中的用途。

背景技术

急性冠脉综合症(ACS)包括不稳定心绞痛和心肌梗死，是导致过早死亡、发病和住院的关键因素。ACS主要临床表现为胸痛和冠状动脉闭塞，造成心脏血流减少，引起心肌损伤。动脉粥样硬化斑块的破裂或侵袭被认为是ACS的共同病理生理学，ACS患者也具有更活跃的炎症。在靶向治疗之前可基于成像方式(超声心动图、MRI和CT)和生物标志物(高度敏感或超灵敏的心肌肌钙蛋白测定)对ACS进行早期诊断。在治疗、复发和早期预防ACS中积极抗血小板、抗血栓、抗缺血和降脂剂结合生活方式干预，改变风险因素，长期治疗发挥重要作用。

miRNA作为大量非编码小RNA的亚群，在降解或抑制其靶mRNA翻译过程中起着举足轻重的作用，从而调控靶基因表达，并对多种生物过程产生潜在影响。作为主要的内皮清道夫受体，氧化低密度脂蛋白(凝集素样)受体1(OLR1)基因有助于降解参与动脉粥样硬化发病的氧化低密度脂蛋白。p38-丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)系统已被认为是促炎介质产生的主要通路。最近，越来越多的研究人员已经认识到miRNA在心血管疾病中的作用，但是这些miRNA是如何参与到心血管疾病的发病和发展中仍然没有明确的研究结果。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明人经过实验发现，microRNA-9(miR-9)可以作为ACS患者的生物标志物，并发现miR-9在ACS的动脉粥样硬化斑块和血管重塑中起着重要的作用，其中涉及p38MAPK通路的基础机制。

因此，本发明的目的是提供miR-9在制备治疗急性冠脉综合症的药物中的用途。

优选地，miR-9通过OLR1负调节p38MAPK通路抑制脆弱的动脉粥样硬化斑块形成并促进血管重塑。

优选地，miR-9抑制脂质分布、减少炎症反应、促进血管重塑。

优选地，miR-9增强HDL-C水平，抑制TG、TC、LDL-C的血脂水平。

优选地，miR-9抑制血清TNF-α、IL-6、VEGF的表达。

优选地，miR-9降低动脉粥样硬化斑块面积和内膜中层厚度，同时增加小鼠主动脉的胶原面积。

优选地，miR-9抑制OLR1和p38MAPK信号通路相关蛋白的蛋白质水平。

此外，本发明提供miR-9激动剂在制备治疗急性冠脉综合症的药物中的用途。

优选地，所述miR-9激动剂促进和/或上调miR-9表达。

此外，本发明提供治疗急性冠脉综合症的药物组合物，其含有miR-9和/或miR-9激动剂。

所述miR-9激动剂可以是促进和/或上调miR-9表达/过表达的物质(包括具有上述作用的miR-9相似物或miR-9类似物)。

本发明采用基于微阵列的基因表达谱法鉴别ACS患者中差异表达的基因(DEGs)和调节OLR1的miRNA。通过生物信息学预测网站和双荧光素酶报告基因检测验证miR-9是否直接靶向OLR1。然后分别与miR-9的激动剂(比如agomir)或拮抗剂(比如antagomir)或针对OLR1的siRNA一起引入，建立ApoE-/-小鼠作为动脉粥样硬化模型。采用全自动生化分析仪和ELISA法测定血清甘油三酸酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、TNF-、IL-6、VEGF的水平。HE和Masson染色用于观察血管重塑和脆弱的动脉粥样硬化斑块。采用RT-qPCR和western blot分析检测miR-9，OLR1和p38MAPK信号通路相关因子p38MAPK，Bax，Fas和p53的表达。

综合微阵列分析发现：miR-9通过调控p38MAPK信号通路调控OLR1，从而影响ACS。OLR1是miR-9的靶基因。结果显示，TG，TC，LDL-C，TNF-α，IL-6，VEGF，p38MAPK，Bax，Fas和p53的水平显著降低，但HDL-C水平明显升高，对减少脆弱的动脉粥样硬化斑块面积和增强血管重构的动脉粥样硬化的小鼠用miR-9的agomir和OLR1的siRNA处理，表明血清血脂水平和动脉粥样硬化均受到抑制，但是miR-9过度表达或下调OLR1可促进血管重构。

研究结果表明：miR-9可负反馈调节OLR1介导的p38MAPK通路，抑制易损的动脉粥样硬化斑块形成并增强血管重塑。

附图说明

图1A-1D为全面微阵列分析图。结果表明miR-9通过调控p38MAPK信号通路调节OLR1来调节ACS。图1A，与GSE19339芯片数据的ACS有关的DEG的热图；横坐标表示样品编号，纵坐标表示DEGs的名称。右上方的直方图是指颜色渐变。每个区块代表一个样本中基因的表达水平。图1B，DEG与已知与ACS相关基因之间相互作用的网络。三角形是指与ACS相关的已知基因，圆圈是指DEGs。图1C，DEG与ACS之间的关系网络；图1D，在DIANA，RNA22，TargetScan和microRNA中调控OLR1的miRNA的预测结果的比较，并且仅有一个交叉点，mmu-miR-9-5p；ACS，急性冠脉综合症；DEGs，差异表达基因；miRNA，microRNA。

图2A和图2B为通过双荧光素酶报道基因测定确认OLR1是miR-9的靶标图。图2A，使用目标预测程序，miR-9结合ORL1的3'UTR；图2B，通过miR-9模拟物ORL1-3'UTR-wt的组合处理后，荧光素酶活性降低，表明miR-9调节ORL1。在图2B中，数据以平均值±标准差表示。*，与NC组相比p<0.05。miR-9，microRNA-9；OLR1，氧化型低密度脂蛋白受体1；NC，阴性对照。该实验独立重复三次。

图3A-3D为全自动生化分析仪测定结果图。结果显示，过度表达的miR-9抑制TG，TC，LDL-C的血清水平，同时增加HDL-C水平的图。图3A，各组小鼠血清TG含量；图3B，各组小鼠血清TC含量；图3C，各组小鼠血清中HDL-C的含量；图3D，各组小鼠血清中LDL-C的含量；*，与对照组相比，p<0.05，#相对于动脉粥样硬化组，p<0.05。miR-9，microRNA-9；OLR1，氧化型低密度脂蛋白受体1；NC，阴性对照；TG，甘油三酯；TC，总胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇。数据表示为平均值±标准偏差，通过单向ANOVA分析。n＝10。实验独立重复三次。

图4A-4C为ELISA测定图。结果显示，上调的miR-9抑制TNF-α，IL-6，VEGF的血清水平。图4A，各组小鼠血清中TNF-α的含量；图4B，各组小鼠血清中IL-6含量；图4C，各组小鼠血清中VEGF的含量；*，与对照组相比，p<0.05，#相对于动脉粥样硬化组，p<0.05。miR-9，microRNA-9；OLR1，氧化型低密度脂蛋白受体1；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；IL-6，白细胞介素-6；VEGF，血管内皮生长因子；NC，阴性对照；数据表示为平均值±标准偏差，通过单向ANOVA分析。n＝10。实验独立重复三次。

图5A-5E为HE和Masson染色图。结果显示，上调的miR-9降低动脉粥样硬化斑块面积和内膜中层厚度，同时增加小鼠主动脉的胶原面积。图5A，实验组小鼠的内膜-中膜厚度；图5B，实验组小鼠斑块面积与管腔面积的比值；图5C，实验组中小鼠的胶原面积与血管面积的比率；图5D，HE染色；图5E，Masson染色。*，与对照组相比，p<0.05，#相对于动脉粥样硬化组，p<0.05。miR-9，microRNA-9；OLR1，氧化型低密度脂蛋白受体1；NC，阴性对照；HE，苏木精-伊红。数据表示为平均值±标准偏差，通过单向ANOVA分析。计数数据以百分比或比率表示。n＝10。实验独立重复三次。

图6为RT-qPCR结果图。结果显示，上调的miR-9抑制OLR1和p38MAPK信号传导通路。包括：各组小鼠主动脉血管组织中miR-9，OLR1和p38MAPK的mRNA水平；各组小鼠主动脉血管组织中Bax，Fas和p53的mRNA水平。*，与对照组相比，p<0.05，#相对于动脉粥样硬化组，p<0.05。miR-9，microRNA-9；OLR1，氧化型低密度脂蛋白受体1；NC，阴性对照。数据以平均值±标准差表示。

图7A和7B为western印迹图。试验结果显示，上调的miR-9抑制OLR1和p38MAPK信号传导通路。图7A，各组小鼠主动脉血管组织中OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p35蛋白水平的电泳条带；图7B，各组小鼠主动脉血管组织中OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53的蛋白水平；与对照组相比。*，与对照组相比，p<0.05，#相对于动脉粥样硬化组，p<0.05。miR-9，microRNA-9；OLR1，氧化型低密度脂蛋白受体1；NC，阴性对照。数据表示为平均值±标准偏差，通过单向ANOVA分析。n＝10。实验独立重复三次。

具体实施方式

基于以上发明内容的描述，本领域技术人员能够全面地应用本发明，所有相同原理或类似的改动均应视为包括在本发明的范围之内。

微阵列分析：ACS GSE19339的芯片数据是从基因表达综合(GEO，国家生物技术信息中心(NCBI)的子数据库)下载的。基于强大的多阵列平均(RMA)算法，下载的Affy软件包用于芯片数据预处理的背景校正和标准化。使用R语言的limma包来识别ACS的差异表达基因(DEGs)。计算基因的log2折叠变化(log2FC)。修正后，p值表示为adj.P.Val。|log2FC|>2.0且adj.P.Val<0.01被认为是明显的差异表达，在DisGeNET数据库中检索与ACS有关的基因。有关基因相互作用的信息由String(https://string-db.org/)数据库提供，以构建DEG与ACS相关基因之间相互作用的网络，并利用细胞图3.6.0软件来可视化网络。Chilibot用于提取各种生物学概念，基因，蛋白质或药物之间的信息，并构建内容丰富的关系网络。此外，进行Chilibotwebsite以进一步利用DEG与ACS之间的相关性。另外，miRNA-mRNA关系的四种预测工具，包括DIANA、RNA22、TargetScan和microRNA用于预测DEGs的目标源miRNA。绘制了jvenn来比较和分析来自四种预测工具和维恩图的miRNA预测结果。

双荧光素酶报道基因测定：利用生物预测网站(http://www.microRNA.org)分析miR-9的靶基因，然后应用荧光素酶报告方法验证OLR1是否为miR-9的直接靶基因。转化后，通过siXhoI和BamH的限制性内切酶位点将合成的OLR1 3'UTR基因片段导入pcDNA3.1-Luc(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的载体pcDNA3.1-Luc中。在OLR1野生型上设计种子序列的互补序列突变位点。然后使用T4DNA连接酶进行酶切将目标片段插入pcDNA3.1-Luc报告质粒中将测序的萤光素酶报告质粒WT，MUT和miR-9模拟物共转染到HEK-293T(BeinuoBiotechnology Co.，Ltd.，Shanghai，China)中。收集细胞并在转染48小时后裂解，并通过荧光素测试试剂盒(K801-200，Biovision，Mountain View，CA，USA)检测荧光素酶活性。每组重复三次实验。

动物模型建立和药物传递：本发明以南京大学动物研究中心提供的年龄为6周龄，重18～20g的ApoE-/-小鼠(雄性和雌性，平均年龄分别为70)和无特定病原体(SPF)(南京，中国)为研究对象。另外10c57bl/6J正常小鼠(雌雄相同)具有相同的遗传背景，具有SPF级的对照组，年龄6周，体重18～20g，购自上海斯莱克实验动物公司有限公司(上海，中国)。所有小鼠在SPF动物房内饲养，温度为19-22℃，湿度为50-70％，照度适中，通风良好。给小鼠喂普通饲料1周，并自由饮水。老鼠的环境适应后保持体重稳定，分为8组(n＝10)，其中正常组(C57BL/6J小鼠注射生理盐水并喂食正常饮食)，模型组(ApoE-/-注射生理盐水的小鼠)，miR-9agomir阴性对照(NC)组(注射miR-9类似物作为阴性对照的ApoE-/-小鼠)，miR-9agomir组(注射ApoE-/-miR-9类似物)，miR-9 antagomir NC组(注射miR-9拮抗剂作为阴性对照的ApoE-/-小鼠)，miR-9 antagomir组(注射miR-9拮抗剂的ApoE-/-小鼠)，si-OLR1组(注射si-OLR1的ApoE-/-小鼠)和miR-9 antagomir+si-OLR1组(用miR-9拮抗剂和si-OLR1注射的ApoE-/-小鼠)。给所有的ApoE-/-小鼠提供含21％脂肪和0.15％胆固醇的高脂饮食，腹膜内注射10μ/d si-OLR1；将miR-9激动剂、拮抗剂和阴性对照物质以80mg/kg/d的剂量溶解于0.2mL生理盐水中，连续10天通过尾静脉一次注射到小鼠体内。

动物组织提取：小鼠禁食一晚，采集的血液样本用于检测血脂和炎症因子水平。之后，通过颈椎脱臼处死小鼠。然后迅速打开小鼠的胸腔和腹腔，沿着主动脉分离主动脉瓣。采用小鼠主动脉根部进行组织学分析，取髂总动脉裆部进行mRNA和蛋白质的分析，并应用小鼠右心室静脉血检测树突状细胞表型。

小鼠血清脂质水平的检测：采集的血液样本在室温下保存1小时。在4℃以3000r/min离心10分钟后，收集上层血清(约0.4mL)。(TG)(南京建成生物工程研究所A110-1)，总胆固醇(TC)(A111-1，南京建成生物工程研究所，南京)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(南京建成生物工程研究所A112-1)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(A113-1，南京建成生物工程研究所，南京)，采用全自动生化分析仪(CX7，日立制作所，日本东京)。

酶联免疫吸附测定(ELISA)测定：严格按照肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(ab100747，Abcam，Cambridge，MA，USA)，白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒(ab100712，Abcam，Cambridge，MA，USA)和血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒(ab10075，Abcam，Cambridge，MA，USA)。使用BioTek Synergy 2多功能酶标记仪器在3分钟内测量每个孔(450nm)的吸光度(A)值。以标准浓度为横坐标，A值为纵坐标建立标准曲线的回归方程。将样品的A值代入方程中，并计算样品的目标蛋白质浓度。

苏木精-伊红(HE)染色：将小鼠的主动脉根部浸入生理盐水中，取出心外膜结缔组织，用10％甲醛溶液固定，并包埋在石蜡中。将各组的连续5μm主动脉根切成片。常规HE染色如下：石蜡切片在二甲苯I(CAS号14936-97-1，上海电子研究生物技术有限公司，中国上海)，二甲苯II(CAS号523-67-1，上海育多生物技术有限公司，中国上海)，每次5分钟，分别在100％，95％，80％，75％乙醇中进一步脱蜡1分钟。之后，石蜡切片再用蒸馏水洗涤2分钟，用苏木精(CAS No.474-07-7，青岛吉斯康生物技术有限公司，青岛，中国)染色5分钟，用自来水漂洗，用1％盐酸乙醇分化30s(插入数量分化)并在流动水中浸泡15分钟或温水浸泡5分钟(约50℃)。接下来，使用伊红溶液(RY0648，青岛吉斯康生物技术有限公司，中国青岛)将切片染色2分钟，然后通过跑步冲洗并在显微镜下观察。如果染色不好，可以重复上述步骤。之后，将切片分别用95％、100％、100％甲醇1分钟脱水，用二甲苯碳酸(3:1)、二甲苯I、二甲苯II(各1分钟)清除，并用中性树脂干燥。最后，使用Image-Pro Plus 6软件在显微镜下观察切片，测量内膜中层厚度和动脉粥样硬化斑块面积与内腔面积之比。细胞核染成深蓝色，细胞质和纤维组织在不同深度呈红色。

Masson染色：将石蜡包埋的切片分别在二甲苯I和二甲苯II中脱蜡5分钟，然后在100％、95％、80％、75％乙醇中脱蜡1分钟，用蒸馏水冲洗2分钟。接下来，将100μL Masson染料化合物溶液(试剂A)施用于染色5分钟，并用蒸馏水充分冲洗切片。之后，切片用100μL磷钼酸(试剂C)染色5分钟并干燥。切片用苯胺蓝(试剂D)染色5分钟，然后用蒸馏水稍微洗涤；加入100μL分化液(试剂B)分化30～60s，操作两次。然后将切片分别在95％、100％和100％酒精中脱水30秒，并在二甲苯I和二甲苯II中分别清洗1分钟。之后，将切片干燥并用中性树胶密封。在显微镜下观察这些切片：Masson染色后胶原纤维染成蓝色，细胞核染成蓝紫色，肌肉和纤维素染成红色。胶原面积与血管壁面积之比表示胶原含量，其通过图像分析软件Image plus 6.0测量。

RNA分离和定量：使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)从每组中提取主动脉血管组织样品的总RNA。将RNA溶于由焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的超纯水中。通过ND-1000紫外/可见分光光度计(NanoDropTechnologies Inc.，Wilmington，USA)测量260nm和280nm下的RNA的A值以鉴定和确定总RNA的质量和浓度。用逆转录酶试剂盒合成cDNA。通过在80℃加热cDNA样品5分钟使逆转录酶失活，然后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增cDNA。PCR的反应体系为25μL，U6作为miR-9的内参照，β-actin作为其他mRNA的内参照。miR-9的PCR条件如下：95℃预变性30s，然后进行40个循环的95℃变性5s，60℃变性30s。OLR1PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃变性30s，72℃变性30s，70℃延伸70min 72℃。p38MAPK的PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性5s，60℃30s，延伸1s，每1℃65～90℃。Bax PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，58.5℃变性30s，72℃延伸7min，45个循环。Fas的PCR条件为94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃变性30s，72℃变性60s，72℃延伸变性32个循环持续7分钟。PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，63℃变性30s，72℃变性45s，72℃延伸变性35个循环持续7分钟。每个样品的测量重复3次，取平均值。用相对定量法计算PCR结果，用相对定量法计算CT值(扩增功率曲线的拐点)：△Ct＝CT(靶基因)-CT(内参)，△△Ct＝△Ct(实验组)-△Ct(对照组)，其中2-ΔΔCt表示每个靶基因的相对表达。

Western印迹分析：立即将小鼠的主动脉组织样品置于预冷的裂解缓冲液中并在4℃下超声粉碎。在8000rmp离心15分钟后，收集上清液并使用BCA试剂盒(20201ES76，YeasenBiotechnology Co.，Ltd.，Shanghai，China)测定以确定每个样品中的蛋白质浓度。接下来，使用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，并且在凝胶电泳之后将蛋白质电转移至硝酸纤维素膜(ZY-160FP，Zeye Biotechnology Co.，Ltd.，Shanghai，China)。之后，在室温下用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭膜1小时，用Tris-缓冲盐水(TBS)洗涤3次，每次10分钟。然后将膜在4℃过夜温育包括LOX-1(ab60178，Abcam，Cambridge，UK)，抗-p38(磷酸化T180)的一级抗体，兔抗小鼠多克隆抗体(1:500稀释)(ab26，Abcam，Cambridge，UK)，Bax(ab32503，Abcam，Cambridge，UK)，Fas(ab15285，Abcam，Cambridge，UK)，p53(ab26，Abcam，Cambridge，UK)，GAPDH(ab181602，Abcam，Cambridge，UK)。用TBS在37℃洗涤膜3次，每次10分钟。在37℃振荡下加入二抗HRP标记的IgG山羊抗兔多克隆抗体(1:500稀释)(ab20272，Abcam，Cambridge，UK)，TBS洗膜3次，10分钟每。然后使膜与电化学发光(ECL)(ECL808-25，Biomiga，San Diego，CA，USA)在室温下反应1分钟。之后，除去反应液，在X射线机(36209ES01，上海Qcbio科学技术有限公司，中国上海)下观察覆盖有保鲜膜的膜。以GAPDH作为内参，以目标条带灰度值与参考条带的比值作为蛋白质的相对表达量。实验在每组中重复3次。

统计分析：使用SPSS 21.0(IBM CorpArmonk，NY，USA)进行统计分析。测量数据用平均值±标准差表示。使用单因素方差分析(ANOVA)和方差齐性检验比较多组间的数据。Q检验比较两组间的差异。当没有均匀方差时，将使用非参数秩检验。α水平设定为0.05，并且p<0.05的水平被认为具有显著统计学差异计数数据以百分比或比率表示，并使用x²检验。

结果：

MiR-9通过调节p38MAPK信号通路调节OLR1来调节ACS

根据ACS芯片数据GSE19339，用|log2FC|筛选出20个具有明显差异的基因>2.0和adj.P.Val<0.01作为阈值并绘制DEGs热图(图1A)。在DisGeNET数据库中检索到与ACS有关的基因，前10个基因(IL6，ITGB3，CRP，MMP9，TNF，TLR4，PAPPA，PON1，TNNI3和TUBB1)是已知的与ACS有关的基因。与ACS有关的DEGs和已知基因被包括在String数据库中。分析基因之间的相互作用并绘制基因相互作用网络(图1B)。在该网络中，8个DEG，OLR1，CCL20，CCL2，CXCL3，CXCL2，FN1，PPARG和ACKR3与其他基因(度>5)更密切相关，表明它们可能与ACS相关。随后，在Chilibot中进一步开发了8个DEG与ACS之间的关系网络(图1C)。本发明人发现除了ACKR3和OLR1外，其他DEG与ACS有直接或间接关联，本发明人非常重视OLR1对ACS的影响。已知OLR1在ACS中异常激活，先前的研究表明OLR1与ACS相关，而更深层次的分子机制仍然知之甚少。DIANA、RNA22、TargetScan和microRNA被用来预测可调节OLR1的miRNA。从TargetScan获得的84个miRNA以上下文++评分<-0.3为阈值，并且来自DIANA的92个miRNA以miTG评分>0.7作为阈值。此外，有725种miRNA可以调控从RNA22获得的OLR1，以及12种来自microRNA.org的miRNA，其mirSVR得分<-0.7作为阈值。通过分析miRNA的四个预测结果绘制Venn图(图1D)，本发明人发现仅有一个交叉点，mmu-miR-9-5p，表明mmu-miR-9-5p更可能调控OLR1。这些发现揭示了miR-9可以调节ACS中的OLR1和p38MAPK信号通路。

miR-9直接靶向OLR1：最初，使用生物预测网站(http://www.microrna.org)分析miR-9的靶基因，并使用双荧光素酶报告基因测定来验证miR-9和OLR1之间的靶向关系(图2A)。结果显示转染miR-9模拟物可以显著降低萤光素酶报道基因的活性(p<0.05)(图2B)。因此，ORL1是miR-9的直接靶基因。

增加HDL-C水平的同时上调的miR-9抑制TG，TC，LDL-C的血脂水平：接下来，使用全自动生化分析仪测定TG，TC，HDL-C和LDL-C的血脂水平。结果如下(图3A-3D)：与对照组相比，实验组血清TG，TC和LDL-C水平显著升高(均P<0.05)，但HDL-C水平显著降低(p<0.05)。TG，TC，HDL-C，LDL-C水平在动脉粥样硬化组，miR-9 agomir NC组，miR-9 antagomir NC组和miR-9 antagomir+si-OLR1组间差异无统计学意义(均p>0.05)。与动脉粥样硬化组相比，miR-9 agomir组和si-OLR1组TG，TC和LDL-C水平显著降低(均P<0.05)，但HDL-C水平明显升高(p<0.05))。相反，miR-9 antagomir组TG，TC和LDL-C水平显著升高(均P<0.05)，而HDL-C水平显著下降(p<0.05)。miR-9 agomir组和si-OLR1组TG，TC，HDL-C和LDL-C水平无显著差异(均p>0.05)。这些结果表明，过表达的miR-9可以抑制TG，TC，LDL-C的血脂水平，同时增加HDL-C水平。

另外，用ELISA法测定各组小鼠血清中TNF-α，IL-6和VEGF的含量，结果如下(图4A-4C)：与对照组相比，TNF-α，在动脉粥样硬化，miR-9agomirNC，miR-9 antagomir NC和miR-9antagomir+si-OLR1组中，IL-6和VEGF显著增加(均p<0.05)(所有p>0.05)。与动脉粥样硬化组比较，miR-9 agomir组和si-OLR1组TNF-α，IL-6和VEGF含量明显降低(均P<0.05)，而TNF-α，IL-6和VEGF明显高于miR-9 antagomir组(均p<0.05)。miR-9 agomir组和si-OLR1组TNF-α，IL-6和VEGF含量无明显差异(均p>0.05)。结果表明，miR-9表达上调可以抑制血清TNF-α，IL-6，VEGF的表达。

增加小鼠主动脉中胶原面积的同时上调miR-9减少动脉粥样硬化斑块面积和内膜中层厚度。此外，HE和Masson染色法检测动脉粥样硬化斑块面积与管腔面积及胶原面积与血管壁面积的比值，发现动脉粥样硬化斑块纤维帽中的胶原含量在斑块稳定性中起着重要作用，因为不稳定斑块纤维帽中的胶原含量变少，斑块不稳定性的可能性会增加，从而使斑块破坏更容易。同时用血管重构方法测量了内膜-介质厚度。结果如图5A-5E所示：与动脉粥样硬化组相比，miR-9agomir组和si-OLR1组的斑块面积与管腔面积比和内膜中层厚度明显减少(均p<0.05)，胶原面积与血管面积的比值显著增加(p<0.05)。相反，miR-9 antagomir组斑块面积与管腔面积比值和内膜中层厚度显著增加(均p<0.05)，胶原面积与血管面积比值明显下降(p<0.05))。miR-9 agomir组与si-OLR1组之间斑块面积与管腔面积比率，内膜中层厚度以及胶原面积与血管面积之比没有显著差异(所有p>0.05)。动脉粥样硬化组，miR-9 agomir NC组和miR-9 antagomir NC组的斑块面积与管腔面积比率，内膜中层厚度和胶原面积/血管面积比值均无统计学差异(均p>0.05)。因此，上调的miR-9降低了动脉粥样硬化斑块面积和内膜中层厚度，同时增加了小鼠主动脉的胶原面积。

上调的miR-9抑制OLR1和p38MAPK信号通路相关基因的mRNA表达：RT-qPCR检测各实验组主动脉血管组织中miR-9，OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53的表达。结果如下(图6)：与对照组相比，实验组中发现miR-9，OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53的mRNA表达较高(均为p<0.05)。动脉粥样硬化组，miR-9agomir NC组和miR-9antagomir NC组的miR-9，OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p35mRNA表达均无显著性差异(均p>0.05)。与动脉粥样硬化组比较，miR-9agomir组miR-9表达水平升高(p<0.05)，OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53mRNA表达水平明显下降(均P<0.05)。miR-9 antagomir组miR-9表达降低(p<0.05)，OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53 mRNA表达明显增强(p<0.05)。在si-OLR1组中发现miR-9，OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53的低表达(均为p<0.05)。在miR-9 antagomir+si-OLR1组中发现miR-9的表达较低(p<0.05)，而OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53的mRNA表达无显著性差异(均p>0.05)。结果表明，上调的miR-9可以抑制OLR1和p38MAPK信号通路。

上调的miR-9抑制OLR1和p38MAPK信号通路相关蛋白的蛋白质水平：最后，进行蛋白质印迹分析以测量OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53的蛋白质水平，并且通过OLR1与GAPDH，p-p38MAPK与p38MAPK，Bax与GAPDH，Fas与GAPDH和p53的比率来表示蛋白质水平到GAPDH。结果如图7A和7B所示：与对照组相比，实验组中OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p53的蛋白质水平显著增加(所有p<0.05)。在动脉粥样硬化，miR-9 agomir NC，miR-9 antagomir NC和miR-9antagomir+si-OLR1组中，OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p35的蛋白水平没有显著差异(所有p>0.05)；与动脉粥样硬化组相比，miR-9 agomir和si-OLR1组OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p35的蛋白水平明显下降(均p<0.05)。相反，在miR-9 antagomir组中发现更高的OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p35蛋白质水平(所有p<0.05)。miR-9 agomir组和si-OLR1组之间OLR1，p38MAPK，Bax，Fas和p35蛋白水平无显著差异(均p>0.05)。上述结果表明，上调的miR-9抑制OLR1和p38MAPK信号通路。

目前，诱导ACS的精确分子和细胞触发因素仍然模糊不清，尽管已经发现了几种ACS突然发生和发展的机制，其中最常见的是脆弱的斑块破裂，其特征是大的纤维帽覆盖的坏死核心。在这项研究中，本发明人的目标是探讨miR-9是否可以作为ACS患者治疗和诊断的生物标志物，以及其对OLR1基因和p38MAPK通路的影响。因此，本研究通过激活OLR1介导的p38MAPK通路，通过上调ACS中的miR-9来证实受抑制的易损斑块和增强的血管重构。

在目前研究中，在miR-9 agomir和si-OLR1中发现显著较低的血清TG，TC，LDL-C，TNF-α，IL-6，VEGF和HDL-C水平显著升高，表明在动脉粥样硬化小鼠模型中，miR-9可以通过降低血清脂质谱，抑制炎症反应和促进血管重塑来改善心血管疾病。

此外，本发明人发现p38MAPK，Bax，Fas，p53水平在暴露于激动剂和si-RNA之后降低，表明上调的miR-9抑制OLR1和p38MAPK通路。在本发明人的研究中，在动脉粥样硬化小鼠模型中过表达miR-9后，本发明人通过实验证实通过miR-9直接抑制OLR1翻译。

总体而言，本发明人的数据提供了证据表明miR-9的过表达可以通过在动脉粥样硬化小鼠模型中通过激活OLR1依赖性p38MAPK通路来抑制脂质分布，减少炎症反应和促进血管重塑而显著改善心血管疾病。显示miR-9可以作为ACS的潜在治疗靶点。

Claims (7)

1.miR-9在制备治疗急性冠脉综合症的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-9通过OLR1负调节p38MAPK通路抑制脆弱的动脉粥样硬化斑块形成并促进血管重塑。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-9抑制脂质分布、减少炎症反应、促进血管重塑。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-9增强HDL-C水平，抑制TG、TC、LDL-C的血脂水平。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-9抑制血清TNF-α、IL-6、VEGF的表达。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-9降低动脉粥样硬化斑块面积和内膜中层厚度，同时增加小鼠主动脉的胶原面积。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-9抑制OLR1和p38MAPK信号通路相关蛋白的蛋白质水平。

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