CN108685098B - 复合食用菌多糖 - Google Patents
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Abstract
复合食用菌多糖，涉及一种保健食品。本发明复合食用菌多糖由香菇多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖、姬松茸多糖和蛹虫草多糖组成。本发明的目的是提供一种复合食用菌多糖，通过科学配伍克服单一多糖功效的局限性，使其对机体的抗氧化、抗肿瘤和提高免疫功能的协同增效作用达到最佳。
Description
技术领域
本发明涉及一种保健食品。
背景技术
多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。多糖无甜味，在水中不能形成真溶液，只能形成胶体，无还原性，无变旋性，但有旋光性。多糖具有免疫调节、抗病毒及抗癌、降血糖、治疗、美容、乳化等作用。
食用菌多糖为活性多糖，大多数可以刺激免疫活性，能增强网状内皮系统吞噬肿瘤细胞的作用，促进淋巴细胞转化，激活T细胞和B细胞，并促进抗体的形成。从而在一定程度上具有抗肿瘤的活性。但对于肿瘤细胞并无直接的杀伤作用。活性多糖能降低甲基胆蒽诱发肿瘤的发生率，对一些易发生广泛转移，不宜采取手术治疗和放射疗法的白血病，淋巴瘤等特别有价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合食用菌多糖，通过科学配伍克服单一多糖功效的局限性，使其对机体的抗氧化、抗肿瘤和提高免疫功能的协同增效作用达到最佳。
本发明复合食用菌多糖由香菇多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖、姬松茸多糖和蛹虫草多糖组成。
进一步，香菇多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖、姬松茸多糖和蛹虫草多糖按20:20:10:10:20的质量比组成。
进一步，所用姬松茸多糖的纯度为8.95％；灰树花多糖的纯度为22.6％、香菇多糖的纯度为39.8％、蛹虫草多糖的纯度为8.30％、黑木耳多糖的纯度为55.3％。
进一步，复合食用菌多糖中姬松茸多糖的含量为10g/L。
通过动物体内发现本发明复合食用菌多糖对小白鼠非特异性及特异性免疫功能的提高均比单一食用菌多糖显著。
本发明复合食用菌多糖与五种单一食用菌多糖中的任一种相比，其对体外超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率至少提高10％。
本发明复合食用菌多糖与五种单一食用菌多糖中的任一种相比，对体外培养癌细胞的生长抑制作用均有显著性差异。
食用菌多糖经复合后其作用并非是单味多糖成分的简单相加，各成分间往往存在着相互协同作用而促使疗效提高。复合食用菌多糖比单一类型的真菌多糖更能全面激活人体免疫系统的原因是：不同的真菌多糖分子因其化学组成与结构不同，其激活免疫系统的途径也有所不同，单一种类的真菌多糖的免疫作用不可避免地存在自身局限性；而复合食用菌多糖所含的不同种类的多糖分子群可以通过不同的作用机理，激活不同层面的免疫系统，产生更强的免疫作用。
本发明采用的香菇、黑木耳、灰树花、姬松茸和蛹虫草等是被大众熟知和认可的绿色安全、保健作用较强的食用真菌，从中提取的多糖，其主要功效也各有千秋。其中，香菇多糖的功效主要体现在抗病毒、抗肿瘤和提高人体免疫力方面；黑木耳多糖的功效主要体现在提高机体免疫力、调节血糖和抗氧化作用上；灰树花多糖则具有较强的抗肿瘤效果；姬松茸多糖具有明显增强人体精力和抑制肿瘤功效；蛹虫草多糖的功效主要体现在其抑菌和抗氧化作用。本发明将以上主要功效略有不同的5种食用菌多糖通过正交试验选择最佳的配伍比例，并采用葡聚糖凝胶方法纯化每种多糖，选择生物活性较高的多糖组分进行配伍，可以克服单一多糖功效的局限性，不仅能使几种单一多糖的共有功效通过协同作用得以强化，而且还能发挥出每种单一多糖各自比较薄弱的功效。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式复合食用菌多糖由香菇多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖、姬松茸多糖和蛹虫草多糖组成。
香菇、黑木耳、灰树花、姬松茸和蛹虫草分别提取粗多糖，经Sevage法脱蛋白，采用双氧水氧化法进行脱色，得到纯化的食用菌多糖。
实施例1
复合食用菌多糖由香菇多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖、姬松茸多糖和蛹虫草多糖组成；其中，香菇多糖的含量为20g/L、黑木耳多糖的含量为20g/L、灰树花多糖的含量为10g/L、姬松茸多糖的含量为10g/L、蛹虫草多糖的含量为20g/L；所用姬松茸多糖的纯度为8.95％；灰树花多糖的纯度为22.6％、香菇多糖的纯度为39.8％、蛹虫草多糖的纯度为8.30％、黑木耳多糖的纯度为55.3％。
对照单一食用菌多糖分别是含量为20g/L、纯度为39.8％的香菇多糖；含量为20g/L、纯度为55.3％的黑木耳多糖；含量为10g/L、纯度为22.6％的灰树花多糖；含量为10g/L、纯度为8.95％的姬松茸多糖；含量为20g/L、纯度为8.30％的蛹虫草多糖。
其中，复合食用菌多糖的制备方法如下：
采用胰蛋白酶法提取香菇多糖，提取条件为料水比1:35，胰蛋白酶用量2.5％，pH7.0，提取温度55℃，提取时间2h。
采用分别酶法提取黑木耳多糖，提取条件为料水比1:60，纤维素酶用量3.75％，pH5.0，提取温度43℃，提取时间1.5h；pH调至7.5，加入6.5％中性蛋白酶，提取温度43℃，提取时间1.5h。
采用微波-热水浸提法提取灰树花多糖，提取条件为料水比1:20，pH 7.5，用高功率微波，微波时间4min，100℃浸提2h。
采用微波-热水浸提法提取姬松茸多糖，提取条件为料水比1:40，用高功率微波处理10min，提取温度100℃，提取时间5h，提取2次。
采用微波-热水浸提法提取蛹虫草多糖，提取条件为料水比1:40，采用420W微波间隔辐照4次共计4min，提取温度80℃，提取时间1h。醇沉工艺条件为3倍体积95％乙醇沉淀6h。
经提取得到的5种粗多糖经Sevage法脱蛋白，采用双氧水氧化法进行脱色，得到香菇多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖、姬松茸多糖和蛹虫草多糖，纯度分别为39.8％、55.3％、22.6％、8.95％、8.30％。
实验方法：
特异性免疫功能检测采用血清溶血素测定法进行检测；
非特异性免疫功能检测采用鸡血红细胞吞噬试验法进行检测；
用邻苯三酚法测定多糖对超氧阴离子自由基的清除率；
用水杨酸法测定多糖对羟自由基的清除率；
以荷瘤小鼠的瘤重为指标，观察多糖对小白鼠的肉瘤S180抗肿瘤活性。
免疫功能检测：
取240只雄性小白鼠随机分成30组，每组8只，空白对照组每只每天灌胃0.5ml生理盐水，实验对照组每只每天分别灌胃食用菌多糖低剂量(50mg/kg体重)、中剂量(100mg/kg体重)、高剂量(200mg/kg体重)、更高剂量(400mg/kg体重)0.5ml，连续灌胃10d；实验组每只每天分别灌胃复合食用菌多糖0.5ml，低剂量多糖含量(2.5g/L)、中剂量多糖含量(5.0g/L)、高剂量多糖含量(10.0g/L)、更高剂量多糖含量(20.0g/L)，连续灌胃10d。
实验前将保存的鸡红细胞用生理盐水洗涤数次后，配制成3％的红细胞悬液。给药第一天用鸡红细胞悬液腹腔注射0.2ml进行免疫，末次给药后2h，各组小鼠尾静脉取血1～2ml，置于事先放有抗凝剂的试管中，300rpm，离心10min，取上清液作为待测血清备用。
取2.5ml红细胞悬液，加0.1ml鼠血清，25℃保温1h后1000rpm离心2min，于540nm处测吸光度值。溶血素含量表示为所测OD值×稀释倍数。
多糖对小鼠溶血素产生影响的实验结果，如表1所示。
表1
实验证实复合食用菌多糖对小鼠的特异性免疫功能的提高与五种真菌多糖中任一种相比均有显著性差异，表现出较强的体液免疫增强作用。
鸡血红细胞吞噬试验：
观察多糖对小鼠特异性免疫功能的影响。小鼠灌胃过程如上(免疫功能检测)，末次灌胃多糖30min后，每只小鼠腹腔注射5％(V/V)鸡血红细胞0.5ml，3h后颈椎脱臼处死小鼠，剖开腹腔皮肤，腹腔注射生理盐水2ml,轻柔小鼠腹部后，吸取腹腔冲洗液1ml,分别滴于两张载玻片上，放入垫有湿纱布的瓷盘中，于37℃具饱和湿度的孵箱中温育30min。用37℃生理盐水漂洗以除去未粘壁的细胞，晾干后滴固定液固定5min，以4％Giemsa-wright染色3min，晾干后用油镜观察。
计算公式：
吞噬百分数＝(吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数/200)×100％
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/200/2
所得吞噬指数经方差分析，求出组间差异性(P值)。
表2多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响
实验结果表明，在高、中、低三个剂量组中，复合食用菌多糖和五种单一真菌多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的均有不同程度的显著性提高，统计学分析表明，服用复合食用菌多糖与服用单一真菌多糖相比，各剂量组对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力都有显著性差异，证明复合食用菌多糖对小鼠的非特异性免疫功能的提高与五种真菌多糖中任一种相比均有显著性差异。
邻苯三酚法测定真菌多糖对O2-·的清除率
取pH 8.2的50mmol/L Tris-HCI缓冲液5ml。1ml去离子水，1ml无水乙醇，混匀后在25℃水浴中保温20min。取出后立即加人在25℃预热过的3mmol/L的邻苯三酚0.5ml(以10mmol/L HCl配制，空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液))，迅速摇匀后倒入比色杯，321nm下每隔30s测定吸光度，计算线性范围内吸光度的增加。
测定样品活性时，在加人邻苯三酚前，先加入1ml的样品溶液，1ml去离子水，然后按照前面的方法操作，计算清除率:
清除率(I％)＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]
注:A1:邻苯三酚的自氧化吸光度；
A2:不含样品和邻苯三酚的吸光度；
A3:含有样品和邻苯三酚的吸光度；
A4:含有样品但不含邻苯三酚的吸光度。
表3多糖对超阳离子自由基的清除率
实验结果表明，香菇、黑木耳、灰树花、姬松茸、蛹虫草及复合食用菌多糖在浓度为10g/L时，对超氧阴离子自由基的体外清除率分别达到最高。在由低到高的三个浓度时，复合食用菌多糖对超氧离子自由基的清除率分别比清除率最高的单一多糖高出19.1％、20.3％、16.2％。
水杨酸法测定对·OH的清除率：
用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(6mmol/L H2O2 1ml,2mmol/L Fe2+1ml,6mmol/L 1ml水杨酸-乙醇溶液)中加入一系列1ml不同浓度的多糖。最后加H202启动反应，37℃反应30min，以超纯水为参比，在510nm处测量各浓度下的吸光度。考虑待测溶液本底的吸光值不同，以2mmol/L Fe2+1ml,6mmol/L水杨酸-乙醇溶液1ml，待测溶液1ml和双蒸水1ml作为待测溶液的本底吸收值。其清除率计算公式为:
清除率(I％)＝[A0-(AX-AX0)/A0]×100％
注:A0:空白对照液的吸光度；
Ax:加人待测溶液后的吸光度；
AX0:待测溶液的本底吸收。
表4多糖对羟自由基的清除率
| 组别 | 浓度(mg/ml) | 清除率％ |
| 香菇多糖低 | 2.5 | 15.4±1.0 |
| 黑木耳多糖低 | 2.5 | 21.2±1.2 |
| 灰树花多糖低 | 2.5 | 12.8±0.8 |
| 姬松茸多糖低 | 2.5 | 14.5±1.0 |
| 蛹虫草多糖低 | 2.5 | 20.3±1.2 |
| 复合食用菌多糖低 | 2.5 | 23.9±1.7 |
| 香菇多糖中 | 5.0 | 28.6±1.6 |
| 黑木耳多糖中 | 5.0 | 45.7±2.0 |
| 灰树花多糖中 | 5.0 | 29.9±1.7 |
| 姬松茸多糖中 | 5.0 | 34.3±1.8 |
| 蛹虫草多糖中 | 5.0 | 48.1±2.2 |
| 复合食用菌多糖中 | 5.0 | 55.0±2.5 |
| 香菇多糖高 | 10.0 | 40.2±2.0 |
| 黑木耳多糖高 | 10.0 | 49.8±2.3 |
| 灰树花多糖高 | 10.0 | 40.6±1.8 |
| 姬松茸多糖高 | 10.0 | 37.8±1.8 |
| 蛹虫草多糖高 | 10.0 | 52.2±2.4 |
| 复合食用菌多糖高 | 10.0 | 61.4±2.9 |
实验结果表明，香菇、黑木耳、灰树花、姬松茸、蛹虫草及复合食用菌多糖在浓度为10g/L时，对羟自由基的体外清除率分别达到最高。在由低到高的三个浓度时，复合多糖对羟自由基的清除率分别比清除率最高的单一多糖高出12.7％、14.3％、17.6％。与各种真菌多糖对超阳离子自由基的清除率相比较，各种真菌多糖对羟自由基清除率比较高，说明香菇、黑木耳、灰树花、姬松茸、蛹虫草及复合食用菌多糖具有较强的清除羟自由基活性，是良好的羟自由基清除剂和抗氧化剂。
抗肿瘤功能测定：
采用多糖对小白鼠抑制S180瘤株的抑瘤实验来比较复合食用菌多糖与5种单一多糖的抗肿瘤活性。
选用昆明种雌性小鼠，随机分组，每组8只，分别为空白对照组、阳性对照组(环磷酰胺20mg/kg，接种后开始灌胃给予，连续7d)、各单一真菌多糖及复合食用菌多糖高、中、低剂量组。复合食用菌多糖经口给予，连续30d。第21天时，取接种后8d左右、肿瘤生长旺盛、无溃破且动物健康较好的瘤源动物，颈椎脱臼并固定于蜡板上，用酒精消毒操作部位皮肤。在无菌条件下，切开皮肤，选择生长良好、无坏死或液化的瘤组织，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水稀释成1：3的瘤细胞悬液，容器置于冰块上，用空针抽吸，每次抽吸前将细胞混匀，每个动物接种0.2ml于右前肢腋窝皮下，整个操作在30min内完成。停止给复合食用菌多糖之次日，处死动物，先称体重，后解剖皮下瘤块，称重，计算抑瘤率。重复实验1次。
表5多糖对小鼠S180肉瘤生长的抑制试验结果
实验结果表明，复合食用菌多糖中各剂量组瘤重与空白对照组比较均有显著差异(P＜0.05)，中剂量组与高剂量组无差异(P＞0.05)，高剂量组的最高抑瘤率达到41.86％。复合食用菌多糖中各剂量组瘤重与五种单一真菌多糖的任一种比较均有显著差异(P＜0.05)，证明复合食用菌多糖的抗肿瘤活性得到了明显的协同增效作用，有较好的抗肿瘤效果。
Claims (2)
1.复合食用菌多糖，其特征在于复合食用菌多糖由香菇多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖、姬松茸多糖和蛹虫草多糖按20:20:10:10:20的质量比制成；所用姬松茸多糖的纯度为8.95%；灰树花多糖的纯度为22.6%、香菇多糖的纯度为39.8%、蛹虫草多糖的纯度为8.30%、黑木耳多糖的纯度为55.3%。
2.根据权利要求1所述的复合食用菌多糖，其特征在于复合食用菌多糖中姬松茸多糖的含量为10g/L。
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