CN108676723A - 一株海洋珊瑚来源新属、新种藻及其分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株海洋珊瑚来源新属、新种藻及其分离培养方法；所述珊瑚来源新属、新种藻是保藏编号为CCTCC NO：M2018096的珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae Un01；该微藻为绿藻门，石莼纲一新属、新种，与已公开发表的近缘藻类在来源、形态、进化方面存在较大差异；该藻为研究海洋藻类功能以及该藻与珊瑚可能的共生关系提供了良好的研究材料，在珊瑚人工培育、珊瑚礁重建、新型藻类材料等方面也具有应用潜力。

Description

一株海洋珊瑚来源新属、新种藻及其分离培养方法
技术领域
本发明涉及一株珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae及其分离、培养方法。
背景技术
珊瑚礁是由珊瑚等生物作用产生碳酸钙积累和生物骨壳及其碎屑沉积而成，其中珊瑚以及少数其他腔肠动物、软体动物与某些藻类的共生对珊瑚礁石灰岩基质的形成起重要作用。全球约110个国家拥有珊瑚礁资源，其总面积约占全球海域面积的0.1％-0.5％，但已记录的礁栖生物却占到海洋生物总数的30％。在目前已知的所有海洋生态系统中，珊瑚礁生态系统生物多样性最高，属高生产力生态系统，被誉为“海洋中的热带雨林”。珊瑚礁生态系统不仅为人类的生产和生活提供了各种生物资源，而且具有巨大的生态功能、生态价值、综合开发利用价值，对保障海洋生物多样性、生物生产力和生态平衡具有重要作用。特别是珊瑚礁生物资源已经成为现代海洋药物研发的热点资源。然而，由于遭受人为和自然的双重压力，世界范围内的珊瑚礁正面临严重的退化，中国珊瑚礁资源退化更为严重。
其中珊瑚个体的造礁能力及抵抗环境压力的能力与其共生的藻类密切相关。珊瑚为其共生的藻类提供无机盐及生活场所，而共生的藻类通过光合作用为珊瑚提供营养。与珊瑚共生的藻类包括共生虫黄藻、虫绿藻、虫蓝藻等。这些珊瑚共生藻类在长期的进化过程中，与珊瑚宿主形成了互惠的共生关系，共同影响珊瑚生长、发育、造礁能力。在全球气候变化(特别是全球海水升温酸化)以及人类活动双重压力下，珊瑚共生藻会排出珊瑚体内，导致珊瑚白化，死亡及生态功能的丧失。因此，认识珊瑚与不同藻的共生关系，对珊瑚个体发育与繁殖、健康状况、珊瑚礁人工重建具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一株珊瑚来源新属、新种藻Symbiochloriumhainandiae及其分离培养方法；本发明通过分离培养技术优化，实现了一株珊瑚来源的藻类新属、新种的培养。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一株珊瑚来源藻新属、新种藻；该藻种命名为珊瑚共生藻Symbiochlorium hainandiae Un01，其保藏编号为：CCTCC NO：M2018096。
本发明从取自三亚鹿回头珊瑚礁自然保护区的南海块状珊瑚澄黄滨珊瑚(Porites lutea)组织释放液中分离到一株海洋珊瑚来源微藻新属、新种，命名为珊瑚共生藻Un01，Symbiochlorium hainandiae Un01，已于2018年2月28日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018096。
本发明分离的珊瑚来源藻Symbiochlorium hainandiae在以ASP-8A培养基为基础营养盐培养基培养时，藻细胞呈球状或卵形，直径在5-15μm之间，每个细胞内有多个周生叶绿体，具有1个细胞核，具有1个蛋白核；细胞壁为100nm左右。另外，该微藻可通过静孢子囊繁殖，静孢子囊大小在5-20μm之间，具有较厚的细胞壁，内部包含多个静孢子。
第二方面，本发明涉及一种本发明的珊瑚来源藻新属、新种藻的分离、培养方法，所述方法包括如下步骤：
S1、南海的块状珊瑚澄黄滨珊瑚(Porites lutea)组织置于ASP-8A液体培养基中进行组织培养，培养温度为10℃～45℃，培养时间为2～3天；
S2、观察到该珊瑚破碎组织中的藻释放后，吸取其破碎组织释放的藻液体培养物，涂布于ASP-8A固体培养基于10℃～45℃培养20-60天；
S3、挑取所述固体培养基长出的Symbiochlorium hainandiae藻落到灭菌的ASP-8A培养液中培养至对数生长期，获得微藻种子液；
S4、将经过对数期培养的微藻种子液接种到灭菌的ASP-8A培养液中进行培养，即可。
优选的，步骤S1中，所述南海的块状珊瑚澄黄滨珊瑚为三亚鹿回头珊瑚礁自然保护区的南海块状澄黄滨珊瑚Porites lutea。
优选的，步骤S1中，所述ASP-8A液体培养基中含50μg·ml-1卡那霉素、100μg·ml-1氨苄青霉素和50μg·ml-1链霉素.。
优选的，步骤S1中，培养时培养基pH值为4.0～11.0，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0。
优选的，步骤S2中，所述ASP-8A固体培养基中含50μg·ml-1卡那霉素、100μg·ml-1氨苄青霉素和50μg·ml-1链霉素。
优选的，步骤S2中，培养时培养基pH值4.0～11.0，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0。
优选的，步骤S4中，培养时培养温度10℃～45℃，培养基pH值4.0～11.0，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2～1vvm。
第三方面，本发明还涉及一种本发明的珊瑚来源藻新属、新种藻在珊瑚人工培育或珊瑚礁重建中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供的海洋珊瑚来源的Symbiochlorium hainandiae为一藻类新属新种，通过该发明涉及到的分离培养方法，实现了该微藻在实验室的纯化培养，该藻为研究海洋藻类功能以及该藻与珊瑚可能的共生关系提供了良好的研究材料，该藻也可能在珊瑚人工培育、珊瑚礁重建、新型藻类材料等方面具有应用潜力。
2、本发明的海洋珊瑚来源藻-Symbiochlorium hainandiae为一藻类新属新种，与已报道的珊瑚共生藻及已发表的其它微藻藻种相比在新态特征及进化方面具有显著差异，为一藻类新属、新种。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae光学显微镜照片；
图2为珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae扫描电镜图片；
图3为珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae孢子囊扫描电镜图片；
图4为珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae投射电镜图片；
图5为珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae进化树(18S rRNA基因)；
图6为珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae进化树(ITS2)；
图7为珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae(rbcL)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
南海的块状珊瑚澄黄滨珊瑚(Porites lutea)样本用无菌水冲洗干净，在无菌条件下用手术剪剪取1立方厘米大小的珊瑚组织块，用研钵及研杵研磨破碎珊瑚组织，破碎的珊瑚组织放入装有100ml ASP-8A液体培养基(培养基中添加50μg·ml-1卡那霉素，100μg·ml-1氨苄青霉素，50μg·ml-1链霉素)的三角瓶。珊瑚破碎组织培养液于25℃培养2.5天(培养基pH值7.0，光照强度为8500lux，光暗比为16：8)。通过显微镜观察到珊瑚破碎组织藻的释放后，吸取珊瑚破碎组织释放的藻液体培养物100μl，涂布于ASP-8A固体培养基(培养基中添加50μg·ml-1卡那霉素，100μg·ml-1氨苄青霉素，50μg·ml-1链霉素)，于30℃培养40天(培养基pH值8.0，光照强度为10000lux，光暗比为12：12)。挑取固体培养基长出的单藻落转接至灭菌的ASP-8A培养液中培养用于形态学观察，藻类分子鉴定。形态学鉴定(图1-4)表明该藻具有细胞壁、液泡、细胞核、叶绿体、蛋白核等细胞结构，细胞大小5-12微米，细胞表面光滑。该藻具具有孢子囊繁殖阶段，孢子囊大小10-20微米，包含多个静孢子。分子鉴定结果如图5-7所示：图5为基于该藻18S rRNA基因序列建立的系统发育进化树，由该图可知，与其它的clade相比，该藻与Ignatius clade相近，但无法与该clade的其余三株藻聚为一枝，显示基于该藻的18S rRNA基因判断，该藻是独立于Ignatius clade的一个新的分枝；图6为基于该藻ITS2基因序列建立的系统发育进化树，由该图可知，该藻的ITS2基因能与Ignatiusclade聚为一枝，但二者之间存在显著差异，意即该藻与Ignatius clade是相互独立的两个分枝；图7为基于该藻rbcL基因序列建立的系统发育进化树，由该图可知，该藻的rbcL基因序列与Ignatius clade相近但无法聚为一枝，表明该藻是与Ignatius clade相近但存在大量不同的新的分支；18S rRNA、ITS2和rbcL三个基因是常用于藻类分子鉴定的三个分子标签，由图5-7可知，该藻的这三个分子标签均与绿藻门其他属的对应分子标签有差异，可以认为该藻属于绿藻门的一个新属。综上所述，该藻属于绿藻门、石莼纲的一新属新种，该藻由上海交通大学海洋生物技术实验室李志勇教授和巩三强博士生根据国际双名法(国际命名规则：属名+种名)命名为珊瑚来源新属、新种藻Symbiochlorium hainandiae，属名为Symbiochlorium，种名为hainandiae。该藻与国外研究者分离自美国的微藻Ignatiustetrasporus UTEX:2012和Pseudocharacium americanum UTEX2112在进化上形成姐妹枝。序列相似性分析表明该藻与Ignatius tetrasporus UTEX 2012和Pseudocharaciumamericanum UTEX 2112藻18S rRNA序列相似性最高，分别为89％和88％。
实施例2
南海的块状珊瑚澄黄滨珊瑚(Porites lutea)样本用无菌水冲洗干净，在无菌条件下用手术剪剪取1立方厘米大小的珊瑚组织块，用研钵及研杵研磨破碎珊瑚组织，破碎的珊瑚组织放入装有100ml ASP-8A液体培养基(培养基中添加50μg·ml-1卡那霉素，100μg·ml-1氨苄青霉素，50μg·ml-1链霉素)的三角瓶。珊瑚破碎组织培养液于10℃培养3天(培养基pH值4.0，光照强度为15000lux，光暗比为24：0)。通过显微镜观察到珊瑚破碎组织藻的释放后，吸取珊瑚破碎组织释放的藻液体培养物100μl，涂布于ASP-8A固体培养基(培养基中添加50μg·ml-1卡那霉素，100μg·ml-1氨苄青霉素，50μg·ml-1链霉素)，于10℃培养60天(培养基pH值4.0，光照强度为15000lux，光暗比为24：0)。挑取固体培养基长出的单藻落转接至灭菌的ASP-8A培养液中培养用于形态学观察，藻类分子鉴定。利用该方法分离自南海珊瑚Platygyra lamellina样本的微藻形态特征及分子鉴定结果与上述实施例1一致。
实施例3
南海的块状珊瑚澄黄滨珊瑚(Porites lutea)样本用无菌水冲洗干净，在无菌条件下用手术剪剪取1立方厘米小的珊瑚组织块，用研钵及研杵研磨破碎珊瑚组织，破碎的珊瑚组织放入装有100ml ASP-8A液体培养基(培养基中添加50μg·ml-1卡那霉素，100μg·ml-1氨苄青霉素，50μg·ml-1链霉素)的三角瓶。珊瑚破碎组织培养液于45℃培养2天(培养基pH值11.0，光照强度为2500lux，光暗比为8：16)。通过显微镜观察到珊瑚破碎组织藻的释放后，吸取珊瑚破碎组织释放的藻液体培养物100μl，涂布于ASP-8A固体培养基(培养基中添加50μg·ml-1卡那霉素，100μg·ml-1氨苄青霉素，50μg·ml-1链霉素)，于45℃培养60天(培养基pH值11.0，光照强度为2500lux，光暗比为8：16)。挑取固体培养基长出的单藻落转接至灭菌的ASP-8A培养液中培养用于形态学观察，藻类分子鉴定。利用该方法分离自南海珊瑚Favia speciosa样本的微藻形态特征及分子鉴定结果与上述实施例1与2一致。
综上所述，本发明利用珊瑚组织预处理、珊瑚来源藻热激释放、藻分离纯化、培养等技术实现了一新属新种珊瑚来源藻的实验室纯化培养；进一步克隆了该藻核糖体小亚基基因全长序列(18S rRNA基因),核糖体基因间隔区序列ITS2，1,5二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbcL，部分序列)，同时获得了该藻株的光学显微镜、扫描电镜、投射电镜照片，通过与以公开发表的藻类基因序列以及显微形态照片比对，将该藻株鉴定为一新属、新种。属名为Symbiochloriu；种名为hainandiae。该株珊瑚来源新属、新种藻Symbiochloriumhainandiae的成功分离培养，为研究海洋藻类功能以及该藻与珊瑚可能的共生关系提供了良好的研究材料，该藻也可能在珊瑚人工培育、珊瑚礁重建、新型藻类材料等方面具有应用潜力。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.一株珊瑚来源新属、新种藻，该藻种命名为珊瑚共生藻Symbiochlorium hainandiaeUn01，其保藏编号为：CCTCC NO：M2018096。
2.一种如权利要求1所述的珊瑚来源新属、新种藻的分离、培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、南海的块状珊瑚澄黄滨珊瑚组织置于ASP-8A液体培养基中进行组织培养，培养温度为10℃～45℃，培养时间为2～3天；
S2、观察到该珊瑚破碎组织中的藻释放后，吸取其破碎组织释放的藻液体培养物，涂布于ASP-8A固体培养基于10℃～45℃培养20-60天；
S3、挑取所述固体培养基长出的藻落到灭菌的ASP-8A培养液中培养至对数生长期，获得微藻种子液；
S4、将经过对数期培养的微藻种子液接种到灭菌的ASP-8A培养液中进行培养，即可。
3.如权利要求2所述的珊瑚来源新属、新种藻的分离、培养方法，其特征在于，步骤S1中，所述南海的块状珊瑚澄黄滨珊瑚为三亚鹿回头珊瑚礁自然保护区的南海块状澄黄滨珊瑚Porites lutea。
4.如权利要求2所述的珊瑚来源新属、新种藻的分离、培养方法，其特征在于，步骤S1中，所述ASP-8A液体培养基中含50μg·ml-1卡那霉素、100μg·ml-1氨苄青霉素和50μg·ml-1链霉素.。
5.如权利要求2所述的珊瑚来源新属、新种藻的分离、培养方法，其特征在于，步骤S1中，培养时培养基pH值为4.0～11.0，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0。
6.如权利要求2所述的珊瑚来源新属、新种藻的分离、培养方法，其特征在于，步骤S2中，所述ASP-8A固体培养基中含50μg·ml-1卡那霉素、100μg·ml-1氨苄青霉素和50μg·ml-1链霉素。
7.如权利要求2所述的珊瑚来源新属、新种藻的分离、培养方法，其特征在于，步骤S2中，培养时培养基pH值4.0～11.0，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0。
8.如权利要求2所述的珊瑚来源新属、新种藻的分离、培养方法，其特征在于，步骤S4中，培养时培养温度10℃～45℃，培养基pH值4.0～11.0，光照强度为2500～15000lux，光暗比为8～24：16～0，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2～1vvm。
9.一种如权利要求1所述的珊瑚来源新属、新种藻在珊瑚人工培育或珊瑚礁重建中的用途。
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