CN108660084A - 大量扣囊复膜酵母的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域,特别是指大量扣囊复膜酵母的制备方法。步骤为:以小麦面粉为扣囊复膜酵母的培养原料,将经过培养后的扣囊复膜酵母菌液与面粉按照比例混匀后,揉捏或压制成扁平状,然后置于恒温条件下培养,收集面块表面的白色粉状物,即可获得扣囊复膜酵母。本发明提供一种简便有效的扣囊复膜酵母发酵生产方法,此方法可以大批量生产扣囊复膜酵母,使用原料简单,操作方法简便,可直接发酵得到酵母菌粉,无需进行干燥处理,菌粉含水率在9.87%左右;所得扣囊复膜酵母为酵母细胞个体,非酵母假菌丝。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域,特别是指大量扣囊复膜酵母的制备方法。
背景技术
扣囊复膜酵母菌是子囊菌属的一个种,能分泌大量的淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡糖苷酶,可直接将淀粉加工成各种产品,无需液化、糖化,降低成本,节约能源,在发酵行业、医药行业和生物能源工业具有潜在的应用价值。但针对其大规模生产方面的研究较少。常规的平板发酵法虽然能获得一定浓度的菌泥,但是,仍存在以下不足:①需要在固体平板上培养,不适合大批量生产;②获得菌泥后,需要再进行干燥处理,操作较复杂;③最终得到的扣囊复膜孢酵母多为假菌丝状态。
随着其应用价值的发掘,人们对扣囊复膜酵母的需求量越来越大,因此急需探索出一种大批量生产扣囊复膜酵母的方法。
发明内容
本发明提出一种大量扣囊复膜酵母的制备方法,解决了现有技术中扣囊复膜孢酵母不能大量工业化生产、假菌丝状态的扣囊复膜孢酵母影响扣囊复膜酵母质量的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的:
大量扣囊复膜酵母的制备方法,步骤为:以小麦面粉为扣囊复膜酵母的培养原料,将经过培养后的扣囊复膜酵母菌液与面粉按照比例混匀后,揉捏或压制成扁平状,然后置于恒温条件下培养,收集面块表面的白色粉状物,即可获得扣囊复膜酵母。
所述扣囊复膜酵母菌液与面粉的比例为:1mL扣囊复膜酵母菌液加入1.5-2.5g面粉。
大量扣囊复膜酵母的制备方法,具体步骤为:
(1)扣囊复膜酵母菌液制备
将低温下保存的扣囊复膜酵母菌取出,在无菌操作台内,将其涂布在固体平板培养基上,置于30℃培养箱内,倒置培养48h后,平板表面长出菌落;挑取扣囊复膜酵母单克隆于液体培养基内,30℃静止培养48h后,获得扣囊复膜酵母菌液;
(2)将扣囊复膜酵母菌液与面粉按比例混合成面絮后,反复揉捏成表面光滑的面团,然后用表面光滑的铁盘将面团压制成厚度为0.5-1.5cm的扁平面块;
(3)扣囊复膜酵母的获得
将扁平面块平铺于无菌的容器内,用保鲜膜覆于容器上,于30℃培养24h-48h后,用灭菌刀片收集面块表面的白色粉状物,即为扣囊复膜酵母。
所述步骤(1)中固体平板培养基的配方为酵母粉10g、蛋白胨粉20g、无水葡萄糖20g、琼脂粉16g、蒸馏水1L。
所述步骤(1)中液体培养基的配方为酵母粉10g、蛋白胨粉20g、无水葡萄糖20g、蒸馏水1L。
所述步骤(2)中扣囊复膜酵母菌液与面粉的比例为:1mL扣囊复膜酵母菌液加入1.5-2.5g面粉。
所述步骤(2)和步骤(3)均在无菌条件下进行。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明大量扣囊复膜酵母的制备方法不需要固体平板培养,采用面团发酵代替固体培养基发酵,可根据菌粉的需求量调整种子培养液的制备量;便于大批量生产;发酵完成后,从面团表面收集到的菌粉含水率在9.87%左右,含水量较少,不需要再进行干燥处理;最终所得菌粉为扣囊复膜酵母孢子体,为单个细胞状态,非酵母假菌丝;孢子态个体对环境胁迫有较大的耐受性,便于在低温下长期储存。
(2)本发明提供一种简便有效的扣囊复膜酵母发酵生产方法,此方法可以大批量生产扣囊复膜酵母,使用原料简单,操作方法简便,可直接发酵得到酵母菌粉,无需进行干燥处理,菌粉含水率在9.87%左右;所得扣囊复膜酵母为酵母细胞个体,非酵母假菌丝。
(3)大量生产扣囊复膜酵母实现工业化生产海藻糖,海藻糖具有优异的保湿持水功能,在干燥条件下能够在细胞表面形成一层特殊的保护膜,其水合作用可以束缚水分子,在失水时还可以起到代替细胞中水分的作用,从而保护皮肤细胞不致受损,为高效保湿剂;淀粉经扣囊复膜酵母一步发酵,可大批量生产海藻糖,与常规的海藻糖的制备方法相比更适合产业化大批量生产。
附图说明
图1为扣囊复膜孢酵母在固体平板表面的状态。
图2为对比例中显微镜下观察扣囊复膜孢酵母的假菌丝状态。
图3为扣囊复膜孢酵母在面团表面形成的白色粉状物。
图4为实施例1显微镜下观察扣囊复膜孢酵母的单个细胞状态。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的大量扣囊复膜酵母的制备方法,步骤如下:
1、种子培养基制备:取酵母粉10g,蛋白胨粉20g,葡萄糖20g(葡萄糖需单独灭菌后加入),蒸馏水1L,高压蒸汽灭菌121℃,15min,得到种子液体培养基。
2、种子制备: 取出低温甘油保存的菌种,吸取100uL菌液到1mL液体培养基进行活化,30℃,培养12h,然后吸取100uL接种于10mL新鲜液体种子培养基内,30℃,培养40-45h,得到对数期的菌液。
3、种子扩大培养:将获得的10mL种子培养液进行扩大培养,按照1:10的比例扩大,吸取2mL种子培养液到200mL新鲜的液体种子培养基内,放在恒温振荡培养箱内30℃,150rpm,振荡培养38-40h,得到对数期的扣囊复膜孢酵母培养液。
4、扣囊复膜酵母面团发酵
将获得的200mL扣囊复膜酵母菌培养液倒入灭菌处理后的铁盆中,按照1:2(v/m)的比列加入400g小麦面粉(中劲,特一粉)。双手用酒精消毒后,将菌液与面粉混合成面絮,手工(或和面机)反复揉捏成表面光滑的面团,然后用表面光滑的铁盘将面团压制成厚度约1 cm左右的扁平状面块。将扁平状面块置于相应的容器内(注:容器四周的高度要超过面块的高度约2cm),平放,用保鲜膜覆上容器,置于30℃恒温培养箱内进行培养。
5、扣囊复膜酵母菌粉获得
30℃恒温培养24h后,面块表面产生少量白色粉状物,此时面块较软不宜收集菌粉,48h后,面块表面产生大量白色粉状物(图3),此时面块硬度适中适宜收集菌粉。用灭菌后的铁质刀片,将面块表面的白色粉状物刮下,即可获得扣囊复膜酵母纯菌粉。此为扣囊复膜酵母形成的子囊孢子,为单个细胞状态(图4),非酵母假菌丝。
本发明的优点为:(1)不需要固体平板培养,采用面团发酵代替固体培养基发酵,可根据菌粉的需求量调整种子培养液的制备量。便于大批量生产。(2)发酵完成后,从面团表面收集到的菌粉含水率在 9.87%左右,含水量较少,不需要再进行干燥处理。(3)最终所得菌粉为扣囊复膜酵母孢子体,为单个细胞状态,非酵母假菌丝。孢子态个体对环境胁迫有较大的耐受性,便于在低温下长期储存。
实施例2
本实施例的大量扣囊复膜酵母的制备方法,步骤如下:
1、种子培养基制备:取酵母粉10g,蛋白胨粉20g,葡萄糖20g(葡萄糖需单独灭菌后加入),蒸馏水1L,高压蒸汽灭菌121℃,15min,得到种子液体培养基。
2、种子制备: 取出低温甘油保存的菌种,吸取100uL菌液到1mL液体培养基进行活化,30℃,培养12h,然后吸取100uL接种于10mL新鲜液体种子培养基内,30℃,培养40h,得到对数期的菌液。
3、种子扩大培养:将获得的10mL种子培养液进行扩大培养,按照1:10的比例扩大,吸取2mL种子培养液到200mL新鲜的液体种子培养基内,放在恒温振荡培养箱内30℃,150rpm,振荡培养40h,得到对数期的扣囊复膜孢酵母培养液。
4、扣囊复膜酵母面团发酵
将获得的200mL扣囊复膜酵母菌培养液倒入灭菌处理后的铁盆中,按照1:1.5(v/m)的比列加入300g小麦面粉(中劲,特一粉)。双手用酒精消毒后,将菌液与面粉混合成面絮,手工(或和面机)反复揉捏成表面光滑的面团,然后用表面光滑的铁盘将面团压制成厚度约0.5 cm左右的扁平状面块。将扁平状面块置于相应的容器内(注:容器四周的高度要超过面块的高度约2cm),平放,用保鲜膜覆上容器,置于30℃恒温培养箱内进行培养。
5、扣囊复膜酵母菌粉获得
30℃恒温培养24h后,面块表面产生少量白色粉状物,此时面块较软不宜收集菌粉,48h后,面块表面产生大量白色粉状物,此时面块硬度适中适宜收集菌粉。用灭菌后的铁质刀片,将面块表面的白色粉状物刮下,即可获得扣囊复膜酵母纯菌粉。此为扣囊复膜酵母形成的子囊孢子,为单个细胞状态,非酵母假菌丝。
实施例3
本实施例的大量扣囊复膜酵母的制备方法,步骤如下:
1、种子培养基制备:取酵母粉10g,蛋白胨粉20g,葡萄糖20g(葡萄糖需单独灭菌后加入),蒸馏水1L,高压蒸汽灭菌121℃,15min,得到种子液体培养基。
2、种子制备: 取出低温甘油保存的菌种,吸取100uL菌液到1mL液体培养基进行活化,30℃,培养12h,然后吸取100uL接种于10mL新鲜液体种子培养基内,30℃,培养40h,得到对数期的菌液。
3、种子扩大培养:将获得的10mL种子培养液进行扩大培养,按照1:10的比例扩大,吸取2mL种子培养液到200mL新鲜的液体种子培养基内,放在恒温振荡培养箱内30℃,150rpm,振荡培养40h,得到对数期的扣囊复膜孢酵母培养液。
4、扣囊复膜酵母面团发酵
将获得的200mL扣囊复膜酵母菌培养液倒入灭菌处理后的铁盆中,按照1:2.5(v/m)的比列加入300g小麦面粉(中劲,特一粉)。双手用酒精消毒后,将菌液与面粉混合成面絮,手工(或和面机)反复揉捏成表面光滑的面团,然后用表面光滑的铁盘将面团压制成厚度约1.5 cm左右的扁平状面块。将扁平状面块置于相应的容器内(注:容器四周的高度要超过面块的高度约2cm),平放,用保鲜膜覆上容器,置于30℃恒温培养箱内进行培养。
5、扣囊复膜酵母菌粉获得
30℃恒温培养24h后,面块表面产生少量白色粉状物,此时面块较软不宜收集菌粉,48h后,面块表面产生大量白色粉状物,此时面块硬度适中适宜收集菌粉。用灭菌后的铁质刀片,将面块表面的白色粉状物刮下,即可获得扣囊复膜酵母纯菌粉。此为扣囊复膜酵母形成的子囊孢子,为单个细胞状态,非酵母假菌丝。
对比例
1、种子培养基制备:取酵母粉10g,蛋白胨粉20g,葡萄糖20g(葡萄糖需单独灭菌后加入),蒸馏水1L,高压蒸汽灭菌121℃,15min,得到种子液体培养基。每升液体培养基中加入琼脂粉16g,灭菌后倒平板,每个培养皿约20毫升,得到种子固体培养基。
2、种子制备:取出低温甘油保存的菌种,吸取100ul菌液到1ml液体培养基进行活化,30℃,培养12h,然后吸取10ul接种于1ml新鲜液体种子培养基内,30℃,培养40-45h,得到对数期的菌液。
3、固体平板培养:将得到的对数期菌液,均匀涂布于种子固体培养基上,每个固体平板涂布100uL对数期菌液,平板在操作台内放置15min后,置于30℃恒温恒湿培养箱内,倒置培养40-48h。
4、收集菌泥:培养40-48h后,将固体平板从培养箱内取出,平板培养基表面形成一层较厚的胶状物质(图1),这种表层物就是扣囊复膜孢酵母的菌体,用消毒后的镊子,将菌体从培养基上取出,得到高浓度菌泥。显微镜下观察,此时的扣囊复膜孢酵母菌体为菌丝体状态(图2)。
对比例的方法可获得高浓度菌泥,但存在一些不足之处:(1)需要在固体平板上培养,不适合大批量生产(2)获得菌泥后,需要再进行干燥处理,操作较复杂。(3)最终得到的扣囊复膜孢酵母为假菌丝状态。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.大量扣囊复膜酵母的制备方法,其特征在于,步骤为:以小麦面粉为扣囊复膜酵母的培养原料,将经过培养后的扣囊复膜酵母菌液与面粉按照比例混匀后,揉捏或压制成扁平状,然后置于恒温条件下培养,收集面块表面的白色粉状物,即可获得扣囊复膜酵母。
2.如权利要求1所述的大量扣囊复膜酵母的制备方法,其特征在于,所述扣囊复膜酵母菌液与面粉的比例为:1mL扣囊复膜酵母菌液加入1.5-2.5g面粉。
3.如权利要求1或2所述的大量扣囊复膜酵母的制备方法,其特征在于,具体步骤为:
扣囊复膜酵母菌液制备;
将低温下保存的扣囊复膜酵母菌取出,在无菌操作台内,将其涂布在固体平板培养基上,置于30℃培养箱内,倒置培养48h后,平板表面长出菌落;挑取扣囊复膜酵母单克隆于液体培养基内,30℃静止培养48h后,获得扣囊复膜酵母菌液;
将扣囊复膜酵母菌液与面粉按比例混合成面絮后,反复揉捏成表面光滑的面团,然后用表面光滑的铁盘将面团压制成厚度为0.5-1.5cm的扁平面块;
扣囊复膜酵母的获得
将扁平面块平铺于无菌的容器内,用保鲜膜覆于容器上,于30℃培养24h-48h后,用灭菌刀片收集面块表面的白色粉状物,即为扣囊复膜酵母。
4.如权利要求3所述的大量扣囊复膜酵母的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中固体平板培养基的配方为酵母粉10g、蛋白胨粉20g、无水葡萄糖20g、琼脂粉16g、蒸馏水1L。
5.如权利要求3所述的大量扣囊复膜酵母的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中液体培养基的配方为酵母粉10g、蛋白胨粉20g、无水葡萄糖20 g、蒸馏水1 L。
6.如权利要求3所述的大量扣囊复膜酵母的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中扣囊复膜酵母菌液与面粉的比例为:1mL扣囊复膜酵母菌液加入1.5-2.5g面粉。
7.如权利要求3所述的大量扣囊复膜酵母的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)和步骤(3)均在无菌条件下进行。
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