CN108658949A

CN108658949A - 一种用作抗肿瘤药物的化合物及其生产方法

Info

Publication number: CN108658949A
Application number: CN201810698933.0A
Authority: CN
Inventors: 牛雪梅; 陈永红; 何江波; 张克勤
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN108658949B

Abstract

本申请涉及一种用作抗肿瘤药物的化合物及其生产方法。所述化合物如结构式I所示：其中，R₁和R₆分别为羟基，R₂、R₃、R₄和R₅独立的选自氢、烷基和羟基中的一种。其对选自肺癌、肝癌和乳腺癌中的具有显著抑制活性。

Description

一种用作抗肿瘤药物的化合物及其生产方法

技术领域

本申请涉及一种可以用作抗肿瘤药物的新型化合物，及其生产方法。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)统计，全世界有3/5的人死于癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系统疾病这4大类疾病，而癌症则是最主要的死因之一。为了攻克癌症这一世界性难题，世界各国都投入了大量的人力物力来进行研究，以希望能早日找到治愈其的方法，为癌症患者带来生的希望。因此，抗肿瘤药物的化合物的筛选是当前研究的一个热点。

经过多年的发展，抗肿瘤药物的研发取得了许多重要进展。然而，面对威胁人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90％以上的实体瘤至今仍然缺乏高效、特异性强的药物，这一方面反映了抗肿瘤药物研发的艰难，另一方面也意味着还需要开发新型抗肿瘤化合物药物。

发明内容

本申请之一提供了一种新型化合物，所述化合物如结构式I所示：

其中，R₁和R₆分别为羟基，R₂、R₃、R₄和R₅独立的选自氢、烷基和羟基中的一种。

在一个具体实施方式中，所述R₂、R₃、R₄和R₅独立地选自氢或烷基。

在一个具体实施方式中，所述烷基选自甲基、乙基和丙基中的一种。

在一个具体实施方式中，所述化合物为如结构式II至IV所示中的至少一种：

本申请之二提供了一种生产如本申请之一所述的化合物的方法，所述方法包括对含有编码法尼基转移酶的基因的异源生物进行发酵的异源生物，得到含有如本申请之一中任意一种所述化合物的发酵液；其中，所述法尼基转移酶具有如下(I)或(II)的氨基酸序列：

(I)来源于节丛孢属(Arthrobotrys)中的一种真菌的法尼基转移酶的氨基酸序列，优选地，如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

(II)与(I)中的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与(I)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(I)中的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与(I)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，编码所述法尼基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

在一个具体实施方式中，编码所述法尼基转移酶的基因连接在能够用于所述异源生物的表达载体上。

在一个具体实施方式中，所述异源生物为埃希氏菌属(Escherichia)中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述异源生物为大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一个具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：

1)将所述法尼基转移酶的基因连接到pCold-TF载体上，得到表达载体；

2)将所述表达载体转化至埃希氏菌中，获得工程菌株；

3)将所述工程菌株接种至埃希氏菌的液体培养基，在37±2℃和200±50rpm的条件下培养12±4h，按照2％至10％的接种率扩大培养培养至OD值为0.5至0.8，添加异丙基硫代半乳糖苷和2，5-二羟基甲苯，18°±2℃诱导24±4h，28±2℃培养72±12h，获得含有如本申请之一中任意一种所述化合物的发酵液。

在一个具体实施方式中，在步骤3)中，异丙基硫代半乳糖苷的使用浓度为45至55μM，优选异丙基硫代半乳糖苷的使用浓度为50μM。

在一个具体实施方式中，在步骤3)中，2，5-二羟基甲苯的使用浓度为60±40μg/mL，优选2，5-二羟基甲苯的使用浓度为60μg/mL。

在一个具体实施方式中，编码所述法尼基转移酶(SEQ ID No.1)的基因具有如SEQID No.2所示的核苷酸序列；通过柱式法提取少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)1.3170(菌种由云南生物资源保护与利用国家重点实验室提供)的总RNA；将总RNA使用Oligo dT引物反转录成cDNA，设计引物进行PCR，回收靶标DNA片段；通过In-fusion的方法将靶标DNA片段连在表达质粒pCold-TF上，得到含有法尼基转移酶基因的载体pCold-AOL_s00215g276；将所述表达载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli，BL21(DE3))中，获得工程菌株；将工程菌株接种至LB液体培养基，在37±2℃、200±50rpm培养12±4h，按照2％-10％的接种率扩大培养培养至OD值为0.6-0.8，添加50μM异丙基硫代半乳糖苷和60±40μg/ml 2，5-二羟基甲苯，18°±2℃诱导24±4h，28±2℃培养72±12h，获得含有如本申请之一中任意一种所述化合物发酵液。

在一个具体实施方式中，所述方法还包括从所述发酵液中纯化所述化合物的步骤。

在一个具体实施方式中，纯化所述化合物通过减压蒸馏得到浓缩物；用乙酸乙酯超声萃取，减压浓缩乙酸乙酯部后得到粗提物；通过常规的化合物分离和提纯方法，分离得到如本申请之一中任意一种所述化合物。

申请之三提供了本申请之一中的任意一种化合物和/或本申请之二的任意一项中的方法生产的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

在一个具体实施方式中，所述肿瘤选自肺癌、肝癌和乳腺癌中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述肺癌为肺腺癌。

本申请的有益效果：

本申请首次发现了通过将来源于节丛孢属(Arthrobotrys)真菌的法尼基转移酶的异源表达(例如在大肠杆菌中的表达)，可以得到具有强的抗人肺腺癌细胞NCI-H1975、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7活性的全新碳骨架的化合物。因而这些化合物具有对人肺癌、肝癌和乳腺癌有效的潜在药物。并且该生物合成制备方法具有合成难度低、步骤简单、容易方便、污染小、安全可靠以及发酵周期短等方面的优点。

附图说明

图1为少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)1.3170的总RNA凝胶电泳图，其中泳道M为DL5000 DNA Marker，泳道1为RNA。

图2为AOL_s00215g276基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DL2000DNA Marker，泳道1为法尼基转移酶基因的目的条带(1101bp)。

图3为以pCold-TF-AOL_s00215g276质粒为模板扩增AOL_s00215g276的PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道为DL2000 DNA marker，泳道1为法尼基转移酶基因的目的条带(1101bp)。

图4为pCold-TF-AOL_s00215g276表达载体图谱。

具体实施方式

以下为结合具体实例对本申请进行进一步描述，但本申请的保护范围并不仅限于此。

在没有特别说明的情况下，本申请中使用的试剂和原料均可以市售获得，或者通过常规配制得到。

PDB培养基配方：将200g马铃薯用水煮沸30min后，取上清加入20g无水葡萄糖定容至1L，121℃灭菌20min。

LB培养基配方：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g，氯化钠10g，定容至1L，121℃灭菌20min。

pCold-TF质粒载体来源：购自Takara公司。

实施例1

1.含有法尼基转移酶基因目的片段的pCold-TF-AOL_s00215g276质粒

(1)采用柱式法提取少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)1.3170(菌种由云南生物资源保护与利用国家重点实验室提供)的总RNA。过程如下：将少孢节丛孢1.3170于PDB培养基中37℃培养7天，过滤收集菌丝，加入液氮充分研磨至菌体呈粉末状；接下来参照天根植物基因组提取试剂盒说明书提取总RNA。总RNA电泳检测如图1所示。

(2)参照Takara cDNA第一链合成试剂盒说明书，使用Takara cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA。以获得的cDNA为模板，以276-F(如SEQ ID No.3所示)和276-R(如SEQ ID No.4所示)为引物对，进行PCR扩增。PCR体系为50μL：5×PrimeSTAR GXL缓冲液10μL，dNTP混合物(每种2.5mM)4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA模板1μL，PrimeSTAR GXLDNA聚合酶1μL，ddH₂O 32μL。PCR仪为eppendorf产品，PCR反应温度为：98℃ 2min，98℃10sec，55℃ 15sec，68℃ 1min共计35个循环，68℃ 5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，见图2，从图中可见约1000bp的PCR产物。

(3)参照Takara胶回收试剂盒，使用Takara胶回收试剂盒对PCR片段进行回收纯化。

(4)通过In-fusion的方法将回收纯化的PCR产物连接到质粒pCold-TF上，经菌落PCR验证条带大小正确(如图3)，得到含有完整目的片段的pCold-TF-AOL_s00215g276质粒(见图4)。该PCR产物目的片段为总长1101bp的法尼基转移酶基因AOL_s00215g276(如SEQID No.2所示，其编码如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列)。

2.工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276的构建

(1)将pCold-TF-AOL_s00215g276质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养12h。

(2)随机挑取转化子使用引物276-F和276-R进行菌落PCR筛选，选取PCR产物为阳性的转化子进行进一步的测序验证。

(3)将验证正确的表达载体pCold-TF-AOL_s00215g276成功转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276。

3.工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276的发酵

(1)将工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276接种至含有氨苄青霉素的200mL液体LB培养基中，并以转化了空载质粒pCold-TF的BL21(DE3)菌株为阴性对照。

(2)在37℃ 200rpm培养12h，按照5％的接种量扩大培养。

(3)培养菌液至OD值为0.7，添加50μM异丙基硫代半乳糖苷和60μg/mL 2，5-二羟基甲苯。

(4)18℃诱导24h，然后28℃培养72h，获得发酵液。

4.化合物的提取分离和结构鉴定

通过常规的化学方法，首先将发酵液减压蒸馏浓缩，得到浓缩物。将所述浓缩物用乙酸乙酯萃取并进行超声处理，减压浓缩后得到褐色的油状乙酸乙酯提取浸膏。所述浸膏采用凝胶Sephadex LH-20(MeOH)柱层析，甲醇洗脱除去部分杂质，然后根据TLC分析，合并样品。样品再次采用中压Rp-18柱(40-60μm)梯度洗脱(甲醇:水，10:90-100:0，流速10ml/min)。然后根据紫外吸收情况，采用254nm检测，合并样品。将其中90％甲醇洗脱的样品A，然后再次用凝胶Sephadex LH-20(MeOH)除去部分杂质，根据薄层色谱(TLC)分析，再次用硅胶柱层析(200-300目硅胶)分离，采用石油醚:丙酮(10:1-1:1)梯度洗脱，得到5mg化合物II(TLC分析，石油醚：丙酮＝2:1展开，Rf＝0.5)。将90％甲醇洗脱的样品B，再次用凝胶Sephadex LH-20(MeOH)除去部分杂质，根据TLC分析，再次用硅胶柱层析分离，采用石油醚：丙酮(10:1-1:1)梯度洗脱，得到3mg化合物III(TLC分析，石油醚:丙酮＝2:1展开，Rf＝0.6)。中压柱层析中将80％甲醇洗脱下来的样品，根据紫外吸收合并得到样品C，采用凝胶Sephadex LH-20(MeOH)分离，除去部分杂质后，将样品C再次采用高压液相色谱进行制备(乙腈:水＝30:70，流速2ml/min)，得到1.5mg IV(TLC分析，石油醚：丙酮＝1:1展开，Rf＝0.8)。经过对一维核磁共振谱、二维核磁共振谱以及质谱的分析，鉴定这三个化合物为一类新型的化合物(II，III，IV)。

其中，如结构式II至IV所示的化合物的外观均为淡黄色固体，均可溶于氯仿、丙酮和二甲亚砜等有机化合物中，不溶于己烷和水。如结构式II至IV所示的化合物的分子式均为：C₂₉H₂₃NO₃，分子量为433；高分辨负离子ESI-MS质谱：实测值为432.1595[M-H]⁺，计算值为432.1594(计算为C₂₉H₂₂NO₃)。

表1为结构式II至IV所示的化合物的¹H和¹³C NMR数据(溶解溶剂为CD₃COCD₃，400MHz，δ：ppm)

表1

5.化合物的抗细胞毒活性测试

人肺腺癌细胞株NCI-H1975购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

人肝癌细胞株HepG2受赠于昆明理工大学黄芬副教授。

人乳腺癌细胞MCF-7RASW480均购自ATCC(美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚，马纳萨斯)。

所有细胞株均用含有10％胎牛血清、100IU/mL氨苄青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基在37℃、5％CO₂和90％湿度下培养。

采用常规的MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基-2H-四唑))法测定如结构式II、III、IV所示的化合物对NCI-H1975、HepG2和MCF-7细胞生长抑制活性。其中，活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成可溶性的甲臜(Formazan)化合物，该化合物的光密度OD(490nm)值与活细胞数目成正比。

首先将NCI-H1975、HepG2和MCF-7细胞(5×10³/孔)分别接种于96孔板，于37℃(5％CO₂)恒温培养箱中培养24h后，然后向每孔的细胞培养物中分别加入10μM的供试样品(即将化合物II，III和IV分别溶于400μl的DMSO中，然后再配置成各化合物浓度为10μM的0.1％DMSO溶液作为供试样品)；阴性对照则为仅向细胞培养物中加入DMSO至体积浓度0.1％。然后置于培养箱中孵化72h，加入20μl MTS溶液(购自Promega公司)后在37℃下继续孵化1h，然后在490nm用酶标仪下测定各孔光密度(OD值)，以测定活细胞量，使用Reed&Muench法计算IC₅₀值(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,1991,1(11),611-614)。

MTS法测试显示化合物II-IV对细胞株人肺腺癌细胞NCI-H1975、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7均具有较强的肿瘤细胞毒活性(Bioorganic&medicinalchemistry letters,2014,24(1):224-227.)，结果见表2。

表2化合物II-IV对不同肿瘤细胞株的半数生长抑制浓度IC₅₀(μM)

实施例2

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(2)中的37℃改为35℃。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例3

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(2)中的37℃改为39℃。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例4

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(2)中的200rpm改为150rpm。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例5

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(2)中的200rpm改为250rpm。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例6

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(2)中的12h改为8h。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例7

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(2)中的12h改为16h。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例8

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(2)中的5％的接种量改为2％的接种量。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例9

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(2)中的5％的接种量改为10％的接种量。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例10

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(3)中的OD值为0.7改为0.5。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例11

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(3)中的OD值为0.7改为0.8。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例12

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(3)中的60μg/mL改为20μg/mL。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例13

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(3)中的60μg/mL改为100μg/mL。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例14

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(4)中的18℃改为16℃。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例15

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(4)中的18℃改为20℃。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例16

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(4)中的诱导24h改为诱导20h。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例17

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(4)中的诱导24h改为诱导28h。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例18

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(4)中的28℃改为26℃。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例19

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(4)中的28℃改为30℃。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例20

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(4)中的72h改为60h。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

实施例21

将实施例1第2小节中获得的工程菌株BL21(DE3)/pCold-TF-AOL_s00215g276进行发酵并进行接下来的化合物纯化。菌株的培养和处理步骤同实施例1的第3小节和第4小节，不同之处在于，第3小节的步骤(4)中的72h改为84h。在这些组合条件下，能够分离得到本申请书中的三个化合物II、III和IV。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一种用作抗肿瘤药物的化合物及其生产方法

<130> LHA1860404

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 366

<212> PRT

<213> 少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)

<400> 1

Met Glu Ser Ile Ile Ala Arg Pro Arg Thr Arg Ser Ser Ala Lys Glu

1 5 10 15

Lys Thr Gln Thr Met Ser Ala Lys Lys Ile Ser Ala Asn Gly Asn Asn

20 25 30

Ile Ala Val Gln Ala Lys Ser Lys Arg Asn Thr Pro Leu Gly Val Ile

35 40 45

Lys Leu Ala Arg Leu His Thr Leu Glu Ser Leu Leu Cys Val Tyr Pro

50 55 60

Ala Ile Trp Gly Ala Cys Leu Ser Ala Gly Ser His Gln Lys Val Phe

65 70 75 80

Thr Pro Ser Ser Phe Leu Ser Val Leu Phe Ala Asn Trp Ile Ser Met

85 90 95

Thr Ile Ala His Met Ala Phe Cys Thr Phe Asn Asp Ile Val Asp Arg

100 105 110

Asn Phe Asp Gly Lys Val Glu Arg Thr Lys Val Arg Pro Leu Pro Ala

115 120 125

Gly Met Ile Ser Leu Arg Ser Ala Ile Ile Ala Phe Ile Val Glu Met

130 135 140

Gly Leu Thr Val Tyr Ile Ser Tyr Ala Thr Leu Gly Phe Asp Gly Ala

145 150 155 160

Leu Val Cys Ala Pro Val Trp Ile Ala Ser Thr Ile Tyr Pro Phe Met

165 170 175

Lys Arg Val Val Gln Trp Pro Gln Leu Val Leu Gly Pro Ile Ile Gly

180 185 190

Met Ala Val Phe Pro Gly Trp Val Ser Val Ala Gly Asn Leu Asp Thr

195 200 205

Leu Arg Asp Ala Val Pro Met Phe Leu Ala Thr Ser Ala Trp Val Val

210 215 220

Tyr Phe Asp Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Asp Thr Asn Asp Asp Lys Lys

225 230 235 240

Ile Gly Val Lys Ser Leu Ala Val Leu Phe His Asn His Met His Gln

245 250 255

Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ser Ile Gln Ile Ala Leu Leu Ser Phe Thr

260 265 270

Ala Arg Lys Ala Asn Met Ser Ala Leu Phe Trp Ser Leu Gly Val Cys

275 280 285

Val Trp Gly Leu Asn Ile Pro Phe His Leu Leu Ser Leu Asp Thr Lys

290 295 300

Asn Pro Lys Thr Gly Gly Lys Val Phe Leu Met Asn Ile Leu Leu Gly

305 310 315 320

Leu Trp Ile Thr Ile Val Cys Val Ile Glu Leu Trp Thr Thr Thr Val

325 330 335

Met His Leu Asp Val Asn Asp Phe Leu Leu Lys Thr Val Val His Asn

340 345 350

Ile Thr Leu Thr Ala Gln Asn Ile Arg Ser Ser Val Ala Phe

355 360 365

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> 少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)

<400> 2

atggagagca ttattgcaag accacgaact cgaagttctg ctaaagaaaa gactcagaca 60

atgtccgcaa agaagatatc tgcaaatggc aacaatattg ctgttcaagc aaaatcaaag 120

cgaaatactc ctcttggagt tatcaagcta gctaggcttc acaccctcga gtcgcttcta 180

tgtgtctacc cagcgatatg gggagcttgc ttgagtgcag ggagtcacca gaaggttttc 240

acgccatcat cattcctcag cgtccttttt gcaaattgga ttagcatgac aattgcacat 300

atggcattct gtaccttcaa tgatatcgtt gaccgaaact ttgatggaaa agtcgaaaga 360

acaaaggttc gacctttgcc agctggaatg ataagccttc gatcagcgat catcgctttc 420

atcgtagaaa tgggccttac ggtgtacatc agctatgcca ctttaggttt cgatggtgct 480

cttgtttgtg ctcccgtgtg gatcgcaagc acaatctacc cattcatgaa acgagttgtt 540

caatggccac aacttgtttt ggggcccatc atcggaatgg cagttttccc tggctgggtt 600

tccgtcgctg gaaacttgga tacacttcga gacgctgttc ctatgttcct tgcaaccagt 660

gcctgggtcg tctactttga tactatctat gcaactcagg atacaaacga tgacaagaag 720

attggcgtca aatctctggc ggtacttttc cacaaccaca tgcaccaatt cctaggattc 780

cttggatcga tacaaatagc tttgttgtcg tttactgcgc gcaaagcaaa catgtctgca 840

cttttctggt ccttgggggt ctgtgtatgg gggttgaaca tcccattcca ccttctttcg 900

ttggatacca agaatcctaa aactggaggc aaagttttcc tgatgaatat tctcttggga 960

ctctggatca ccattgtttg tgttatcgag ctgtggacga ctactgttat gcacttggat 1020

gtaaacgatt tcctacttaa gacggtcgtg cacaatatta ctttgactgc acagaatatc 1080

aggagcagcg tggcgtttta g 1101

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 3

gtggtatcga aggtaggcat atggagagca ttattgcaag 40

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 4

cttgaattcg gatccctcga ctaaaacgcc acgctgct 38

Claims

1.一种新型化合物，所述化合物如结构式I所示：

其中，R₁和R₆分别为羟基，R₂、R₃、R₄和R₅独立的选自氢、烷基和羟基中的一种；优选所述R₂、R₃、R₄和R₅独立地选自氢或烷基；更优选地，所述烷基选自甲基、乙基和丙基中的一种。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为如结构式II至IV所示中的至少一种：

3.一种生产如权利要求1或2所述的化合物的方法，所述方法包括对含有编码法尼基转移酶的基因的异源生物进行发酵的异源生物，得到含有如权利要求1或2所述化合物的发酵液；其中，所述法尼基转移酶具有如下(I)或(II)的氨基酸序列：

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，编码所述法尼基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求3或4的方法，其特征在于，编码所述法尼基转移酶的基因连接在能够用于所述异源生物的表达载体上。

6.根据权利要求3至5所述的方法，其特征在于，所述异源生物为埃希氏菌属(Escherichia)中的至少一种，优选所述异源生物为大肠杆菌(Escherichia coli)。

7.根据权利要求3至6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2)将所述表达载体转化至埃希氏菌中，获得工程菌株；

3)将所述工程菌株接种至埃希氏菌的液体培养基，在37±2℃和200±50rpm的条件下培养12±4h，按照2％至10％的接种率扩大培养培养至OD值为0.5至0.8，添加异丙基硫代半乳糖苷和2,5-二羟基甲苯，18°±2℃诱导24±4h，28±2℃培养72±12h，获得含有如权利要求1或2所述化合物的发酵液。

8.根据权利要求3至7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述发酵液中纯化所述化合物的步骤。

9.根据权利要求1或2所述的化合物和/或如权利要求3至8中任意一项所述的方法生产的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、肝癌和乳腺癌中的至少一种。