CN108633615A - 一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及虫草培养领域，具体涉及一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，包括如下步骤：(1)菌种的分离与选育(2)感染寄主(3)配制营养液；(4)蚕虫草的培育和发酵；(5)无土栽培虫草和采收。整个过程历经60‑80天，操作简单方便，不需要用注射器将菌种注射至蚕蛹体内，避免了接种感染的情况发生，培育出草率可以达到80％以上。利用该桑蚕幼虫和蛹虫草培育的虫草，产量大、成本低、零污染，虫草素含量大大提高。
Description
技术领域
本发明涉及虫草培养领域，具体涉及一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法。
背景技术
虫草作为藏族民间用药已有上千年历史，全草入药。与人参、鹿茸并称为三大高级滋补品，具补肺益肾、止血化痰之功效。虫草含虫草酸，亦称D-甘露醇，为虫草的主要活性成分。据文献报道含脂肪酸、天冬氨酸、苏氨酸等17种氨基酸及Al、Si、K、Na等多种元素，近年来还发现含有尿嘧啶、腺嘌呤、腺嘌呤核苷等7种新成分。
由于虫草具有良好的治疗和保健作用，国内外的需求量日益增加，加之虫草仅分布于特定的区域，天然产量有限，长期过度采集，导致分布范围和产量呈现明显萎缩现象。如何有效地保护和持续利用虫草资源，探索人工培育新技术，已成为当前急需解决的重要课题。
现有的虫草培育，活体菌种培养完成后，培养虫草时，需要用注射器将菌种注射至蚕蛹体内，如中国专利CN102440149A，操作要求较高、产量低，最主要的是容易出现接种感染的现象，影响后期培育出草率，甚至终止培育过程。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，避免了接种感染的情况发生，培育出草率可以达到80％以上。
解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明的利用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，具体包括以下步骤：
(1)菌种的分离与选育：从市售天然冬虫夏草中，筛选出对桑蚕感染力强、出草率高、自身比较健壮的虫草菌株，加入一定量的葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨、和硫酸镁的混合物浸泡7天；
(2)感染寄主：选择肤色均匀的5龄桑蚕幼虫和蛹虫作为寄主，在20-23℃，湿度为70-80RH％的培养箱内，将步骤(1)的经过处理后的菌种和寄主一起放入，并200-300nm波长紫外光照射下，照射15-20天，肉眼看见寄主表面长满白色菌丝后，调节紫外光照射波长为100-150nm，继续照射5-10天；
(3)配制营养液：将麦芽糊精20份质量份、燕麦5-8质量份、山楂5质量份、枸杞5-10质量份、黄芪5-10质量份、当归15-20质量份、灵芝10-15质量份用搅拌机切碎混合均匀，再加入1000ml蒸馏水，加热烧开，70-75℃浸提，在0.75kg/CM2高压、120℃灭菌30-50min，得营养液；
(4)蚕虫草的培育和发酵：在步骤(2)的光照培养箱中，将步骤(3)配制得营养液作为发酵液用于寄主的发酵，控制培养箱内的温度湿度不变，采用紫外波长为100-150nm照射30-40天；
(5)无土栽培虫草和采收：把经过步骤(4)发菌后的寄主置于一次性塑料杯中，所述的一次性塑料杯经过灭菌处理，将寄主隔离栽培，在300-350Lx的光照强度下，让栽培的蚕虫草接近于天然生长状态的冬虫夏草，当蚕虫草长到5厘米的长度时，即可采收。
进一步地说，步骤(1)所述的葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物是按照质量比为2:1:1:1:1混合，加入量为使得虫草菌株可以完全淹没在内即可。
进一步地说，步骤(4)所述的营养液是借助于一个内置容器放入培养箱内部的，所述的内置容器的外部还套接一个外容器，所述的内置容器和外容器通过经过灭菌的螺杆连接在一起，所述的内置容器和外容器之间的空隙内通入循环冷却液体用于保持营养液的恒温。
进一步地说，所述的培养箱置于无菌室内，所述的无菌室的温度为20-28℃。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，操作简单方便，不需要用注射器将菌种注射至蚕蛹体内，避免了接种感染的情况发生，无土栽培虫草，培育出草率可以达到80％以上。利用该桑蚕幼虫和蛹虫草培育的虫草，产量大、成本低、零污染，生产周期短，虫草素含量大大提高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，包括如下步骤：
(1)菌种的分离与选育：从市售天然冬虫夏草中，筛选出自身比较健壮的虫草菌株，加入一定量的葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物浸泡7天；葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物是按照质量比为2:1:1:1:1混合，加入量为使得虫草菌株可以完全淹没在内即可。
(2)感染寄主：选择肤色均匀的5龄桑蚕幼虫和蛹虫作为寄主，在23℃，湿度为80％的培养箱内，将步骤(1)的经过处理后的菌种和寄主一起放入，并300nm波长紫外光照射下，照射20天，肉眼看见寄主表面长满白色菌丝后，调节紫外光照射波长为150nm，继续照射10天；
(3)配制营养液：将麦芽糊精20份质量份、燕麦8质量份、山楂5质量份、枸杞10质量份、黄芪10质量份、当归20质量份、灵芝15质量份用搅拌机切碎混合均匀，再加入1000ml蒸馏水，加热烧开，75℃浸提，在0.75kg/CM2高压、120℃灭菌50min，得营养液；
(4)蚕虫草的培育和发酵：在步骤(2)的光照培养箱中，将步骤(3)配制得营养液作为发酵液用于寄主的发酵，是将寄主放入营养液内，控制培养箱内的温度湿度不变，采用紫外波长为150nm照射40天；营养液是借助于一个内置容器放入培养箱内部的，所述的内置容器的外部还套接一个外容器，所述的内置容器和外容器通过经过灭菌的螺杆连接在一起，所述的内置容器和外容器之间的空隙内通入循环冷却液体用于保持营养液的恒温。
(5)无土栽培虫草和采收：把经过步骤(4)发菌后的寄主置于一次性塑料杯中，所述的一次性塑料杯经过灭菌处理，将寄主隔离栽培，在350Lx的光照强度下，让栽培的蚕虫草接近于天然生长状态的冬虫夏草，当蚕虫草长到5厘米的长度时，即可采收。
培养箱置于无菌室内，所述的无菌室的温度为20-28℃。
本实施例方法培养出的虫草经高效液相色谱法检测，含有虫草素5.755mg/g，出草率达到83.8％。
实施例2：
一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，包括如下步骤：
(1)菌种的分离与选育：从市售天然冬虫夏草中，筛选出自身比较健壮的虫草菌株，加入一定量的葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物浸泡7天；葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物是按照质量比为2:1:1:1:1混合，加入量为使得虫草菌株可以完全淹没在内即可。
(2)感染寄主：选择肤色均匀的5龄桑蚕幼虫和蛹虫作为寄主，在20℃，湿度为70％的培养箱内，将步骤(1)的经过处理后的菌种和寄主一起放入，并200nm波长紫外光照射下，照射15天，肉眼看见寄主表面长满白色菌丝后，调节紫外光照射波长为100nm，继续照射5天；
(3)配制营养液：将麦芽糊精20份质量份、燕麦5质量份、山楂5质量份、枸杞5质量份、黄芪5质量份、当归15质量份、灵芝10质量份用搅拌机切碎混合均匀，再加入1000ml蒸馏水，加热烧开，70℃浸提，在0.75kg/CM2高压、120℃灭菌30min，得营养液；
(4)蚕虫草的培育和发酵：在步骤(2)的光照培养箱中，将步骤(3)配制得营养液作为发酵液用于寄主的发酵，是将寄主放入营养液内，控制培养箱内的温度湿度不变，采用紫外波长为100nm照射30天；营养液是借助于一个内置容器放入培养箱内部的，所述的内置容器的外部还套接一个外容器，所述的内置容器和外容器通过经过灭菌的螺杆连接在一起，所述的内置容器和外容器之间的空隙内通入循环冷却液体用于保持营养液的恒温。
(5)无土栽培虫草和采收：把经过步骤(4)发菌后的寄主置于一次性塑料杯中，所述的一次性塑料杯经过灭菌处理，将寄主隔离栽培，在300Lx的光照强度下，让栽培的蚕虫草接近于天然生长状态的冬虫夏草，当蚕虫草长到5厘米的长度时，即可采收。
培养箱置于无菌室内，所述的无菌室的温度为20-28℃。
本实施例方法培养出的虫草经检测，含有虫草素4.897mg/g，出草率达到81.5％。
实施例3：
一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，包括如下步骤：
(1)菌种的分离与选育：从市售天然冬虫夏草中，筛选出自身比较健壮的虫草菌株，加入一定量的葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物浸泡7天；葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物是按照质量比为2:1:1:1:1混合，加入量为使得虫草菌株可以完全淹没在内即可。
(2)感染寄主：选择肤色均匀的5龄桑蚕幼虫和蛹虫作为寄主，在22℃，湿度为75％的培养箱内，将步骤(1)的经过处理后的菌种和寄主一起放入，并250nm波长紫外光照射下，照射18天，肉眼看见寄主表面长满白色菌丝后，调节紫外光照射波长为120nm，继续照射8天；
(3)配制营养液：将麦芽糊精20份质量份、燕麦7质量份、山楂5质量份、枸杞8质量份、黄芪8质量份、当归17质量份、灵芝14质量份用搅拌机切碎混合均匀，再加入1000ml蒸馏水，加热烧开，73℃浸提，在0.75kg/CM2高压、120℃灭菌35min，得营养液；
(4)蚕虫草的培育和发酵：在步骤(2)的光照培养箱中，将步骤(3)配制得营养液作为发酵液用于寄主的发酵，是将寄主放入营养液内，控制培养箱内的温度湿度不变，采用紫外波长为140nm照射35天；营养液是借助于一个内置容器放入培养箱内部的，所述的内置容器的外部还套接一个外容器，所述的内置容器和外容器通过经过灭菌的螺杆连接在一起，所述的内置容器和外容器之间的空隙内通入循环冷却液体用于保持营养液的恒温。
(5)无土栽培虫草和采收：把经过步骤(4)发菌后的寄主置于一次性塑料杯中，所述的一次性塑料杯经过灭菌处理，将寄主隔离栽培，在330Lx的光照强度下，让栽培的蚕虫草接近于天然生长状态的冬虫夏草，当蚕虫草长到5厘米的长度时，即可采收。
培养箱置于无菌室内，所述的无菌室的温度为20-28℃。
本实施例方法培养出的虫草经检测，含有虫草素4.065mg/g，出草率达到80.7％。
对比例1：
采用中国专利CN102440149A的方法，利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，是需要在熟蚕的皮下组织中注射15μL蛹虫草菌悬液；具体操作为：
(1)蛹虫草菌种寄主的选择
以熟蚕(5龄桑蚕幼虫发育到最后，停止进食桑叶时的蚕幼虫称为熟蚕)为寄主培育蛹虫草，要求熟蚕躯体透明，排出粪便的颜色为浅红色。
(2)蛹虫草菌种制备
在无菌PDA斜面培养基中加入一根生长状态良好的蛹虫草子实体(冷冻保藏或新鲜子实体)，在19℃避光环境下培养，等气生菌丝布满整个斜面后进行光照培养，待气生菌丝完全转黄后，在无菌环境中轻轻刮出菌丝体，加入无菌水后研磨制成蛹虫草菌悬液，蛹虫草菌悬液的浓度为0.1mg/μL(以新鲜菌丝体的质量计)。
(3)低温麻醉及接种
将熟蚕放在冰块上(或在4℃环境中)进行低温麻醉20min，然后通过喷雾的方法用75％酒精对熟蚕的体表进行消毒，用微量注射器在熟蚕的皮下组织中注射15μL蛹虫草菌悬液，接种完后迅速放入无菌塑料盒中，盖上盒盖后即可进行培养。
(4)培养管理
①前期培养管理
先将被接种的熟蚕在19℃避光培养5h，然后依次在4℃避光培养(低温麻醉)10h，在19℃避光培养12h，在4℃避光培养(低温麻醉)4h，在19℃避光培养12h，在4℃避光培养(低温麻醉)4h，在19℃避光培养20h。以上培养过程结束后，即可将已感染且躯体已僵化的熟蚕在无菌环境中检出，轻轻放入另一无菌塑料盒中，在盒盖反面上均匀喷雾适量无菌水后，盖紧盒盖，然后进行蛹虫草的中期培养管理。
②中期培养管理
中期培养要求在避光的条件下培养，通过覆盖黑布等方法遮光；培养温度为19℃，湿度为85％，培养时间以蚕躯体各环节均匀生长出白色菌丝体即可，约为5d。随后进入后期培养管理。
③后期培养管理
后期培养要求在光照的条件下培养，通过日光灯来实现，光照强度为200Lx；培养蛹虫草的塑料盒要求盒盖不能盖严，确保内外通风良好；培养温度为19℃，湿度为85％，培养时间以子实体成熟前期即可，约为50d。
培养结束后，收集蛹虫草，蛹虫草子实体长2～5cm，每条桑蚕躯体上生长3～10个子实体，本对比例方法培养出的虫草经检测，含有虫草素3.35mg/g，出草率仅为40.4％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种的分离与选育：从市售天然冬虫夏草中，筛选出自身比较健壮的虫草菌株，加入一定量的葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物浸泡7天；
(2)感染寄主：选择肤色均匀的5龄桑蚕幼虫和蛹虫作为寄主，在20-23℃，湿度为70-80RH％的培养箱内，将步骤(1)的经过处理后的菌种和寄主一起放入，并200-300nm波长紫外光照射下，照射15-20天，肉眼看见寄主表面长满白色菌丝后，调节紫外光照射波长为100-150nm，继续照射5-10天；
(3)配制营养液：将麦芽糊精20份质量份、燕麦5-8质量份、山楂5质量份、枸杞5-10质量份、黄芪5-10质量份、当归15-20质量份、灵芝10-15质量份用搅拌机切碎混合均匀，再加入1000ml蒸馏水，加热烧开，70-75℃浸提，在0.75kg/CM2高压、120℃灭菌30-50min，得营养液；
(4)蚕虫草的培育和发酵：在步骤(2)的光照培养箱中，将步骤(3)配制得营养液作为发酵液用于寄主的发酵，是将寄主放入营养液内，控制培养箱内的温度湿度不变，采用紫外波长为100-150nm照射30-40天；
(5)无土栽培虫草和采收：把经过步骤(4)发菌后的寄主置于一次性塑料杯中，所述的一次性塑料杯经过灭菌处理，将寄主隔离栽培，在300-350Lx的光照强度下，让栽培的蚕虫草接近于天然生长状态的冬虫夏草，当蚕虫草长到5厘米的长度时，即可采收。
2.根据权利要求1所述的一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，其特征在于，步骤(1)所述的葡萄糖、乙酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和硫酸镁的混合物是按照质量比为2:1:1:1:1混合，加入量为使得虫草菌株可以完全淹没在内即可。
3.根据权利要求1所述的一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，其特征在于，步骤(4)所述的营养液是借助于一个内置容器放入培养箱内部的，所述的内置容器的外部还套接一个外容器，所述的内置容器和外容器通过经过灭菌的螺杆连接在一起，所述的内置容器和外容器之间的空隙内通入循环冷却液体用于保持营养液的恒温。
4.根据权利要求1所述的一种用桑蚕幼虫和蛹虫培养虫草的方法，其特征在于，所述的培养箱置于无菌室内，所述的无菌室的温度为20-28℃。
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