CN108607000A - 尿囊素提取物及尿囊素单体在制备降血脂药物中的应用 - Google Patents

尿囊素提取物及尿囊素单体在制备降血脂药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肉苁蓉尿囊素提取物的纯化工艺，具体包括：大孔树脂的预处理；肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏的制备；肉苁蓉尿囊素提取物的纯化。还公开了尿囊素提取物及尿囊素单体在制备降血脂药物和保健品中的应用。本发明采用大孔树脂进行纯化，该树脂价格较低，且安全性高；本发明通过动物实验证明尿囊素单体和纯化得到的肉苁蓉尿囊素提取物具有降血脂作用，能够制备成降血脂药物。

Description

尿囊素提取物及尿囊素单体在制备降血脂药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种肉苁蓉尿囊素提取物的纯化工艺，还涉及一种肉苁蓉尿囊素提取物及尿囊素单体在制备降血脂药物和保健品中的应用。
背景技术
高脂血症又称高脂蛋白血症，是脂质代谢异常的惯称，主要指血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等水平异常而导致的机体心血管相关疾病，在目前临床上较为常见。随着血脂的升高以及血脂异常时间的延长，它会引发动脉粥样硬化、冠心病、高血压、糖尿病、中风、脂肪肝等多种疾病。近年来的许多研究表明，许多天然化学物中的活性成分在高脂血症的预防和治疗过程中疗效稳定、毒性小，不良反应少，可长期使用。
肉苁蓉(Herba Cistanche)是列当科(Orobanchaceae)肉苁蓉属(Cistanche)植物，肉苁蓉为干燥带鳞叶的肉质茎。多年的探索研究发现肉苁蓉具有保护神经细胞，可增加脑内神经递质的释放，改善脑循环，增强记忆力、防治老年痴呆、保护肝脏及抗衰老等作用。2005年，堵年生等首次从肉苁蓉中分离得到尿囊素，尿囊素是肉苁蓉中一种酰脲类化合物，具有促进皮肤细胞生长，清理坏死组织，促使伤口组织愈合，刺激新的健康组织生长等生理活性，临床上主要用于皮肤干燥皲裂、手部皮炎、胃及十二指肠溃疡等的治疗。但肉苁蓉中尿囊素的含量很低，约为0.5～0.8％左右。因此亟需一种肉苁蓉尿囊素提取物的纯化工艺，从而获得肉苁蓉尿囊素提取物的精制品，将尿囊素单体和尿囊素提取物制备成降血脂药物和保健品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肉苁蓉尿囊素提取物的纯化工艺，从而获得肉苁蓉尿囊素提取物的精制品，以及尿囊素单体和尿囊素提取物在制备降血脂药物和保健品中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种肉苁蓉尿囊素提取物的纯化工艺，具体步骤如下：
(1)大孔树脂的预处理；
(2)肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏的制备；
(3)称取制备好的肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏，用水完全溶解，作为上样液，取经预处理好的大孔树脂，湿法装柱，径高比为1:2～1:10，取上样液以0.5～2ml/min的流速上样，静置吸附2～12小时，用1BV～4BV蒸馏水洗脱，洗至Molish反应呈阴性，再用0.5BV～3BV40％～100％乙醇洗脱，控制洗脱流速为0.5～2ml/min，收集醇洗脱液，减压浓缩后，烘干，得肉苁蓉中尿囊素提取物精制品。
进一步，所述肉苁蓉为列当科肉苁蓉属植物。
优选地，所述大孔树脂为HPD-100、HPD300、HPD-400、HPD-600、D101、D301、S-8或AB-8型大孔树脂。
优选地，所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
优选地，步骤(1)所述的大孔树脂的预处理步骤为：先用70～95％乙醇洗涤至流出的液体与2～5BV蒸馏水混合不显白色浑浊，用蒸馏水洗至中性，再用2％～5％HCl洗脱2～5BV，用蒸馏水洗至中性，然后用2％～5％NaOH洗脱5～10BV，用蒸馏水洗至中性，即得预处理好的大孔树脂。
优选地，步骤(2)所述的肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏的制备步骤为：称取肉苁蓉粉末200g，分别以10倍、8倍量水水浴加热提取两次，每次2h，过滤，合并提取液，减压浓缩至稠膏状，55℃水浴蒸干制成浸膏。
进一步，肉苁蓉尿囊素提取物在制备降血脂药物及保健品中的应用。
优选地，所述药物及保健品包括肉苁蓉尿囊素提取物，以及药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
进一步，肉苁蓉尿囊素提取物在制备预防和/或治疗高血脂症和高血脂症导致的心血管疾病药物及保健品中的应用。
优选地，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、冠心病和脂肪肝。
优选地，所述药物及保健品包括肉苁蓉尿囊素提取物，以及药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
进一步，尿囊素单体在制备降血脂药物及保健品中的应用。
优选地，所述药物及保健品包括尿囊素单体，以及药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
进一步，尿囊素单体在制备预防和/或治疗高血脂症和高血脂症导致的心血管疾病药物及保健品中的应用。
优选地，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、冠心病和脂肪肝。
优选地，所述药物及保健品包括尿囊素单体，以及药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
本发明的有益效果是：本发明采用大孔树脂纯化肉苁蓉中尿囊素提取物，此法操作简单，设备投入少；本发明用到的洗脱剂为乙醇，价格便宜，成本低，安全性高；本发明采用大孔树脂进行纯化，该树脂价格较低，且安全性高。本发明通过动物实验证明尿囊素单体及通过纯化得到的肉苁蓉尿囊素提取物具有降血脂作用，能够制备成降血脂药物和相应的保健品。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
1.图1为本发明肉苁蓉中尿囊素泄漏曲线；
2.图2为本发明肉苁蓉中尿囊素提取物上样质量浓度对吸附率的影响；
3.图3为本发明乙醇体积分数对洗脱率的影响；
4.图4为本发明正常组大鼠肝脏组织结构HE×20；
5.图5为本发明模型组大鼠肝脏组织结构HE×20；
6.图6为本发明血脂康组大鼠肝脏组织结构HE×20；
7.图7为本发明尿囊素单体组大鼠肝脏组织结构HE×20；
8.图8为本发明尿囊素提取物高剂量组大鼠肝脏组织结构HE×20；
9.图9为本发明尿囊素提取物中剂量组大鼠肝脏组织结构HE×20；
10.图10为本发明尿囊素提取物低剂量组大鼠肝脏组织结构HE×20。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1肉苁蓉中尿囊素提取物的大孔树脂纯化工艺
Ⅰ、肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏制备
肉苁蓉药材粉碎，过30目筛。称取肉苁蓉粉末200g，分别以10倍、8倍量水水浴加热提取两次，每次2h，过滤，合并提取液，减压浓缩至稠膏状，55℃水浴蒸干制成浸膏，得到浸膏61.7g，浸膏得率30.85％。
Ⅱ、尿囊素含量测定HPLC色谱条件
Hypersil BDS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-水溶液(0.4：99.6)为流动相，尿囊素检测波长224nm，流速0.5mL/min，柱温30℃。
Ⅲ、大孔树脂的预处理
分别将AB-8，S-8，NKA-9，SP70，XAD-5，D-201，D-301，HPD-100，HPD-300，HPD-400型号的十种大孔树脂，先用70～95％乙醇洗涤至流出的液体与2～5BV蒸馏水混合不显白色浑浊，用蒸馏水洗至中性，再用2％～5％HCl洗脱2～5BV，用蒸馏水洗至中性，然后用2％～5％NaOH洗脱5～10BV，用蒸馏水洗至中性，即得预处理好的大孔树脂。
Ⅳ、树脂的筛选
取经预处理的上述十种大孔树脂各1g，置于锥形瓶中，称取制备好的肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏，用水完全溶解，测浓度，分别加入已测浓度为5mg/ml的尿囊素提取溶液15ml，封口后放于恒温培养振荡器中(25℃，100r/min)，振荡吸附24h后抽滤，滤液用蒸馏水定容至25ml，取定容后的液体按步骤Ⅱ测定肉苁蓉中尿囊素含量与树脂的吸附率。将上述吸附后的树脂置锥形瓶中，加入95％的乙醇15ml，封口后放于恒温培养振荡器中(25℃，100r/min)，振荡吸附2h后抽滤，滤液用95％的乙醇定容至25ml，取定容后的液体按步骤Ⅱ测定肉苁蓉中尿囊素含量与树脂的解析率，结果见表1。
表1十种大孔树脂对尿囊素的吸附率和解吸率
根据吸附率和解析率，选择AB-8型大孔树脂。
Ⅴ、泄漏曲线测定
称取处理好的AB-8大孔树脂8g置于树脂柱中(径高比1:10)，取6.79mg/ml尿囊素提取液240ml上样，吸附流速1ml/min。每隔1BV收集1次流出液，将收集的30份流出液每相邻两份两两合并，减压浓缩至10ml，按步骤Ⅱ测定尿囊素质量浓度。以流出液份数为横坐标，尿囊素质量浓度为纵坐标绘制动态吸附曲线。由图1可知，6BV达到饱和吸附，8BV起几乎完全开始泄漏。以6BV计算，即1g树脂最大动态吸附约40.74mg肉苁蓉中尿囊素提取物。
Ⅵ、单因素试验考察
①上样浓度考察
将15ml不同质量浓度的样品液(0.5074，5.074，10.26，50.86，69.82mg/ml)分别通过AB-8树脂柱(径高比1：10)，以1ml/min的流速进行动态吸附，收集流出液定容至15ml，按步骤Ⅱ测定尿囊素质量浓度，计算吸附率。由图2可知，上样质量浓度小于10mg/ml时，吸附率随着上样质量浓度的增大而升高；而上样质量浓度大于10mg/ml时，吸附率随着上样质量浓度的增大而急剧下降，当上样质量浓度为10.26mg/ml时吸附率达到最高。
②水洗用量考察
称取处理好的AB-8大孔树脂8g置于树脂柱中，径高比1:10(1BV＝8ml)，取10.26mg/ml样品液24ml，以1ml/min的流速进行动态吸附，吸附完全后加6BV蒸馏水洗脱多糖类杂质，收集洗脱液，每1BV为1份，进行Molish反应。结果水洗用量为4BV时Molish反应阴性，说明树脂表面的多糖已基本除尽，故确定水洗用量4BV。
③洗脱剂浓度考察
称取8g处理好的AB-8大孔树脂装柱，取10.26mg/ml样品液24ml，以1ml/min的流速进行动态吸附，吸附完全后加4BV水洗脱除杂，再分别用10BV体积分数分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％、100％的乙醇以1ml/min速度洗脱，分别收集10BV醇洗脱液并浓缩至10ml，按步骤Ⅱ测定每份醇洗脱液中尿囊素质量浓度，计算洗脱率。由图3可知，乙醇体积分数越大，洗脱率越高，当乙醇体积分数为100％时，洗脱率达最大值63.56％，故选用无水乙醇。
④洗脱剂用量考察
取8g处理好的AB-8大孔树脂按上述最佳条件装柱、上样，加4BV水洗脱，再加10BV无水乙醇以1ml/min流速洗脱，每1BV收集1份洗脱液，按步骤Ⅱ测定每份洗脱液中尿囊素质量浓度，计算洗脱率。结果当无水乙醇用量为1BV，2BV，3-10BV时，肉苁蓉中尿囊素洗脱率分别为60.8％，0.9％，0，说明1BV无水乙醇可将肉苁蓉中尿囊素几乎全部洗脱出来，故选用1BV无水乙醇洗脱。
⑤吸附流速考察
称取处理好的AB-8大孔树脂8g置于树脂柱中(径高比1:10)，取3份10.26mg/ml样品液分别上样，吸附流速分别为1ml/min，2ml/min，3ml/min，吸附完全后，按上述最佳洗脱条件洗脱并收集洗脱液，并按步骤Ⅱ测定各流速下吸附后尿囊素质量浓度，计算吸附率。结果当吸附流速为1ml/min，2ml/min，3ml/min，吸附率分别为52％，50.4％，32.7％，随着吸附流速的增大，吸附率逐渐降低，故选用1ml/min作为吸附流速。
⑥洗脱速度考察
取处理好的AB-8大孔树脂按上述最佳条件装柱、上样，加4BV水洗脱除杂，再加1BV无水乙醇分别以1ml/min，2ml/min，3ml/min的流速进行洗脱，收集各流速下1BV醇洗脱液，并按步骤Ⅱ测定其洗脱液中尿囊素质量浓度。再分别精密量取各洗脱流速的醇洗脱液5ml于55℃水浴蒸干，得干燥物并称重，计算洗脱率分别为61.6％，55.3％，53.7％。结果表明，洗脱流速越快，洗脱率越低，故将1ml/min作为洗脱流速。
⑦树脂柱径高比
分别称取处理过的AB-8大孔树脂适量置于同样型号树脂柱中，使树脂柱径高比分别为1:5，1:10，1:15。按上述优选的纯化工艺上样与洗脱，收集醇洗脱液，按步骤Ⅱ测定其中尿囊素含量，计算洗脱率分别为60.8％，63.7％，59.7％。结果表明，树脂柱径高比为1:10时，肉苁蓉中尿囊素洗脱率最高。
Ⅶ、肉苁蓉中尿囊素纯化工艺正交试验
根据考察单因素的影响，以肉苁蓉中尿囊素纯度为考察指标，选取上样液质量浓度、乙醇体积分数、洗脱流速、径高比4个因素进行考察，每个因素设计3个水平，因素水平见表2。采用L9(34)正交法进行试验，收集洗脱液，减压浓缩，测定尿囊素含量，计算肉苁蓉中尿囊素纯度，试验安排及结果见表3，方差分析见表4。
表2肉苁蓉中尿囊素大孔树脂纯化工艺优选正交试验因素水平
表3肉苁蓉中尿囊素大孔树脂纯化工艺优选正交试验安排及直观分析
表4方差分析
注：F0.01(2,2)＝99。
由直观分析可知，各因素对试验结果的影响顺序为A>D>B>C。方差分析表明因素A，B，D对纯化工艺的影响非常显著，确定最佳纯化工艺为A2B3D2C2，即上样液质量浓度10mg/ml，乙醇体积分数100％，洗脱流速1ml/min，径高比1:10。
VIII、工艺验证及放大试验
准确称量肉苁蓉粉末2000g，分别以10倍、8倍量水加热，80℃条件下提取两次，合并提取液并减压浓缩。水提液按照优化的工艺，通过AB-8型大孔吸附树脂柱纯化，按步骤Ⅱ测肉苁蓉中尿囊素纯化前后的峰面积，计算纯度。纯化前肉苁蓉中尿囊素纯度1.09％，纯化后肉苁蓉中尿囊素纯度20.01％(n＝3，RSD＝1.51％)，说明该工艺合理、稳定、可行。
实施例2肉苁蓉尿囊素提取物降血脂作用动物实验
肉苁蓉(2015年3月采自新疆吉木萨尔沙漠地区)，品种由新疆医科大学杨建华教授鉴定为盐生肉苁蓉(C.salsa)，凭证标本保存在新疆医科大学生药学教研室。血脂康胶囊(北京北大维信生物科技有限公司，批号：20150101)；总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒，谷丙转氨酶(ALT)试剂盒，谷草转氨酶(AST)试剂盒，碱性磷酸酶(ALP)试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，批号141715018；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，丙二醛(MDA)试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒，总脂酶试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号20151128；水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号20120718)；胆固醇(上海蓝季科技发展有限公司，批号：20150615)；胆盐(上海蓝季科技发展有限公司，批号：20150512)；切片石蜡(上海标本模型厂，批号：20140218)。
Wistar大鼠(200±20g)84只，全雄，由新疆医科大学医学实验动物中心提供，动物实验室为SPF级，室温22℃±2℃，相对湿度50％～70％。实验动物质量合格证号：SCXK(新)2011-0004，实验动物使用许可证号：SYXK(新)2011-0001。
基础饲料：玉米粉22％、麸皮12％、小麦粉25％、油渣18％、鱼粉8％、豆粕12％、食盐0.17％、维生素0.25％、微量元素0.25％、鱼肝油0.33％、石粉2％。
高脂饲料配方：78.8％基础饲料、1％胆固醇、10％蛋黄粉、10％猪油和0.2％胆盐。
采用SPSS16.0软件统计分析数据，实验数据以均数±标准差表示，两组间比较用t检验，P<0.05差异显著，P<0.01差异非常显著，具有统计学意义。
Ⅰ、尿囊素单体的制备
制备尿囊素单体的过程包括：以肉苁蓉为原料，经水或任何比例的醇-水混合溶剂提取，提取液经浓缩，加乙醇沉淀杂质后或不经乙醇沉淀杂质直接通过大孔吸附树脂分离，收集水洗脱部分，将其中含尿囊素的组份再通过颗粒活性炭吸附分离，先以水洗脱，再以10～50％的乙醇洗脱，收集含尿囊素的流份，冷冻干燥，得含尿囊素的提取物，用乙醇或甲醇重结晶得尿囊素单体。
肉苁蓉尿囊素提取物的纯化工艺，步骤如下：
肉苁蓉药材粉碎，过30目筛。取肉苁蓉粉末500g，分别以10倍、8倍量水加热，80℃条件下回流提取两次，合并提取液并减压浓缩。水提液通过AB-8型大孔吸附树脂柱，以4倍柱床体积(1000ml)水洗脱，再用1倍柱床体积(250ml)无水乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至稠膏，再经冷冻干燥得尿囊素提取物粉末30.7g，得率6.14％，含量20.01％。
Ⅱ、建立大鼠实验性高脂血症模型
Wistar大鼠在实验环境下喂饲基础饲料观察5d，按体重随机分为正常对照组(12只)、实验组(72只)。正常对照组给予基础饲料，实验组给予高脂饲料造模，每周称重1次。6周后，大鼠不禁食眼眶取血，测定血清总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，结果实验组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平较正常对照组显著升高，HDL-C水平显著降低，表明大鼠实验性高脂血症模型造模成功，见表5。
表5实验组与正常对照组比较
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。
Ⅲ、动物分组及给药
将72只成模大鼠根据TC水平随机平均分为6组，即高血脂模型组、血脂康对照组(0.1g/kg)，尿囊素单体组(0.2g/kg)，尿囊素提取物低剂量组(0.05g/kg)，尿囊素提取物中剂量组(0.2g/kg)，尿囊素提取物高剂量组(0.8g/kg)。尿囊素提取物各给药组及血脂康、尿囊素单体组每天给药灌胃一次，正常对照组和模型组大鼠给予同体积蒸馏水，连续灌胃6周，除正常对照组给予基础饲料外，其他各组继续用高脂饲料喂养，动物自由饮水。每周称量体重1次，于实验结束禁食(不禁水)12小时，测定各指标。
Ⅳ、尿囊素提取物对高脂血症大鼠体重的影响
在整个试验过程当中，所有实验动物生长状况均表现良好，无异常行为和异常死亡情况发生。如表6所示，实验前各组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)，在高脂饲养12周后，模型组、尿囊素提取物低、中剂量组大鼠体重明显增加，与正常组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，而尿囊素提取物高剂量组、尿囊素单体组以及血脂康组大鼠体重增加缓慢，与正常组比较没有显著性差异(P>0.05)；尿囊素提取物中、高剂量组和尿囊素单体组大鼠体重与模型组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。表明尿囊素提取物中、高剂量及尿囊素单体有抑制大鼠体重增加的作用。
表6尿囊素提取物对大鼠体重变化的影响(n＝12)
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
Ⅴ、尿囊素提取物对高脂血症大鼠血清血脂水平的影响
在末次给药后12h(禁食不禁水)，于10％水合氯醛麻醉(3ml/kg，腹腔注射)下，自大鼠腹主动脉取血，于3500r/min离心10min，取血清，-20℃冷冻保存。测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST与ALP，均用试剂盒于全自动生化分析仪测定；血清SOD的测定采用羟胺法，血清MDA的测定采用硫代巴比妥酸法，血清GSH-PX的测定采用比色法，均用试剂盒测试。
表7显示，模型组、尿囊素提取物低剂量组TC、TG、LDL-C明显增加，而HDL-C含量明显降低，与正常组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，而尿囊素提取物中、高剂量组和尿囊素单体组TC、TG、LDL-C、HDL-C含量，与正常组比较没有显著性差异(P>0.05)；尿囊素提取物低、中、高剂量组和尿囊素单体组大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C含量与模型组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，表明尿囊素提取物低、中、高剂量及尿囊素单体均能明显抑制TC、TG及LDL-C含量的升高，抑制HDL-C含量的降低，对大鼠实验性高脂血症有预防及治疗作用。
表7尿囊素提取物对大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的影响(n＝12)
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
给药治疗后，尿囊素提取物中、低剂量组以及模型组MDA含量明显增加，与正常组比较有显著性差异(P<0.01)，而尿囊素提取物高剂量组和尿囊素单体组MDA含量，与正常组比较无显著性差异(P>0.05)，但与模型组比较有非常显著性差异(P<0.01)。尿囊素提取物中、低剂量组以及模型组SOD活性明显降低，与正常组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，尿囊素提取物中、高剂量组和尿囊素单体组SOD活性，与模型组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。模型组GSH-PX活性较正常组有显著性差异(P<0.01)，而尿囊素提取物高、中、低剂量组及尿囊素单体组GSH-PX活性较正常组无显著性差异(P>0.05)，尿囊素提取物高剂量组及尿囊素单体组GSH-PX活性与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，如表8所示。综上表明尿囊素提取物高剂量及尿囊素单体能明显降低MDA含量，增强血清中SOD活性与GSH-PX活性，说明其可有效抑制体内脂质过氧化产生以及加强对氧自由基的清除，对机体细胞起到一定的保护作用。
表8尿囊素提取物对大鼠血清MDA、SOD、GSH-PX的影响(n＝12)
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
如表9所示，给药治疗后，模型组、尿囊素提取物低剂量组ALT、AST、ALP活性明显升高，与正常组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，而尿囊素提取物中、高剂量组及尿囊素单体组ALT、AST、ALP活性较模型组有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，但与正常组比较无显著性差异((P>0.05))，表明尿囊素提取物中、高剂量及尿囊素单体均能明显降低ALT、AST、ALP活性，对大鼠肝脏具有一定保护作用。
表9尿囊素提取物对大鼠血清ALT、AST、ALP的影响(n＝12)
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
Ⅵ、尿囊素提取物对高脂血症大鼠肝组织血脂相关指标的的影响
大鼠处死解剖取出肝脏后，称取300mg肝组织将其充分研碎，制成10％肝匀浆。3500r/min离心15min，取血清液-20℃保存。脂蛋白酯酶(LPL)、肝脂酶(HL)活性的测定采用比色法，用试剂盒测试。
结果如表10所示，尿囊素提取物中、低剂量组及模型组大鼠血清LPL和HL活性均显著低于正常对照组(P<0.05，P<0.01)，且尿囊素提取物中、低剂量组LPL和HL活性，与模型组比较没有显著性差异(P>0.05)。尿囊素提取物高剂量组和尿囊素单体组LPL和HL活性较模型组有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，但与正常组比较无显著性差异((P>0.05))，表明尿囊素提取物高剂量和尿囊素单体能明显升高LPL、HL活性，对高脂血症的发生具有一定预防作用。
表10尿囊素提取物对大鼠肝组织血脂相关指标的影响(n＝12)
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
Ⅶ、大鼠的脏体比与脂体比
大鼠处死解剖称取心，肝，脾，肺，肾，睾丸及肾周脂、睾周脂的重量(脏器在-80℃温度下保存)，并求得脏体比(脏器湿重/大鼠体重×100％)和脂体比[(肾周脂+睾周脂)/大鼠体重×100％]。
表11显示，各给药组及模型组大鼠心、脾、肺、肾、睾丸等脏器重量及其脏器指数与正常对照组比较无统计学差异(P>0.05)，但除尿囊素提取物低剂量组外，其他各给药组大鼠肝脏的重量及肝脏指数与模型组相比有显著性差异(P<0.05)，表明高脂血症对大鼠心、脾、肺、肾、睾丸无影响，对肝脏有较大的影响，而尿囊素提取物中、高剂量和尿囊素单体可缓解大鼠肝脏受损，具有一定的肝脏保护作用。
表11大鼠的各脏器重量与脏体比(n＝12)
注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。
由表12可知，模型组、尿囊素提取物低剂量组大鼠肾周脂、睾周脂及脂体比，与正常组比较有非常显著性差异(P<0.01)，尿囊素提取物低剂量组大鼠肾周脂、睾周脂及脂体比较模型组没有显著性差异(P>0.05)；尿囊素提取物中、高剂量组和尿囊素单体组大鼠肾周脂、睾周脂及脂体比，与模型组比较有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，而尿囊素提取物高剂量和尿囊素单体组大鼠肾周脂、睾周脂及脂体比较正常组无显著性差异(P>0.05)，表明尿囊素提取物中、高剂量和尿囊素单体可有效减少肾周及睾周脂肪的生成，缓解高脂血症症状。
表12大鼠的肾周脂、睾周脂的重量及脂体比(n＝12)
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
Ⅷ、大鼠肝脏病理形态学观察
在肝脏最大叶距边缘0.5cm处取肝组织(约0.5cm×0.5cm×0.5cm)，用4℃磷酸缓冲液(0.01M PBS，pH＝7.3)冲洗，浸泡于10％甲醛溶液过夜，经脱水、石蜡包埋及切片后得到约4μm的切片，HE染色后至显微镜观察大鼠肝脏病理变化。
肉眼观察：正常对照组大鼠肝脏呈红褐色、色泽鲜亮，形态规则，质地均匀且富有弹性；模型组肝脏色泽泛黄且无光泽，体积明显较正常组增大，触之有油腻感，切面呈花斑状；血脂康组、尿囊素单体组肝组织颜色较红，表面光滑，质地接近于正常对照组；尿囊素提取物低剂量组肝组织颜色呈灰黄色，有较多花斑，表面光滑有油腻感，质地松软，光泽度差，但体积较模型组减小；尿囊素提取物高剂量、中剂量组肝组织颜色与正常对照组颜色相似，光泽度较好，体积较模型组显著减小且质地较均匀。
光镜检查：正常组大鼠肝无异常，肝窦清晰可见，肝索排列整齐，肝细胞形态排列正常，细胞中央有大而圆的核，肝小叶规则，细胞质均匀(图4)；模型组肝细胞内可见大量大小不等白色脂滴，脂滴密布于整个胞浆中，肝脏出现明显的弥漫性脂肪变性，肝细胞排列紊乱(图5)；血脂康组与尿囊素单体组肝细胞形态排列较为整齐，细胞核清晰可见，较模型组组有明显的改善，肝脏脂肪变性显著减轻(图6、7)；尿囊素提取物低、中、高剂量组肝脏脂肪变性程度依次有所减轻，中、高剂量组脂滴较模型组明显减少，细胞排列相对整齐(图8、9、10)。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种肉苁蓉尿囊素提取物的纯化工艺，其特征在于，具体步骤如下：
(1)大孔树脂的预处理；
(2)肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏的制备；
(3)称取制备好的肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏，用水完全溶解，作为上样液，取经预处理好的大孔树脂，湿法装柱，径高比为1:2～1:10，取上样液以0.5～2ml/min的流速上样，静置吸附2～12小时，用1BV～4BV蒸馏水洗脱，洗至Molish反应呈阴性，再用0.5BV～3BV 40％～100％乙醇洗脱，控制洗脱流速为0.5～2ml/min，收集醇洗脱液，减压浓缩后，烘干，得肉苁蓉中尿囊素提取物精制品。
2.根据权利要求1所述的一种肉苁蓉尿囊素提取物的纯化工艺，其特征在于，所述肉苁蓉为列当科肉苁蓉属植物。
3.根据权利要求1所述的一种肉苁蓉中尿囊素提取物的纯化工艺，其特征在于，步骤(1)所述的大孔树脂的预处理步骤为：先用70～95％乙醇洗涤至流出的液体与2～5BV蒸馏水混合不显白色浑浊，用蒸馏水洗至中性，再用2％～5％HCl洗脱2～5BV，用蒸馏水洗至中性，然后用2％～5％NaOH洗脱5～10BV，用蒸馏水洗至中性，即得预处理好的大孔树脂。
4.根据权利要求1所述的一种肉苁蓉中尿囊素提取物的纯化工艺，其特征在于，步骤(2)所述的肉苁蓉中尿囊素提取物浸膏的制备步骤为：称取肉苁蓉粉末200g，分别以10倍、8倍量水水浴加热提取两次，每次2h，过滤，合并提取液，减压浓缩至稠膏状，55℃水浴蒸干制成浸膏。
5.肉苁蓉尿囊素提取物在制备降血脂药物及保健品中的应用。
6.根据权利要求5所述的肉苁蓉尿囊素提取物在制备降血脂药物及保健品中的应用，其特征在于，所述药物及保健品包括肉苁蓉尿囊素提取物，以及药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
7.肉苁蓉尿囊素提取物在制备预防和/或治疗高血脂症和高血脂症导致的心血管疾病药物及保健品中的应用。
8.根据权利要求7所述的肉苁蓉尿囊素提取物在制备预防和/或治疗高血脂症和高血脂症导致的心血管疾病药物及保健品中的应用，其特征在于，所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、冠心病和脂肪肝。
9.根据权利要求7所述的肉苁蓉尿囊素提取物在制备预防和/或治疗高血脂症和高血脂症导致的心血管疾病药物及保健品中的应用，其特征在于，所述药物及保健品包括肉苁蓉尿囊素提取物，以及药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
10.尿囊素单体在制备降血脂药物及保健品中的应用。
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