CN108602048B

CN108602048B - 分离介质

Info

Publication number: CN108602048B
Application number: CN201680073137.7A
Authority: CN
Inventors: C·J·菲; S·迪马蒂诺; T·胡贝尔
Original assignee: University of Canterbury
Current assignee: University of Canterbury
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: US11065601B2; EP3389853A1; JP6885611B2; JP2018537283A; CN108602048A; WO2017103863A1; US20180369785A1; EP3389853B1; EP3389853A4

Abstract

本发明涉及用来从含有悬浮固体的进料流分离分析物的分离介质、使用分离介质进行分离的方法，以及分离介质从含有悬浮固体的进料流分离分析物的用途。分离介质提供为具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构的水凝胶，所述水凝胶包含至少一种与至少一种目标分析物结合的配体。

Description

分离介质

技术领域

本发明总体上涉及一种包含水凝胶的分离介质，所述水凝胶具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构，所述分离介质可用来从进料流分离目标分析物，例如期望的生物分子。

背景技术

生物分子是活体内存在的分子，包括像蛋白、多糖、脂质和核酸这样的大分子，以及像初级代谢产物、次级代谢物和天然产物这样的小分子。

目前在工业和医学中对生物分子（包括生物制药或生物制剂）的用途存在巨大的兴趣。生物制药是在生物来源中制造、从生物来源提取、或从生物来源半合成的医药产品。

医学中有兴趣的生物分子包括抗体（重组抗体、天然抗体、人源化抗体、多克隆抗体和单克隆抗体）、治疗蛋白（例如胰岛素、生长因子，以及对付贫血、类风湿性关节炎和癌症的疗法）、生长因子、疫苗、病毒、类病毒颗粒、DNA（质粒和其它）和RNA。

其它有兴趣的生物分子包括乳制品营养品和像乳铁蛋白这样的其它高价值蛋白。

所期望的生物分子经常通过从含有其的进料流色谱分离来获得。但是，色谱分离还可用来从复合进料流除去不希望的生物分子，例如从牛奶除去β-乳球蛋白，或者从含有重组产生的治疗蛋白的发酵液除去水解蛋白。

标准色谱分离技术的一个缺点是在目标分析物可被分离之前甚至低浓度的悬浮固体也需要从进料流除去。

例如，含有生物分子的进料流经常包含发酵液或细胞培养物，其含有细胞碎片和其它固体。首先必须通过离心步骤和/或过滤步骤将这些悬浮固体除去，以防止堵塞进料流要穿过的色谱介质。

这些附加处理步骤会大大增加生产时间和成本。

另外，离心步骤和/或过滤步骤会导致目标分析物总产率的损失。在目标分析物是不稳定化合物的情况下，更多的处理会增加对变性条件（高剪切应力和升高的温度）和工艺物料流中存在的蛋白酶的曝露。因此，分析物活性和总的产物产率均被降低。

因此，对可用来从进料流、特别是含有悬浮固体的进料流分离目标分析物、特别是生物分子的其它分离介质和方法存在需求。

本发明的目的是至少部分满足这一需要，并且/或者至少为公众提供有用选项。

发明内容

本发明总体上涉及用来从含有悬浮固体的进料流分离分析物的水凝胶，以及分离方法。

在一个方面，本发明提供一种包含水凝胶的分离介质，所述水凝胶具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构，所述水凝胶包含至少一种与至少一种目标分析物结合的配体。

在一个实施例中，水凝胶结构选自包含以下的群组：舍恩螺旋状结构、施瓦茨菱形结构、施瓦茨初级结构，以及舍恩IWP结构。

在一个实施例中，水凝胶结构为螺旋状结构或施瓦茨菱形结构。

在一个方面，本发明提供一种分离介质，其包含螺旋状结构的水凝胶，所述水凝胶包含至少一种与至少一种目标分析物结合的配体。

在以上方面：

在一个实施例中，所述配体特定地和/或优选地与至少一种目标分析物结合。

在一个实施例中，所述水凝胶为多糖水凝胶。在一个实施例中，所述水凝胶是热敏性的。优选地，所述水凝胶包含琼脂糖或纤维素。

在另一个方面，本发明涉及包含本发明分离介质的色谱装置。在一个实施例中，所述色谱装置为色谱柱。

在另一个方面，本发明涉及本发明的分离介质通过将分离介质与进料流接触将至少一种目标分析物从进料流分离的用途。

在另一个方面，本发明涉及本发明的分离介质通过在容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件下将分离介质与进料流接触从而将至少一种目标分析物从进料流分离的用途。

在另一个方面，本发明涉及本发明的分离介质通过将分离介质与进料流接触将至少一种目标分析物与分离介质结合从而将至少一种目标分析物从进料流分离的用途。

在另一个方面，本发明涉及将至少一种目标分析物从进料流分离的方法，其包含将本发明的分离介质与进料流接触。

在另一个方面，本发明涉及将至少一种目标分析物从进料流分离的方法，其包含在容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件下将本发明的分离介质与进料流接触。

在另一个方面，本发明涉及将至少一种目标分析物从进料流分离的方法，其包含将本发明的分离介质与进料流接触从而将所述至少一种目标分析物与分离介质结合。

在一个实施例中，所述用途或方法还包含从分离介质回收至少一种目标分析物，或者回收与分离介质结合的至少一种目标分析物。

在另一个方面，本发明涉及用来降低进料流中至少一种目标分析物的浓度的方法，其包含：

（a）将本发明的分离介质与进料流接触，以及

（b）回收进料流。

（a）在容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件下将本发明的分离介质与进料流接触，以及

（b）回收进料流。

（a）将本发明的分离介质与进料流接触从而将所述至少一种目标分析物与分离介质结合，以及

（b）回收进料流。

在另一个方面，本发明涉及通过本发明的方法产生的产物。在另一个方面，本发明涉及通过本发明的方法获得的产物。

在以上各方面：

在一个实施例中，所述产物为含有目标分析物的组合物。在另一个实施例中，所述产物为进料流，其含有相较于与本发明的分离介质接触之前的进料流而言浓度降低的目标分析物。

在一个实施例中，所述进料流含有悬浮固体。

在提及专利说明书、其它外部文件、或其它信息来源的本说明说中，这总体上是为了讨论本发明的特征而提供上下文的目的。除非明确地另外指出，否则提及这些外部文件不应被理解为承认这种文件、或这种信息来源在任何司法管辖区内是现有技术，或者形成本领域公知常识的一部分。

提及本文所公开的数字范围（例如1到10）旨在同样包括提及该范围内的所有有理数字（例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10），并且同样包括该范围内的有理数字的任何范围（例如2到8、1.5到5.5和3.1到4.7），因此本文明确公开的所有范围的所有子范围在此被明确地公开。这些仅仅是特定意指的实例，并且所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合均应被看作以类似的方式在本申请中被明确地声明。

对于本发明相关领域的技术人员，将在不偏离如所附权利要求书所限定的本发明范围的情况下表明许多结构改变和本发明的不同实施例和应用。此处的公开内容和描述仅仅是说明性的，在任何意义上都并非旨在进行限制。

附图简要说明

图1是一系列图片，其描绘：（a）和（b）两种不同螺旋状结构的实例，（c）螺旋状结构，其具有通过流动路径支化导致的变化的孔隙度；（d）双螺旋状结构，其包含两个独立的流动通道和单独的固定相；（e）螺旋状结构，其包含直径统一的两个独立流动通道和三种独立的固定相材料。

图2是显示由sin(x)∙cos(y) + sin(y)∙cos(z) + sin(z)∙cos(x) < G定义的螺旋状结构的孔隙度与常数G之间的关系的图表。

图3是3D打印的由sin(x)∙cos(y) + sin(y)∙cos(z) + sin(z)∙cos(x) < 0定义的螺旋状单一整块的图片。

图4是基于纤维素和琼脂糖的凝胶的一系列SEM显微照片，所述凝胶具有50%的添加的纤维素粉末和各种水平的化学交联。显示在丙酮中储存接着在水中储存随后进行冷冻干燥之后的凝胶。显微照片显示水凝胶的内部孔隙度，而不是螺旋状结构的通道。

图5是显示制备本发明分离介质的方法的图表。

图6是两张本发明分离介质的光学显微照片，其显示螺旋状结构的通道。

图7是色谱装置（Snap柱）的图片，在Snap柱中包含琼脂糖螺旋状结构，所结合的细胞色素C给出红色。Snap是“Essential Life Solutions Ltd”的注册商标，“EssentialLife Solutions Ltd”的地址为308 Tosca Drive，Stoughton，MA 02072。

图8是显示从BSA和酵母细胞分离细胞色素C的色谱图。

图9显示从色谱分析法收集的各级分的SDS PAGE凝胶。1：样品上样。2-10：流穿峰。11-17：洗脱峰。L：Novex Sharp Protein Standard的梯度。

图10是显示凝胶上第2-17道的BSA和细胞色素C带的相对带强度的图。

图11是显示对如实例4所述上样到本发明的DEAE琼脂糖柱上的2.5 mg/ml的BSA进行分离的色谱图。

图12是显示对如实例4所述上样到DEAE琼脂糖柱上的2.5 mg/ml的BSA和1.0 mg/ml的细胞色素C进行分离的色谱图。

图13是BSA和细胞色素C级分的SDS PAGE凝胶，其中ON=带有样品：L=梯度：1-2=流穿峰；3-7=冲洗未结合的样品：8-14=洗脱液。

图14是上样到琼脂糖DEAE柱上的BSA、酵母、酵母+BSA样品在600 nm处的吸光度的色谱图。

图15是苄胺琼脂糖柱上的α-乳清蛋白的色谱图。对280 nm和600 nm处的吸光度进行分析，单个步骤中添加100%的洗脱缓冲液。

图16是显示在用来仅仅捕获α-乳清蛋白、酵母，以及在酵母的存在下捕获α-乳清蛋白的苄胺琼脂糖柱上进行的试验在280 nm处的吸光度的色谱图。

图17是显示在用来仅仅捕获α-乳清蛋白、酵母，以及在酵母的存在下捕获α-乳清蛋白的苄胺琼脂糖柱上进行的试验在600 nm处的吸光度的色谱图。

图18是结合到施瓦茨D阳离子交换器上的细胞色素C的色谱图。

图19是施瓦茨D琼脂糖阳离子交换器上的细胞色素C、酵母，以及细胞色素C加酵母在280 nm处的UV吸光度的色谱图。

图20是施瓦茨D琼脂糖阳离子交换器上的细胞色素C、酵母，以及细胞色素C加酵母在600 nm处的UV吸光度的色谱图。

图21是结合在舍恩螺旋状纤维素阳离子交换器上的细胞色素C的色谱图。

图22是舍恩螺旋状纤维素阳离子交换器上的细胞色素C、酵母，以及细胞色素C加酵母在280 nm处的UV吸光度的色谱图。

图23是舍恩螺旋状纤维素阳离子交换器上的细胞色素C、酵母，以及细胞色素C加酵母在600 nm处的UV吸光度的色谱图。

5.具体实施方式

5.1 定义

如本文所使用的术语‘包含’意思是‘至少部分由...组成’。当在包括术语‘包含（comprising）’的该说明书和权利要求书中对各陈述进行解释时，每个陈述中除了前面带有该术语的特征之外还可存在其它特征像‘包含（comprise）’和‘包含（comprised）’这样的相关术语应以类似方式解释。

如本文所使用的术语“孔隙度”意思是空的部分或空的空间，并且是总的空隙体积占总体积的分数，以百分比表示。

术语“分析物”在本文中如本领域普通技术人员所已知和理解进行使用，并且是指有兴趣的化合物、物质或化学组成。分析物优选为生物分子。

术语“非目标分析物”在本文中如本领域普通技术人员所已知和理解进行使用，并且是指不感兴趣的化合物、物质或化学组成。例如，非目标分析物可以是细胞培养物或细胞裂解物中的蛋白、核酸、脂质或其它细胞组成。非目标分析物旨在穿过本发明的分离介质而不与分离介质结合，或者以比目标分析物更低的特异性或更低的结合亲和力与分离介质结合，以便非目标分析物可使用技术人员容易确定的洗脱条件或洗涤条件（但不限于其）从分离介质除去。

如本文所使用的术语“结合”是指两种物质之间的连接，并且包括共价键、氢键、范德华力、极性力或静电力和离子键。所述两种物质通常是指溶液（流动相）中存在的分子和色谱基质（固定相）上存在的配体。

如本文针对配体和目标分析物所使用的术语“优选结合”意思是目标分析物以比非目标分析物更高的效率与配体结合。

如本文针对配体和目标分析物所使用的术语“特定结合”意思是只有目标分析物与配体结合。

如本文所使用的术语“在容许所述目标分析物与...结合的条件下”是指流动相在其pH、离子强度、组成、温度、粘度和密度方面容许分析物与配体之间进行相互作用的条件。

如本文所使用的术语“结合亲和力”是指分析物与配体结合的亲和力。对给定的分析物-配体对的结合亲和力进行检测的各种方法在本领域中是已知的。据信，本领域技术人员可使用这种方法来确定分析物对配体的结合亲和力是常规事件。

如本文所使用的术语“三维周期性极小曲面”意思是可使用小块表面通过取基础部分并在空间的三个独立方向转移各个拷贝来组成整个表面。

本发明的分离介质

将目标分析物从含有悬浮固体的进料流直接分离需要为分析物的结合提供足够的表面积同时容许悬浮固体自由通过的分离介质。

已知分离技术的一个主要缺点是在许多目标分析物可使用目前可用的方法回收之前需要对进料流进行预处理或预过滤。

发明人令人惊讶地发现，获得流动相的最佳流动模式同时仍保持目标分析物的分离介质是具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构、特别是舍恩螺旋状结构的水凝胶。

舍恩螺旋状结构的表面通过一个复杂的数学公式来限定，所述数学公式可通过以下表达式近似计算：

sin(x)cos(y) + sin(y)cos(z) + sin(z)cos(x) = G

其中x、y和z是笛卡儿坐标系统中介质中各点的位置，G为任意常数。当“=”符号替代为“<”符号时，那么该表达式将区分空间中两个分离的区域，其界面通过以上原始方程限定。然后所述两个区域被区分为多孔性固体和空隙（流动通道）。任意常数G是确定介质几何体中固体和空隙（流动通道）部分的相对体积分数的任意常数。可通过改变该方程的常数和函数来制备一系列螺旋状结构。图1给出了非限制性实例。

因此，本发明的分离介质包含螺旋状结构的水凝胶，所述水凝胶包含至少一种会与目标分析物结合的配体。

螺旋状结构的水凝胶在固定相的配体与流动相中的分析物之间提供足够的接触以实现结合，同时容许悬浮固体通过。

在一个实施例中，螺旋状结构由以下方程定义：

sin(x)cos(y) + sin(y)cos(z) + sin(z)cos(x) < G其中x、y和z是笛卡儿坐标系统中介质中各点的位置，G在-1.413与1.413之间，优选在约-1.4到约1.4之间，更优选在约-0.5到约0.5之间。该不等式表明，固定相在方程的左手侧比G小的情况下所限定的体积内的坐标x、y和z处打印，留下的左手侧等于或大于G的位置将由流动通道（流动相）组成。

在一个实施例中，G为0。

在一个实施例中，通过水凝胶的互联通道限定螺旋状结构，直径为约5到约500mm，优选为约10到约250 mm。

可限定其它类型的三维周期性极小曲面，并用作本发明中的几何体。另一种类型的三维周期性极小曲面是由以下方程限定的施瓦茨原始几何形状：

cos(x) + cos(y) + cos(z) < G其中x、y、z和G如以上所定义。

另一种类型的三维周期性极小曲面是由以下两个方程中任一个所限定的施瓦茨菱形几何形状：

cos(x)cos(y)cos(z)-sin(x)sin(y)sin(z)<G

或者

sin(x)sin(y)sin(z)+sin(x)cos(y)cos(z)+cos(x)sin(y)cos(z)+cos(x)cos(y)sin(z)<G

其中x、y、z和G如以上所定义。

另一种类型的三维周期性极小化结构是由以下方程所限定的舍恩IWP几何形状：

2[cos(x)cos(y)+cos(x)cos(z)+cos(y)cos(z)]-[cos（2x）+cos（2y）+cos（2z）]<G

其中x、y、z和G如以上所定义。

螺旋状结构天然存在（例如蝴蝶翅膀、线粒体膜、嵌段共聚物和水脂质相），但是仅仅在纳米尺度下并且在高度特定的条件下天然形成。本发明涉及水凝胶，其在微尺度下具有螺旋状结构或其它三维周期性结构。

水凝胶的特征在于孔隙大小在纳米范围（<1 mm）内的内部孔隙度。这些内孔的大小比孔径和/或通道大小在微米范围（即微尺度）内的螺旋状结构的几何特征小得多。

在一个实施例中，本发明的色谱介质包含水凝胶，其具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构，孔隙度为约10到约90%，优选为约50到约90%，更优选为约30到约70%。

在一个实施例中，本发明的色谱介质包含螺旋状结构的水凝胶，孔隙度为约10到约90%，优选为约50到约90%，更优选为约30到约70%。

术语“螺旋状结构”或“舍恩螺旋状”包括其中两个独立的螺旋状通道网络被固定相分离（反之亦然）的结构。

本发明的分离介质提供完美控制的流动部分，其不受颗粒几何形状或随机装填程序的限制。包含具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构的水凝胶的分离介质容许快速色谱处理含有悬浮固体颗粒的大体积进料流，而不需要进行预处理。在一个实施例中，水凝胶为螺旋状结构。

这要归功于各种特征的组合，所述特征包括（a）通道中高的自由体积，用来通过载有固体的进料，（b）高的固定相表面积（即高的目标分析物吸附能力），（c）统一的通路长度，用来在介质整个长度的流动相和固定相中进行扩散，以及（d）没有闭端区域和最小再循环区域，其会最小化污染风险并减小在适当位置清洗的要求。

这些特性意味着压降被减小，结构在高剪切条件下是机械稳定的，并且固/液接触被改进。

在一个方面，本发明提供包含纤维素或琼脂糖水凝胶的分离介质，所述水凝胶具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构，其中所述结构的通道的直径为约5到约500 mm，并且所述水凝胶具有约50到约90%的孔隙度，所述水凝胶包含至少一种与至少一种目标分析物结合的配体。

在一个方面，本发明提供包含螺旋状结构的纤维素或琼脂糖水凝胶的分离介质，其中螺旋状通道的直径为约5到约500 mm，并且所述螺旋状结构具有约50到约90%的孔隙度，所述水凝胶包含至少一种与至少一种目标分析物结合的配体。

本发明的分离介质的制备

本发明的分离介质通过将水凝胶形成溶液凝固为螺旋状结构的水凝胶来制造。水凝胶的选择取决于获得螺旋状结构的方式，这是由于一些水凝胶更适合特定的成形技术。

在一个实施例中，分离介质使用负模板制备，其中常规3D打印机使用塑料或其它合适的材料制造所期望的螺旋状结构的负模具。优选为丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）。然后向模具中灌输水凝胶形成溶液，其然后胶凝，形成固体水凝胶。然后将模板用（针对ABS）丙酮容易地溶解，留下具有期望的3D结构的水凝胶介质。可将该材料插入色谱柱中，用来从含有悬浮固体的进料流分离目标分析物。

该技术的分辨率仅受用来制造模具的3D打印机可获得的分辨率的限制。因此，壁和通道的大小、弯曲度和厚度可全部随意改变。另外，可制备包含多个独立流动通道的水凝胶，并且同一分离介质中的孔隙度可不同。

螺旋状几何形状相对于通道中流动主轴的相对方向可提供优选的轴向（或者接近轴向）流动通过空隙，或者可处于与该轴的一个角度以有利于不同流动路径的互连，或者任何其它中间相对方向。

例如，对于最简单的螺旋状结构（等于1的所有常数，除了G）：

sin(x)∙cos(y)+sin(y)∙cos(z)+sin(z)∙cos(x)<G

孔隙度可简单地通过改变G常数来调节（参见图2）。

对于该螺旋状结构，空隙分数与常数G之间的关系可以大约为线性关系（在-1.413<G<1.413的范围内），但是其它参数（例如表面积、孔隙大小等）符合其它关系。另外，如果螺旋状结构由不同形式的基础方程限定，那么这些关系将不同。

负模板方法特别适合制备热敏性水凝胶。热敏性水凝胶从水凝胶形成溶液制造，所述水凝胶形成溶液可简单地通过改变其温度而胶凝。

例如，基于纤维素的水凝胶可如下制备：在低温（低于4℃）下将纤维素溶液灌输到负模板中，然后通过提高温度（到大约60℃或更高）将该材料热胶凝。纤维素溶液可通过将纤维素（5-7wt%）溶于NaOH或LiOH与脲、硫脲或聚乙二醇（PEG）的组合中、特别是NaOH/脲中来制造。热胶凝之后，可洗掉NaOH和脲以再生纤维素水凝胶。

琼脂糖水凝胶可如下制备：在升高的温度（大约80℃）下将琼脂糖溶液灌输到负模板中，然后通过将温度降至低于45℃来胶凝。

图3显示使用负模板技术制备的纤维素水凝胶螺旋状结构。

可通过添加物理交联剂对水凝胶的物理结构进行改动以获得特定的目标特性（例如平均孔隙大小、孔壁厚度、孔隙度等）。用于物理交联的添加剂包括（但不限于）微晶纤维素、纳米纤维素、细菌纤维素、几丁质、壳聚糖和其它不溶碳水化合物。例如，在制备纤维素水凝胶时可向饱和纤维素溶液中添加另外的纤维素。在胶凝/再生时，该材料充当将水凝胶的强度和硬度改进的增强相。

还可通过添加化学交联剂对水凝胶的物理结构进行改动以产生更硬的凝胶。用于化学交联的添加剂包括（但不限于）表氯醇（ECH）、戊二醛等等。本领域技术人员可操控交联程度以影响凝胶的物理特性，包括（但不限于）断裂伸长率、断裂最大压缩加载、弹性模量、蠕变阻力、平均纳米孔尺寸、微孔隙大小分布和总表面积。

图4显示含有不同交联剂和不同浓度的本发明的一系列水凝胶的SEM显微照片。

改变用来再生水凝胶的介质（例如醇、丙酮、硫酸）也可能会通过（例如）收缩或膨胀水凝胶而影响其特性。

为了用作分离介质，水凝胶必须通过引入至少一种会与目标分析物结合的配体来官能化。

在一个实施例中，反应产生水凝胶的聚合物在形成之前用配体官能化。在另一个实施例中，水凝胶在形成之后用配体官能化。用配体将水凝胶官能化的技术在本领域内是众所周知的。

配体包含适合与目标分析物结合的官能团。所需要的官能团取决于所使用的色谱类型。

会与目标分析物结合的配体包括（但不限于）用于亲和力色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、多模式色谱或凝胶渗透色谱的配体。

对于阴离子交换色谱（为了可逆地吸附带负电荷的生物分子），配体的官能团可选自胺、季胺、二乙基胺（DEAE）和其它。对于阳离子交换色谱（为了捕获带正电荷的生物分子），配体的官能团可选自羧基，磺酸和其它。

对于亲和力色谱，配体可包含会捕获免疫球蛋白的蛋白A、蛋白L、蛋白G和其它。用于金属亲和力色谱的配体上存在官能团亚氨基二乙酸（IDA），以通过首先将IDA加载像镍或铜这样的多价金属离子来捕获His-标记的蛋白。其它特定的亲和力配体可用来特定地与其它目标分析物结合。

对于疏水作用色谱，配体包括像（但不限于）烷基链（丁基、辛基）、苯基和苄胺基团这样的官能团。

在一个实施例中，所述配体选自由以下组成的群组：小分子、阳离子、阴离子、带电荷的或不带电荷的聚合物、疏水性基团、仿生配体、多模式配体、蛋白、肽、核酸、抗体或其抗体结合片段。

在配体可与水凝胶连接之前，水凝胶必须通过引入反应性基团来活化。在一个实施例中，水凝胶通过1,1'-羰基二咪唑（CDI）活化来活化。还可使用其它羰基化试剂，例如1,1'-羰基二-1,2,4-三唑（CD5）、1,1'-羰基-1,2,3-苯并三唑（CDB）。

在CDI活化中，水凝胶聚合物中的羰基与1,1'-羰基二咪唑反应，形成N-烷基氨基甲酸酯，其然后与配体中存在的N-亲核试剂反应，得到包含反应性基团的配体。

尽管水凝胶的内部通道是表面由三维周期性极小曲面限定的结构，但是本发明分离介质的外部形状可以是适合用于色谱法的任何形状，包括（但不限于）片或膜、股、塞、盘、单一整块、圆柱、环形空腔或珠粒。所期望的形状将取决于介质将用于其中的色谱装置的类型。

在另一个方面，本发明提供包含本发明分离介质的色谱装置。在一个实施例中，色谱装置为色谱柱。在一个实施例中，柱包括相关的盒，使得能够与像快速蛋白液相色谱（FPLC）装置或高效液相色谱（HPLC）装置这样的色谱装置连接。

图5显示负模板方法，用来产生包含圆柱形螺旋状结构水凝胶的分离介质，其被插入待用色谱柱中。图6显示本发明分离介质的螺旋状结构的通道。

本发明的分离方法

发明人已经发现，通过使用本文所述的分离介质，可将目标分析物从进料流有效分离或除去。发明人相信，它们的发明的分离介质在许多工业中具有广泛的应用，用来在预处理进料流可能昂贵和/或费时的情况下从进料流、特别是从包含悬浮固体的进料流分离或去除各种分析物。

因此，在一个方面，本发明涉及本发明的分离介质从进料流分离至少一种目标分析物的用途，包含将分离介质与进料流接触。

在另一个方面，本发明涉及本发明的分离介质从进料流分离至少一种目标分析物的用途，包含在容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件下将分离介质与进料流接触。

在另一个方面，本发明涉及本发明的分离介质从进料流分离至少一种目标分析物的用途，包含将分离介质与进料流接触从而将至少一种目标分析物与分离介质结合。

在以上各方面：

在一个实施例中，所述用途或方法任选地包含从分离介质回收至少一种目标分析物。

在一个用途或方法实施例中，分析物的分离或去除在不对进料流进行预处理以除去悬浮固体的情况下进行。

在一个用途或方法实施例中，接触包含将进料流通过、或者至少部分通过分离介质。

在一个用途或方法实施例中，进料流含有悬浮固体。

在一个用途或方法实施例中，分离介质在容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件下与进料流接触。在一个实施例中，至少一种目标分析物特定地与分离介质中包含的配体结合。

容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件包含（但不限于）调节进料流的pH、盐度、电导率、或温度。在一些实施例中，进料流在容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件下。

在其它实施例中，可对容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件进行调节，以调整结合相互作用。例如，可改变进料流的条件以增加或降低至少一种目标分析物与分离介质的结合。

在一个用途或方法实施例中，接触包含将分离介质与进料流接触从而将至少一种目标分析物与分离介质结合。

在一个用途或方法实施例中，至少一种目标分析物优选与分离介质结合。在一个用途或方法实施例中，至少一种目标分析物特定地与分离介质结合。优选地，目标分析物优选地或特定地与结合到分离介质的配体结合。

在一个用途或方法实施例中，结合到分离介质的配体包含在分离介质的水凝胶中。

在一个用途或方法实施例中，所述配体为离子交换配体，优选为阳离子交换配体。在一个实施例中，所述配体选自包含6-氨基己酸、7-氨基己酸和8-氨基己酸的群组。

在另一个实施例中，所述配体为疏水性相互作用配体。在一个用途或方法实施例中，所述配体在形成限定水凝胶螺旋状结构的表面的水凝胶的空隙和/或通道的表面上被曝露。

在一个用途或方法实施例中，进料流含有悬浮固体。在一个用途或方法实施例中，进料流含有至少一种非目标分析物。在一个用途或方法实施例中，进料流含有至少2种、优选至少3种、优选至少4种、优选至少5种或者更多种非目标分析物。在一个用途或方法实施例中，进料流未被预处理以除去非目标分析物。

在一个用途或方法实施例中，至少一种目标分析物通过色谱分离从进料流分离。在一个用途或方法实施例中，色谱分离包含亲和力色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、多模式色谱或凝胶渗透色谱。色谱分离优选包含离子交换色谱、亲和力色谱或多模式色谱。

在一个用途或方法实施例中，至少一种目标分析物包含生物分子。

在一个用途或方法实施例中，至少一种目标分析物包含选自由以下组成的群组的分析物：生物分子、蛋白；蛋白片段；包括寡肽和寡肽片段的肽；多肽；多肽片段；抗体结合域；抗体；抗体片段；抗原决定簇；单抗原决定簇；半抗原；免疫抗原；免疫抗原片段；抑制剂；辅助因子；底物；酶；受体；受体片段；受体次单元；受体次单元片段；配体；受体配体；受体激动剂；受体拮抗剂；信号传导分子；信号传导蛋白；信号传导蛋白片段；单醣；低聚醣；多糖；糖蛋白；脂质；细胞；细胞表面蛋白；细胞表面脂质；细胞表面碳水化合物；细胞表面糖蛋白；细胞提取物；病毒；病毒外壳蛋白；类固醇；激素；类固醇激素；血清蛋白、小分子和大分子；及其任意组合。

在一个用途或方法实施例中，目标分析物为细胞色素，优选为细胞色素C、或α-乳清蛋白。

在一个用途或方法实施例中，进料流为生物流体或非生物流体。

在一个用途或方法实施例中，生物流体选自由以下组成的群组：血液、尿、血清、唾液、牛奶、乳清和精液。

在一个用途或方法实施例中，非生物流体包含生物分子。在一个实施例中，非生物流体选自由以下组成的群组：细胞悬浮液、细胞浆液、细胞裂解物、细胞培养介质、细胞生长介质、或其组合、或其滤液或上清液。

在一个用途或方法实施例中，所述用途或方法在将分离介质与进料流接触与回收至少一种目标分析物的步骤之间包含洗涤分离介质的附加步骤。在一个实施例中，洗涤包含将洗涤缓冲液通过、或者至少部分通过分离介质，以便从分离介质除去未结合的目标分析物、进料流中其它未结合的组分和/或任何残留的悬浮固体，而不会除去与分离介质结合的目标分析物。在一个实施例中，洗涤缓冲液在进料流中保持目标分析物与分离介质结合的条件。在一个实施例中，所述条件为pH、盐度、电导率、或温度中的至少一种。

技术人员应理解，在目标分析物与分离介质的结合中还可涉及其它条件。据信，为了在附加洗涤步骤过程中保持目标分析物与分离介质之间的结合而保持适当的条件在本领域人员的技术能力内。

在将进料流通过分离介质之后进行回收步骤。进料流优选在不对进料流进行任何预处理以除去悬浮固体和/或非目标分析物的情况下通过分离介质。

例如，可存在于进料流中的悬浮固体包括可存在于细胞培养介质、细胞制品或细胞裂解物（但不限于其）中的细胞或细胞碎片。通过进一步的实例的方式，细胞或细胞碎片可来自像大肠埃希氏菌、棒状杆菌和/或荧光假单胞菌这样的细菌、像发面酵母和毕赤酵母这样的酵母、像曲霉菌、木霉菌和Myceliophtyora这样的丝状真菌、像利什曼原虫这样的原生生物、像Sf9、Sf21和HighFive这样的巴氏病毒感染的昆虫细胞、像花烟草或拟南芥这样的植物，以及像小家鼠细胞、原牛细胞、中国地鼠卵巢（CHO）细胞、幼地鼠肾细胞、人胚肾细胞和人癌细胞（HeLa）这样的哺乳动物细胞，但不限于其。

回收可使用本领域已知的标准方法进行，并且取决于包含在分离介质中的目标分析物与配体之间的结合相互作用的性质，回收条件可由技术人员容易地确定。

在一个用途或方法实施例中，回收包含从分离介质洗脱至少一种目标分析物。在一个实施例中，洗脱包含将分离介质与缓冲液接触。在一个实施例中，接触包含将缓冲液通过、或者至少部分通过分离介质。

在另一个用途或方法实施例中，分析物通过从分离介质切割配体来回收。

在一个用途或方法实施例中，进料流中存在的至少1%、优选至少5%、优选至少10%、优选至少20%、优选至少30%、优选至少40%、优选至少50%、优选至少60%、优选至少70%、优选至少80%、优选至少90%、优选至少95%、优选至少99%的至少一种目标分析物在与分离介质接触之前被回收。优选40%到60%的至少一种目标分析物被回收，优选约50%的至少一种目标分析物被回收。

在一个用途或方法实施例中，进料流中存在的基本上所有的至少一种目标分析物在与分离介质接触之前被回收。

在另一个方面，本发明涉及将至少一种目标分析物从进料流分离的方法，其包含

a）将包含特定地和/或优选地与至少一种目标分析物结合的配体的分离介质与进料流接触，以便将至少一种目标分析物与分离介质结合，

其中进料流包含选自由以下组成的群组的悬浮固体：组织、组织碎片、细胞、细胞碎片、生物分子，以及生物分子聚集体，包括脂质、蛋白、碳水化合物和/或核酸的聚集体，

其中分离介质是一种水凝胶，其具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构，

其中水凝胶结构选自包含以下的群组：舍恩螺旋状结构、施瓦茨菱形结构、施瓦茨初级结构，以及舍恩IWP结构，优选为螺旋状结构，

其中水凝胶为热敏性水凝胶，优选为多糖水凝胶，优选为琼脂糖水凝胶或纤维素水凝胶，并且

其中水凝胶被用于离子交换色谱或疏水作用色谱的配体官能化，以及

b）进一步包含从分离介质回收至少一种目标分析物，或者回收与分离介质结合的至少一种目标分析物。

（a）将分离介质与进料流接触，以及

（b）回收进料流。

（a）在容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件下将分离介质与进料流接触，以及

（b）回收进料流。

（a）将分离介质与进料流接触从而将至少一种目标分析物与分离介质结合，以及

（b）回收进料流。

容许至少一种目标分析物与分离介质结合的条件在本文中参考本发明的用途和分离方法方面进行描述，并且可如技术人员所理解同等地应用于根据本发明的降低方法。

技术人员应理解，在本文中关于分离介质从进料流分离目标分析物的用途、或者从进料流分离至少一种目标分析物的方法考虑的本发明的某些实施例也可以用作本发明的方法（其为用来降低进料流中至少一种目标分析物的浓度的方法）的实施例。因此，本文中明确地考虑所有这些实施例作为本发明的一部分，即用来降低进料流中至少一种目标分析物的浓度的方法。

在本文中还作为“本发明的降低方法”的实施例描述了根据本发明用来降低进料流中至少一种目标分析物的浓度的方法的其它实施例。

在本发明的降低方法的一个实施例中，回收步骤通过在将进料流通过分离介质之后收集进料流来进行。在一个实施例中，进料流包含悬浮固体。优选在不对进料流进行任何预处理以除去悬浮固体和/或非目标分析物的情况下将进料流通过分离介质。

回收可使用本领域中已知的标准方法进行。

在降低方法的一个实施例中，回收包含在将分离介质与进料流接触之后、优选在将进料流通过、或者至少部分通过分离介质之后收集进料流。

在降低方法的一个实施例中，进料流具有与进料流中至少一种目标分析物在与分离介质接触之前的浓度相比浓度降低的至少一种目标分析物。

在降低方法的一个实施例中，进料流中至少一种目标分析物的浓度被降低至少1%、优选至少5%、优选至少10%、优选至少20%、优选至少30%、优选至少40%、优选至少50%、优选至少60%、优选至少70%、优选至少80%、优选至少90%、优选至少95%、优选至少99%。

在降低方法的一个实施例中，接触包含将基本上所有的目标分析物与分离介质结合。

在另一个方面，本发明涉及通过本发明的方法产生的产物。在一个实施例中，所述产物为含有目标分析物的组合物。

在另一个实施例中，产物为进料流，其含有跟进料流与本发明的分离介质接触之前的进料流相比浓度降低的目标分析物。

本发明的各种方面现在将以非限制性的方式通过参考以下实例进行说明。

实例

6.1 通用方法和材料

材料

所使用的纤维素为Type20 Sigmacell纤维素粉末（平均颗粒直径20 µm），从Sigma-Aldrich（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）购买。氢氧化钠（NaOH）（纯度97%）以粒丸形式从Thermo Fisher Scientific（Waltham，美国马萨诸塞州）购买。脲（ACS级）和表氯醇（ECH）（纯度98%）也从Sigma-Aldrich购买。类型为Certified Molecular BiologyAgarose的琼脂糖从Bio-Rad（美国加利福尼亚州伯克利）购买。工业级丙酮（纯度95%）从ASCC（新西兰奥克兰）购买。所有化学品均原样使用。

实例1-3的3D螺旋状模具的打印

模具的CAD（计算机辅助设计）模型使用SolidWorks 2012（Dessault Systems，法国巴黎）产生。模具在Startasys Dimension Elite机器（Stratasys Ltd.，以色列雷霍沃特）上使用ABSplus和可溶支持材料打印，所述可溶支持材料在打印之后使用StratasysSCA-1200支持物去除系统除去。然后将模具用Milli-Q水冲洗，并在环境条件下干燥至少7天。

实例4-6的3D模具的打印

模具的CAD（计算机辅助设计）模型使用SolidWorks 2012（Dessault Systems，法国巴黎）产生。来自ABSplus的模具在Startasys Dimension Elite机器（Stratasys Ltd.，以色列雷霍沃特）上与可溶支持材料一起打印，所述可溶支持材料在打印之后使用Stratasys SCA-1200支持物去除系统除去。然后将模具用Milli-Q水冲洗，并在环境条件下干燥至少7天。

来自Solidscape 3Zmodel材料的模具在Solidscape 3Z PRO机器（StratasysLtd.，以色列雷霍沃特）上与Solidscape 3ZTMSupport材料一起打印，所述Solidscape3ZTMSupport材料在打印之后使用加热到50摄氏度的Bioact VSO（Vantage SpecialtyChemicals，美国伊利诺伊州古尔尼）浴液除去。然后将模具置于45摄氏度下的烘箱中，以蒸发掉残留的VSO，进行至少48小时。

纤维素溶液的制备

为了制备用于本发明色谱介质的纤维素水凝胶，制备了12wt%的脲和7wt%的NaOH在Milli-Q水中的水溶液并冷却到12℃。

向该溶液中加入纤维素粉末（5wt%），并搅拌大约60秒。将该混合物在-12℃下保持过夜，然后剧烈搅拌大约5分钟，直到纤维素完全溶解为止。然后将该溶液离心，除去任何纤维素团块。该溶液在大约1℃下储存，直到被进一步使用。

为了产生全纤维素组成的水凝胶，初始溶解的纤维素部分中某一质量分数的纤维素粉末（10%、50%、100%等）使用L4RT Silverson机械混合器在大约800 rpm下溶于纤维素溶液中，充当最终水凝胶中的增强物以及胶凝过程中的物理交联剂。

溶液温度在混合过程中保持在3-5℃，以避免溶液胶凝。将该悬浮液搅拌大约5分钟，直到所添加的粉末均匀地分散在原始溶液中为止。

为了产生化学交联的水凝胶，化学交联剂ECH作为所用纤维素（溶解，并且最终额外的纤维素混合到溶液中）的某一质量分数（1%、5%、10%等）添加到溶液中。使用顶部搅拌器在大约1000 rpm的转速下将含有交联剂的溶液搅拌5分钟，以便获得ECH的良好分散。溶液温度在混合过程在保持在3-5℃，以避免溶液胶凝。

琼脂糖溶液的制备

为了制备琼脂糖水凝胶，使用设在800 rpm的Silverson L4RT机械混合器（Silverson Machines，Inc.，美国马萨诸塞州东朗梅多）以6:94的质量比将琼脂糖粉末与Milli-Q水混合大约60秒，以便完全分散琼脂糖粉末。

在期望获得更强的水凝胶的情况下，将纤维素粉末添加到琼脂糖-水混合物中，称量为某一质量分数（10%、50%、100%等）的分散琼脂糖粉末并添加到琼脂糖-水混合物中。然后该混合物使用Silverson混合器在100 rpm下搅拌另外120秒。

将琼脂糖混合物保持在盖有石蜡膜的玻璃烧杯中，然后置于1000 W的三星Timesaver微波炉（三星）中。该微波炉在1000瓦特下运行30秒，以便将混合物加热到大约75℃。然后将该混合物用刮勺搅拌，并以相同的设置再次加热。重复这一过程，直到所有琼脂糖粉末都被溶解，形成粘性溶液。所添加的任何纤维素粉末都保持不溶。

本发明分离介质的制备：实例1-3的螺旋状结构的琼脂糖水凝胶

使用一次性塑料注射器将琼脂糖溶液注入3D打印螺旋状模具中。将填充的模具置于微波炉中，并在100瓦特下加热10秒。将模具沿其长轴旋转并再次加热。该过程重复4-5次，以便完全填满模具。随后，将该模具在-20℃下的冰柜中放置30分钟，以便琼脂糖溶液完全胶凝。

将填满的模具浸入Schott瓶中的丙酮中。在室温下将封闭瓶在100 W的DigitechUltrasonic Cleaner（Digitech，美国犹他州南佐敦）中放置30分钟的间隔，以溶解ABS模具。在8-10次的超声处理间隔之后更换丙酮，直到全部ABS都被溶解为止。随后使用Milli-Q水洗掉丙酮，得到螺旋状结构的琼脂糖水凝胶。

本发明分离介质的制备：实例1-3的螺旋状结构的纤维素水凝胶

使用一次性塑料注射器将纤维素溶液注入3D打印螺旋状模具中。将填满的模具在85℃下的烘箱中放置5-6小时以胶凝溶液。将模具从烘箱中取出并在室温下冷却。如上所述除去ABS。

实例1：基于纤维素的螺旋状结构水凝胶

包含基于纤维素的螺旋状结构水凝胶的本发明分离介质根据以上所列程序制备。所制备的一些水凝胶具有ECH交联（1和10%）。所制备的水凝胶还具有添加的纤维素颗粒。添加了纤维素粉末（相对于用来制备溶液的纤维素为10wt%、40wt%、50wt%和100wt%）。还制备了与ECH交联并且用纤维素粉末支持的水凝胶。图4显示所制备的一些水凝胶的SEM显微照片。

实例2：基于琼脂糖的螺旋状结构水凝胶

包含基于琼脂糖的螺旋状结构水凝胶的本发明分离介质根据以上所列程序制备。所制备的一些水凝胶具有ECH交联（1和10%）。

所制备的水凝胶还具有添加的纤维素颗粒。添加了纤维素粉末（相对于用来制备溶液的纤维素为10wt%、40wt%、50wt%和100wt%）。

还制备了与ECH交联并且用纤维素粉末支持的水凝胶。图4显示所制备的一些水凝胶的SEM显微照片。

实例3：使用分离介质为螺旋状结构水凝胶的阳离子交换色谱从含有悬浮固体的进料流回收目标细胞色素C

螺旋状结构的琼脂糖水凝胶使用以上所述技术通过负模板方法从3D打印模板产生。它用来在悬浮的酵母细胞的存在下分离两种蛋白而不会保留酵母细胞。

该实验中使用的分离介质为25 mm长、10 mm直径的螺旋状结构琼脂糖水凝胶的单一整块，通道大小为1.2 mm，壁厚度为1.2 mm。对于简单螺旋状，单一整块的孔隙度为50%，G=0

其中x、y和z是笛卡儿坐标系统中柱中各点的位置，G为任意常数，其确定柱几何体内固体（吸附剂）部分和空隙（流动通道）部分的相对体积分数。

螺旋状琼脂糖单一整块如此产生：用琼脂糖热溶液填充螺旋状单一整块的ABS塑料打印负模板，并通过冷却到室温让它凝胶。然后通过用丙酮溶解将ABS除去。

羰基二咪唑活化

使用丙酮除去ABS之后，水凝胶单一整块在6倍柱体积的丙酮中洗涤，以确保没有残留的ABS保留在系统中。

使用1,1羰基二咪唑（CDI）将琼脂糖单一整块活化，以便在琼脂糖基质的聚合物骨架上提供活性咪唑中间体。将0.2 g的CDI添加到琼脂糖单一整块，将其悬浮于10 ml的丙酮中。让该混合物在恒定搅拌下反应2小时。

除去反应混合物，并将单一整块在6倍单一整块体积的丙酮中快速洗涤，以除去未反应的CDI。快速完成洗涤步骤是必要的，以避免活化琼脂糖材料水解。

配体偶合

将配体6-氨基己酸与琼脂糖水凝胶偶合，以引入阳离子交换官能团，即–COOH基团。将单一整块添加到使用NaOH调节为pH 10的0.5 M 6-氨基己酸和1 M碳酸氢钠的6 ml溶液中。6-氨基己酸通过胺连接与琼脂糖表面共价键连，游离羧基在配体的端部，用来进行阳离子交换。该溶液在恒定搅拌下反应48小时，之后将其置于pH 7的磷酸钠缓冲液中（如果在配体偶合之后不立即用于蛋白分离的话）。

分离

将所偶合的官能化的螺旋状结构水凝胶从反应容器移去，置于10 mm直径的SNAP玻璃柱（Sorbent Technologies Inc.，佐治亚州诺克罗斯）中，并与AKTA Start液相色谱系统（GE Healthcare Technologies，瑞典乌普萨拉）连接。使用上流配置将柱与该系统连接。

该系统用pH 7的磷酸钠缓冲液（结合缓冲液）冲洗，直到水凝胶完全被缓冲液饱和，然后用pH 7的磷酸钠缓冲液和1 M NaCl（洗脱缓冲液）冲洗，将反离子添加到离子交换基质。获得平衡之后，将柱再平衡到结合缓冲液中。

将5 mg/ml发面酵母、2 mg/ml牛血清蛋白（BSA）和2 mg/ml细胞色素C在pH 7.4的结合缓冲液中的2 ml溶液上样到柱上。预期细胞色素C（等电点pI为9.6）会与柱结合，同时预期BSA（pI为4.7）和酵母细胞（pI通常为5.2到6.4）会穿过柱。

图7显示完成样品上样和洗涤步骤之后的柱，通过红色清楚地显示细胞色素C已经与柱结合。用大约25 ml结合缓冲液洗涤之后（直到除去所有未结合的蛋白为止），给柱施加洗脱缓冲液（1 M NaCl），直到显然（通过观察离开柱的流体中UV吸光度的降低）所有结合的蛋白已经被除去为止。

收集的峰值级分使用凝胶电泳进行分析。在室温下将该级分离心5分钟，以便在施加到凝胶上之前从溶液除去酵母固体。对凝胶施加考马斯亮蓝染色12小时，然后用乙酸溶液将其脱色以显示蛋白标准物。

凝胶上的带密度使用开源ImageJ软件测量，给出相较于带有样品的道上的带的相对强度，其可显示色谱图的每个峰中存在的BSA和细胞色素C按比例的浓度。

结果

本发明的分离方法成功地从含有固体的进料流回收了细胞色素C。

色谱分析（如图8所示）显示出以大约5 ml为中心的高的流穿峰，其中酵母、BSA和一些细胞色素-C从系统洗脱而不与柱相互作用。

在大约35 ml处伴随着电导率的急剧增加的洗脱峰仅含有细胞色素C，这可以从图9看出。

凝胶电泳确认细胞色素C从BSA和酵母分离（图9）；对应于进料样品峰和流穿峰的各道（第2到第10道）显示66.5 kDa的BSA和12.3 kDa的细胞色素C。凝胶上第2到第6道不那么清晰的带可能由带有样品的峰和流穿峰中存在的完整的或断裂的酵母细胞分泌的蛋白产生。第7-10道显示渐进除去未结合的材料，与图8中的色谱图一致；但是酵母似乎比蛋白快得多得被从柱除去，表明对酵母细胞的流动没有阻碍。

在施加洗脱缓冲液之后，图8中的UV峰显示对蛋白的洗脱，证据表明洗脱样品中具有纯的细胞色素C。这在第11-17道的凝胶中是显而易见的（参见图9），其显示洗脱峰以及随后从琼脂糖螺旋状柱除去细胞色素C。这证实使用通过3D打印方法产生的阳离子交换色谱柱将细胞色素C从酵母细胞、细胞色素C和BSA的混合物分离。

从凝胶上每道的相对带强度推测，与凝胶结合并随后从凝胶洗脱的细胞色素C的量大约为上样到柱上的总量的50%（图10）。

色谱图中峰下的面积对于流穿峰给出1632 mAU ml，对于洗脱峰给出521 mAU ml。与洗脱峰中仅有的洗脱细胞色素C相比更大的流穿峰面积将由BSA、未结合的细胞色素C和酵母细胞的存在而导致。

在整个色谱运行中观察到可忽略的返压。在正常操作过程中，记录0 MPa，在施加酵母之后其增加到0.01 MPa。一旦流穿峰通过系统它就变回0 MPa。缺少返压表明在样品施加和洗涤步骤过程中酵母未被捕获到柱中，而是流动穿过柱。

结论

螺旋状结构的琼脂糖水凝胶通过阳离子交换成功地将细胞色素C从包含悬浮固体的进料流（即包含BSA、细胞色素C和酵母细胞的混合物的进料流）色谱分离。酵母细胞正如所预期的穿过柱。

BSA未被水凝胶柱保留，而样品中约50%的细胞色素C则与水凝胶柱结合，并随后通过施加1 M的NaCl被洗脱。

实例4：分离介质为螺旋状结构水凝胶的3D打印琼脂糖DEAE柱的产生以及使用阴离子交换色谱从含有悬浮固体的进料流回收目标细胞色素C

该研究展示了用作简单蛋白纯化系统的第一种3D打印阴离子交换色谱以及用于模拟发酵液的蛋白和固体（发面酵母）的溶液的更复杂的蛋白捕获步骤。

方法

DEAE官能化

如以上方法详述使用从Solidscape 3ZTMModel材料打印的模板制备的3D打印琼脂糖柱（6%w/w的琼脂糖，50 mm的长度，10 mm的直径，400 µm的通道大小，50%的孔隙率）使用基于由Toufik和Labarr开发的方法（Toufik，J.和Labarre，D.（1995），《带有二乙基氨基 乙基基团的多糖表面的补体活化的降低与其取代程度之间的关系》.Biomaterials，16（14），1081-1088。doi：10.1016/0142-9612（95）98904-s）的方法用DEAE配体2-氯-N,N-二乙基乙基胺盐酸盐官能化。以1 g琼脂糖:27 ml DEAE:20 ml NaOH的比例将琼脂糖置于4 MNaOH和3 M DEAE中，并在水浴中在30℃下搅拌90分钟。活化之后，将柱用15 ml 1 M的NaCl冲洗，然后用15 ml 1 M的NaOH冲洗，接着用15 ml 1 M的HCl冲洗3次。将柱储存在20%的异丙醇中直到被使用。

平衡

使用AKTA Start装置，将琼脂糖柱置于SNAP箱中并与AKTA连接。以5.0 ml/min将70%的IPA穿过柱，以除去进入柱中的任何空气，同时将其转移到SNAP箱中。然后将柱用3倍柱体积的pH 7.0的20 mM的磷酸钠缓冲液+1 M的NaCl平衡（以便为基质添加反离子），然后用3倍柱体积的pH 7.0的20 mM的磷酸钠缓冲液平衡。

动力学测试

通过2.0 ml上样环将2.5 mg/ml的BSA上样到柱上。用结合缓冲液洗掉未结合的样品，并且在4倍柱体积之后向柱施加盐缓冲液以促进蛋白洗脱。

蛋白分离

通过上样环将来自牛心的2.5 mg/ml BSA和1 mg/ml细胞色素c的2.0 ml溶液上样到柱上。进行与以上相同的洗涤和洗脱程序。收集这次运行的2.0 ml级分，并使用SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行分析。

固体通过率

针对该分析完成了3次运行：0.5w/w%的酵母；2.0 mg/的BSA；以及2.0 mg/ml的BSA和0.5w/w%的酵母。酵母样品如下制备：将所需质量的干燥的面包酵母添加到pH 7.0的20mM磷酸钠缓冲液中并搅拌1小时，直到所有颗粒均被分解到浆液中。将具有DEAE琼脂糖的SNAP柱与AKTA10 Explorer连接并平衡。对于每次运行，将样品上样到柱上，跟以上一样添加缓冲液（结合缓冲液和洗脱缓冲液）。从每次运行收集4 ml级分；在光谱仪上测量每个样品在600 nm处的光学密度，以便对酵母通过率进行定量。每次运行之后，将柱用1 M的NaOH冲洗，以除去可能会粘在硬件或柱中的任何酵母。

结果和讨论

显而易见的是，DEAE琼脂糖柱是一种成功的阴离子交换柱。通过施加BSA样品和随后的盐缓冲液洗脱，大约51.6%的BSA与柱结合并随后被洗脱（图11，表1）。

表1：峰面积

157 167 51.6%将细胞色素C从细胞色素C和BSA的混合物成功分离（图12）进一步证明该研究中产生的柱的阴离子交换能力。在7.0的缓冲液pH下，BSA带负电荷（pI=4.7），细胞色素C带正电荷（pI范围10-10.5）。因此BSA会与柱结合，而具有与柱类似电荷的细胞色素C则会穿过柱。

从色谱图显而易见的是，比仅施加BSA时更多的蛋白流动通过柱（图11，图12）。流穿峰在组合蛋白分析中大得多，而洗脱峰则具有类似的强度，表明相同量的BSA与柱结合。

从BSA/细胞色素C运行收集的级分的凝胶电泳会确认图12中的流穿峰和洗脱峰中是什么。BSA（MW=66.5 kDa）和细胞色素C（Mw=12.3 kDa）在带有样品（ON）的凝胶上是显而易见的（图13）。两种蛋白的二聚体也是显而易见的。代表流穿峰的道显示BSA和细胞色素C，随后对未结合样品的冲洗显示残留量的两种蛋白。洗脱后（第8-14道）凝胶中只存在BSA，确认只有BSA与柱结合。

3D打印琼脂糖DEAE柱容许固体通过，但是存在一定量的酵母与柱结合，其会被洗脱掉。600 nm处的光学密度分析显示整个运行中的固体通过率；在只有BSA的情况下，在结合、冲洗和洗脱过程中没有600 nm处的光学密度变化，表明在运行中没有固体，这意味着在600 nm处检测到的任何吸光度均表明是酵母（图14）。在具有酵母和酵母/BSA的情况下，存在一个清楚的流穿峰和洗脱峰，意味着酵母与柱结合然后在盐条件下被洗脱。大约83.4%的酵母流动通过柱，剩余部分用增加浓度的盐洗脱。

技术人员可视情况对各条件进行改动，以便将它的影响降低，例如将盐添加到结合缓冲液中从而降低溶液的离子强度并防止酵母与柱结合。

结论

产生了一种3D打印琼脂糖DEAE柱。该柱作为阴离子交换器运行，用来进行蛋白纯化；对BSA和细胞色素C的混合物进行分离确认了这一点，以及在酵母的存在下的阴离子交换器。正如所预测的，酵母会与阴离子交换基团相互作用，但是操控缓冲液条件会对此进行控制。

实例5：分离介质为螺旋状结构水凝胶的3D打印琼脂糖疏水性相互作用柱的产生以及从含有悬浮固体的进料流回收α-乳清蛋白

该研究展示了用作简单蛋白纯化系统的第一种3D打印疏水作用色谱柱以及用于模拟发酵液的蛋白和固体（发面酵母）的溶液的更复杂的蛋白捕获步骤。

琼脂糖螺旋状基质用CDI活化，然后与苄胺偶合，以便通过固定在表面的极其疏水性的苄基基团产生疏水性基质。展示了α-乳清蛋白被捕获到柱上，以及两种蛋白被捕获到溶液中（尽管蛋白分离不成功）。大约65%的施加到柱上的蛋白被捕获，意味着应该对效率进行改进。最后，还展示了从酵母细胞溶液捕获α-乳清蛋白，但是由于酵母与柱之间的相互作用仅仅73%的酵母穿过柱，这在文献中很少被报道。

方法

CDI活化和苄胺官能化

使用来自Solidscape 3ZModel材料的模具制造的3D打印琼脂糖柱（6%w/w的琼脂糖，50 mm的长度，10 mm的直径，400 µm的通道大小，50%的孔隙率）用1,1’-羰基二咪唑（CDI）活化，随后使用文献中采用的方法（Bethal，G.S.，Ayers，J.S.，Hearn，M.T.W.，以及Hancock，W.S.（1987）。《1,1′-羰基二咪唑对各种不溶多糖的活化的研究以及对活化基质特性的研究》。Journal of Chromatography A，219（3），361-371。doi：http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673（00）80379-9），以及Hermanson，Millia & Smith，1992（Hermanson，G.T.，Mallia，A.K.，&Smith，P.K.（1992）《固定亲和力配体技术：学术出版社》）与苄胺配体偶合。

将琼脂糖柱置于50 mL Falcon管中，并依序冲洗到丙酮中（以30/70、50/50、70/30然后100/0的%丙酮/%水的比例），然后留在100%的丙酮中进行活化。将0.084 g CDI/g琼脂糖添加到琼脂糖和丙酮中，并在室温下在转动轮上放置1小时，以确保持续混合。1小时之后，从琼脂糖除去液体，然后使用丙酮洗涤留在柱通道中的任何未反应液体。向Falcon管中的柱中加入新的丙酮，以1:0.11的丙酮:苄胺比向其中加入某一体积的苄胺。让它在转动轮上反应24小时。一旦完成配体偶合，便将液体从Falcon管倒出。向柱中施加2倍柱体积的丙酮，以除去任何未反应的苄胺。然后将该柱储存在20%的异丙醇（IPA）中直到被使用。

平衡

使用AKTA10 Explorer装置，将琼脂糖柱置于SNAP箱中，并与AKTA连接。以5.0 ml/min将70%的IPA穿过该柱以除去进入柱中的任何空气，同时将其转移到SNAP箱中。然后将该柱用3倍柱体积的pH 6.0的20 mM磷酸钠缓冲液+2 M (NH₄)₂SO₄（结合缓冲液）平衡。还制备了pH 6.0的20 mM磷酸钠洗脱缓冲液。

动力学测试

通过2.0 ml上样环以1 ml/min将2.0 mg/ml的α-乳清蛋白上样到柱上。未结合的样品用结合缓冲液洗掉，并且在4倍柱体积之后将洗脱缓冲液施加到该柱中，以便通过减小疏水性相互作用来促进蛋白洗脱。在运行结束时，将该柱用2倍柱体积的70%的IPA冲洗，以除去未被洗脱缓冲液除去的任何α-乳清蛋白。

双重蛋白洗脱

通过上样环以1 ml/min将2.0 mg/ml α-乳清蛋白和2 mg/ml牛血清蛋白（BSA）的2.0 ml溶液上样到柱上。进行与以上相同的冲洗和洗脱和清洗程序。收集该运行的2.0 ml级分，并使用SDS-PAGE和考马斯蓝染色对其进行分析。

固体通过率

针对该分析完成3次运行：0.5w/w%的酵母；2.0 mg/ml的α-乳清蛋白；以及2.0 mg/ml的α-乳清蛋白和0.5w/w%的酵母。酵母样品如下制备：将所需质量的干燥的面包酵母添加到pH 6.0的20 mM磷酸钠缓冲液、2 M (NH₄)₂SO₄中，并搅拌1小时，直到所有颗粒都被分解到浆液中。将具有插入的苄胺柱的SNAP箱与AKTA10 Explorer连接并平衡。对于每次运行，将样品上样到柱上，如同以上以1 ml/min添加缓冲液（结合缓冲液和洗脱缓冲液）。从每次运行收集4 ml级分；在光谱仪上测量每个样品在600 nm处的光学密度，以便对酵母通过率进行定量。每次运行之后，将柱用2倍柱体积的70%的IPA和1 M NaOH冲洗，以除去可能会粘在硬件或柱中的任何蛋白或酵母。

结果和讨论

色谱图展示了苄胺琼脂糖疏水性基质上的蛋白捕获（图15）。在280 nm轴处的吸光度的各峰说明蛋白是在何处被从柱洗脱的。在添加的1.5-10 ml之间的第一个峰是流动通过的未结合的α-乳清蛋白。显然添加高达大约24 ml的缓冲液未从柱洗下蛋白，意味着一旦缓冲液被改变并且电导率降低，那么此处洗脱的蛋白便对应于由于减小疏水性相互作用（降低盐的浓度）而洗脱的蛋白，从而证明基于疏水性成功捕获蛋白。对峰的大小的分析显示，65%的蛋白被捕获并随后用洗脱缓冲液洗脱。技术人员可对色谱条件进一步优化以增加所期望的目标分析物的捕获百分比。

在酵母的存在下，α-乳清蛋白与苄胺琼脂糖柱结合，并随后在洗脱缓冲液的存在下被洗脱（图16）。如此结论是基于合并的三个实验在280 nm处的吸光度色谱图：α-乳清蛋白，酵母，以及α-乳清蛋白+酵母。α-乳清蛋白线显示大约等量的蛋白流动通过并洗脱。对于仅使用酵母的情况，观察到大的流穿峰（在280 nm处）和小的洗脱峰。这表明小量的酵母由于与酵母相关的一些细胞外蛋白与柱具有相互作用而与柱结合。对于α-乳清蛋白加酵母，记录了大的流穿峰（大约合并的α-乳清蛋白流穿峰和酵母流穿峰的大小），洗脱峰类似于α-乳清蛋白运行中的洗脱峰大小。这表明柱在进料液中存在或不存在固体的情况下具有类似的性能，显示酵母不会抑制苄胺琼脂糖柱的性能。

通过监控色谱图上600 nm处的UV吸光度观察酵母通过柱的通过率。与以上相同，进行了3个实验：α-乳清蛋白、酵母，以及α-乳清蛋白加酵母。α-乳清蛋白运行显示α-乳清蛋白在600 nm处具有很小的吸光度。只有酵母的运行具有大的流穿峰和小的洗脱峰–再一次证明一些吸附体-被吸附物相互作用。酵母和α-乳清蛋白加酵母在两个运行中基本上轨迹相同，显示酵母通过率在两个试验中相同。峰强度的对比显示73%的酵母流动通过柱。需要进行优化以减小酵母细胞和蛋白与柱之间的相互作用；这将通过改变盐的浓度和pH来实现。

在图17中应注意，每个实验在洗脱峰之后的长尾巴表明25 mAu的新基线，这是由于缓冲液的改变而导致；洗脱缓冲液在600 nm处具有比结合缓冲液更高的UV吸光度。

结论

产生了3D打印琼脂糖苄胺柱。该柱作为疏水作用色谱基质运行，用来进行蛋白纯化；α-乳清蛋白和BSA的捕获以及随后低盐缓冲液的洗脱证明了这一点。可通过优化活化方案和配体偶合方案改进蛋白捕获效率（现在为65%）。

实例6：（a）3D打印施瓦茨菱形琼脂糖阳离子交换（CM）色谱柱和（b）舍恩螺旋状纤维素阳离子交换（CM）色谱柱的产生和用途

该研究详述了被阳离子交换配体官能化产生羧甲基阳离子交换器的两根3D打印色谱柱的产生。第一根柱为6%的琼脂糖柱，使用3D打印方法产生，形成具有50%空隙的施瓦茨菱形结构。第二根柱为5%的纤维素柱，制造成具有50%空隙的舍恩螺旋状结构。琼脂糖和纤维素水凝胶使用以上所述方法使用由Solidscape 3ZModel材料制造的模具制备。

展示了细胞色素C在两根柱上的捕获，琼脂糖施瓦茨菱形的捕获效率为37%，纤维素舍恩螺旋状的捕获效率为89.2%。还显示两根柱在固体（发面酵母）的存在下具有类似的捕获效率，尽管纤维素螺旋状中的酵母通过率比琼脂糖施瓦茨菱形中的酵母通过率更高。

方法

柱的规格

施瓦茨菱形柱是50 mm长度、10 mm直径、500 µm通道、50%空隙的柱，由6%的琼脂糖水凝胶制造。舍恩螺旋状柱是50 mm长度、10 mm直径、400 µm通道、50%空隙的柱，由5%的纤维素水凝胶制造，添加的50%的纤维素与5%的表氯醇交联。

CDI活化和配体偶合

两根柱均采用相同的官能化方法。对Bethell等人（Bethell，G.S.，Ayers，J.S.，Hearn，M.T.W.，以及Hancock，W.S.（1987）。《1,1′-羰基二咪唑对各种不溶多糖的活化的研究以及对化基质特性的研究》。Journal of Chromatography A，219（3），361-371。doi：http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673（00）80379-9）和Hermanson，Millia & Smith，1992（Hermanson，G.T.，Mallia，A.K.，&Smith，P.K.（1992）。《固定亲和力配体技术：学术出版社》）的方法改进以适合琼脂糖和纤维素活化和随后的配体偶合：使用1,1’羰基二咪唑（CDI）活化多糖凝胶中的羟基，并将6-氨基己酸与活化基质偶合，以便通过配体中存在的羧基在表面上产生阳离子交换基团。通过添加3倍柱体积的以下比例的%丙酮/%水混合物将各柱依次从水性冲洗为丙酮：30/70、50/50、70/30、100/0。在这之后，将各柱置于3倍柱体积的添加有0.2 g CDI的新丙酮中。每个混合物均在转动轮上放置1小时。活化之后，将反应物混合物从柱倒出，然后将柱用2倍柱体积的丙酮冲洗，以除去未反应的CDI基团。为了将配体6-氨基己酸与琼脂糖柱偶合，将柱添加到使用NaOH调节为pH 10的0.5 M 6-氨基己酸和1 M碳酸氢钠的6 ml溶液中。6-氨基己酸通过胺连接与琼脂糖表面形成共价键，游离的羧基在配体的端部，以便进行阳离子交换。将溶液在恒定搅拌下反应48小时，之后将其置于pH 7的磷酸钠缓冲液中（如果在配体偶合之后并不立即用于蛋白分离的话）。

平衡

所有动力学测试均在AKTA10 Explorer上进行，其中活化的3D打印柱被置于玻璃SNAP柱箱中并与AKTA连接。将柱用5倍柱体积的70%的异丙醇（IPA）冲洗，以除去通道中的任何空气。将3倍柱体积的洗脱缓冲液（20 mM磷酸钠+1 M NaCl，pH 7.0）冲洗到柱上，以便给阳离子交换基团添加反离子。然后将柱用3倍柱体积的结合缓冲液（20 mM磷酸钠缓冲液，pH7.0）平衡，以便将柱为施加蛋白样品做好准备。

蛋白结合

以1 ml/min将2.0 ml的2.0 mg/ml的细胞色素C上样到柱上。然后将柱用4.5倍柱体积的结合缓冲液冲洗，以除去未结合的样品。最后，将4倍柱体积的洗脱缓冲液施加到柱上，以便从柱洗脱结合的细胞色素C。然后将柱用结合缓冲液再平衡，以便为下一次运行做好准备。

在酵母的存在下的蛋白结合

将0.25%wt/wt的面包酵母搅拌到2.0 ml结合缓冲液中。然后将其上样到新近平衡的柱上，冲洗程序和洗脱程序与以上相同。然后将柱用3倍柱体积的1 M NaOH冲洗，以除去粘在柱中或AKTA硬件中的任何酵母细胞。然后如上将柱用结合缓冲液再平衡。制成了另一个0.25%wt/wt的酵母溶液，然后将其用2.0 mg/ml的细胞色素C增强效果。按照与以上同样的程序将其施加到柱上。

结果和讨论

（a）施瓦茨菱形琼脂糖

在运行过程中监控280 nm处的UV吸光度（图18）显示，37%的上样到柱上的细胞色素C被结合并随后通过添加盐洗脱缓冲液被洗脱。这证明柱作为阳离子交换器的能力，由于在pH 7.0的缓冲溶液中细胞色素C（pI为10.0-10.5）带正电荷，意味着它会与偶联到琼脂糖基质的带负电荷的阳离子交换配体结合。但是结合效率相当低；这可通过改变缓冲液类型和盐的浓度来优化。

对细胞色素C、酵母，以及细胞色素C加酵母的运行在280 nm处的UV吸光度的分析显示，细胞色素C和酵母在该波长均具有吸光度（图19）。这意味着细胞和蛋白不能被分离，但是细胞色素C和酵母运行的峰强度是只有细胞色素C的运行中和只有酵母的运行中的峰的和。这显示在酵母的存在下，细胞色素C的捕获不会受到较大影响，从而确认施瓦茨D琼脂糖阳离子交换器在固体的存在下作为蛋白捕获机制的能力。

在600 nm的UV吸光度显示固体的通过率，但是显而易见的是，归功于细胞色素C在550 nm处的吸光度光谱中的峰，在600 nm处会略微检测到细胞色素C（各值之间接近会导致细胞色素C在600 nm处的非零值）。再一次，细胞色素C和酵母运行中检测到的峰等于只有细胞色素C的运行和只有酵母的运行的和（图20）。

结果显示，施瓦茨D琼脂糖阳离子交换器中的酵母通过率为94.2%。小量蛋白与柱结合的原因是由于阳离子交换器与酵母细胞液的一些部分之间的相互作用。Tari等人报道相互作用系数在该电导率下为0.095（Tari，C.，Vennapusa，R.R.，Cabrera，R.B.，& Fernández-Lahore，M.（2008），《胶体沉积实验作为生物质在生物制品吸附体表面上的结合的诊断工具》。Journal of Chemical Technology and Biotechnology，83（2），183-191。doi：10.1002/jctb.1852）（与树脂的细胞亲和力会随着盐的浓度增加），因此酵母的一些结合是所预期的，并且会产生大约10%的蛋白结合。

（b）舍恩螺旋状纤维素

此处应用施瓦茨D琼脂糖阳离子交换器的相同分析。捕获效率和酵母通过率将会被报道。该讨论的剩余部分基本上保持相同。

舍恩螺旋状琼脂糖柱上的蛋白捕获在色谱图上示出（图21）。与洗脱峰相比观察到一个小的流穿峰，相当于89.2%的细胞色素C捕获。

合并的280 nm处的UV吸光度显示，在仅有的缓冲液中的柱上的细胞色素C捕获与酵母混合物中的柱上的细胞色素C捕获之间存在的性质上的变化很小，意味着固体的存在不会扰乱蛋白结合能力。酵母通过率从600 nm处的UV吸光度计算（图23）。对只有酵母的曲线的相对峰强度的分析给出94.5%的酵母通过率。

结论

该研究确认，独特的施瓦茨菱形几何形状可用作用于耐固体色谱的3D打印阳离子交换色谱柱的结构。获得了37%的蛋白捕获效率，并且当一部分悬浮固体液时不会被降低。该混合液的细胞通过率为94.2%，从而显示柱处理蛋白和细胞的能力。

还展示了纤维素用作耐固体色谱的3D打印阳离子交换色谱柱的可能性。在此，蛋白捕获效率高得多（89%），固体通过率为94.5%。

工业应用性

本发明的分离介质可用来从进料流获得目标分析物。在进料流含有悬浮固体的情况下，分离介质可直接使用，而不需要首先除去固体。

Claims

1.一种包含水凝胶的分离介质，所述分离介质呈单一整块的形式，所述水凝胶具有内部通道，其中所述水凝胶的内部通道具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构，所述水凝胶包含至少一种与至少一种目标分析物结合的配体，并且其中所述水凝胶被用于亲和力色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、或多模式色谱的配体官能化。

2.根据权利要求1所述的分离介质，其中所述水凝胶的内部通道具有选自以下的群组的结构：舍恩螺旋状结构、施瓦茨菱形结构、施瓦茨初级结构，以及舍恩IWP结构。

3.根据权利要求1所述的分离介质，其中所述水凝胶的内部通道具有螺旋状结构。

4.根据权利要求1所述的分离介质，其中所述水凝胶为热敏性水凝胶。

5.根据权利要求1所述的分离介质，其中所述水凝胶为多糖水凝胶。

6.根据权利要求5所述的分离介质，其中所述水凝胶为琼脂糖水凝胶。

7.根据权利要求5所述的分离介质，其中所述水凝胶为纤维素水凝胶。

8.根据权利要求1所述的分离介质，其中所述水凝胶被用于阳离子交换色谱或阴离子交换色谱的配体官能化。

9.根据权利要求8所述的分离介质，其中用于阴离子交换色谱的配体具有选自胺、季胺、和二乙基氨基乙基的官能团，并且用于阳离子交换色谱的配体的官能团具有选自羧基和磺酸的官能团。

10.根据权利要求1所述的分离介质，其中用于疏水作用色谱的配体具有选自烷基链、苯基和苄胺基团的官能团。

11.根据权利要求10所述的分离介质，其中用于疏水作用色谱的配体具有选自丁基和辛基的官能团。

12.一种色谱装置，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的分离介质。

13.将至少一种目标分析物从进料流分离的方法，其包含将分离介质与所述进料流接触从而将所述至少一种目标分析物与所述分离介质结合，

其中所述方法进一步包含从所述分离介质回收所述至少一种目标分析物，

其中所述分离介质包含水凝胶并且呈单一整块的形式，所述水凝胶具有内部通道，其中所述水凝胶的内部通道具有表面由三维周期性极小曲面限定的结构，所述水凝胶包含至少一种与至少一种目标分析物结合的配体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中在容许所述至少一种目标分析物与所述分离介质结合的条件下将所述进料流与所述分离介质接触。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述进料流包含悬浮固体。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述悬浮固体选自由以下组成的群组：组织、组织碎片、细胞、细胞碎片、生物分子，以及生物分子聚集体，包括脂质、蛋白、碳水化合物和/或核酸的聚集体。

17.根据权利要求13所述的方法，其还包含回收所述进料流，其中在回收的进料流中所述至少一种目标分析物的浓度减少。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种目标分析物选自由以下组成的群组：抗体、抗体的抗原结合片段，以及蛋白。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述蛋白选自细胞色素C和α-乳清蛋白。