CN108588257A - 一种咖啡黄葵issr-pcr反应体系 - Google Patents

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王春娇
张智明
曹毅
郑冰云
廖慧敏
陈晓慧
罗卓林
吴其峰
刘崇峻
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Abstract

本发明公开了一种咖啡黄葵ISSR‑PCR反应体系，20μl反应体积中包括：模板DNA 40ng，引物1.0μmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，Mg2+2.5mmol/L，10×PCR Buffer 2μl；扩增反应按如下程序进行：94℃预变性5min；94℃变性1min，48～60℃退火1min，72℃延伸90s，循环40次；72℃延伸10min。本发明较为细致地进行了咖啡黄葵ISSR‑PCR反应体系的优化工作，确定了咖啡黄葵ISSR‑PCR的最佳反应体系，可用于咖啡黄葵的种质资源遗传多样性研究、种子纯度鉴定、杂交后代杂种真实性鉴定、遗传图谱构建等。

Description

一种咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系
技术领域
本发明涉及生物技术领域。
背景技术
咖啡黄葵，学名Abelmoschus esculentus(Linn.)Moench，亦称黄秋葵，是锦葵科秋葵属一年生草本植物，在热带以及亚热带地区广泛种植。咖啡黄葵的果实富含多种营养成分，食用价值极高，作为一种保健蔬菜受普罗大众所欢迎，提取出的果胶还能用于食品加工或其他工业产品。对咖啡黄葵种质资源进行遗传多样性及亲缘关系的研究有助于咖啡黄葵的鉴定、分类、选育等。国内外已有少量运用RAPD、SRAP、ISSR及SSR等分子标记技术对咖啡黄葵种质进行分析的研究。其中，ISSR分子标记技术同时具备SSR、RAPD等标记技术的优良特性，与SSR相比，该技术不需序列信息，同一套ISSR引物可作用于多种植物；与RAPD相比，ISSR重复性更高，稳定性更好，兼备RAPD的操作简便的特性，因此相比其他技术，ISSR的省时便捷、低成本、节省DNA用量、安全高效等优势尤为明显。然而，咖啡黄葵ISSR-PCR体系的优化研究尚未见报道，为了提高咖啡黄葵ISSR-PCR实验结果的清晰度、稳定性、重复性，同时降低长期科研工作的成本，必须优化咖啡黄葵ISSR-PCR体系。
发明内容
本发明提供了一种咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系。
咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系，20μl反应体积中包括：模板DNA40ng，引物1.0μmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，Mg2+2.5mmol/L，10×PCR Buffer 2μl；扩增反应按如下程序进行：94℃预变性5min；94℃变性1min，48～60℃退火1min，72℃延伸90s，循环40次；72℃延伸10min。具体退火温度根据所用引物确定。
本发明提供的咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系，扩增产物条带清晰、丰度高，稳定性好，可用于咖啡黄葵的种质资源遗传多样性研究、种子纯度鉴定、杂交后代杂种真实性鉴定、遗传图谱构建等。
附图说明
图1是ISSR-PCR正交试验1～4号处理的产物电泳图；标号M为100～3000bp LadderDNA Maker；标号1～4分别为SEQ ID№1所示引物在1～4号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号5～8分别为SEQ ID№2所示引物在1～4号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号9～12分别为SEQ ID№1所示引物在1～4号处理体系中对“华宝”的扩增条带；标号13～16分别为SEQ ID№2所示引物在1～4号处理体系中对“华宝”的扩增条带；
图2是ISSR-PCR正交试验5～8号处理的产物电泳图；标号M为100～3000bp LadderDNA Maker；标号1～4分别为SEQ ID№1所示引物在5～8号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号5～8分别为SEQ ID№2所示引物在5～8号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号9～12分别为SEQ ID№1所示引物在5～8号处理体系中对“华宝”的扩增条带；标号13～16分别为SEQ ID№2所示引物在5～8号处理体系中对“华宝”的扩增条带；
图3是ISSR-PCR正交试验9～12号处理的产物电泳图；标号M为100～3000bpLadder DNA Maker；标号1～4分别为SEQ ID№1所示引物在9～12号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号5～8分别为SEQ ID№2所示引物在9～12号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号9～12分别为SEQ ID№1所示引物在9～12号处理体系中对“华宝”的扩增条带；标号13～16分别为SEQ ID№2所示引物在9～12号处理体系中对“华宝”的扩增条带；
图4是ISSR-PCR正交试验13～16号处理的产物电泳图；标号M为100～3000bpLadder DNA Maker；标号1～4分别为SEQ ID№1所示引物在13～16号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号5～8分别为SEQ ID№2所示引物在13～16号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号9～12分别为SEQ ID№1所示引物在13～16号处理体系中对“华宝”的扩增条带；标号13～16分别为SEQ ID№2所示引物在13～16号处理体系中对“华宝”的扩增条带。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系的优化。
(1)利用改良CTAB法提取“红星”、“华宝”2个咖啡黄葵品种的基因组DNA:称取0.2g嫩叶置于研钵中，加入0.04g PVPP，液氮研磨，研磨后的粉末转移至2ml离心管中；加入1.5ml前处理液(0.2mol/L Tris pH 7.5,0.05mol/L EDTA,2mol/L NaCl)，混匀，冰浴10min；8000rpm 4℃离心5min，弃上清；迅速往弃掉上清液的离心管中加入1.2ml 65℃预热的改良CTAB提取液(3％CTAB，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，pH8.0)65℃水浴1h(期间注意颠倒混匀)，8000rpm 4℃离心5min；吸取上清液至新离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀，12000rpm 4℃离心10min，重复此步骤1次；吸取上清液至新离心管，加入1/10体积5mol/L NaCl及2/3体积异丙醇，颠倒混匀，6000rpm离心3min收集沉淀；弃掉上清液，加入0.4ml TE/NaCL缓冲液溶解沉淀；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(24:24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；吸取上清液至新离心管，加入1/10体积3M醋酸钠及2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，此时会出现絮状DNA沉淀，6000rpm离心3min收集沉淀；70％乙醇洗涤DNA沉淀2～3次，风干，溶于50μl 0.1×TE(含10μg/ml RNaseA)，55℃水浴30min，-20℃保存备用。
(2)以“红星”、“华宝”2个咖啡黄葵品种的基因组DNA为ISSR-PCR扩增的模板，以SEQ ID№1及№2为参试引物，采用L16(44)正交试验设计，对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs及引物的浓度进行4因素4水平(表1)共16个处理(表2)的试验。
表1ISSR-PCR反应体系的因素水平
表2ISSR-PCR正交试验的16个处理
PCR反应体系的总体积为20μl,模板DNA 40ng，10×PCR Buffer 2μL，引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶及Mg2+按表2的16个处理分别加入相应的量,加ddH2O补足20μl；扩增反应按如下程序进行：94℃预变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸90s，循环40次；72℃延伸10min。扩增产物用1.7％琼脂糖凝胶电泳检测。
正交试验16个处理的PCR产物电泳结果见附图1～4。在1号、2号及5～16号处理中，引物SEQ ID№1和2对“红星”与“华宝”的扩增出现了条带缺失、过少、模糊或过亮等问题；而在3号及4号处理中，扩增条带比较清晰且丰度较高。虽然3号及4号处理的效果比较接近，但对比2个处理所用的试剂量，可发现3号处理比4号处理节约33.3％的引物量及16.7％的Mg2+与dNTPs量。综合考虑扩增效果及科研工作的长期性，选择3号处理为最优体系，即总反应体系为20μL PCR反应体积中包括：模板DNA 40ng，引物1.0μmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，Mg2+2.5mmol/L，10×PCR Buffer 2μl。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种秋葵ISSR-PCR分子标记体系
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagagagag agagagg 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagagagaga gagagac 17

Claims (1)

1.一种咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系，其特征在于，20μl反应体积中包括：模板DNA40ng，引物1.0μmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，Mg2+ 2.5mmol/L，10×PCRBuffer 2μl；扩增反应按如下程序进行：94℃预变性5min；94℃变性1min，48～60℃退火1min，72℃延伸90s，循环40次；72℃延伸10min。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104541978A (zh) * 2015-01-07 2015-04-29 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 一种出菇整齐的白灵菇及其栽培方法

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张绪元 等: "43份黄秋葵种质的ISSR分析", 《热带作物学报》 *
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