CN108588082B - 烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因BtDnmt3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及烟粉虱MED隐高温耐受相关基因BtDnmt3及其应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明明确了BtDnmt3基因在烟粉虱MED隐种中的表达的时间与空间特征。该基因的表达直接降低了MED隐种对高温耐受性的能力。所获得的结果为明确BtDnmt3基因在烟粉虱MED温度耐受性中的作用奠定基础。

Description

烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因BtDnmt3及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因基因BtDnmt3及其应用。

背景技术

烟粉虱(Bemisia tabaci(Gennadius))属节肢动物门，昆虫纲，半翅目，粉虱科，小粉虱属，又称棉粉虱或甘薯粉虱。

烟粉虱的最适发育温度为26～30℃，发育临界温度在10.8～12.5℃之间，致死高温区在37～42℃之间。17℃和35℃是烟粉虱正常生长发育的最低和最高的温度极限。较强的温度逆境适应能力是烟粉虱在世界范围内广泛分布的原因。随着温室效应的增加，全球气温正逐年增高，烟粉虱较强的温度逆境适应能力使其能逐渐扩大保护地面积，这为其抵御温度逆境、延续种群提供给了场所。

随着全球温度的变化，烟粉虱MED隐种在不同地理环境下的成功适应，已经广泛引起了人们对其入侵机制的理论探讨，对于其温度适应性的分子机制更是近几年来的研究热点之一。对烟粉虱进行热激选择的实验中发现，2代内其存活率显著提高，表明存活能力的快速提高是其在恶劣环境生存的重要策略。这种短期内生物体对环境变异产生的响应机制与表观遗传有关。表观遗传过程会增加有机体对非温度胁迫和其它环境挑战的进化潜能的响应，这与全球环境变暖的背景是高度相关的。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrand RNA,dsRNA)导入细胞后能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。RNAi广泛存在于生物界，通过RNAi技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段，进而达到利用或防治其危害的目的。由于烟粉虱个体体积小，注射dsRNA不易操作、费时等限制，而饲喂dsRNA具有简便、易于操作等特点而在烟粉虱研究中得以应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因BtDnmt3。

本发明的再一目的是提供上述烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因BtDnmt3的应用。

根据本发明的烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因BtDnmt3，该基因cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

根据本发明的具体实施方式，首次克隆出烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因BtDnmt3，实验分析证实：BtDnmt3基因定位在细胞核内，编码蛋白的氨基酸的数目为653个。MEME分析发现，BtDnmt3有6个保守的motif。对得到的motif进一步分析，发现有6个motif注释为DNA甲基转移酶高度保守位点，分别为motifⅠ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ。

对BtDnmt3进行不同组织的表达谱分析，实时荧光定量PCR结果表明，BtDnmt3在头部、胸部和腹部中均有表达，且在腹部显著高表达。

对BtDnmt3进行不同发育阶段的表达谱分析，实时荧光定量PCR结果表明，BtDnmt3在卵期、一龄、二龄、三龄、四龄、伪蛹、成虫中具有表达。成虫之前，在卵期高表达，后表达量逐渐降低，到成虫再次高表达。

本发明提供了上述烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因BtDnmt3的应用。对烟粉虱MED隐种进行RNAi，结果显示，饲喂ds BtDnmt3的MED隐种成虫的高温耐击倒时间显著降低。说明BtDnmt3基因在烟粉虱MED隐种中的温度耐受性中起关键作用。上述烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因BtDnmt3可用于破坏烟粉虱温度耐受性，进而用于防治烟粉虱的应用。

本发明首次从烟粉虱MED隐种中克隆出高温耐受相关基因BtDnmt3。明确了高温耐受相关基因在烟粉虱MED隐种中的表达的时间与空间特征。该基因的表达直接降低了MED隐种对高温耐受性的能力。所获得的结果为明确高温耐受相关基因在烟粉虱MED温度耐受性中的作用奠定基础，期望为进一步研究烟粉虱MED隐种的温度耐受性机理与DNA甲基化机制的关系和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。

附图说明

图1显示了BtDnmt3基因在烟粉虱MED隐种中组织特异性分析；

图2显示了BtDnmt3基因在烟粉虱MED隐种中不同发育历期分析；

图3显示了BtDnmt3基因的dsRNA处理对烟粉虱MED隐种成虫耐热性的影响：比较饲喂BtDnmt3基因dsRNA、dsEGFP和饲喂10％蔗糖溶液3h后烟粉虱MED隐种成虫高温击倒时间。

具体实施方式

实施例1：烟粉虱MED隐种BtDnmt3基因全长cDNA序列克隆

1、总RNA提取及cDNA合成

(1)从烟粉虱成虫提取总RNA

分别取不同温度胁迫条件下烟粉虱成虫200头放入1.5mL的离心管，液氮冷冻后利用研磨棒将其研成粉末，然后提取RNA，-80℃保存以备用。

(2)根据Transgen公司的反转录试剂盒(Super Script First-StrandSynthesisSystem)说明，反转录合成cDNA：

2、PCR扩增烟粉虱MED隐种BtDnmt3基因的中间片段

(1)设计PCR扩增烟粉虱MED隐种BtDnmt3基因的中间片段引物：

BtDnmt3-F：CTACTGCTAAACTCCATTCGC

BtDnmt3-R：CTCTGAAACACGGTAGTCCC

(2)以cDNA为模板，利用(1)所设引物，PCR扩增烟粉虱MED隐种BtDnmt3基因的中间片段。

(3)回收目的片段，并测序；

3、烟粉虱MED隐种BtDnmt3基因5’RACE和3’RACE获得

(1)根据步骤2所获得的烟粉虱MED隐种BtDnmt3基因的中间片段序列，设计5’RACE和3’RACE特异性引物，PCR扩增BtDnmt3基因的5’和3’端序列：

5’RACE Inner Primer:GGAACCTCTGAAACACGGTAGTCCCCAA

5’RACE Outer Primer:TTGTGACACGCAGTGACTTCAGTGATAGGT

3’RACE Inner Primer:TAACCACCAATCCAAATTCCTTGCGGC

3’RACE Outer Primer:TGGTTTGGGGACTACCGTGTTTCAGAGG

(2)采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clonetch)试剂盒，获得BtDnmt3基因的cDNA序列全长,得到BtDnmt3基因4512bp序列，所得的基因具有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，包含653个核苷酸，该基因所编码的酶具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

实施例2：BtDnmt3基因的表达特性分析

一、在烟粉虱MED隐种中组织特异性分析

1、提取不同组织部位RNA及cDNA合成：

选取初羽化的MED隐种成虫，在显微镜下进行解剖，分别搜集头部、胸部、腹部的组织。总共需要成虫800头。将搜集的样本于液氮中冷冻3分钟后-80℃保存。按照实例1的方法提取RNA并反转录成cDNA。

2、荧光定量PCR检测不同组织表达量：

(1)设计荧光定量PCR的BtDnmt3基因和β-tublin内参基因的引物：

qBtDnmt3-F:GGACTACCGTGTTTCAGAG

qBtDnmt3-R:CATGTGCAAAGGAATACTAGATA

qβ-tublin-F：TTCATGGTTGATAACGAAGC

qβ-tublin-R：GCACCAAGTTAGTCTGGAAT

(2)反应体系为20μL：2×TransStartTM Green qPCR 10.0μL、ROA 0.4μL、cDNA模板1.0μL、Primer-F 0.3μL、Primer-R 0.3μL、ddH2O 8.0μL。

反应条件：94℃30s；95℃5s,53℃30s,72℃30s,0个循环。

3、数据分析

用2-ΔΔCt方法(Livak&Schmittgen,2001)计算基因相对表达量。采用SPSS 16.0统计软件分析。表达量的比较采用Fisher’s least significant difference(平均数±标准误(Means±SE)表示数据，P<0.05。

如图1显示，对BtDnmt3进行不同组织的表达谱分析，实时荧光定量PCR结果表明，BtDnmt3在头部、胸部和腹部中均有表达，且在腹部显著高表达。

二、BtDnmt3基因在烟粉虱MED隐种中不同发育历期分析

1、提取不同发育历期RNA及cDNA合成：

在显微镜分别搜集不同发育历期的虫态，收集量如下：卵(>1500粒)、一龄和二龄(>1000头)、三龄和四龄(>600粒)、伪蛹(>400头)和成虫(>200头)。将搜集的样本于液氮中冷冻3分钟后-80℃保存。按照实例1的方法提取RNA并反转录成cDNA。

2、荧光定量PCR检测不同发育历期的表达量

如图2显示，对BtDnmt3进行不同发育阶段的表达谱分析，实时荧光定量PCR结果表明，BtDnmt3在卵期、一龄、二龄、三龄、四龄、伪蛹、成虫中具有表达。成虫之前，在卵期高表达，后表达量逐渐降低，到成虫再次高表达。

三、BtDnmt3基因的dsRNA处理对烟粉虱MED隐种耐热性的影响

1、dsRNA模板的制备：

(1)设计合成加上T7启动子(下划线所示序列)的引物序列：

T7+BtDnmt3-F：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGACTACCGTGTTTCAGAG-3’

BtDnmt3-R：5’-CATGTGCAAAGGAATACTAGATA-3’。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(2)总RNA提取及cDNA合成：同实施例1。

(3)T7引物PCR扩增、产物纯化，纯化所得的PCR产物即为合成dsRNA的模板。

2、dsRNA的合成与纯化

使用

RNAi Kit试剂盒合成和纯化dsRNA，按照试剂盒说明书进行操作。

3、dsRNA饲喂

Parafilm膜预先用DEPC水处理以去除RNA酶。在浓度为10％的蔗糖液中加入dsRNA，浓度为0.3～0.5μg/μL。根据实验需求，对Parafilm膜夹营养液法做了相应的改进：取初羽化烟粉虱成虫约200头，放入两端通透的玻璃管中，用双层Parafilm覆盖玻璃管上端，在两膜之间加入浓度为10％的蔗糖溶液200μL，并加入dsRNA，并使其终浓度为0.3-0.5μg/μL，玻璃管下端用纱布覆上，保持通风透气。玻璃管周围及下端用黑色塑料包裹，使烟粉虱向顶端Paraflim膜聚集更好的取食dsRNA，将装置放入人工气候箱，温度26±0.5℃，24h光照，相对湿度为60-70％，饲喂3h BtDnmt3基因的dsRNA后，将烟粉虱收集于指型管中，放入预热的高温水浴锅进行热击倒，并开始记录至烟粉虱不能直立站立的时间，处理温度为45℃。以饲喂dseGFP且灭菌处理过的10％的蔗糖溶液的烟粉虱作为阳性对照，和不含dsRNA且灭菌处理过的10％的蔗糖溶液的烟粉虱作为阴性对照，每组3个重复。

利用SPSS16.0统计软件分析饲喂不同溶液后烟粉虱MED隐种高温击倒时间，结果如图3所示，饲喂BtDnmt3基因dsRNA的烟粉虱MED隐种的击倒时间显著低于饲喂dseGFP组和蔗糖组的击倒时间(P<0.05)；同时在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST显示，所饲喂的靶序列片度为BtDnmt3基因特有的序列，由此确保了干扰效果为烟粉虱MED隐种的目的BtDnmt3基因所产生，因此，本发明说明BtDnmt3基因在烟粉虱MED隐种v性中起着关键作用。

本发明从烟粉虱MED隐种中克隆到BtDnmt3基因的cDNA，荧光定量PCR显示BtDnmt3基因在MED隐种不同发育历期均有表达，且在成虫期显著高表达，成虫中主要在腹部高表达；最后通过饲喂BtDnmt3基因dsRNA，进而导致烟粉虱MED隐种成虫的高温击倒时间显著减少。根据本发明的具体实施方式，试验结果明确了BtDnmt3基因在烟粉虱MED隐种中的表达时间与空间特征及该基因在MED隐种中温度耐受性起关键作用。本发明为进一步明确BtDnmt3基因在烟粉虱MED隐种中温度耐受性的作用奠定基础，期望为进一步研究烟粉虱MED隐种的温度适应机理与DNA甲基化机制的关系和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 烟粉虱MED 隐种高温耐受相关基因BtDnmt3及其应用

<150> 2017103873075

<151> 2017-05-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4512

<212> DNA

<213> 烟粉虱(Bemisia tabaci)

<400> 1

ttgggtgaca ctatagaata ctcaagctat gcatccaacg cgttgggagc tctcccatat 60

ggtcgacctg caggcggccg cgaattcact agtgattggg atcgccctta agcagtggta 120

tcaacgcaga gtacatggga ttgttgatgt tgcacttttc agtctttagt gtgaaaaggt 180

gaggtttctg aacgatttgc ccttaattaa tgtgtttaaa attagttttt acgcaattat 240

gaagtattag aatcactctt gagtccgtta ttttaccctt tttccttttt atccttccgt 300

tttctgaaat ttactcttca agtatggcca tctggctaat ttgagaagct gcacagtggc 360

agccatagtg agatttgcac agtgaacgtt ctattgtatg aaccgatccc agtgtaagta 420

caatgaggca tacagatcta gacttatcgt tagacagccg ttcatggaag attttgattg 480

tatgaaccgc tcccagtgta agtacaatga ggcatacaga tctagactta tcgttagaca 540

gctgttcatg gaagattttt aacaaaatcc gtctgaattt gcaggcagct actgctaaac 600

tccattcgca gctgcgaagc tcatcaaatc aatcaatcaa caacgatgtc ttttgtatat 660

acctatcact gaagtcactg cgtgtcgcaa tgtcaatacc atcaaagacc ttaatcgcca 720

gtagtctcat acctgtcaaa tgggacaaaa agattattga cagtttgtta ttgtgcagga 780

aaatctccaa ttcactctgg ttgccaggga tcattaaacc aatacaatgt gaataatgga 840

aggatagcaa ctgttggact taaggtgaac aaactaggag gtagattcca acgcacaaac 900

gtagacagga caaaaaagat ggctgaaaat gaaaaacagt gttgctgcat aggcgcacca 960

caaagaagcg taatgatctc caccttgctg tccatcaacc accttctggt ctggtccgcc 1020

tcggcatccc tcagcctccc ctattgtaac cctggaccaa tctggcgggt gttacatctt 1080

tagttagcct ggcaacgctg tatccaagta gggcctctgg aacgccgtgt tccggaaaat 1140

tgaagaatga gccctcagac gttgccaaat ttccttcgac aaatcacgaa ttttcgggaa 1200

agccctgtac cacaatgggg agaaaagcaa gaacaataac aactagcagc aatcccaagg 1260

ctttgaaatg gggaagtaat gttcctcttg gcttattagt gtggggaaaa gtctcatcct 1320

caccatggtg gccaggcatt gttgtgaatc atgaagactg tggagtaaac cctcctgcag 1380

tatcatccgt ttgggttttt tggtttgggg actaccgtgt ttcagaggtt cctctttctc 1440

ggctccagcc tttcgcagag agttttgtga aattttttga caagaacaac aaaggtgtca 1500

gactcaaaaa tggtgtacta gaagctatta agattcatgc agcacgcagt ggagaaactg 1560

acagtgaact ttggaacttc tcagatgctg tttcttggat atctagtatt cctttgcaca 1620

tgttgaagtc caaacacatt tcgtcaagcg attcgtttga tgatgacctc cctgaatttg 1680

tcaacagtaa aattttgaaa attaaattga ccaacttaga acttacacgc gcagaaaaca 1740

aacgcaagag tgaggaaagt gatgatgatg atgagatatg caagttcaac aaaaagttga 1800

aggcaagtca agataatgtt gatgcaagca gagaagttgc gtttaaatct tcagttatcg 1860

aaaaagtgaa gggcaagaag ttaaagctag aaaatatatg cctttgctgt gtaagagaaa 1920

aaagcaatct aaatcatgag catccatttt ttgaaggaag agtctgcgat caatgttttg 1980

aagaaatcaa ggatacggct tttgtaatag gagatgacaa tgtctattac cactgtgttg 2040

tatgtgcgca aagaggagta gttcttattt gcgacaatcc atcctgcaaa aaggtttatt 2100

gcaacacttg tattgaagtt ctgtgtccaa aaaaagctag agaaaggatc gctgaaatga 2160

atccatggct ctgctttttg tgctcaggtt atgacaaaca actcaatggg ttcttgaaga 2220

aacgtgaaaa cttctctgct catgttgcca aaatgtacat tgagcatcca aaaccagaga 2280

taattcctaa atttgaaaga catcccttac gtgttctatc cttattcgat ggaattggga 2340

caggattgtg tgttttgaag aagctgaaat taaaagtaga ggtgtactat gcaagtgaga 2400

tcgaagatga tgccatcaat gtgactacaa tgaatcacgg ctcggatgtg attcatctgg 2460

ggaaagtaga agacctaacc aatgctgaac ttgcaaaact gggcccaatt gatcttctga 2520

ttggaggatc accttgcaat gaattaagtg gagtcaatca tgccagaaag ggaatctatg 2580

atgcaactgg tactggagtc ctgttttttg acttcttccg catactgcaa ttcctgaaga 2640

caaacaatga tggtcgtcat ttgttttggt tgttcgagaa tgttacatcc atgccaaaag 2700

attacagaaa agtgattaca cgattttttg agtgtgaccc tattgttgtg gatgcaaaat 2760

atttttctgc tcaaaataga tccagatttt tctggggaaa catcccaagt ctaagaaagg 2820

ctcaagaaag cgctatggat atagaaaatt gccctgagtt aaacagtgtc ttgacaaaaa 2880

attgcagccg aaaagctgta gtcaaaaaag tgtgcaccat aaccaccaat ccaaattcct 2940

tgcggcaagg gaaggaagca tcaatgccag tactcatgaa tggcaaaggt gacactttgt 3000

gggctacaga gatggaagag ctttttggtt ttccgcggca ctacacagat gctggaaacc 3060

ttcagccatc cagaagactc cgtttactcg gcaaatcctg gtcaattcct gttttgtgcc 3120

acattctcaa acctttgact atgttgtacc catccactga agcagaaatt gattgagttt 3180

atttaatttt tgtcaatgta tgatctcaaa tgtttgataa tgatgtttgt tgttttttgt 3240

ttgtatgttc tttttcttaa gtttaaattt gtgagcatgc aacttgtaaa tcttaaaatt 3300

atatttagtt ctaagtgaag aaagctatca aactatgttt gctccttcag catatggagt 3360

gttaagtcat ttactctcaa gtcatttttt tcgtgtctaa ttgtaaaata tttttgtaga 3420

caatactgtg ttcccaagta gtgttagtcc tttccagtta acttctattt tttctggaac 3480

cagttgcatg aaggtttaat tctcgtgcct ttttaattgg tgaacatttt tatagatcag 3540

ctcagtttga gtaagactta atttttttac cgagaactaa gatttttagg ataaacaaat 3600

agaatggaag tagacgctct gcaggataaa cgttttagca tttttgttaa ataattatta 3660

aagctaaata taattatagc caccagcgtt ttgagtctag catgaggata aattaatatt 3720

caatgcattc tcataattaa attgaatctg ttcgttcacc taaactttta cggtatttgt 3780

gcaagcattt tcatcctgaa attgcatttt ctttctcact aaaatttttt actgattata 3840

tgaatgacac tgatctgtta ttgcatgaga aatgtattat tatttctttg aatctgtcat 3900

tttttagtaa tggtgctctt ctctctttag atatttttac tggtctcagt aaagatcacc 3960

acacccttcc acatattgag aattgtgcct atttcagcaa atgaacaata atgttcttgt 4020

tccctgagca ggccaaattt tgttctctaa aacgagataa gtatatcaat ggaagtatca 4080

aagaattctg tggctctttt gtactgcctc agataatata tctctgttaa atgtttttta 4140

actttatatt gttgacaagt aatagaatta tgtgccttaa atgccatgct ctctatgtta 4200

cttcataatt tttactcatt cacgaatgtc atgattatct tgatcatatt tactgcatat 4260

agaatggttg gagccattct tgatccaaaa gggaagcatt aattgttaca catgaaaaat 4320

gattgcatta ttatcataat gcaatcatat gaaaggtctg attaattaat tataattaag 4380

ttttcgcagt atggtattac cactcattct attgcagttt acacgtataa taaattacaa 4440

ttatttttac tgctttaaca gtttcaaatt tctctaactt aggtagaaaa aaaaaaaaaa 4500

aaaaaaaaaa aa 4512

<210> 2

<211> 653

<212> PRT

<213> 烟粉虱(Bemisia tabaci)

<400> 2

Met Gly Arg Lys Ala Arg Thr Ile Thr Thr Ser Ser Asn Pro Lys Ala

1 5 10 15

Leu Lys Trp Gly Ser Asn Val Pro Leu Gly Leu Leu Val Trp Gly Lys

20 25 30

Val Ser Ser Ser Pro Trp Trp Pro Gly Ile Val Val Asn His Glu Asp

35 40 45

Cys Gly Val Asn Pro Pro Ala Val Ser Ser Val Trp Val Phe Trp Phe

50 55 60

Gly Asp Tyr Arg Val Ser Glu Val Pro Leu Ser Arg Leu Gln Pro Phe

65 70 75 80

Ala Glu Ser Phe Val Lys Phe Phe Asp Lys Asn Asn Lys Gly Val Arg

85 90 95

Leu Lys Asn Gly Val Leu Glu Ala Ile Lys Ile His Ala Ala Arg Ser

100 105 110

Gly Glu Thr Asp Ser Glu Leu Trp Asn Phe Ser Asp Ala Val Ser Trp

115 120 125

Ile Ser Ser Ile Pro Leu His Met Leu Lys Ser Lys His Ile Ser Ser

130 135 140

Ser Asp Ser Phe Asp Asp Asp Leu Pro Glu Phe Val Asn Ser Lys Ile

145 150 155 160

Leu Lys Ile Lys Leu Thr Asn Leu Glu Leu Thr Arg Ala Glu Asn Lys

165 170 175

Arg Lys Ser Glu Glu Ser Asp Asp Asp Asp Glu Ile Cys Lys Phe Asn

180 185 190

Lys Lys Leu Lys Ala Ser Gln Asp Asn Val Asp Ala Ser Arg Glu Val

195 200 205

Ala Phe Lys Ser Ser Val Ile Glu Lys Val Lys Gly Lys Lys Leu Lys

210 215 220

Leu Glu Asn Ile Cys Leu Cys Cys Val Arg Glu Lys Ser Asn Leu Asn

225 230 235 240

His Glu His Pro Phe Phe Glu Gly Arg Val Cys Asp Gln Cys Phe Glu

245 250 255

Glu Ile Lys Asp Thr Ala Phe Val Ile Gly Asp Asp Asn Val Tyr Tyr

260 265 270

His Cys Val Val Cys Ala Gln Arg Gly Val Val Leu Ile Cys Asp Asn

275 280 285

Pro Ser Cys Lys Lys Val Tyr Cys Asn Thr Cys Ile Glu Val Leu Cys

290 295 300

Pro Lys Lys Ala Arg Glu Arg Ile Ala Glu Met Asn Pro Trp Leu Cys

305 310 315 320

Phe Leu Cys Ser Gly Tyr Asp Lys Gln Leu Asn Gly Phe Leu Lys Lys

325 330 335

Arg Glu Asn Phe Ser Ala His Val Ala Lys Met Tyr Ile Glu His Pro

340 345 350

Lys Pro Glu Ile Ile Pro Lys Phe Glu Arg His Pro Leu Arg Val Leu

355 360 365

Ser Leu Phe Asp Gly Ile Gly Thr Gly Leu Cys Val Leu Lys Lys Leu

370 375 380

Lys Leu Lys Val Glu Val Tyr Tyr Ala Ser Glu Ile Glu Asp Asp Ala

385 390 395 400

Ile Asn Val Thr Thr Met Asn His Gly Ser Asp Val Ile His Leu Gly

405 410 415

Lys Val Glu Asp Leu Thr Asn Ala Glu Leu Ala Lys Leu Gly Pro Ile

420 425 430

Asp Leu Leu Ile Gly Gly Ser Pro Cys Asn Glu Leu Ser Gly Val Asn

435 440 445

His Ala Arg Lys Gly Ile Tyr Asp Ala Thr Gly Thr Gly Val Leu Phe

450 455 460

Phe Asp Phe Phe Arg Ile Leu Gln Phe Leu Lys Thr Asn Asn Asp Gly

465 470 475 480

Arg His Leu Phe Trp Leu Phe Glu Asn Val Thr Ser Met Pro Lys Asp

485 490 495

Tyr Arg Lys Val Ile Thr Arg Phe Phe Glu Cys Asp Pro Ile Val Val

500 505 510

Asp Ala Lys Tyr Phe Ser Ala Gln Asn Arg Ser Arg Phe Phe Trp Gly

515 520 525

Asn Ile Pro Ser Leu Arg Lys Ala Gln Glu Ser Ala Met Asp Ile Glu

530 535 540

Asn Cys Pro Glu Leu Asn Ser Val Leu Thr Lys Asn Cys Ser Arg Lys

545 550 555 560

Ala Val Val Lys Lys Val Cys Thr Ile Thr Thr Asn Pro Asn Ser Leu

565 570 575

Arg Gln Gly Lys Glu Ala Ser Met Pro Val Leu Met Asn Gly Lys Gly

580 585 590

Asp Thr Leu Trp Ala Thr Glu Met Glu Glu Leu Phe Gly Phe Pro Arg

595 600 605

His Tyr Thr Asp Ala Gly Asn Leu Gln Pro Ser Arg Arg Leu Arg Leu

610 615 620

Leu Gly Lys Ser Trp Ser Ile Pro Val Leu Cys His Ile Leu Lys Pro

625 630 635 640

Leu Thr Met Leu Tyr Pro Ser Thr Glu Ala Glu Ile Asp

645 650

Claims (1)

1.一种降低烟粉虱MED隐种的温度耐受性的方法，其特征在于，给成虫期的烟粉虱MED隐种饲喂BtDnmt3基因的dsRNA片段，其中，基因BtDnmt3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

其中，所述dsRNA片段通过使用以下引物扩增SEQ ID No.1所示基因而得，

T7+BtDnmt3-F：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGACTACCGTGTTTCAGAG-3’

BtDnmt3-R：5’-CATGTGCAAAGGAATACTAGATA-3’，

dsRNA的浓度为0.3～0.5μg/μL。

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