CN108586599B - 一种用于评价化疗耐药性的分子标志物及其检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于评价化疗耐药性的分子标志物及其检测试剂盒。所述的分子标注物是KIF4蛋白的多肽片段，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。所述的化疗耐药指非小细胞肺癌患者中与LRP(肺耐药相关蛋白，lung resistance‑related protein，LRP)的功能相关的针对化疗药物的耐药性，所述的化疗药物优选为顺铂。

Description

一种用于评价化疗耐药性的分子标志物及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一种用于评价化疗耐药性的分子标志物及其检测试剂盒。
背景技术
2014年世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的报告中指出，肺癌已超越乳腺癌，发病率和致死率均为恶性肿瘤之首，是对人类生命威胁最大的疾病之一。肺癌发病率逐年上升，特别是发展中国家尤其明显，2012年全球新增肺癌病例180万。我国的肺癌发病率和致死率位居全球首位，环境恶化以及吸烟等不良生活习惯是其主要原因。同时，作为我国头号癌症杀手，肺癌发病率在我国呈现明显的逐年上升的趋势。据统计，我国每年大约有超过60万人死于肺癌。
肺癌分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占80％以上。目前肺癌治疗主要是采取手术切除结合放、化疗等手段。化疗主要包括靶点清楚的靶向治疗和靶点不清楚的常规化学药物治疗。但在肺癌病人化疗过程中，很多患者出现的化疗药物耐药性，极大的影响了肺癌治疗效果。肺癌患者化疗耐药不仅导致患者巨大的经济浪费，最重要的是丧失了有效治疗肺癌患者的最佳时机。然而目前国内外尚无特异性有效早期预测肺癌患者化疗耐药的分子诊断试剂盒，研发肺癌病人化疗耐药早期预测分子诊断试剂盒势在必行。
对于肺癌耐药性的分子机制，目前主要研究是基于多药耐药机制，认为是由于肿瘤细胞内耐药相关蛋白增多，特别是LRP(肺耐药相关蛋白，lung resistance-relatedprotein，LRP)蛋白增多，最终使化疗药物排出胞外，降低胞内化疗药物的有效浓度。LRP蛋白是一种分子量为104-110KD蛋白，它是人类的穹隆体主蛋白，参与胞核与胞质间物质交换和囊泡运输的调控，可能通过降低药物核质分布比率以降低核内药物浓度，并通过囊泡转运和胞吐将药物排出细胞外。研究结果显示，LRP在肺癌组织中的表达率和表达强度远远高于正常组织。
由于染色体驱动蛋白分子KIF4A的高表达与肺癌发生发展及预后密切相关，而且驱动蛋白KIF4A作为细胞内的动力蛋白，已经证实负责细胞浆内囊泡、细胞器以及多种生物大分子等的运输。实验结果表明驱动蛋白KIF4A与LRP蛋白在耐药肺癌细胞内相互结合。进一步实验证实在细胞内LRP蛋白介导的囊泡转运依赖于驱动蛋白分子KIF4A，因此可以推测，LRP介导的肺癌细胞耐药决定于驱动蛋白KIF4A的表达和功能。
在此基础上，初步检测肺癌病人肿瘤组织内的KIF4A表达水平，结合肺癌病人化疗后耐药的临床资料，发现肺癌病人肿瘤组织标本中驱动蛋白KIF4A高表达与病人化疗后出现耐药密切相关，而且相关性高于病人肿瘤组织中LRP蛋白的高表达。这些临床及基础实验室研究结果表明，驱动蛋白KIF4A的表达水平可以作为很好的肺癌病人化疗耐药的早期预测指标。
发明内容
肺癌分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占80％以上。目前肺癌治疗主要是采取手术切除结合放、化疗等手段。化疗主要包括靶点清楚的靶向治疗和靶点不清楚的常规化学药物治疗。但在肺癌病人化疗过程中，很多患者出现的化疗药物耐药性，极大的影响了肺癌治疗效果。肺癌患者化疗耐药不仅导致患者巨大的经济浪费，最重要的是丧失了有效治疗肺癌患者的最佳时机。然而目前国内外尚无特异性有效早期预测肺癌患者化疗耐药的分子诊断试剂盒，研发肺癌病人化疗耐药早期预测分子诊断试剂盒势在必行。
本发明首先涉及一种用于鉴定获得性化疗耐药的分子标志物，所述的分子标注物是KIF4蛋白的第1153至1171氨基酸的多肽片段，所述的片段的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，
Seq ID No.1：SFFNPVCAPNSKILKEMC。
所述的获得性化疗耐药指，非小细胞肺癌患者中与LRP(肺耐药相关蛋白，lungresistance-related protein，LRP)的功能相关的针对化疗药物的耐药性，所述的化疗药物优选为顺铂。
本发明还涉及以所述的分子标志物制备获得的检测抗体。
本发明还涉及以所述分子标志物制备检测抗体的方法，所述方法包括如下步骤，
(1)将抗原与佐剂混合；
(2)免疫动物
(3)分离抗血清并纯化抗体。
所述的步骤(1)为，将抗原溶于磷酸缓冲液(PBS)中，将佐剂(弗氏完全完全或不完全佐剂)按与抗原1：1的比例滴加到抗原溶液中，4℃摇匀2小时，振荡，超声，至形成油包水型抗原乳化液；
所述的步骤(2)为：
挑选健康的雄性6周左右的新西兰大白兔，动物房饲养一周使其适用环境，
实验前，在兔的耳缘静脉取2ml血作为免疫前血清，
第一周，在兔的背部皮下注射300ug抗原与弗氏完全佐剂混合液，
第三周，在兔的背部皮下注射200ug抗原与不完全佐剂混合液，
第五周，耳缘静脉取血10ml左右。取血清检测抗体的效价和特异性，
第六周，在兔的背部皮下注射200ug抗原与不完全佐剂混合液，
第七周，耳缘静脉取血10ml左右。取血清检测抗体的效价和特异性，
此后双周皮下注射抗原，单周耳缘静脉取血检测。持续3～4月；
所述步骤(3)的抗血清分离方法为：
将兔耳源静脉取的血放置4度冰箱过夜，次日取出，小心吸取黄色上清(避免吸取凝集积淀物)，即获得抗体血清，使用抗体纯化试剂盒纯化抗体。
本发明还涉及以所述的抗体制备的用于检测KIF4A分子的分子诊断试剂盒，所述的试剂盒包括：用于定量KIF4A分子的所述抗体，以及必要的封闭液、二抗、显色液和缓冲液。
本发明还涉及所述的抗体、诊断试剂盒在制备诊断获得性化疗耐药的试剂盒中的应用。
本发明的有益效果：肺癌病人化疗耐药早期预测分子诊断试剂盒是建立研究团队多年科研成果和学术背景知识基础上，并进过临床实践检测验证。肺癌病人化疗耐药早期预测分子诊断试剂盒能够有效解决肺癌病人化疗耐药早期预测诊断难题，目前国内外市场尚无该类分子诊断试剂盒产品，该试剂盒将填补国内外该领域的空白，具有创新性和先进性。
附图说明
图1、本发明所述的试剂盒的制备流程图。
图2、免疫组化检测KIF4A在非小细胞肺癌组织中的表达。
图3、接受铂类治疗后晚期非小细胞肺癌患者中KIF4A蛋白表达情况与中位无进展生存期(progression-freesurvival，PFS)及总体生存期(overall survival，OS)之间的关系。
图4、抗体血清的特异性WB杂交结果图。
图5、纯化抗体对体外培养的A549细胞的荧光染色(KIF4A为绿色)验证。
具体实施方式
实施例1、特异性KIF4A蛋白分子抗体的制备
1、首先进行根据KIF4A蛋白分子的氨基酸序列设计制备抗体所需的多肽；所述的多肽为KIF4蛋白的第1153至1171位氨基酸的多肽片段，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，由杭州丹港生物科技有限公司合成。
Seq ID No.1：SFFNPVCAPNSKILKEMC。
2、将多肽与血蓝蛋白(KLH)交联后作为免疫原；
3、以新西兰大白兔为免疫动物，制备特异性KIF4A蛋白分子的特异性抗体；
(1)动物免疫方法：
1)将抗原(多肽-KLH偶联复合物)溶于磷酸缓冲液(PBS)中，与佐剂(弗氏完全完全或不完全佐剂，Sigma-Aldrich公司产品)1：1均匀混合。方法：将佐剂滴加到抗原中,4℃摇匀2小时,振荡,超声,至形成油包水的小滴。
2)免疫动物
A.挑选健康的雄性6周左右的新西兰大白兔，动物房饲养一周使其适用环境。
B.实验前，在兔的耳缘静脉取2ml血作为免疫前血清。
第一周，在兔的背部皮下注射300ug抗原与弗氏完全佐剂混合液。
第三周，在兔的背部皮下注射200ug抗原与不完全佐剂乳化液。
第五周，耳缘静脉取血10ml左右。取血清检测抗体的效价和特异性。
第六周，在兔的背部皮下注射200ug抗原与不完全佐剂乳化液。
第七周，耳缘静脉取血10ml左右。取血清检测抗体的效价和特异性。
C.此后双周皮下注射抗原，单周耳缘静脉取血检测。持续3～4月。
(2)抗血清分离方法：
将兔耳源静脉取的血放置4度冰箱过夜。次日取出，小心吸取黄色上清(避免吸取凝集积淀物)，即获得抗体血清。
4、对上述抗体血清的特异性进行相关分子生物学实验方法鉴定
应用人肺腺癌细胞A549对所述抗体血清的特异性进行分子生物学实验方法鉴定，步骤如下，
1)体外培养人肺腺癌细胞A549。
2)收集1×107细胞，加入500微升RIPA细胞裂解液进行裂解。
3)将细胞裂解液对半分到2个1.5ml离心管内。
4)分别向离心管内加入1微升上述抗体血清和兔免疫前血清。
5)4度混匀4小时。
6)加入20微升蛋白A琼脂糖磁珠(protein A beads)。继续4度混匀2小时。
7)短暂离心，去掉上清，应用适量RIPA裂解液对磁珠进行洗涤2次。
8)离心去掉洗液，向管内磁珠加入20微升蛋白上样缓冲液(SDS loadingbuffer)，95度加热5min，冷却至室温。
9)短暂离心后，取上清进行常规蛋白电泳(SDS-PAGE)，随后将蛋白转印到PVDF膜。
10)对上述蛋白转印的PVDF膜进行常规蛋白印迹杂交(Westernblot，一抗使用1：1000稀释的上述抗体血清)。
实验结果如图4显示：应用免疫前血清的样品无特异性蛋白条带，相反应用抗体血清的样品在分子量140KDa位置有特异性条带(KIF4A蛋白分子量为140KDa)。
5、纯化上述特异性抗体以备应用于分子诊断试剂盒。
(1)抗体纯化：使用Thermo公司试剂盒(货号44999)纯化抗体血清。
(2)纯化抗体的验证：使用纯化的抗体(1：100稀释)对体外培养的A549细胞进行免疫荧光染色(KIF4A为绿色)，染色结果见图5，显示KIF4A在有丝分裂细胞内的亚细胞定位与前报道一致。
实施例2、KIF4A分子诊断试剂盒的组装、优化
以上述特异性抗体为基础组装特异性免疫组化染色试剂盒。试剂盒内除特异性上述抗体外，还具备以下成分：
试剂A.即用型封闭液，10％非免疫山羊血清1瓶(3ml)
试剂B.即用型生物素标记二抗1瓶(3ml)
试剂C.即用型链霉亲和素过氧化物酶藕1瓶(3ml)
试剂D.浓缩底物缓冲液(20X)1瓶(160ul)
试剂E.DAB chromogen(20X)1瓶(160ul)
试剂F.0.6％H2O2(20X)1瓶(160ul)。
具体试剂盒组成：
以上述特异性抗体为基础，结合通用兔源免疫组化试剂盒(购自杭州丹港生物科技有限公司)组装特异性免疫组化染色试剂盒。
所需其它试剂及材料(试剂盒未提供)：
1.一抗(上述特异性兔抗KIF4A抗体，20μl/支)
2.蒸馏水或去离子水
3.30％H2O2
4.10mM PBS,pH 7.4或50mM TBS,pH 7.8
5.二甲苯、乙醇、无水甲醇
6.苏木精染液
7.封片胶
8.显微镜
染色步骤：(石蜡肿瘤组织切片)
1.标本制备
石蜡切片用二甲苯常规脱蜡、入水、抗原修复。染色前用PBS浸泡组织或细胞涂片10分钟。
2.染色
a)石蜡切片放入3％H2O2-甲醇液中浸泡10分钟，以消除内源性过氧化氢酶的作用。
b)用PBS洗2min/次×3次。
c)加一滴试剂A于组织切片上(需完全覆盖待检组织)孵育10分钟。
d)倒掉或吸干液体(不要冲洗)。
e)每张切片加约100μl一抗工作液(使用PBS缓冲液1∶100稀释抗体)(需完全覆盖待检组织)，湿盒内孵育30-60分钟。
f)用PBS洗2min/次×3次。
g)每张切片加一滴试剂B(需完全覆盖待检组织)，孵育10分钟。
h)用PBS洗2min/次×3次。
i)每张切片加一滴试剂C(需完全覆盖待检组织)，孵育10分钟。
j)用PBS洗2min/次×3次。
k)制备DAB显色液(需现用现配；以染一张切片为例；可根据需要一次染多张切片，具体用量见下表)
i.取2.5μl试剂D加入到50μl蒸馏水中，混匀。
ii.取2.5μl试剂E和2.5μl试剂F加入i中，混匀。
配制DAB显色液所需试剂D、E、F用量表
l)每张切片加一滴上述DAB显色液，室温显色2-5分钟(可在镜下掌握显色程度)。
m)自来水充分冲洗。
n)复染，盐酸酒精分化。
o)脱水、透明、封片、镜检。
3.结果
阳性结果为在抗原定位处染棕黄或棕褐色。
实施例3、使用KIF4A试剂盒检测KIF4A在肺癌组织及肺正常组织中的表达
应用实施例1制备的肺癌病人化疗耐药早期预测分子诊断试剂盒分别对出现获得性耐药的晚期非小细胞肺癌患者肺癌组织及肺正常组织中KIF4A表达情况进行检测。结果如图2所示，结果显示，KIF4A在获得性耐药的晚期非小细胞肺癌组织中高表达，呈棕黄色或棕褐色染色，而在正常肺组织中低表达。KIF4A在获得性耐药的晚期非小细胞肺癌组织和正常组织中阳性表达率分别为60.00％(30/50)和26.67％(4/15)，KIF4A在获得性耐药的非小细胞肺癌肺癌组织中阳性率明显高于正常组织。
实施例4、KIF4A蛋白表达与铂类药物疗效的关系
分别对接受铂类治疗后晚期非小细胞肺癌患者中KIF4A蛋白表达情况与中位无进展生存期(progression-freesurvival，PFS)及总体生存期(overall survival，OS)之间的关系进行分析。结果显示，使用本试剂盒检出KIF4A蛋白表达阳性与表达阴性的患者的PFS分别为6个月和9个月，两组间PFS差异有统计学意义(P＝0.003)(图3A)，使用本试剂盒检出KIF4A蛋白表达阳性与阴性患者的OS分别为16.5个月和22个月，两组间OS差异有统计学意义(P＝0.007)，(图3B)。
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。
序列表
<110> 天津师范大学
<120> 一种用于评价化疗耐药性的分子标志物及其检测试剂盒
<130> 一种用于评价化疗耐药性的分子标志物及其检测试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Phe Phe Asn Pro Val Cys Ala Pro Asn Ser Lys Ile Leu Lys Glu
1 5 10 15
Met Cys

Claims (6)

1.一种用于鉴定获得性化疗耐药的分子标志物，其特征在于，所述的分子标志物是KIF4蛋白的多肽片段，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述的获得性化疗耐药指非小细胞肺癌患者中与肺耐药相关蛋白的功能相关的针对化疗药物的耐药性，所述的化疗药物为顺铂。
3.识别权利要求1所述的分子标志物的检测抗体，所述的抗体是用所述分子标志物免疫兔获得的兔多抗。
4.制备权利要求3所述的检测抗体的方法，所述方法包括如下步骤，(1)将抗原与佐剂混合；
(2)免疫动物；
(3)分离抗血清并纯化抗体；
所述的步骤(1)为，将抗原溶于磷酸缓冲液中，将弗氏完全完全或不完全佐剂按与抗原1：1的比例滴加到抗原溶液中，4℃摇匀2小时，振荡，超声，形成抗原佐剂混合液；
所述的步骤(2)为：
挑选健康的雄性6周的新西兰大白兔，饲养一周使其适应环境，
实验前，在兔的耳缘静脉取2ml血作为免疫前血清，
第一周，在兔的背部皮下注射300μg抗原与弗氏完全佐剂混合液，
第三周，在兔的背部皮下注射200μg抗原与不完全佐剂混合液，
第五周，耳缘静脉取血10ml，取血清检测抗体的效价和特异性，
第六周，在兔的背部皮下注射200μg抗原与不完全佐剂混合液，
第七周，耳缘静脉取血10ml，取血清检测抗体的效价和特异性，
此后双周皮下注射抗原，单周耳缘静脉取血检测，持续3～4月；
所述步骤(3)的抗血清分离方法为：
将兔耳源静脉取的血放置4度冰箱过夜，次日取出，吸取黄色上清，即获得抗体血清，使用抗体纯化试剂盒纯化抗体。
5.以权利要求3所述的检测抗体制备的用于检测KIF4A分子的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：权利要求3所述检测抗体，以及封闭液、二抗、显色液和缓冲液。
6.权利要求3所述的检测抗体或权利要求5所述的诊断试剂盒在制备诊断获得性化疗耐药的试剂盒中的应用，所述的获得性化疗耐药指非小细胞肺癌患者中与肺耐药相关蛋白的功能相关的针对化疗药物的耐药性，所述的化疗药物为顺铂。
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Title
Activation of KIF4A as a Prognostic Biomarker andTherapeutic Target for Lung Cancer;MasayaTaniwaki et al;《Clinical Cancer Research》;20071115;第13卷(第22期);第6625页"Materials and Methods"，第6626页右栏最后一段，第6628页图2
Anti-KIF4A antibody produced in rabbit;SAB4501035;《Sigma-Aldrich》;20180312;全文

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