CN108559008B - 一种具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针及其制备方法。其方法是先利用GTA改性壳聚糖，制得水溶性良好且带正电荷的TMC；将TPE分子接枝到季铵化壳聚糖分子链上，得到TPE‑TMC；然后将TPE‑TMC与天然阴离子聚合物肝素在水溶液中静电自组装，制得本发明的复合纳米荧光探针。本发明通过静电自组装法将肝素与TPE‑TMC复合，经肝素改性后该粒子克服了季铵化壳聚糖荧光探针的固有缺点，细胞毒性显著减小，血液相容性提高，体内循环时间延长。本发明制备的荧光探针具有优异的生物相容性和血液相容性，同时具有聚集诱导发光特性，在生物检测领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米荧光探针领域，具体涉及一种具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素纳米荧光探针及其制备方法。
背景技术
近年来，癌症病例逐年增加，越来越多的人因此死亡，而在癌症治疗过程中，对早期癌细胞的诊断和检测起到了至关重要的作用。在众多检测技术中，荧光检测因其反应迅速、灵敏度高、分辨率高等特点脱颖而出，然而传统荧光分子往往具有聚集诱导淬灭效应，限制了其应用。2001年唐本忠等首次发现了一类具有聚集诱导发光特性的分子，在固态或聚集态下发出强烈荧光，具有较好的抗光漂白性和大斯托克斯位移等优点，大大推进了荧光检测技术的发展。
壳聚糖是一种可生物降解的天然多糖，具有优异的生物相容性、抗肿瘤活性等，因此近年来壳聚糖基荧光探针的发展备受瞩目。但是壳聚糖基荧光探针水溶性欠佳，只可溶解于酸性溶液中，在实际应用中存在一定的局限性。对壳聚糖进行季铵化改性可大大增强其水溶性等，然而过高的正电性又会引起细胞毒性增大等问题。
肝素是一种带负电的硫酸酯类抗凝血药物，具有抗凝血、抗炎、补体调节和抑制肿瘤生长等功能，其与具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖可发生静电复合，从而自组装形成纳米粒子。静电自组装法操作简单、反应迅速，经肝素改性的纳米粒子能降低正电性，大大减弱细胞毒性，降低补体激活，并延长其在体内的循环时间。因此具有聚集诱导发光特性且具备高生物相容性、低细胞毒性和体内长滞留性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针将是生物检测领域的新兴材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针及其制备方法，以获得聚集诱导发光、高生物相容性、低细胞毒性和体内长滞留性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针。
本发明的具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针，采用如下方法制得：先利用2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)改性壳聚糖，制得水溶性良好且带正电荷的季铵化壳聚糖(TMC)；将带有异硫氰酸酯基团的四苯基乙烯(TPE)分子接枝到季铵化壳聚糖分子链上，制备具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖衍生物(TPE-TMC)；然后将TPE-TMC与抗凝血的天然阴离子聚合物肝素在水溶液中静电自组装，形成具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针。
具体的，包括以下步骤：
1)首先称取壳聚糖粉末溶解于体积浓度2％的稀醋酸溶液中，再加入GTA溶液，并于65℃下反应6小时，然后使用去离子水将反应产物透析至中性，真空冻干得到季铵化壳聚糖粉末；
2)称取步骤1)中制备的季铵化壳聚糖，并溶胀于DMSO溶剂中，然后加入TPE，于65℃下反应至少48小时；使用去离子水将其透析至中性，冻干得到TPE-TMC粉末；
3)将肝素粉末溶解于去离子水中，得到肝素溶液；
4)将步骤2)得到的TPE-TMC溶解于去离子水中，配制TPE-TMC溶液，并在搅拌下向其中滴入步骤3)的肝素溶液，搅拌，使肝素与季铵化壳聚糖在水溶液中静电自组装，形成具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针。
上述技术方案中，所述的壳聚糖的脱乙酰度为80％～95％，分子量为20000～1000000。
步骤1)中制得的季铵化壳聚糖季铵化度应在15％～50％。
步骤2)中制得的TPE-TMC的TPE接枝率应为2％～20％。
本发明的有益效果在于：
本发明以壳聚糖中氨基为反应位点，在壳聚糖分子链上修饰了季铵盐基团与聚集诱导发光荧光基团，再将其水溶液与肝素水溶液共混，使其静电自组装形成纳米粒子。通过肝素静电复合改性显著减弱了纳米粒子的细胞毒性，并延长其在体内的循环时间，可制备获得适应体内微环境的纳米荧光探针。本发明制备的纳米荧光探针具有高生物相容性、低细胞毒性和体内长滞留性，同时兼具聚集诱导发光特性、抗光漂白性和大的斯托克斯位移，可应用于癌细胞的检测与示踪成像等。
附图说明
图1是TPE‐TMC的结构及1HNMR谱图；
图2是季铵化壳聚糖/肝素复合纳米粒子的TEM图片。
具体实施方式
以下结合实例进一步说明本发明。
实施例1：
1)首先称取1g壳聚糖(分子量20000，脱乙酰度80％)粉末溶解于体积浓度2％的稀醋酸溶液中，再加入0.25mL的GTA溶液，并于65℃下反应6小时。然后使用去离子水将反应产物透析至中性，真空冻干得到季铵化壳聚糖粉末，经核磁共振图谱分析其季铵化度为15％；
2)称取50mg步骤1)中制备的季铵化壳聚糖，并溶胀于1mLDMSO溶剂中，然后加入5.0mg的TPE，于65℃下反应48小时。使用去离子水将其透析至中性，冻干得到TPE-TMC粉末，经核磁共振图谱分析其TPE接枝率为5％；
3)将一定质量的肝素粉末溶解于去离子水中，得到浓度为2mg/mL的肝素溶液；
4)将步骤2)得到的TPE-TMC溶解于去离子水中，配制浓度为4mg/mL的TPE-TMC溶液，并在搅拌下向其中滴入等体积步骤3)的肝素溶液，搅拌30分钟，使带有负电荷的肝素与带有正电荷的季铵化壳聚糖在水溶液中静电自组装，形成具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针，该粒子具有电荷可调控性，低细胞毒性，优异的血液相容性以及较长的体内循环时间；
5)由动态光散射法测得步骤4)得到的纳米荧光探针平均粒径(Z-Average)为194.3±0.7nm，Zeta电位为17.6±0.6mV，然而在相同条件下，未经肝素复合的TMC水溶液的Zeta电位为36.1±0.2mV。
由于癌细胞表面带有负电荷，高正电性的TMC易与癌细胞膜发生相互作用并使其破裂，显现较高的细胞毒性。经肝素复合改性的纳米粒子正电性显著降低，克服了TMC的固有缺点，呈现低细胞毒性。另外肝素具有优秀的抗凝血性及降低补体激活特性，可大大延长该纳米粒子在体内的循环时间。
实施例2：
1)首先称取1g壳聚糖(分子量30000，脱乙酰度95％)粉末溶解于2％的稀醋酸溶液中，再加入2.5mL的GTA溶液，并于65℃下反应6小时。然后使用去离子水将反应产物透析至中性，真空冻干得到季铵化壳聚糖粉末，季铵化度为50％；
2)称取50mg步骤1)中制备的季铵化壳聚糖，并溶胀于1mLDMSO溶剂中，然后加入2.0mg的TPE，于65℃下反应48小时。使用去离子水将其透析至中性，冻干得到TPE-TMC粉末，TPE接枝率为2％；
3)将一定质量的肝素粉末溶解于去离子水中，得到浓度为1mg/mL的肝素溶液；
4)将步骤2)得到的TPE-TMC溶解于去离子水中，配制浓度为2mg/mL的TPE-TMC溶液，并在搅拌下向其中滴入等体积步骤3)的肝素溶液，搅拌30分钟，使带有负电荷的肝素与带有正电荷的季铵化壳聚糖在水溶液中静电自组装，形成具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针，该粒子具有电荷可调控性，低细胞毒性，优异的血液相容性以及较长的体内循环时间；
5)由动态光散射法测得步骤4)得到的纳米荧光探针平均粒径(Z-Average)为146.4±1.2nm，Zeta电位为19.2±0.6mV。
实施例3：
1)首先称取1g壳聚糖(分子量34000，脱乙酰度95％)粉末溶解于2％的稀醋酸溶液中，再加入0.4mL的GTA溶液，并于65℃下反应6小时。然后使用去离子水将反应产物透析至中性，真空冻干得到季铵化壳聚糖粉末，季铵化度为20％；
2)称取50mg步骤1)中制备的季铵化壳聚糖，并溶胀于1mLDMSO溶剂中，然后加入50mg的TPE，于65℃下反应48小时。使用去离子水将其透析至中性，冻干得到TPE-TMC粉末，TPE接枝率为20％；
3)将一定质量的肝素粉末溶解于去离子水中得到浓度为0.2mg/mL的肝素溶液；
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5)由动态光散射法测得步骤4)得到的纳米荧光探针平均粒径(Z-Average)为148.4±9.2nm，Zeta电位为20.2±0.5mV。
实施例4：
1)首先称取1g壳聚糖(分子量1000000，脱乙酰度95％)粉末溶解于2％的稀醋酸溶液中，再加入0.5mL的GTA溶液，并于65℃下反应6小时。然后使用去离子水将反应产物透析至中性，真空冻干得到季铵化壳聚糖粉末，季铵化度为25％；
2)称取50mg步骤1)中制备的季铵化壳聚糖，并溶胀于1mLDMSO溶剂中，然后加入3.5mg的TPE，于65℃下反应48小时。使用去离子水将其透析至中性，冻干得到TPE-TMC粉末，TPE接枝率为2.8％；
3)将一定质量的肝素粉末溶解于去离子水中，得到浓度为2mg/mL的肝素溶液；
4)将步骤2)得到的TPE-TMC溶解于去离子水中配制浓度为3mg/mL的TPE-TMC溶液，并在搅拌下向其中滴入等体积步骤3)的肝素溶液，搅拌30分钟，使带有负电荷的肝素与带有正电荷的季铵化壳聚糖在水溶液中静电自组装，形成具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针，该粒子具有电荷可调控性，低细胞毒性，优异的血液相容性以及较长的体内循环时间；
5)由动态光散射法测得步骤4)得到的纳米荧光探针平均粒径(Z-Average)为196.8±1.3nm，Zeta电位为—31.7±0.6mV。
实施例5：
1)首先称取1g壳聚糖(分子量34000，脱乙酰度85％)粉末溶解于2％的稀醋酸溶液中，再加入0.4mL的GTA溶液，并于65℃下反应12小时。然后使用去离子水将反应产物透析至中性，真空冻干得到季铵化壳聚糖粉末，季铵化度为20％；
2)称取50mg步骤1)中制备的季铵化壳聚糖，并溶胀于1mLDMSO溶剂中，然后加入3.5mg的TPE，于65℃下反应48小时。使用去离子水将其透析至中性，冻干得到TPE-TMC粉末，TPE接枝率为3％；
3)将一定质量的肝素粉末溶解于去离子水中，得到浓度为0.2mg/mL的肝素溶液；
4)将步骤2)得到的TPE-TMC溶解于去离子水中，配制浓度为0.2mg/mL的TPE-TMC溶液，并在搅拌下向其中滴入等体积步骤3)的肝素溶液，搅拌30分钟，使带有负电荷的肝素与带有正电荷的季铵化壳聚糖在水溶液中静电自组装，形成具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针，该粒子具有电荷可调控性，低细胞毒性，优异的血液相容性以及较长的体内循环时间；
5)由动态光散射法测得步骤4)得到的纳米荧光探针平均粒径(Z-Average)为85.75±0.7nm，Zeta电位为—32.8±1.1mV。
Claims (5)
1.一种具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针，其特征在于：该复合纳米荧光探针采用如下方法制得：先利用2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)改性壳聚糖，制得水溶性良好且带正电荷的季铵化壳聚糖(TMC)；将带有异硫氰酸酯基团的四苯基乙烯(TPE)分子接枝到季铵化壳聚糖分子链上，制备具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖衍生物(TPE-TMC)；然后将TPE-TMC与抗凝血的天然阴离子聚合物肝素在水溶液中静电自组装，形成具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针。
2.如权利要求1所述的具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)首先称取壳聚糖粉末溶解于体积浓度2％的稀醋酸溶液中，再加入GTA溶液，并于65℃下反应6小时，然后使用去离子水将反应产物透析至中性，真空冻干得到季铵化壳聚糖粉末；
2)称取步骤1)中制备的季铵化壳聚糖，并溶胀于DMSO溶剂中，然后加入TPE，于65℃下反应至少48小时；使用去离子水将其透析至中性，冻干得到TPE-TMC粉末；
3)将肝素粉末溶解于去离子水中，得到肝素溶液；
4)将步骤2)得到的TPE-TMC溶解于去离子水中，配制TPE-TMC溶液，并在搅拌下向其中滴入步骤3)的肝素溶液，搅拌，使肝素与季铵化壳聚糖在水溶液中静电自组装，形成具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针。
3.根据权利要求2所述的具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖的脱乙酰度为80％～95％，分子量为20000～1000000。
4.根据权利要求2所述的具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中制得的季铵化壳聚糖季铵化度应在15％～50％。
5.根据权利要求2所述的具有聚集诱导发光特性的季铵化壳聚糖/肝素复合纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中制得的TPE-TMC的TPE接枝率应为2％～20％。
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