CN108553685B - 人工肺泡的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工肺泡的制备方法。所述方法先将明胶水溶液通过微流控装置制备直径均一的明胶微球，通过自组装方法获得规则排列的明胶支架，加热使其紧密排列后灌注PU溶液，经冷冻干燥去除溶剂后，水浴法除去明胶模板，获得具有反蛋白石结构的三维多孔PU支架。然后将PU支架进行氨等离子体处理接枝氨基，通过EDC/NHS将肝素连接到氨基上，再加入VEGF，使VEGF结合于肝素上。最后将MRC‑5细胞旋转接种于VEGF修饰的PU支架上，按比例接种HUVECs和NL20细胞的混合细胞悬液，共培养后制得组织工程人工肺泡。本发明通过调控明胶溶液和聚氨酯浓度、水相和有机相的流速及通道直径，自组装温度和时间，有效调控制得的人工肺泡的直径在300微米左右。

Description

人工肺泡的制备方法
技术领域
本发明涉及一种人工肺泡的制备方法，属于组织工程技术领域。
背景技术
肺作为人体的重要器官，承载着气体交换的功能，肺组织由1.5-4亿个肺泡组成，表面积达到70-80m2，在对人体提供氧气排出二氧化碳方面发挥着重要作用。
肺泡的大小通常在250微米左右，其中表面积的90％由I型肺泡细胞占据，II型肺泡细胞约占5％，其余由巨噬细胞和血管内皮细胞共同占据。然而，很多疾病如肺癌、慢阻肺、肺动脉高压等会对肺部造成不可逆转的损伤。肺移植是目前应用较多的治疗技术，但是极为有限的供体数量，昂贵的手术费用，以及术后生存期较短等极大地限制了肺移植。
组织工程技术的出现使得肺修复成为可能。但是由于肺部组织结构复杂，肺泡形态特殊，人工肺泡的制备是一项难题。目前有些研究将非灵长类动物的肺组织进行去细胞化处理，获得具有完整肺部构造的三维支架作为肺组织工程的支架。但是迄今还没有可以用体外支架制备技术来制备人工肺泡的研究。
发明内容
针对肺部疾病造成的肺组织不可逆修复，肺移植供体不足，治疗方法极为有限的问题，本发明提供一种简便易行、尺寸可控的人工肺泡的制备方法，该方法是由组织工程三维反蛋白石结构支架、生长因子VEGF、肺细胞、内皮细胞和上皮细胞共培养组成。
本发明的技术方案如下：
人工肺泡的制备方法，以三维多孔反蛋白石结构支架为基础，修饰并缓释VEGF，依次接种肺细胞、内皮细胞和上皮细胞，培养3周后获得模拟肺泡结构的组织工程肺泡，具体步骤如下：
步骤1，配制浓度为3～10wt/v％的明胶溶液，采用微流控技术制备明胶微球，将明胶微球置于模具中，自组装排列粘结成型后得到明胶模板；
步骤2，将明胶模板浸渍在浓度为10～20wt/v％的聚氨酯(PU)的1,4-二氧六环溶液中，置于-20℃冷却，冷冻干燥后除去1,4-二氧六环，得到明胶/PU复合物；
步骤3，将明胶/PU复合物置于≥45℃水浴下，搅拌溶解去除明胶微球，得到PU三维多孔反蛋白石结构支架；
步骤4，将PU三维多孔反蛋白石结构支架进行氨等离子体处理，75％酒精浸泡，干燥后置于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和肝素(Heparin)的混合溶液中，室温下孵育，PBS清洗后，再浸泡在VEGF溶液中，4℃下孵育，得到PU-VEGF支架；
步骤5，20～30rpm转速下，将人胚肺细胞(MRC-5)悬液旋转接种至PU-VEGF支架上，然后将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与人支气管上皮细胞(NL20)悬液接种至已接种MRC-5细胞的PU-VEGF支架上，培养至少3周，得到人工肺泡。
优选地，步骤1中，明胶溶液的浓度为5～10wt/v％，所述的微流控参数为：控制明胶溶液的流速为1～3ml/h，有机相的流速为10～30ml/h，有机相通道的直径为0.5～1mm，水相溶液通道的直径为0.16～0.5mm，收集溶液为甲醇溶液，更优选为明胶溶液浓度为10％，控制明胶溶液的流速为3ml/h，有机相的流速为18ml/h，水相溶液通道的直径为0.3mm，有机相溶液通道的直径为0.7mm。
优选地，步骤1中，所述的有机相为含有3wt％司盘80的甲苯。
优选地，步骤1中，所述的自组装温度为60～80℃，自组装时间为1～2h。
优选地，步骤2中，冷却时间为4～6h。
优选地，步骤4中，所述的EDC的浓度为2mM，Sulfo-NHS的浓度为5mM，Heparin的浓度为1mg/ml。
优选地，步骤4中，室温下孵育2～3h，4℃下孵育过夜。
优选地，步骤5中，所述的MRC-5细胞的接种密度为106～107个/ml，HUVECs与NL20细胞的接种密度为105个/ml。
优选地，步骤5中，所述的旋转接种的转速为20rpm。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明通过调控明胶溶液和聚氨酯浓度、水相和有机相的流速及通道直径，自组装温度和时间，有效调控制得的人工肺泡的直径在300微米左右；
(2)本发明通过氨等离子体处理，EDC/Sulfo-NHS，肝素处理，有效接枝VEGF并实现缓释；
(3)本发明通过调节接种细胞的类型、顺序、接种方法以及各种细胞的比例，成功获得以肺细胞为主的模拟肺泡结构的人工肺泡。
(4)本发明通过人工肺泡支架的制备，修饰以及细胞接种，获得模拟肺泡构造的人工肺泡，有望应用于后续的肺组织工程中。
附图说明
图1为组织工程人工肺泡支架的制备流程示意图。
图2为组织工程人工肺泡支架的修饰流程示意图。
图3为显微镜下观察不同尺寸明胶微球图片。
图4为组织工程人工肺泡支架显微镜观察及实物图。
图5为组织工程人工肺泡支架透气性及力学性质检测图。
图6为组织工程人工肺泡细胞培养后的荧光图及HE染色图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
明胶浓度的影响
1.明胶微球的获得：明胶颗粒在大于45℃水浴环境下溶解于超纯水中，分别配制浓度为3％、5％、10％、15％、20％(wt/v)的明胶溶液。用微流控装置收集明胶微球，通过控制水相溶液(明胶溶液)流速为3ml/h，有机相(甲苯为主，加入3wt％的司盘80作为表面活性剂)流速为18ml/h，毛细管直径为0.7mm作为有机相通道，毛细管内部采用注射器针头(内径为0.3mm)作为水相溶液通道，获得明胶微球，收集于甲醇溶液中备用(附图1.A)。
2.明胶模板制备：将收集的明胶微球装入模具中，轻微震动模具使其自组装排列，放入70℃环境中1小时，使微球排列粘结成型后恢复至室温取出备用(附图1.B)；
3.明胶/PU复合物获得：PU颗粒加入溶剂1,4-二氧六环(又名二恶烷)中，浓度为15％(wt/v)，将PU溶液自上方滴加至明胶模板，浸透整个模板后迅速置于-20℃环境冷却4小时，转移至冷冻干燥机中过夜去除有机溶剂1,4-二氧六环(附图1.C)；
4.PU人工肺泡支架制备：取出明胶/PU复合物，置于45℃水浴中磁力搅拌过夜，溶解去除明胶微球，获得PU三维多孔反蛋白石结构支架(附图1.D)；
5.VEGF修饰PU支架步骤：将获得的PU支架置于等离子体处理机样品区，采用50mbar氨气环境，处理5分钟后取出备用；75％酒精浸泡30分钟后取出晾干；将EDC、Sulfo-NHS和Heparin分别以2mM、5mM和1mg/ml的浓度混合15分钟后，与氨等离子体处理的PU支架室温孵育2小时；用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍后，浸泡于100ng/ml的VEGF溶液中4℃过夜完成修饰(附图2)。
6.细胞接种及培养：将MRC-5以107个/ml浓度重悬于DMEM高糖培养液中，将细胞悬液与PU-VEGF支架一起置于涡旋式生物反应器中，以20rpm的转速旋转接种8小时后取出支架，于细胞培养箱中培养24小时后取出，用无菌滤纸吸去支架上多余培养液后，将HUVECs与NL20细胞悬液(4:1混合)以105个/ml的浓度接种于支架，用培养3周后获得人工肺泡。
浓度为3％、5％、10％(wt/v)的明胶溶液制得的明胶微球的平均直径分别为180μm，250μm，300μm(附图3A-C)。15％和20％(wt/v)的明胶溶液浓度过高，不能顺利获得微球。因此，明胶浓度为3％～10％(wt/v)时，制得的明胶微球的尺寸适于制备人工肺泡，最适浓度为10％(wt/v)。明胶浓度过低，制得的明胶微球尺寸过小，浓度过高，制得的明胶微球尺寸过大或者不能获得微球，均不适于制备人工肺泡。
实施例2
明胶溶液流速的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制明胶溶液流速为0.5ml/h、1ml/h、3ml/h、5ml/h和7ml/h。
明胶溶液流速为0.5ml/h时，流速过缓，不能获得球状明胶，而是不规则状。流速为1ml/h及3ml/h制得的明胶微球的平均直径分别为120μm及300μm(附图3D和C)。流速为5ml/h和7ml/h时不能获得微球，而是柱状长线。因此，明胶溶液流速为1～3ml/h时，制得的明胶微球的尺寸适于制备人工肺泡，最适明胶溶液流速为3ml/h。
实施例3
有机相流速的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制有机相流速为10ml/h、18ml/h、30ml/h和35ml/h。
有机相流速为10ml/h、18ml/h和30ml/h制得的明胶微球的平均直径分别为400μm(附图3E)、300μm(附图3C)、120μm(附图3D)。流速为35ml/h时，获得直径更小但是不均匀的明胶微球。因此，有机相流速为10～30ml/h时，制得的明胶微球的尺寸适于制备人工肺泡，最适有机相流速为18ml/h。有机相流速过低，制得的明胶微球尺寸过大，流速过高，制得的明胶微球尺寸过小，均不适于制备人工肺泡。
实施例4
水相溶液通道直径的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制水相溶液通道直径为0.16mm、0.3mm和0.5mm。
水相溶液通道直径为0.16mm、0.3mm和0.5mm制得的明胶微球的平均直径分别为180μm、300μm和400μm。因此，水相溶液通道直径为0.16～0.5mm时，制得的明胶微球的尺寸适于制备人工肺泡，最适水相溶液通道直径为0.3mm。水相溶液通道直径过小，制得的明胶微球尺寸过小，直径过大，制得的明胶微球尺寸过大，均不适于制备人工肺泡。
实施例5
有机相通道直径的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制有机相通道直径为0.5mm、0.7mm和1.0mm。
有机相通道直径为0.5mm、0.7mm、1.0mm制得的明胶微球的平均直径分别为180μm、300μm、400μm。因此，有机相通道直径为0.5～1.0mm时，制得的明胶微球的尺寸适于制备人工肺泡，最适明胶溶液流速为0.7mm。有机相通道直径过小，制得的明胶微球尺寸过小，直径过大，制得的明胶微球尺寸过大，均不适于制备人工肺泡。
实施例6
明胶模板制备过程中自组装温度的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制明胶模板制备过程中自组装温度为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。
明胶微球在模具中自组装后，在温度(60℃～80℃)和时间(1～2h)条件下，均可以获得三维多孔PU支架，但是反应温度的改变会影响微球间粘结程度，进而影响后续PU支架的孔隙间微孔大小，温度越高，微孔越大。60℃和1h反应条件可以获得模拟肺泡间肺泡孔尺寸的微孔(附图4)。在小于50℃时，不足以粘结成型。高于90℃，粘结过度，导致空隙间微孔太大，不能模拟肺泡结构。
实施例7
明胶模板制备过程中自组装时间的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制明胶模板制备过程中自组装时间为0.5h、1h、2h和3h。
明胶微球在模具中自组装后，在温度(60℃～80℃)和时间(1～2h)条件下，均可以获得三维多孔PU支架，但是时间的改变会影响微球间粘结程度，0.5h的反应时间过短，不能形成模板，3h时间过长，导致明胶微球后期不能很好的水浴溶解。60℃和1h反应条件可以获得模拟肺泡间肺泡孔尺寸的微孔(附图4)。附图4显示了180μm，250μm，300μm孔径的PU支架显微镜观察图以及300μm孔径PU支架实物图。
实施例8
溶剂的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，明胶/PU复合物获得过程中，将PU颗粒分别加入溶剂1,4-二氧六环、DMF、丙酮、正戊烷、正己烷、冰醋酸和DMSO中。
DMF、丙酮、正戊烷和正己烷的熔点在-50℃以下，不满足后续制备要求，在-20℃环境中不能固化，导致PU溶液不能完全填充明胶微球空隙，不能形成明胶-PU复合体。冰醋酸和DMSO的熔点虽然在-20℃以上，但是不能溶解PU。因此，1,4-二氧六环为最适溶剂。
实施例9
PU浓度的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制PU浓度为5％、10％、15％、20％和25％。
低于10％浓度的PU溶液(即5％)，会完全通过明胶微球支架，不能形成PU-明胶复合体，或者只会在明胶微球支架下层形成很薄的薄膜，不能获得三维结构。而高于20％的PU溶液(即25％)则不能渗透入明胶微球支架内部，在微球表面形成没有任何孔隙结构的PU层，与明胶微球支架相分离，或者会沿微球支架外围流下，完全包裹在微球支架外部，形成核壳结构(明胶微球支架为核，PU为壳)。10～20％的PU溶液可以从上至下渗透入明胶微球支架内部，最终形成的适宜的人工肺泡PU支架，其中15％效果最佳。
对比例1
VEGF修饰的影响
本对比例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，PU支架未经VEGF修饰。
与VEGF修饰的PU支架相比，未经修饰的PU支架上细胞黏附性差，细胞存活率低，不利于后续细胞接种，难以形成人工肺泡。
对比例2
氨等离子体处理的影响
本对比例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，PU支架未经氨等离子体处理。
修饰过程中，氨等离子体处理将氨基接枝到PU支架上，这个过程没有其他化学试剂的参与，相比于氨水或氢氧化钠等处理法，更加安全环保，没有细胞毒性，且接枝效率更高，能够提高VEGF的修饰总量。
对比例3
多孔支架制备方法以及材料选择的影响
本对比例中PU反蛋白石结构多孔支架制备与实施例1基本相同，明胶浓度为10％。所对比的另一种PU多孔支架制备方法为常规的盐颗粒沥滤制孔法，氯化钠(NaCl)颗粒的大小为250-350μm，PU溶液不变。所对比的另一种多孔支架材料为L-聚乳酸(PLLA)，制备方法为盐颗粒沥滤法。与本方法获得PU支架相比，盐颗粒沥滤法制备的PU支架和PLLA支架透气性差(附图5A)，PLLA支架硬度过高，不能模拟肺泡组织的力学性质(附图5B)。
实施例10
MRC-5细胞接种浓度的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制MRC-5的接种浓度为105个/ml、107个/ml、109个/ml。MRC-5细胞以105个/ml的浓度接种后支架上细胞量过少，不足以扩增至需要的细胞密度，无法形成肺泡主体。109个/ml的浓度使得支架细胞密度过高，充满了整个肺泡支架内部，导致后续细胞的接种失败。107个/ml浓度接种后可以覆盖到PU支架的各个孔壁，构成肺泡主体。因此107个/ml是MRC-5接种的最适浓度。附图6A显示MRC-5细胞接种后在PU支架上的分布情况，可见细胞均匀分布于PU多孔支架孔壁上。
实施例11
MRC-5细胞接种方式的影响
本实施例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，分别控制MRC-5涡旋接种转速为10rpm、20rpm、30rpm、40rpm。
涡旋式动态接种MRC-5可以使细胞均匀接种于PU支架上。转速过高细胞不易黏附，导致接种量过少(附图6B)；转速过低导致细胞黏附于PU支架表面过多，不能进入支架内部。20rpm有利于细胞均匀接种于PU支架(附图6A)。
对比例4
涡旋式接种影响
本对比例与实施例11基本相同，不同的是MRC-5采用常规静态接种。
与涡旋式动态接种相比，静态接种法细胞接种后分布在支架表层，难以进入支架内部，无法形成肺泡主体。
对比例5
本对比例与实施例1基本相同，不同的是明胶浓度为10％，细胞接种顺序为HUVECs和NL20混合接种后接种MRC-5细胞。
与MRC-5先接种相比，HUVECs和NL20混合接种在先，细胞会黏附于PU支架多孔部位表面，不利于后续MRC-5的黏附，不利于形成类似肺泡结构。

Claims (10)

1.人工肺泡的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，配制浓度为3~10wt/v%的明胶溶液，采用微流控技术制备明胶微球，将明胶微球置于模具中，自组装排列粘结成型后得到明胶模板；
步骤2，将浓度为10~20wt/v%的PU的1,4-二氧六环溶液自上方滴加至明胶模板，浸透整个模板后置于-20℃冷却，冷冻干燥后除去1,4-二氧六环，得到明胶/PU复合物；
步骤3，将明胶/PU复合物置于≥45℃水浴下，搅拌溶解去除明胶微球，得到PU三维多孔反蛋白石结构支架；
步骤4，将PU三维多孔反蛋白石结构支架进行氨等离子体处理，75%酒精浸泡，干燥后置于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺和肝素的混合溶液中，室温下孵育，PBS清洗后，再浸泡在VEGF溶液中，4℃下孵育，得到PU-VEGF支架；
步骤5，10-40 rpm转速下，将MRC-5细胞悬液旋转接种至PU-VEGF支架上，然后将HUVECs细胞与NL20细胞悬液接种至已接种人胚肺细胞的PU-VEGF支架上，培养至少3周，得到人工肺泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，明胶溶液的浓度为5~10wt/v%，所述的微流控参数为：控制明胶溶液的流速为1~3 mL/h，有机相的流速为10~30 mL/h，有机相通道的直径为0.5~1mm，水相溶液通道的直径为0.16~0.5 mm，收集溶液为甲醇溶液。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，明胶溶液浓度为10wt/v %，所述的微流控参数为：控制明胶溶液的流速为3 mL/h，有机相的流速为18 mL/h，水相溶液通道的直径为0.3mm，有机相溶液通道的直径为0.7 mm。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的有机相为含有3wt%司盘80的甲苯。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的自组装步骤中，温度为60~80℃，时间为1~2h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，冷却时间为4~6h。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为2 mM，N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为5 mM，肝素的浓度为1 mg/mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述的室温下孵育时间为2~3h，4℃下孵育时间为过夜。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述的MRC-5细胞的接种密度为106~107个/mL，HUVECs与NL20细胞的接种密度为105个/mL。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述的旋转接种的转速为20rpm。
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