CN108553503A - 豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途，为医学、食品科学等领域开发天然降糖产品提供新资源。本发明中经高糖诱导构建的HepG2细胞模型实验评价证明，豆芋块茎乙醇提取物可以显著提高HepG2细胞消耗摄取葡萄糖的能力，作用效果全面且显著。因此，本发明的豆芋块茎乙醇提取物可应用于制备降糖食品或药品，以治疗和预防糖尿病及其相关慢性疾病发生。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途。
背景技术
美国豆芋(Apios americana Medikus)主要生长在北美洲的加拿大安大略至美国佛罗里达之间，目前在欧美及日本有着广泛的种植面积。这是一种多年生豆科土圞儿属植物，类似于土豆。食用部分为地下块茎，是一种高蛋白、高钙食品，因而被印第安人作为主食。美国豆芋于2009年引入中国种植，并得到很好的栽培。研究表明其花、叶、块茎均含有丰富的游离氨基酸、可溶性蛋白、黄酮、异黄酮、皂苷、维生素和矿物质等成分。其中，豆芋花含有较高含量的维生素、总皂苷和异黄酮，具有极大的开发潜力。
据流行病学分析，糖尿病是一种有着漫长历史的慢性疾病。它能严重地影响人类的正常代谢，例如碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢。这种代谢紊乱通常是由胰岛素分泌不足或胰岛素失效所致。常见的症状有：多尿、多饮、多食、体重下降等，严重时可危及生命。2000年数据统计表明全球有1.91亿人口正在忍受糖尿病的折磨，预计到2030年这个数字将达到3.06亿。虽然这是一种影响范围广，危害颇深的疾病，但由于其受到遗传、饮食、生活习惯等多方面因素的影响，我们很难从单一方面入手，找到有效、便捷且成本不高的预防措施治疗方案。如何预防与治疗糖尿病及其相关并发症已引起全世界学者的关注，天然植物活性物质尤其受到青睐，但目前对于豆芋块茎乙醇提取物的降糖功能却鲜有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途，为医学、食品科学等领域开发天然降糖产品提供新资源。
为解决上述技术问题，本发明提供一种豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途：
用于制备降糖食品和/或药物。
作为本发明豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途的改进：
用于制备提高高糖诱导HepG2细胞对葡萄糖消耗能力的降糖食品和/或药物。
作为本发明豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途的进一步改进：
用于制备提高高糖诱导HepG2细胞对葡萄糖摄取能力的降糖食品和/或药物。
注：上述豆芋块茎乙醇提取物通过现有技术制备获得，例如可通过以下步骤制备获得：
1)、以1g:5ml的比例将豆芋块茎和含0.1mol/L盐酸的95％乙醇混合，利用榨汁机进行打浆；所得浆液在45℃条件下，超声(40,000Hz的超声波频率)浸提240±10min后，提取液离心(4000转/min离心30分钟)，离心所得的滤渣替代上述步骤中的豆芋块茎重复进行上述步骤的打浆、超声浸提和离心；重复次数为3次；
将上述3次离心所得的上清液合并后进行下述步骤2)。
2)、将所得的上清液在旋转蒸发仪(旋转蒸发设定的工艺参数为温度38℃，真空度-0.09MPa)进行旋转蒸发浓缩直至为原体积的10％；
3)、将旋蒸所得浓缩液采用大孔树脂进行分离纯化，所采用的大孔树脂为大孔树脂D-101(天津兴南允能高分子技术有限公司)，依次进行以下步骤：
首先用两倍柱体积的甲醇活化大孔树脂，三倍柱体积双蒸水进行平衡；
然后以0.5mL/min的流速上样，上样量为200ml(为柱体积的10％)；提取液充分吸附后，1％甲酸(即，体积浓度1％甲酸水溶液)淋洗除去蛋白质、糖、酸等物质，该淋洗剂的用量为两倍柱体积，流速为0.5mL/min；最后用含有0.2％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂充分洗脱，该洗脱剂的用量三倍柱体积，流速为0.5mL/min；收集洗脱液。
所述含有0.2％甲酸的甲醇水溶液的制备方法为：在100ml体积浓度85％甲醇水溶液中加入0.2ml的甲酸；
4)、将大孔树脂分离纯化所得洗脱液旋转蒸发(旋转蒸发设定的工艺参数为温度38℃，真空度-0.09MPa)进行旋转蒸发浓缩直至为原体积的10％，得浆状浓缩液；
5)、将浓缩液在-80℃预冻6h，然后用真空冷冻干燥机48h(真空冷冻干燥机设定的工艺参数为-40℃，1.2Pa)将其干燥成粉末状(含水率≤0.1％)，得到豆芋块茎乙醇提取物。
本发明公开了一种豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途，为医学、食品科学等领域开发天然降糖产品提供新资源。本发明中经高糖诱导构建的HepG2细胞模型、RINm5F细胞模型实验评价证明，豆芋块茎乙醇提取物可以显著提高HepG2细胞摄取消耗葡萄糖的能力，促进RINm5F细胞合成并分泌胰岛素，作用效果全面且显著。因此，本发明的豆芋块茎乙醇提取物应用于制备降糖食品和/或药品，以治疗和预防糖尿病及其相关慢性疾病发生。
本发明的豆芋块茎乙醇提取物的用法为口服，用量每次约150～250mg，每日三次。
本发明同现有技术相比，具有以下优点：
1.本发明首次发现豆芋块茎乙醇提取物能够促进高糖诱导HepG2细胞摄取消耗葡萄糖，表现出显著的降糖效果，具有良好的开发前景。
2.本发明为豆芋块茎乙醇提取物提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领域。
附图说明
图1为本发明中不同浓度豆芋块茎乙醇提取物对HepG2细胞增殖的影响。
图2为本发明中不同浓度豆芋块茎乙醇提取物对HepG2细胞消耗葡萄糖能力的影响。
图3为本发明中不同浓度豆芋块茎乙醇提取物对HepG2细胞摄取葡萄糖能力的影响(荧光照片)。
图4为本发明中不同浓度豆芋块茎乙醇提取物对HepG2细胞摄取葡萄糖能力的影响(荧光定量)。
注：本发明图2～图4中：
C代表低糖对照组(DMEM葡萄糖浓度5.5mM)；
H代表高糖对照组(DMEM葡萄糖浓度30mM)；
M代表阳性对照组(DMEM葡萄糖浓度30mM+2mM二甲双胍)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途，如图1-图4所示，用豆芋块茎乙醇提取物进行干预由高糖诱导的HepG2细胞，观察HepG2细胞的葡萄糖摄取消耗能力，说明豆芋块茎乙醇提取物具有显著的降糖效果。
实验1、豆芋块茎乙醇提取物对HepG2细胞增殖活力的影响；
收集对数期的HepG2细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h后分组。
分为以下9组：空白对照组，以及5、10、20、40、80、160、320和640ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组；上述5、10、20、40、80、160、320和640ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组分别加入对应浓度的豆芋块茎乙醇提取物，空白对照组中不加入豆芋块茎乙醇提取物。
每组重复6孔，置于37℃、5％CO2培养箱中共同孵育24h后，吸出各孔中残余液体，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液漂洗两次后加入100ul的MTT(0.5mg/mL溶于不含血清培养基)，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养4小时。
随后，去除每孔液体，每孔加入250ul二甲基亚砜(DMSO)，在水平摇床上震荡10分钟，酶标仪于570nm处测定其吸光值。细胞增殖活性(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值*100％；根据图1所示，MTT实验结果显示，各组间吸光值没有显著性差异，说明豆芋块茎乙醇提取物在0～640ug/mL浓度范围内对HepG2细胞均无毒性。
实验2、豆芋块茎乙醇提取物对HepG2细胞消耗葡萄糖能力的影响；
收集对数期的HepG2细胞接种于6cm培养皿(密度为4*105个细胞/皿)，加入低糖培养基(DMEM葡萄糖浓度5.5mM)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育过夜后分组；分为以下5组：低糖对照组、高糖对照组、二甲双胍阳性对照组(浓度为2mM)以及100ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组和300ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组，每个组重复5个培养皿。
其中二甲双胍阳性对照组加入二甲双胍于培养箱中预处理24h。100ug/ml豆芋块茎乙醇提取物组和300ug/ml豆芋块茎乙醇提取物组分别加入对应浓度豆芋块茎乙醇提取物于培养箱中预处理24h。
更换培养基：弃去原有的培养液并用PBS清洗两遍，其中低糖对照组加低糖培养基(DMEM葡萄糖浓度5.5mM)，其余组均加高糖培养基(DMEM葡萄糖浓度30mM)。同时保持二甲双胍阳性对照组中二甲双胍浓度与预处理时一致，100ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组和300ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组中豆芋块茎乙醇提取物浓度与其预处理时一致。
将上述各组均于培养箱中共处理24h后，更换培养基：弃去培养皿中原有的培养液并用PBS清洗两遍，之后均换成低糖培养基。于培养箱中培养12h。
收集细胞上清，使用葡萄糖试剂盒测定培养液中的葡萄糖消耗量。弃去多余的培养液并用PBS清洗两遍，每个培养皿中加1ml细胞裂解液，用细胞刮收集于2ml离心管。超声后用BCA蛋白试剂盒进行定量并校正葡萄糖消耗量的数据。
根据图2所示，葡萄糖消耗实验结果显示，豆芋块茎乙醇提取物能够明显修复由高糖作用下受损的HepG2细胞的葡萄糖吸收能力，其中300ug/ml豆芋块茎乙醇提取物的作用效果比100ug/ml的好，甚至优于二甲双胍阳性对照组。
实验3、豆芋块茎乙醇提取物对HepG2细胞摄取葡萄糖能力的影响；
收集对数期的HepG2细胞接种于24孔板中(密度为4*105个细胞/孔)，加入低糖培养基(DMEM葡萄糖浓度5.5mM)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育过夜后分组；分别分为以下五组：低糖对照组、高糖对照组、二甲双胍阳性对照组(浓度为2mM)、100ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组和300ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组，每个组重复3个孔。
其中二甲双胍阳性对照组加入二甲双胍于培养箱中预处理24h。100ug/ml豆芋块茎乙醇提取物组和300ug/ml豆芋块茎乙醇提取物组分别加入对应浓度豆芋块茎乙醇提取物于培养箱中预处理24h。
更换培养基：弃去原有的培养液并用PBS清洗两遍，其中低糖对照组加低糖培养基(DMEM葡萄糖浓度5.5mM)，其余组均加高糖培养基(DMEM葡萄糖浓度30mM)。同时保持二甲双胍阳性对照组中二甲双胍浓度与预处理时一致，100ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组和300ug/mL豆芋块茎乙醇提取物组中豆芋块茎乙醇提取物浓度与其预处理时一致。
于培养箱中共处理24h后，弃去培养基并用PBS清洗两遍，换成含0.1mM 2-NBDG探针和100nM胰岛素的新鲜培养基，于培养箱中培养30min。染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，计算平均光密度值。
根据图3及图4所示，葡萄糖摄取实验结果显示，相比于低糖条件，高糖作用下，HepG2细胞能摄取更多的葡萄糖。并且100、300ug/ml浓度的豆芋块茎乙醇提取物均能显著提高HepG2细胞摄取葡萄糖的能力。其中，且300ug/ml浓度的豆芋块茎乙醇提取物效果优于100ug/ml的效果。
本发明提出一种豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途，为医学、食品科学等领域开发天然降糖产品提供新资源。同时涉及豆芋块茎乙醇提取物在制备降糖产品中的应用。以上列举的仅为本发明的实施的若干实例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途，其特征在于：
用于制备降糖食品和/或药物。
2.根据权利要求1所述的豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途，其特征在于：
用于制备提高高糖诱导HepG2细胞对葡萄糖消耗能力的降糖食品和/或药物。
3.根据权利要求1所述的豆芋块茎乙醇提取物的降糖用途，其特征在于：
用于制备提高高糖诱导HepG2细胞对葡萄糖摄取能力的降糖食品和/或药物。
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