CN108546725A - 一种利用马血制备的生物活性肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用马血制备的生物活性肽及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：1)将检验合格的马血100重量份进行巴氏杀菌62～65℃、30min，柠檬酸调节pH至6.92，静置3‑10min，去除上层液体，收集下层凝块；2)将凝块加30‑50重量份纯净水，超声波处理20‑30min，制成均匀溶液；3)在溶液中接种3‑4重量份益生菌，室温发酵4‑6h，摇床220转/min，然后放入10‑15℃继续发酵2‑3d静置发酵；4)超滤截留分子量为3KDa‑10KDa间的蛋白质和多肽片段，冷冻干燥制成粉末或浓缩液，真空包装即可。该生物活性肽具有抗氧化等生物活性，同时，生产不添加化学辅料，产品安全可靠。

Description

一种利用马血制备的生物活性肽及其制备方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种利用马血制备的生物活性肽及其制备方法。
背景技术
动物血液是畜禽屠宰加工过程中的主要副产品，营养价值高，应用前景广阔。美国在动物血液的开发研究上处于世界领先水平，在政策鼓励和法律方面，血液加工也得到政府的大力支持，仅美国Sigma、Boaolai等蛋白质公司的血液制品产量占全世界产量的30％以上。这些公司一直不断加强对血液制品科技上的投入，目前，已将资源和力量集中在血红素铁、生物活性肽等产品的研发上，它们是食品添加剂、保健食品、生物制剂的重要原料，广泛应用于医药、食品等领域。
中国作为世界第一产肉大国，每年可得动物血液2.3×109kg以上，这是一个巨大的动物蛋白资源库。但是，我国动物血液的利用率还很低，除小部分用作饲料、食用及提取生化药品外，大部分被废弃，既造成重大的蛋白质资源的损失，而且还污染环境，危害人类健康。因此，将动物血液进行充分利用，开发具有生物活性作用的增值深加工产品，既能提高动物血液的经济附加值，又能减少环境污染，产生一定的社会效益。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利用马血制备生物活性肽的方法，该方法可以充分利用马血中的生物活性物质，为进一步开发马血的经济价值提供了新的方向。
为了实现上述目的，本发明提供一种利用马血制备生物活性肽的方法，包括如下步骤：
1)将马血100重量份进行巴氏杀菌，柠檬酸调节pH至6.92，静置3-5min，收集下层凝块；
本步骤所用马血来自检验检疫合格的健康马匹，通过本步骤处理可去掉马血中的脂肪等杂质成分，获得纯净的马血红蛋白。pH6.92为马血的等电点，使得马血中蛋白质在该条件下凝集沉淀。
2)将凝块加30-50重量份纯净水，超声波处理20-30min，制成均匀溶液；
本步骤用于单独将血红蛋白溶解，便于下一步发酵工序。
3)在溶液中接种3-4重量份益生菌，室温发酵4-6h，摇床220转/min，然后放入10-15℃继续发酵2-3d静置发酵；
本步骤通过菌种代谢将血红蛋白分解产生生物活性肽。
4)超滤截留分子量为3KDa-10KDa间的蛋白质和多肽片段，冷冻干燥制成粉末或浓缩液，真空包装即可。
优选地，所述益生菌包括植物乳杆菌，进一步还可添加木糖葡萄球菌和/或清酒乳杆菌。
其中，植物乳杆菌与木糖葡萄球菌和/或清酒乳杆菌的混合比例(重量比)为2:1，木糖葡萄球菌和清酒乳杆菌混合使用时，二者等比例(重量比)混合。
优选地，所述超滤使用中空纤维超滤设备。
本发明还提供使用上述方法制备的生物活性肽。
本发明所用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC编号22187。菌种特性：革兰氏阳性，菌体呈杆状，无芽胞，菌落圆形，接触酶阴性，兼性厌氧，15℃生长。
本发明所用木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC编号22943。菌种特性：革兰氏球菌，精氨酸双水解酶阳性，尿素酶阳性，过氧化氢酶阳性，发酵麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，不发酵山梨醇、棉子糖。兼性厌氧，最适pH7.0-7.5。
本发明所用清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC编号21858。菌种特性：菌落圆形、光滑、乳白色，0.8-1mm；细胞球形，0.5-0.9×0.5-1.2μm，排列成对或成短链；G+，不形成芽胞；趋酸，化能异养，兼性厌氧；利用蔗糖产生粘稠物；葡萄糖发酵产乳酸。
培养上述益生菌所用的培养基为商品化的MRS肉汤培养基。使用时根据实验所需液体培养基的量，称取粉状培养基，用蒸馏水溶解至所需容量，并用调节酸碱度pH至6.2±0.1，然后分装于锥形瓶中，于高压灭菌锅内121℃灭菌，灭菌15min。
菌种活化：用75％酒精棉擦拭菌种冻干管表面进行消毒，将管顶端与酒精灯外焰上均匀加热，滴2至3滴无菌水与加热部位，使管壁破裂，用镊子敲打破裂处。用无菌吸管吸取0.5ml左右MRS肉汤培养基于冻干管中，将植物乳杆菌冻干粉全部溶解。将溶解后的菌悬液转移至4-5mlMRS肉汤培养基的试管中混匀，并置于30℃条件下静置培养48小时，转接3代，取第3代活化菌液为种子液。
血红蛋白肽的功能活性
1.提高免疫力
血红蛋白水解产生的活性肽能够增强机体的免疫力，有利于机体的生长发育。方俊从非特异性免疫方面和细胞免疫方面，观察猪血多肽对正常小鼠及环磷酞胺所致免疫低下小鼠免疫功能的影响，结果表明猪血多肽均可以提高正常小鼠及环磷酞胺所致免疫低下小鼠的免疫功能。
2.阿片样活性
阿片样活性肽是一种被广泛研究的生物活性肽。它们均具有X-Tyr-Phe、Tyr-X-X-Phe或Tyr-X-X-Tyr的氨基酸片段，使其发挥阿片样活性。Qiuyu Zhao等用反相高效液相色谱法研究了牛血红蛋白的胃蛋白酶水解物中血啡肽，发现血红蛋白是其中两种血啡肽的前体。
3.抗氧化活性
很多研究报道已从猪血红蛋白水解产物中提取得到抗氧化活性肽。常驰月等以猪血红蛋白为原料，采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解得到抗氧化活性肽，水解产物的DPPH自由基清除力为51.6％。
4.降血压活性
血管紧张素I转换酶在调节血压方面发挥着重要的作用。余奕珂等人以猪血红蛋白为原料，采用胃蛋白酶酶解得到两种具有ACE抑制活性肽，分别为为LGFPTTKTYFPHF和VVYPWT，动物实验表明其具有良好的降血压效果。
5.抗菌活性
Froidevaux R等用阴离子交换色谱法和和RP-HPLC从牛血血红蛋白胃蛋白酶水解产物中分离纯化出一种抗菌肽，序列为VLSAADKGNVKAAWGKVGGHAAE。
本发明选用马血作为原料，是由于在家畜血液中马血比牛血、羊血等动物血液的颜色深，血红蛋白的含量高，马血红蛋白的等电点明确，制备的血红蛋白纯度高，杂质少，因此利用马血制备生物活性肽的条件较其他动物血液更加具有优势。
现有技术中利用动物血液制备生物活性肽的方法多是采用离心制备红血球，再加酶进行水解制备生物活性肽。
本发明先采用等电点沉淀的方法制备血红蛋白，再利用益生菌发酵制备具有生物活性肽的粉剂或其他形态的产品。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种利用马血制备生物活性肽的方法，该方法通过添加益生菌分解马血红蛋白制备生物活性肽，制备的产品具有抗氧化等生物活性，同时，生产不添加化学辅料，产品安全可靠。
具体实施方式
下面以具体实施例来说明本发明所要保护的范围。
原料：
1.马血购买自河北省石家庄的养马场，取血的马均为检验检疫合格的健康马匹。
2.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC编号22187。
3.木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC编号22943。
4.清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC编号21858。
实施例1
取100重量份马血进行巴氏杀菌，用柠檬酸调节pH值至6.92，静置5min，收集下层凝块，加50重量份纯净水后进行超声波处理20min，加入4重量份植物乳杆菌后在室温下发酵5h，然后放入15℃条件下继续发酵2-3d，发酵完毕后，采用中空纤维超滤设备超滤获得3KDa-10KDa间的蛋白质和多肽片段，然后进行冷冻干燥成粉末，最后采用真空包装即为成品生物活性肽。
实施例2
取100重量份马血进行巴氏杀菌，用柠檬酸调节pH值至6.92，静置5min，收集下层凝块，加40重量份纯净水后进行超声波处理25min，加入2重量份植物乳杆菌、0.5重量份木糖葡萄球菌和0.5重量份清酒乳杆菌后在室温下发酵6h，然后放入15℃条件下继续发酵2-3d，发酵完毕后，采用中空纤维超滤设备超滤获得3KDa-10KDa间的蛋白质和多肽片段，然后进行冷冻干燥成粉末，最后采用真空包装即为成品生物活性肽。
实施例3ACE抑制
要确定马血红蛋白产物中ACE抑制率的活性强弱时，一般是通过评价其半抑制浓度(IC50)与降压药物卡托普利IC50大小的比较来确定该产物的降压活性。本实验参考Cushman(Bio Pharm,1971,20(2):1673-1675)法将实施例1和实施例2制备的生物活性肽配制成6％、12％、18％这3种不同浓度的溶液，测定每种浓度样品的ACE抑制率，如表1所示。
表1ACE抑制率
实施例4体外抗氧化活力(还原力)
还原力(Reducing power，RP)测定参考Oyaizu方法并加以改进。将实施例1和实施例2制备的生物活性肽配制成6％、12％、18％这3种不同浓度的溶液，取待测液1mL，加入2.5mL 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.6)和2.5mL质量分数1％的铁氰化钾溶液混匀，50℃水浴20min后急速冷却，加入2.5mL 10％(质量分数)TCA(三氯乙酸)，充分混匀后3000g离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水及0.5mL质量分数1％的三氯化铁充分混匀，室温反应10min后于波长700nm处测定吸光度，结果如表2所示。
表2体外抗氧化活力
从实施例3和4可以看出，单一菌发酵的生物活性肽的ACE抑制率高于混合菌发酵的生物活性肽，但从抗氧化活力上看，混合菌发酵的生物活性肽效果好于单一菌发酵的生物活性肽。
从上述实施例可以看出，本发明提供的利用马血制备的生物活性肽确实具有降血压、及抗氧化活性，通过本发明提供的制备方法，开拓了马血的用途范围，同时使用益生菌发酵马血红蛋白，开拓了血红蛋白制备生物活性肽的新方法。获得的马血来源的生物活性肽抗氧化效果好。同时生产不添加化学辅料，产品安全可靠。

Claims (5)

1.一种利用马血制备生物活性肽的方法，其特在在于，包括如下步骤：
1)将马血100重量份进行巴氏杀菌62～65℃、30min，柠檬酸调节pH至6.92，静置3-10min，去除上层液体，收集下层凝块；
2)将凝块加30-50重量份纯净水，超声波处理20-30min，制成均匀溶液；
3)在溶液中接种3-4重量份益生菌，室温发酵4-6h，摇床220转/min，然后放入10-15℃继续发酵2-3d静置发酵；
4)超滤截留分子量为3KDa-10KDa间的蛋白质和多肽片段，冷冻干燥制成粉末或浓缩液，真空包装即可。
2.如权利要求1所述的利用马血制备生物活性肽的方法，其特征在于，所述益生菌包括植物乳杆菌。
3.如权利要求2所述的利用马血制备生物活性肽的方法，其特征在于，所述益生菌进一步增加木糖葡萄球菌和/或清酒乳杆菌。
4.如权利要求1所述的利用马血制备生物活性肽的方法，其特征在于，所述超滤使用中空纤维超滤设备进行超滤。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的方法制备的生物活性肽。
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