CN108530637B - 一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法。本发明采用预修饰偶合技术，将功能性端基的引入置于偶联聚合物之前，可通过有机小分子之间的反应制备同时具有支化中心N和功能端F的关键中间体IM1，获得严格控制结构的预修饰小分子，进而通过分步偶合或一步偶合获得含官能团源的单一功能化支化聚乙二醇，直接获得或通过末端的简单化学修饰即可获得高取代率的单一功能化支化聚乙二醇。本发明的制备方法可采用天然氨基酸、多肽作为支化试剂。原料易得，方法简便，易于规模化生产。

Description

一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法

技术领域

本发明涉及高分子合成领域，特别涉及一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法。

背景技术

聚乙二醇化(PEGylation)是药物修饰的重要手段之一。其中，官能化聚乙二醇(PEG) 可以利用其含有的活性基团与药物分子(包括蛋白药物和有机小分子药物)、肽类、糖类、脂 类、寡核苷酸、亲和配体、辅因子、脂质体以及生物材料等通过共价键进行偶联，实现对药 物和其他生物相关物质的聚乙二醇化修饰。经修饰后的药物分子将具备聚乙二醇的许多优良 性质，如亲水性、柔性、抗凝血性等。此外，由于空间排斥效应，聚乙二醇修饰后的药物能 避免肾小球的过滤及生物反应如免疫反应，使其比未修饰的药物在血液中有着更长的半衰期。 例如：Greenwald等人(J.Org.Chem.1995,331-336)通过与聚乙二醇偶联的手段修饰紫杉醇， 增加其水溶性。聚乙二醇化修饰逐渐发展成为一个热门的研究领域。其中，研究最早也最多 的，是单一官能化的聚乙二醇衍生物，该类型具有单一的可反应基团，药物修饰过程、产物 结构及质量的可控性好。

Monfardini将两根线性甲氧基聚乙二醇分别偶联到赖氨酸的两个氨基上得到两臂分叉型 (支化)聚乙二醇，再将赖氨酸的羧基活化成琥珀酰亚胺活性酯，用于蛋白质修饰研究 (Bioconjugate Chem.1995,6,62-69)。上述制备方法中，在最后步骤中通过对端羧基进行改 造获得单一反应性基团琥珀酰亚胺活性酯，在此过程中，由于被改造端基被两个聚合物链所 包埋、空间位阻大等因素，导致端基的修饰率(取代率、官能化率)受到局限；而且由于端 基改造前后的分子量很大且相接近，也给产品的分离纯化带来难度。而端基取代率、产品纯 度，对于聚乙二醇化药物的质量控制都是至关重要的。因此，有必要开发一种高取代率、易 纯化的制备方法进行改进。

发明内容

本发明针对现有技术制备两臂支化聚乙二醇衍生物时，端基取代率、产品纯度不够理想 的技术瓶颈，提供一种改进的单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，以提供近100％的端基含 量的制备方法，还有利于分离纯化。

本发明提供一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其是通过以下技术方案实现的： 所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(1)或通式(2)所示：

其中，PEG_a、PEG_b为相同或不同的聚乙二醇组分，各自独立，均由C_1～20烃基连接PEG组分的末端氧原子；L_a、L_b为相同或不同的二价连接基，各自独立，分别连接PEG_a、PEG_b的另一个氧端；M_b为氧原子或硫原子；L_c为碳链连接基；L_d为二价连接基，含有经偶合反应 生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁；R₀₁与L_d直接相连，或通过二价连接基 Z相连；制备过程包括以下步骤：

步骤一、获得含有氮源端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1；其中F_N为伯氨基或 仲氨基；所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R₀₁的基团；

步骤二、通过烷基化反应，将第一个聚乙二醇链PEG_a偶合到小分子中间体IMI的氮源 位置，氮源端基F_N转变为M_N，反应式中R_a为能与F_N发生烷基化反应的基团；R_a包括但不 限于磺酸酯基、卤原子、不饱和烯基、环氧基、醛基或酮基，优选磺酸酯基、卤原子。

当M_N不为–NH–时，还进行脱保护，得到含有–NH–的线性中间体IM2；当M_N为–NH– 时，进行下一步骤；

步骤三、通过烷基化反应、酰胺化反应或硫代酰胺化反应将第二个聚乙二醇链PEG_b偶合 到中间体IM2的N原子上；反应式中R_b为能与–NH–发生烷基化反应的基团；R_x为能与–NH– 反应生成酰胺键或硫代酰胺键的基团；

当D_F等于F时，所得结构即对应通式(1)或通式(2)所示的结构。

当D_F不等于F时，经末端微修饰得到对应的通式(1)或通式(2)所示的结构；所述末端微修饰选自以下的化学反应：脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改 变离去基团。

所述步骤一小分子中间体IM1的获得方式可以通过商业途径购买，也可以通过以下过程 制备：以含官能团端D_F的化合物F_source作为原料，与含氮源端基U_N的化合物N_source进行偶 合，形成二价连接基L_d；所述氮源端基U_N为氨基或被保护的氨基；反应式中F₁、F₂为能反 应生成二价连接基的官能团对；当氮源端基U_N不含活泼氢时，还进行脱保护，得到含有氮源 端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1；当U_N含活泼氢时，进行下一步骤。对应的制备 方法反应式如下：

L_c为碳链连接基，包括亚烃基或侧基含杂原子的碳链连接基；优选碳原子数为C_1～24，即 C_1～24亚烃基或C_1～24侧基含杂原子的碳链连接基。

L_c的优选组之一为L_c包含

C_3～6二价环烷基、取代的C_3～6二价环烷基、苯撑、取代的苯撑中至少一个；其中，A₁、A₂、A₃为含有1～10个碳原子的取代基，且各自独立，任两个彼此相同或不同；i、j、k为0～24的整数。A₁、A₂、A₃各自独立 地选自包括但不限于：烷基、环烷基、苯基、芳烷基、取代的烷基、取代的环烷基、取代的 苯基、取代的芳烷基、杂化的烷基、杂化的环烷基、杂化的苯基、杂化的芳烷基。

L_c的优选组之一为C_1～24亚烃基，更优选C_1～12亚烃基，更优选C_1～10亚烃基，更优选C_1～6亚烃基。具体地，优选亚甲基、1,2-亚乙基、1,3-亚丙基、–Ph–、–CH₂–Ph–。

氮源试剂N_source优选氨基羧酸、氨基酮、氨基醛、氨基醇中任一种化合物或上述任一种 化合物的氨基被保护的形式。

氮源试剂优选氨基羧酸类试剂，更优选甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸、苯丙氨酸、NH₂-L₅-COOH或上述任一种的氨基被保护形式；其中L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子。进一步优选甘氨酸、丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸或上述任一种的氨基被保护形式。

氮源试剂优选一端为氨基或被保护的氨基，另一端选自马来酰亚胺基、叠氮基、炔基、 羟基、巯基、羧基、羧酸酯基、酰卤、酰胺、酰肼中任一种基团。酰卤优选酰氯。

L_d优选含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键、一硫代氨基甲酸酯键、二硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、亚胺键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种共价连接基。更优选含有酰胺键。

其中，R₀₁为能与生物相关物质相互反应的功能性基团；所述与生物相关物质相互反应选 自以下任一种：共价键的形成、氢键的形成、光学反应和靶向作用。

其中，R₀₁优选自反应性基团、反应性基团的微变化形式、靶向基团、光敏性基团。

R₀₁优选之一为能与氨基、羟基、羧基、巯基、二硫化合物、醛基、酮羰基、胍基、酰胺基、叠氮基、炔基、烯基中任一种活性基团发生反应生成共价键的基团。

R₀₁的另一组优选为具有被保护形式的反应性基团或者其脱保护的活性形式，例如氨基、 巯基、羟基、醛基、马来酰亚胺基、炔基、烯基及上述基团的被保护形式。其中，被保护的 基团优选缩醛(被保护的醛基)、被保护的马来酰亚胺基、被保护的氨基、被保护的羟基、被 保护的巯基、被保护的炔基、被保护的羧基(e.g.酯类)、氨基甲酸酯类、Boc保护的基团、Fmoc保护的基团、硅基保护的基团中任一种。更优选醛基、缩醛基、马来酰亚胺基、呋喃保护的马来酰亚胺基、氨基、被保护的氨基、胺盐、羧基、酯保护的羧基、叠氮基、炔基；更 优选醛基、马来酰亚胺基、羧基或氨基。

特别优选之一R₀₁为醛基或缩醛基。

特别优选之一R₀₁为马来酰亚胺基或呋喃保护的马来酰亚胺基。

Z不存在或Z为任意合适的基团。

优选之一，R₀₁距离支化中心N原子不超过50个原子间隔，进一步优选不超过10个原子间隔。

Z优选组之一是碳链连接基，具体优选方式与L_c一致。

Z的另一组优选为含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键(氨基甲酸酯键)、硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种连接基。

Z的另一组优选为含有通过烷基化反应、酰胺化反应、酯化反应、硫酯化反应、click反 应(点击反应，如叠氮-炔基环加成反应、Diels-Alder加成反应、生成肟或酰腙的反应、巯基 -乙烯基加成反应、巯基-炔基加成反应、巯基-异氰酸酯基反应等)、环加成反应、Diels-Alder 加成反应(狄尔斯-阿尔德反应)、1,3-偶极环加成反应中任一种偶合反应生成的连接基。

Z的另一组优选为Z中含有重复单元CH₂CH₂O，且重复单元数不超过20，更优选不超过 10，更优选不超过5；更优选不超过2。本发明中的“重复单元”指数量至少为2个。

Z的另一组优选为Z中含有主链杂原子但不含重复单元CH₂CH₂O。

Z的另一组优选为任意合适的稳定的二价连接基STAG、或可降解的二价连接基DEGG。

优选L_a、L_b相同。

进一步优选L_a、L_b为相同的亚烃基，更优选L_a、L_b均为C_1～12亚烃基；更优选C_1～12亚烷基；更优选L_a、L_b均为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基或亚戊基，最优选L_a、L_b均为亚甲 基。

优选L_a与PEG之间形成酯键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键连接。

优选L_b与PEG之间形成酯键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键连接。

优选通式(1)中L_a、L_b相同，且选自含羰基、-CONH-、-COO-中一种端基，分别与 PEG之间形成酯键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键连接。酯键、碳酸酯键具有较好的可降解性， 而氨基甲酸酯键的可降解性相对较弱。

优选PEG_a、PEG_b均为甲基封端的mPEG，进一步优选具有相同的分子量，进一步地，

(1)分子量优选2kDa～20kDa；进一步优选2kDa、5kDa、10kDa或20kDa。

(2)氧化乙烯基单元数优选2～70，还优选2～20。优选两者的氧化乙烯基单元数(或平 均氧化乙烯基单元数)相差不超过1。

优选M_b为氧原子。

本发明还提供另一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其是通过以下技术方案实现 的：所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(3)所示：

其中，PEG_a为C_1～20烃氧基封端的聚乙二醇组分；L_a为二价连接基，连接PEG_a的另一个 氧端；L_c为碳链连接基；L_d为二价连接基，含有经偶合反应生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁；R₀₁与L_d直接相连，或通过二价连接基Z相连；其中，PEG_a、L_a、L_c、 F的定义及优选方式与上述一致。两个PEG_a具有相同的封端和相同的分子量(含化合物的产 品为多分散性时分子量相近，为单分散性时分子量数值严格相等)。

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一、获得含有氮源端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1；其中，F_N、D_F的定义与上述一致；

步骤二、控制投料比，通过烷基化反应，将两个聚乙二醇链PEG_a一步偶合到小分子中间 体IMI的氮源位置，氮源端基U_N转变为叔氮原子；

步骤三、

当D_F等于F时，所得产物即为通式(3)所示的结构，该步骤省略；

当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(3)所示的结构。

优选L_a为亚甲基。

优选L_a与PEG_a形成酯键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键连接。

以本发明制备的单一功能化聚乙二醇为原料，对末端R₀₁进行官能化改性获得新的单一 功能化聚乙二醇的方法也在本发明保护范围内。改性后的功能性端基可选自本发明公开的及 引用文献公开的任意合适的功能性端基，包括但不限于类A～类J的结构。

本发明还公开本发明任一制备方法获得的单一功能化支化聚乙二醇，为一系列化合物分 子的聚集体，所述单一功能化支化聚乙二醇的末端功能性基团的取代率大于95％；更优选大 于96％；更优选大于98％，更优选99％～100％。其中，99％～100％的区间包括99％、大于99％ 且小于100％，100％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明制备方法的总发明构思是：在偶联聚合物之前，通过可控性好的小分子间的 化学反应引入功能性基团或功能性基团的前体。具体地，采用预修饰偶合技术，以含有功能 端(官能团源)的化合物作为起始原料或中间体，先后分步偶合或一步偶合两个聚乙二醇分 支链，直接得到或后期仅通过脱保护等较简单的化学过程，即可获得单一功能化支化聚乙二 醇衍生物；与现有技术相比，本发明将功能性端基的引入置于偶合聚合物之前，并且通过有 机小分子之间的反应实现，与现有技术中在两臂聚合物中间体的基础上进行端基修饰相比， 小分子反应过程可实现相对更加完全的结构控制，所获得的单一功能化支化聚乙二醇可实现 功能性末端100％的取代率；当功能性端基以微变化形成存在于制备过程中时，后续也仅需要 通过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团等较简单的化学 过程即可转化，这类反应的反应条件简单、易控，仅是“微修饰”，容易实现接近100％的取 代率。而在现有技术中，是基于聚合物端基进行化学修饰，会因为空间位阻大、末端被聚合 物链包埋等因素，导致末端取代率受限，还需要增加纯化步骤进行产物分离，而且增加纯化 工艺，同样难以做到100％或近100％的取代率。

(2)本发明中可以利用天然氨基酸等简单小分子为氮支化原料，原料易得，方法简便， 易于规模化生产。

(3)本发明还可直接采用C-端被保护的多肽作为原料或中间体，分步偶合或一步偶合 两个聚乙二醇分支链，得到支化聚乙二醇羧酸酯，对末端进行微修饰可获得末端高修饰率的 支化聚乙二醇羧酸；对末端酯基改性可一进步得到高修饰率的酰胺、酰肼衍生物，对末端羧 基进行改性可得到酰氯衍生物。

术语说明

本发明涉及的术语大多在文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X 及各引用文献中已公开，其中的术语解释及相关结构举例作为参考一并纳入本发明中，这里 不再重复赘述。与本发明中描述不同的，以本发明为准。简单概括如下。

为简便起见，本发明中也将基团中的碳原子数范围以下标形式标注在C的下标位置，表 示该基团具有的碳原子数，例如C_1-10表示“具有1至10个碳原子”、C_3-20表示“具有3至20 个碳原子”。“取代的C_3-20烃基”指C_3-20烃基的氢原子被取代得到的基团。“C_3-20取代的烃基” 指烃基的氢原子被取代后得到的基团中具有3-20个碳原子。又如当一个基团可选自C_1-10烃基 时，可选自下标所示范围中任一种碳原子数的烃基，即可选自C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、 C₈、C₉、C₁₀烃基中任一种烃基。

本发明中，在没有特别说明的情况下，以区间形式标记的整数范围均表示可选自该范围 内任一整数，该范围包括两个端点。又如整数范围2～12表示2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中任一整数。

对于本发明中两个或多个的对象“各自独立地优选”，当具有多级的优选情况时，并不要 求均选自同级的优选组，可以一个为大范围的优选、一个为小范围的优选，也可以一个为最 大范围、另一个为任一种优选情况，也可以选自同级的优选。例如，“R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂的碳原子数各自独立地优选为1～20，更优选为1～10”，可以均为1～20，也可以均为1～10， 也可以部分为1～20，而其它的为1～10。即使为同级别的或同一类优选，也并不限定两个对象 的结构完全一致，例如A、B各自独立地选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基，可以是A为甲 基而B为乙基，或A为丁基而B为苄基。

本发明中的二价连接基，例如亚烃基、亚烷基、亚芳基、酰胺键等，没有特别限定的情 况下，其连接其它基团时可选两个连接端中的任一个，例如在A-CH₂CH₂-和-CH₂-B之间以酰胺键作为二价连接基时，可以为A-CH₂CH₂-C(＝O)NH-CH₂-B或 A-CH₂CH₂-NHC(＝O)-CH₂-B。有的结构式中用星号加以标记作为定向的连接端。

当涉及到的结构具有同分异构体时，没有特别指定的情况下，可以为其中任一种异构体。 例如对于存在顺反异构体的结构，既可以为顺式结构也可以反式结构；有旋光性时可以为左 旋或右旋。如对于烷基，没有特别指定的情况下，指失去任一位置的氢原子形成的烃基。具 体地，如丙基指正丙基、异丙基中任一种，亚丙基指1,3-亚丙基、1,2-亚丙基、异亚丙基中任 一种。

在结构式中，当连接基的端基与其保护的取代基易发生混淆时，如在结构式

中， 采用的

来标记二价连接基中连接其它基团位置。当不会产生歧义时也可不特别标记，如 以下的苯撑结构

本发明中的杂原子没有特别限定，包括但不限于O、S、N、P、Si、F、Cl、Br、I、B等。

脂肪族环包括脂环和脂杂环。脂环指脂肪烃基来源的碳环，是一种全碳脂环。脂杂环指 脂环的环碳原子被杂原子替代的杂环。作为举例，脂杂环烃指来源于脂环烃的杂环烃，如3- 氧杂环丁烷、1,4-二氧杂六环。脂肪族环举例如环丙烷、环氧乙烷、氮杂环丙烷、环丁烷、环 丁烯、方酸、环丁烷二酮、半方酸、环戊烷、茂、四氢呋喃、吡咯烷、噻唑烷、二氢异恶唑、 恶唑烷、环己烷、环己烯、四氢吡喃、哌啶、1,4-二氧六环、降冰片烷、降冰片烯、降冰片二 烯、1,4,7-三氮杂环壬烷、轮环藤宁等，需要补充说明的是，呋喃、噻吩、吡咯、咪唑、恶唑、 异恶唑、噻唑、异噻唑、吡唑等具有弱芳香性的环在本发明中也包括在脂肪族环中，三氮唑 也包括在此类，可归为脂杂环。所述三氮唑包括乙炔基和叠氮基反应生成的基团，也包括环 炔基和叠氮基反应生成的基团。

芳香族环包括芳环和芳杂环。芳环指芳香烃基来源的碳环，是一种全碳芳环。芳杂环指 芳环的环碳原子被杂原子替代的杂环。举例，芳香族环包括但不限于苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、 吡嗪、1,3,5-三嗪、四嗪(1,2,3,4-、1,2,4,5-和1,2,3,5-三种异构体)、茚、二氢化茚、吲哚、异 吲哚、嘌呤、萘、二氢蒽、氧杂蒽(呫吨)、硫代呫吨、二氢菲、10,11-二氢-5H-二苯并[a,d] 环庚烷、二苯并环庚烯、5-二苯并环庚烯酮、喹啉、异喹啉、芴、咔唑、亚氨基二苄、萘乙 环、二苯并环辛炔、氮杂二苯并环辛炔等，及任一种的被取代形式，或任一种的被杂化形式。 其中，环上的氮原子还允许以阳离子的形式存在。如吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪是苯的氮杂形 式，吲哚、异吲哚是茚的氮杂形式，咔唑是芴的氮杂形式，呫吨是二氢蒽的氧杂形式，硫代 呫吨是二氢蒽的硫杂形式，9H-硫代呫吨-10,10-二氧化物是二氢蒽的砜杂化形式。吡啶嗡是吡 啶的取代形式，此时，氮原子以阳离子形式存在。芳香族环除包括CN104530417A中的 [130]～[131]段外，还包括[267]～[284]段。需要说明的是，三价联苯中的联苯并非基础环状核 结构，而是由一个三价苯基的环状核结构与一个二价苯基(苯撑)组合而成；三价的二苯基 甲烷与三价联苯类似。

“原子间隔”指沿原子主链上所间隔的原子数，通常也是最短的原子间距，用来表示连 接基的长度；例如A-CO-NH-B中A与B的原子间隔为2，A-p-Ph-CH₂-B中A与B的原 子间隔为5(p-Ph为对位苯撑)，又如A-CH(CH₂CH₂CH₂CH₃)-B的原子间隔为1。参与构成原 子间隔的“主链原子”只能是非氢原子。

本发明中“取代的”，以“取代的”“烃基”为例，指被取代的“烃基”中任一位置的任一个或一个以上的氢原子可以取代。

本发明中，“取代基”可以是一个原子(取代原子)，也可以是一个包含两个或更多原 子的原子团(取代基团)。也即本发明中的“取代基”包括引用文献CN104877127A、 WO/2016/206540A、CN201610252378X中的取代原子及取代基，引用文献中的“取代基”在 本发明中更改为“取代基团”。

“碳链连接基”指主链原子全部为碳原子的连接基，而侧链部分则允许杂原子或含杂原 子基团取代主链碳的氢原子。“主链原子”为杂原子时，也称为“主链杂原子”，如A-S-CH₂-B、 A-O-CH₂-B、

视为含有主链杂原子。碳链连接基可以分为亚烃基和侧基含杂原 子的碳链连接基；所述侧基含杂原子的碳链连接基包括但不限于氧代(＝O)、硫代(＝S)、氨 代(通过碳氮双键与主链碳相连)、醚键形式的氧杂烃基、硫醚键形式的硫杂烃基、叔氨基形 式的氮杂烃基等。

“碳链连接基”主链全部由碳原子构成，碳链的侧基允许含有杂原子。也即由亚甲基或 取代的亚甲基连接而成。所述取代的亚甲基可以被一个一价取代基、二个一价取代基或一个 二价取代基(如二价氧，或与二价亚甲基构成三元环)取代。所述取代的亚甲基可以是一个 氢原子被取代(如-CH(CH₃)-)，也可以是两个氢原子分别被取代(如-(CH₃)C(OCH₃)-)，还 可以是两个氢原子同时被取代(如羰基、硫代羰基、-C(＝NH)-、-C(＝N⁺H₂)-)，还可以是环 状侧基(如

)。

本发明中的仲氨键、联氨键指“-NH-”两端均被亚烃基封端，如-CH₂-NH-CH₂-；而如-C(＝O)-NH-则称为酰胺键，不视为含有仲氨键。

关于烯基和烯烃基，本发明中，不饱和烃失去氢原子形成诸如烯烃基(也称烯基，alkenyl group)、炔烃基(也称炔基，alkynyl group)、二烯烃基(dienyl group)等。不饱和烃失去不 饱和碳上氢原子形成的烃基，如1-烯基、1-炔基、1-二烯基等等，作为举例如丙烯基、丙炔 基；不饱和烃失去饱和碳上的氢原子形成的烃基根据不饱和键的不同，如烯基烃基 (alkenyl-hydrocarbyl group)、炔基烃基(alkynyl-hydrocarbyl group)，具体地如烯丙基(2-丙 烯基)、炔丙基(2-丙炔基)。

芳烃失去一个氢原子形成芳烃基(aromatic hydrocarbyl group)，典型地芳烃失去芳环上 的一个氢原子形成芳基(aryl group)。芳烃失去非芳环上的氢原子形成芳基烃基 (aryl-hydrocarbyl group)，如芳烷烃失去非芳环上的氢原子形成芳烷基(aralkylgroup或 arylalkyl group)。芳烷基属于芳基烃基的范畴。作为举例，最典型的芳基如苯基，最典型芳基 烃基及芳烷基如苄基。

本发明中，对于多分散性的描述，化合物分子的分子量/聚合度、化合物的宏观聚集体的 数均分子量/数均聚合度的“相等”或“相同”，在没有特别指定的情况下，并不限定在数值 上严格相等，而是指数值相接近或近似相等(优选偏差不超过±10％)。“约”一般指±10％ 的数值范围，部分分子量可放大到±15％，但不超过±20％。例如10kDa与11kDa、12kDa 的偏差分别为10％、20％。又如，指定PEG组分的分子量等于5kDa时，允许相应的分子量 或数均分子量在5kDa±10％，也即4500～5500Da的范围内变化。对于单分散性情况，氧化 乙烯基单元数相同或相等是指在数值上严格相等。

当用Da或kDa描述化合物通式的分子量时，对于单个化合物分子，数值落在所述数值 的±10％范围内(包括端点)；用氧化乙烯基单元描述化合物通式的分子量时，则无范围波动， 但其制备产物可能因为不纯而使EO单元平均数在±10％范围内(包括端点)。例如mPEG的 分子量为5kDa，在通式(化合物分子的集合)和制备产物(化合物分子的聚集体)中指单 个分子的分子量数值、聚集体的平均分子量的数值均在4500～5500Da之间；又如mPEG具 有22个氧化乙烯基单元，则通式中的化合物所有分子的EO单元数均严格为22，但制备产物 可能是20、21、22、23、24个EO单元的化合物的混合物，此时EO单元的平均数则在22±2.2范围内。

对于本发明中的百分数，“约”指±0.5％。

本发明中，“稳定存在”和“可降解”的定义参照WO/2016/206540A及其引用文献，提供一个参考的判断标准，即在一个有限的时间区间内的考察化学键接保持百分比的90％为界， 通常以官能化聚乙二醇的修饰产物的药代动力学曲线为参考，以符合临床评价标准的剂量百 分比为基准。例如，对于静脉给药的PEG化药物，当血药浓度(以有效药物成分计，包括 PEG化的药物以及降解后的非PEG化成分)低于初始浓度的15％(或者更符合该药物临床评 价的比例)时，以其余85％为基数，如果一种连接基保持化学键接的比例超过90％则在本发 明中属于可稳定存在的基团，反之如果低于90％则属于可降解的基团。现有技术中所指的水 解稳定、酶降解等也一并纳入本发明中。本发明的水解稳定，优选指生理条件下的水解速率 低于每天1-2％，质量或摩尔量。典型化学键的水解速率可参考大多标准化学手册。

本发明中的“官能团源”指具有反应活性或具有潜在的反应活性、具有光敏性质或具有 潜在的光敏性质、具有靶向性或具有潜在的靶向性。所述“潜在的”，指经过脱保护、盐络 合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团等过程可以转为反应性基团，经过 光、热、酶、特异结合分子、体内微环境等外界刺激下能发光或产生靶向性。所述发光没有 特别限制，包括但不限于可见光、荧光、磷光等。

本发明中的变化形式指经过氧化、还原、水合、脱水、电子重排、结构重排、盐络合与 解络合、离子化、质子化、去质子化、被取代、脱保护、改变离去基团等中任一种化学变化过程，能够转变为目标反应性基团的结构形式。

本发明中“反应性基团的变化形式”，指一个反应性基团经过氧化、还原、水合、脱水、 电子重排、结构重排、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、被取代、脱保护、改变离去基团等至少一个化学变化过程后仍具有活性的形式(仍是反应性基团)，或经过被保护 后的非活性形式。

本发明中的“微修饰”，指经过简单的化学反应过程即可完成的化学修饰过程。所述简单 的化学反应过程主要指脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、离去基团的 转变等。

“微变化形式”与“微修饰”相对应，指经历脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、离去基团的转变等简单的化学反应过程后能形成目标反应性基团的结构形式。 所述离去基团的转变，如酯形式向酰氯的转变。

“任意合适的连接基”、“任意合适的反应性基团”等中的“任意合适的”是指符合化学 结构的基本原则，且能够使本发明的制备方法顺利实施的结构。用此描述的化学结构可视为 具有确定的变化范围。

“任意组合”指前述列举结构中任一个、或者任两个或任两个以上结构的组合；且对构 成单元的数量不做限定，可以为零个、一个或大于一个，但包括构成单元中的至少一个。例 如，亚烷基、二价环烷基、二价环烯基、二价环炔基、二价环二烯烃基、芳撑、碳碳双键、 碳碳三键、共轭的碳碳双键、二价脂杂环基、二价芳杂环基、侧基含杂原子的碳链连接基的 任意组合举例，-Ph-CH₂-Ph-，-CH₂-Ph-CH₂CH₂-，或苯环替换成己环、二氮杂己环、1-(2-吡 啶基)六氢-1H-1,4-二氮杂卓的结构。

“供选择的范围包括但不限于”，指所述范围内的结构可选，但不限定为所示范围的结构， 但并非所述范围内的所有结构都适用。基本原则是以本发明的制备方法顺利实施为筛选标准。

本发明中的“氨基羧酸”指一端为NH₂、一端为COOH的化合物，除各种天然氨基酸外， 还包括一些非天然的化合物。还优选ω-氨基羧酸。本发明的ω-氨基羧酸优选NH₂-L₅-COOH， 其中L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两 个碳原子，举例如亚甲基、亚乙基(1,2-亚乙基或1,2-亚乙基-CH(CH₃)-)、亚丙基、1,4-亚环 己基、苯撑、亚苄基、-CH(Bn)-，Bn为苄基。其中，芳撑指两个共价键均直接来自芳环。 ω-氨基羧酸优选ω-氨基烷羧酸，此时L₅为亚烷基、二价环烷基的任意组合；进一步优选 H₂N(CH₂)_j1COOH，其中，整数j₁选自2～20，优选2～12，更优选2～6，举例如3-氨基丙酸(β-丙氨酸)、4-氨基丁酸(γ-丁氨酸)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸等。

本发明中的氨基酸结构类型，在没有特别指明的情况下没有特别限制，既可以指_L-型， 也可以指_D-型。

参考文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中有关 氨基酸骨架、氨基酸衍生物骨架、环状单糖骨架的定义与举例亦作为参考纳入本发明中。其 中，氨基酸骨架指具有氨基酸基本特征的残基，具体指失去羧羟基(包括所有的C端羧羟基， 还包括如天冬氨酸、谷氨酸中侧基上的羧羟基)、羟基上的氢原子、酚羟基上的氢原子(酪氨 酸)、巯基上的氢原子(如半胱氨酸)、氮原子上的氢原子后(包括所有的N端氢原子，还包 括侧基中氨基中的氢原子如赖氨酸、鸟氨酸上的ε-氨基上的氢原子、组氨酸及色氨酸的侧基 环上的氨基中的氢原子等)、酰胺上的氨基(如天冬氨酰胺、谷氨酰胺等)、胍基侧基中的氨 基或氨基中的氢原子形成的残基。氨基酸衍生物骨架指除具有氨基酸骨架外，还具有其基本 特征的原子或基团部分。单糖骨架指具有环状结构的单糖失去所有的羟基后形成的残基，包 括开链式单糖骨架、也包括环状单糖骨架(如呋喃糖环、吡喃糖环)。

本发明中，氨基酸的“C-羧基、N-氨基”，在没有特别指定的情形下，均指α-位。

“生物相关物质”包括但不限于文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中所描述及列举的物质。概括地，生物相关物质包括但不仅限于以下物质：药物、蛋白质、多肽、寡肽、蛋白模拟物、片段及类似物、酶、抗原、抗体 及其片段、受体、小分子药物、核苷、核苷酸、寡核苷酸、反义寡核苷酸、多核苷酸、核酸、 适配体、多糖、蛋白多糖、糖蛋白、类固醇、甾类化合物、脂类化合物、激素、维生素、磷 脂、糖脂、染料、荧光物质、靶向因子、细胞因子、神经递质、细胞外基质物质、植物或动 物提取物、病毒、疫苗、细胞、囊泡、脂质体、胶束等。所述生物相关物质可以为生物相关 物质自身，也可以其前体、激活态、衍生物、异构体、突变体、类似物、模拟物、多晶型物、 药物学上可接受的盐、融合蛋白、化学改性物质、基因重组物质等，还可以为相应的激动剂、 激活剂、活化剂、抑制剂、拮抗剂、调节剂、受体、配体或配基、抗体及其片段、作用酶(如 激酶、水解酶、裂解酶、氧还原酶、异构酶、转移酶、脱氨酶、脱亚胺酶、转化酶、合成酶 等)、酶的底物(如凝血级联蛋白酶底物等)等。所述衍生物包括但不限于甙类、核苷类、氨 基酸类、多肽类衍生物。形成新的反应性基团的化学修饰产物，即对反应性基团进行改性而 改变类型、额外引入功能性基团、反应性基团、氨基酸或氨基酸衍生物、多肽等结构后生成 的改性产物，均属于生物相关物质的化学改性物质。生物相关物质在与官能化聚乙二醇结合 之前或之后，还允许有与其结合的目标分子、附属物或递送载体，形成改性的生物相关物质 或复合的生物相关物质。其中，所述药物学上可接受的盐，既可以为无机盐，如盐酸盐，也 可以为有机盐，如草酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐等。其中，本发明中的“药物”包括在体内 或体外提供生理或药理作用的任何药剂、化合物、组合物或混合物，且往往提供的是有益效 果。其种类没有特别限制，包括但不限于药物、疫苗、抗体、维生素、食品、食品添加剂、 营养剂、营养保健品及其它提供有益效果的药剂。所述“药物”在体内产生生理或药理作用 的范围没有特别限制，可以为全身效果，也可以只在局部产生效果。所述“药物”的活性没 有特别限制，主要为能与其它物质发生相互作用的活性物质，也可以为不发生相互作用的惰 性物质；但惰性的药物可通过体内作用或一定刺激转变为活性形式。其中，“小分子药物”为 分子量不超过1000Da的生物相关物质，或任一生物相关物质的小分子拟态物或活性片段。

本发明的一个分子中某个符号数量为2个或2个以上时，没有特别写明的情况下，具有 相同的结构或聚合物通式，对于聚合物通式，允许有不同的分子量。如通式(12)。而Q的 定义写明了同一分子中可以为不同的结构。

具体实施方式

1.两步偶合法

本发明提供一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其是通过以下技术方案实现的： 所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(1)或通式(2)所示：

其中，PEG_a、PEG_b为相同或不同的聚乙二醇组分，各自独立，均由C_1～20烃基连接PEG组分的末端氧原子；L_a、L_b为相同或不同的二价连接基，各自独立，分别连接PEG_a、PEG_b的另一个氧端；M_b为氧原子或硫原子；L_c为碳链连接基；L_d为二价连接基，含有经偶合反应 生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁；R₀₁与L_d直接相连，或通过二价连接基 Z相连；

制备反应式如下：

包括以下步骤：

步骤一、获得含有氮源端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1；其中，所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R₀₁的基团；其中F_N为伯氨 基或仲氨基；

IM1可通过商业途径获得，也可通过以下过程制备：以含官能团端D_F的化合物F_source作 为原料，与含氮源端基U_N的化合物N_source进行偶合，形成二价连接基L_d；所述氮源端基U_N为氨基或被保护的氨基；反应式中F₁、F₂为能反应生成二价连接基的官能团对；当氮源端基 U_N不含活泼氢时，进行脱保护，得到含有氮源端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1；

步骤二、通过烷基化反应，将第一个聚乙二醇链PEG_a偶合到小分子中间体IMI的氮源 位置，氮源端基F_N转变为M_N，反应式中R_a为能与F_N发生烷基化反应的基团；R_a包括但不 限于磺酸酯基、卤原子、不饱和烯基、环氧基、醛基或酮基，优选磺酸酯基、卤原子。

当M_N不为–NH–时，进行脱保护，得到含有–NH–的线性中间体IM2；

步骤三、通过烷基化反应、酰胺化反应或硫代酰胺化反应将第二个聚乙二醇链PEG_b偶合 到中间体IM2的N原子上；反应式中R_b为能与–NH–发生烷基化反应的基团；R_x为能与–NH– 反应生成酰胺键或硫代酰胺键的基团；当D_F不等于F时，经末端微修饰得到对应的通式(1) 或通式(2)所示的结构；所述末端微修饰选自以下的化学反应：脱保护、盐络合与解络合、 离子化、质子化、去质子化、改变离去基团。

其中，M_b优选氧原子。

1.1氮源试剂N_source

氮源试剂N_source是本发明中提供氮原子支化中心的试剂，其一个端基U_N提供氮源，另一 个端基F₁具有反应性，两个端基通过碳链连接基L_c相连。

1.1.1.氮源试剂的结构

1.1.1.1.氮源试剂的N-端

氮源试剂的端基U_N，也即N-端，提供本发明制备产物的氮原子支化中心。U_N可以为伯 氨基形式，也可以为被保护的氨基形式；而且在上述制备过程中还允许以离子形式存在。N- 端是否需要被保护以及采用何种保护基由其在步骤一是否会导致副反应决定，只要N-端不受 偶合反应的影响而保持有效，就允许N-端以氨基形式存在于氮源试剂中。所述N-端的有效， 指能够顺利进行两个PEG链的偶联、而且通过上述制备过程能实现N支化中心的功能。所述 被保护的氨基记为NPG₅，可以保留伯氨基中的一个氢原子(仲氨基)，也可以两个氢原子均 不保留(叔氨基)。NPG₅的供选择的范围包括但不限于CN104530417A(特别地，第529-530 段)、CN104877127A(特别地，第457段)、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引 用文献中所记载的结构，具体地包括但不限于氨基甲酸酯、酰胺、酰亚胺、N-烷基胺、N-芳 基胺、亚胺、烯胺、咪唑、吡咯、吲哚等结构，更具体地，NPG₅优选甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺、氨基甲酸叔丁酯、氨基甲酸2-碘乙酯、氨基甲酸苄基酯、氨基甲酸9-芴甲酯、氨基甲酸2-三甲硅基乙酯、氨基甲酸2-甲基磺酰基乙酯、氨基甲酸2-(对甲苯磺酰基)乙酯、邻苯二甲酰亚胺、二苯基亚甲胺、1,3,5-二氧氮杂环己烷、甲基氨基、三苯基甲基氨基、叔丁基氨基、烯丙基氨基、苄基氨基、4-甲氧基苄基氨基、苄亚胺等当中的任一种。还包括但不限于以下文献及引用文献的氨基保护基、保护与脱保护方法：文献“冯艳芳.氨基酸保护及肽键合成的研究[D].山西大学,2011.”、“许胜.有机合成中的保护基:氨基、炔氢、磷酸脂基团的保护[M].华东理工大学出版社,2016.”、“高旭红等.石河子大学学报(自然科学 版),1999,(01):76-86.”、“中国医药工业杂志,1994,(10):456.”、“化学学报,1984,(04):358-366.”、“国外医学.药学分册,1990,(03):135-138.”、“化学通报,1980,(10):16-17.”、“季涛.肽合成中 官能团新型保护方法的研究[D].厦门大学,2008.”、“王玲.保护氨基酸的制备研究[D].南京工业 大学,2003.”、“化学通报,1991,(02):1-7.”、“黄惟德，陈常庆著.多肽合成[M].北京：科学出版 社,1985.”、“化工管理,2013,(08):204-205.”、“科技信息,2011,(03):478.”、“湖北师范学院学报(自 然科学版),1985,(02):66-72.”、“赣南师范学院学报,1985,(S2):27-42.”、“赵知中编.有机化学中 的保护基团[M].北京：科学出版社,1984.”、“麦凯(Mackie，R.K.),史密斯(Smith，D.M.). 有机合成指南[M].陈韶,译.北京:科学出版社,1988.”、“Guidebook to Organic Synthesis",R.K. Mackie,D.M.Smith andR.A.Aitken,Addison.WesleyLongman,3rd ed.,1999.”等。

1.1.1.2.氮源试剂的反应性端基F₁

氮源试剂的反应性端基F₁，可进行偶合反应而生成共价键。反应性端基F₁包括但不限于 羧基、氯酰基、羧酸酯基、羰基、醛基、羟基、叠氮基等类型；也可以为氨基，但不推荐，以免在后续的PEG链偶联反应中导致副反应的发生。需要说明的是，F₁不限定于–COOH、 –CHO、–SH等反应性基团，还可以含有任意合适的连接基，例如–CH₂COOH、 –CONH–CH₂CH₂CHO等。F₁的供选择范围包括但不限于文献CN104877127A、 WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中类A～类H的反应性基团。

需要说明的是，F₁中的反应性基团与L_c之间还可以存在经偶合反应生成的二价连接基(一 般为含主链杂原子的二价连接基)。即氮源试剂可以是含氮源的分子与另外的小分子化合物偶 合而成。此时，可以向氮源试剂的F₁引入任意合适的反应性基团，以便和官能团源试剂偶联。

1.1.1.3.碳链连接基L_c

L_c为氮源试剂中的碳链连接基，连接氮源端基U_N和反应性端基F₁，主链全部由碳原子 构成。L_c可以是脂肪族性质的，也可以是芳香族性质的；可以为烃基，也可以含有杂原子， 但是杂原子只能存在于碳链的侧基。例如，L_c可以含有–C(＝O)–、–C(OX)–、–C(CH₂OX)–、–C(＝S)–、–C(＝NX)–，其中X为烃基；但不可以含有–O–、–S–、–C(＝S)–O–、–C(＝O)–S–、 –C(＝O)–O–、–C(＝O)–NH–、–NH–C(＝O)–O–等。对于通式(2)，L_c与支化氮原子相邻的碳优 选不为羰基、硫代羰基、氨羰基–C(＝NX)–。

L_c优选1～24个原子间隔，更优选1～12个原子间隔，更优选1～6个原子间隔，最优选1、 2或3个原子间隔。举例，对位苯撑也即1,4-亚苯基的原子间隔为4，间位苯撑的原子间隔为 3，邻位苯撑的原子间隔为2，–CH₂–、–CH(CH₃)–、–C(CH₃)₂–、–CH(CH₂Ph)₂–、–C(CH₂OX)–的原子间隔均为1。

L_c为亚烃基或侧基含杂原子的碳链连接基；优选碳原子数为C_1～24，即C_1～24亚烃基或C_1～24侧基含杂原子的碳链连接基。L_c的结构为线性、支化或含环状结构。

优选之一为L_c包含

C_3～6二价环烷基、取代的C_3～6二价环 烷基、苯撑、取代的苯撑中至少一个。其中，A₁、A₂、A₃为相同或不同的含有1～10个碳原子的取代基，且各自独立；i、j、k为0～24的整数。A₁、A₂、A₃各自独立地选自包括但不限 于：烷基、环烷基、苯基、芳烷基、取代的烷基、取代的环烷基、取代的苯基、取代的芳烷 基、杂化的烷基、杂化的环烷基、杂化的苯基、杂化的芳烷基。

L_c优选之一：与支化N中心相邻的碳原子侧基不含杂原子。

L_c优选之一：亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合。

L_c的优选组之一为C_1～24亚烃基，更优选C_1～12亚烃基，更优选C_1～10亚烃基，更优选C_1～6亚烃基。具体地，优选亚甲基、1,2-亚乙基、1,3-亚丙基、–Ph–、–CH₂–Ph–。其中，Ph为苯环，–Ph–可以为对位、间位或邻位。

L_c的另一组优选为CHR₂₀。其中，R₂₀为氨基酸及其衍生物的侧基、侧基的被保护形式或 侧基的被取代形式；要求R₂₀是非反应性基团。

作为R₂₀来源的氨基酸为氨基酸或氨基酸的衍生物，所述氨基酸为_L-型或_D-型。

作为举例，R₂₀选自包括但不限于以下任一类别中任一种氨基酸及其衍生物的侧基、侧基 的被保护形式或侧基的被取代形式，只要能进行本发明的制备过程即可：

中性氨基酸及其衍生物：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸；

含羟基或巯基的氨基酸的侧基被保护形式：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸；

酸性氨基酸的侧基被保护形式：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；

碱性氨基酸的侧基被保护形式：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、组氨酸、色氨酸。

R₂₀优选甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸的侧基。这是因为其它几种类别的氨基酸及其衍生物由于具有两个反应性基团或其变化形式，对于制备 小分子中间体IM1可能带来干扰或不便。

1.1.2.氮源试剂的种类

氮源试剂N_source优选氨基羧酸、氨基酮、氨基醛、氨基醇等化合物或上述任一种化合物 的氨基被保护的形式。N_source的供选择的范围包括但不限于CN104877127A第998段公开的 异官能化小分子biheteroSM中含氮源端基的化合物。优选天然存在的、商业来源的、文献已 有报道或根据本领域常规技术较容易合成的原料。

氮源试剂的优选之一为氨基羧酸类试剂，典型如氨基酸类、ω-氨基羧酸类。对于中性氨 基酸类，C-端为COOH结构，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸；对于天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺等酸性氨基酸，N-端形成支化中心， C-羧基与侧基活性基团中任一个为活性形式，另一个为被保护形式；对于赖氨酸、鸟氨酸等 侧基含氨基的碱性氨基酸，N-氨基与侧氨基中任一个形成支化中心，另一个氨基与C-羧基中 仅一个为活性形式，优选一个氨基被保护而羧基参与形成L_d。所述ω-氨基羧酸优选 NH₂-L₅-COOH，其中L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合， 且含有至少两个碳原子；进一步优选ω-氨基烷羧酸；进一步优选H₂N(CH₂)_j1COOH，其中， 整数j₁选自2～20，优选2～12，更优选2～6，最优选2(即β-丙氨酸)。上述任一种氨基羧酸 类试剂，包括ω-氨基羧酸在内，其N-端可以是非保护形式的NH₂，也可以是被保护形式。

又如氮源试剂可以为2-叠氮基乙胺或其N-端被保护的化合物，2-氨基乙硫醇或其N-端被 保护的化合物，2-氨基乙醇或其N-端被保护的化合物等等。

1.2.官能团源试剂F_source

官能团源试剂F_source是本发明中提供单一官能团源的试剂，其一个端基D_F提供官能团源， 另一个端基F₂具有反应活性。

官能团源试剂F_source可以来自具有商业来源的、现有已知的、或者利用现有技术手段能 够合成的化合物。优选具有商业来源、利用商业来源的原料结合常规技术能够合成的化合物。

1.2.1.官能团端D_F

D_F作为官能团源，可以是指定的功能性基团F，也可以是指定的功能性基团F的微变化 形式。

功能性基团F中含有一个功能性端基R₀₁，R₀₁直接连接F₂或通过任意合适的连接基Z连接F₂。

R₀₁为能与生物相关物质相互反应的功能性基团。所述与生物相关物质相互反应包括但不 限于共价键的形成、氢键的形成、光学反应和靶向作用。

R₀₁优选自反应性基团、反应性基团的微变化形式、具有治疗靶向性的功能性基团(靶向 基团)、光敏性功能基团(光敏性基团)。

所述反应性基团是活性的，可与生物相关物质之间发生键合反应而形成连接，且主要指 形成共价键的反应，而形成非共价连接时，通过二氢键或多重氢键进行络合。所述的共价键 包括但不限于可稳定存在的共价键、可降解的共价键、动态共价键。

所述反应性基团的微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质 子化、改变离去基团等较简单的化学过程，即可转变为目标反应性基团。优选微变化形式为 目标反应性基团的被保护形式。所述的“简单的化学过程”是与羟基转变为非羟基基团的衍 生化反应、偶合反应等过程进行比较，相对而言更易操作、更易实现近100％的转化，因此本 发明中也称为末端“微修饰”。

所述动态共价键包括但不限于WO/2016/206540A及其引用文献公开的结构，包括但不限 于{Top Curr Chem(2012)322:1-32}、{Top Curr Chem(2012)322:291-314}、{Angew.Chem.Int. Ed.2002,41,898-952}、{J.Am.Chem.Soc.2015,137,14248-14251}、{RSC Adv.,2015,5, 67011-67030}、{ACS Macro Lett.,2016,5(1),78-82}、{Synlett2016；27(02):177-180}、 {Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,15739-15743}、{Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,8980-8983}、 {Chem.Commun.,2015,51,16338-16341}、{Molecular Cell,2015,59,716-717}等文献及其引用 文献中所公开的动态共价键。

光敏性功能基团主要是指荧光性基团，还可以包括直接发出或经刺激后发出可见光、磷 光的基团等。只要能发出荧光，或者经体内微环境作用能发出荧光(如二乙酸荧光素)，或者 经临床性刺激可发出荧光(如光刺激、热刺激等)，则均归为荧光性功能基团。

R₀₁的供选择的范围包括但不限于文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中记载的(类A～类J)、且适用于本发明的功能性基团。且主要参考CN201610252378X的分类方式。

R₀₁的供选择的范围包括但不限于类A～类H的功能性基团或其变化形式，这几类的R₀₁为反应性基团或其变化形式为反应性基团。

类A：活性酯基(包括但不限于琥珀酰亚胺活性酯(如A1、A6)、对硝基苯活性酯(如A2、A7)、邻硝基苯活性酯(如A11、A12)、苯并三唑活性酯(如A5、A10)、1,3,5-三氯苯 活性酯(如A3、A8)、氟代苯基活性酯(如A13，如1,3,5-三氟苯活性酯、五氟苯活性酯)、 咪唑活性酯(如A4、A9))，及活性酯基的类似结构A16-A18(如2-硫酮-3-噻唑烷甲酸酯(四 氢噻唑-2-硫酮-N-甲酸酯)、2-硫氧代噻唑烷-3-羧酸酯、2-硫酮吡咯烷-N-羧酸酯、2-硫酮吡咯 烷-N-甲酸酯、2-硫酮苯并噻唑-N-甲酸酯、1-氧代-3-硫氧代异吲哚啉-N-甲酸酯等)等；

类B：磺酸酯基、亚磺酸酯基、砜基、亚砜基、1,3-二砜基-2-丙基羰基苯基、砜甲基丙 烯酰基等；

类C：羟胺、巯基、氨基(伯氨基，如C4，或仲氨基，如C5、C15)、卤原子、卤代乙 酰胺基(如碘代乙酰胺基)、四甲基哌啶氧基、二氧杂哌啶氧基(3,5-二氧-1-环己胺-N-氧基)、铵盐(胺盐)、肼、二硫化物/双硫化合物(如线性的邻二硫吡啶等、如环状的硫辛酸等)、C17(酯基、硫酯基、硫代酯基)、C18(碳酸酯基、硫代碳酸酯基、二硫代碳酸酯基、三硫酯基 /三硫代碳酸酯)、C19(酰羟胺、O-羰基羟胺)、黄原酸酯、过硫代碳酸酯、四硫双酯、酰胺、 酰亚胺、酰肼、磺酰肼、腙、亚胺、烯胺、炔胺、被保护的羟基或巯基(氨基甲酸酯、一硫 代氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯)、被保护的氨基(氨基甲酸酯、一硫代氨基甲酸酯、二硫 代氨基甲酸酯)等；

类D：羧基、磺酸基、次磺酸基、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、黄原酸、酰卤、磺酰氯、 醛基、乙二醛、缩醛、半缩醛、水合醛、酮、缩酮、半缩酮、半酮缩醇、酮缩醇、水合酮、 原酸、原酸酯、氰酸酯、硫氰酸酯、异腈酸酯、异硫氰酸酯、酯基、氧羰酰卤、二氢恶唑(恶 唑啉D13、异恶唑啉)、硫醛、硫酮、硫缩醛、硫酮水合物、酮缩硫醇、半酮缩硫醇、硫酯(如 D26)、硫代酯(如D27)、双硫酯(二硫代酯，如D18)、硫代半缩醛、单硫代水合物、二硫 代水合物、硫醇水合物、硫代羧酸[一硫代羧酸(硫代羰基D16或硫代羟基D15)、二硫代羧 酸D17]、脲基、硫脲基、胍基及其质子化形式、脒基及其质子化形式、酸酐、方酸、方酸酯、 半方酸、半方酸酯、N-氨基甲酰基-3-咪唑或N-氨基甲酰基-3-甲基碘化咪唑鎓、亚氨酸、亚 氨酸酯、硝酮、肟、假脲等；

类E：马来酰亚胺基、丙烯酸酯、N-丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、N-甲基丙烯酰胺、被保护的马来酰亚胺(如E5)、马来酰胺酸、1,2,4-三唑啉-3,5-二酮、偶氮基(如线性的偶氮化合物、环状的E7等)、环烯烃基(如环辛烯烃、降冰片烯、7-氧杂-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基、二环庚二烯/2,5-降冰片二烯、7-氧杂二环庚二烯等)等，其中E13中的W₃包括但不限于卤素、PhS-等离去基团；

类F：环氧基(缩水甘油醚基)、烯基(包括乙烯基、丙烯基等)、烯基烃基(如烯丙基等)、炔基(如丙炔基)、炔基烃基(如炔丙基)等；

类G，

类Ga：环炔烃基或环炔杂烃基(如G1、G2、G3、G4、G7、G8、G9、G10)、共轭二烯烃(如线性的丁二烯基，如环状的环戊二烯)、杂化的共轭二烯烃基(如呋喃)、1,2,4,5-四嗪 基等；

类Gb：叠氮基、氧化腈/氰氧化物、氰基、异氰基、醛肟、重氮基、重氮鎓离子、氧化偶氮、 腈亚胺、N-氧化醛亚胺、四氮唑、4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基(G31)及其重氮 化形式(G32)等；其它可发生1,3-偶极环加成反应官能化基团亦纳入本发明中；

类H：羟基(包括但不限于醇羟基、酚羟基、烯醇式羟基、半缩醛羟基等)、被保护的羟 基、硅氧基等；

文献Adv.Funct.Mater.,2014,24,2572中所报道的及其引用的click反应相关的功能性基 团作为参考均纳入本发明中。

上述功能性基团(含其变化形式)的用途，作为举例，包括但不限于：

类A的基团可进行氨基修饰，生成酰胺键或氨基甲酸酯键。

类B的基团中的磺酸酯或亚磺酸酯可以用于进行烷基化修饰，含砜基或亚砜基的基团可 用于进行巯基或二硫键的修饰。

类C的基团也经常出现于生物相关物质的被修饰位点，如巯基、氨基、二硫键等。此类 别中主要为具有类似反应性的基团(如羟胺、肼)、被保护形式、盐形式等，此外还包括易离 去的卤素等。C10中如碘代乙酰胺还可以进行巯基修饰。C13和C14同时还可以隶属被保护 的巯基C3。C14的典型举例如硫辛酸。

类D的基团或脱保护后形式可以与羟基或类C中的基团相互反应，如D1～D6、D9、D10、 D12、D13、D14～D16、D19、D20、D21、D22、D23、D25、D29，或D7、D8、D11、D18、 D24、D26～D28的脱保护形式，可以与氨基、巯基、羟基或卤代物中的合适基团发生反应。 类D中的基团也可以与此类别中的其它基团发生反应，例如D25可以与D1发生反应，D13 可以与D1、D4发生反应。其中，胍基可与丹参酮IIa的两个羰基形成二氢键。

类E的基团含有α,β-不饱和键，可发生1,2-加成反应，例如可与类C中氨基、巯基及类 H中的羟基反应，大多属于加成型烷基化反应。E13还可以与双巯基发生取代反应。

类F的基团，其最常见的几种结构在制备方法上具有相似性，可通过相应的卤代物发生 取代反应获得。其中，环氧基包括但不限于通过开环得到裸露的双羟基、与氨基发生开环加 成反应等。F2的烯基可发生加成反应。F3和脱保护的F4是click反应的常见基团。

类G的基团均可进行click反应，又分成Ga和Gb两小类，Ga中的环炔及其前体、共轭二烯烃、1,2,4,5-四嗪基可以发生环加成或Diels-Alder加成反应，Gb中烯丙基、炔丙基、丙二烯等类型的基团可发生1,3-偶极环加成反应。另外，G31可经联胺等处理转化为G32所示的反应性基团，G32可与羧基反应生成酯键。

类H的基团为羟基或其被保护形式。类H中的羟基也可存在于生物相关物质的被修饰位 点。此外，H6、H7可在光条件下转化为烯醇式的羟基，进而与如类E中的α,β-不饱和键发生 加成反应。

R₀₁也可不与生物相关物质发生键合反应，此时具有特殊功能，包括靶向基团和光敏性基 团两类功能性基团或其被取代的形式。该被取代的形式需仍具有相应的特殊功能，可归为相 应的靶向基团和光敏性基团。此类R₀₁包括但不限于类I～类J：

类I：靶向基团及其药物学上可接受的盐，如叶酸及其衍生物、胆固醇及其衍生物、生物 素及其衍生物等。生物素的衍生物如D-脱硫生物素、2-亚氨基生物素等。

类J：光敏性基团(主要包括荧光性基团)，如酞菁配合物、荧光素、罗丹明、蒽、芘、香豆素、荧光黄3G、咔唑、咪唑、吲哚、茜素紫等上述任一种及任一种的功能性的衍生物。 其中，罗丹明的衍生物包括但不限于四甲基罗丹明、四乙基罗丹明(罗丹明B、RB200)、罗 丹明3G、罗丹明6G(罗丹明590)、5-羧基-X-罗丹明、6-羧基-X-罗丹明、磺酰罗丹明B、磺 酰罗丹明G、磺酰罗丹明101、罗丹明X(R101)、罗丹明101、罗丹明110、罗丹明123、罗 丹明700、罗丹明800等，还包括但不限于文献{Progress in Chemistry,2010,22(10):1929-1939} 及其引用文献中所记载的罗丹明衍生物。

本发明中，优选之一是R₀₁为非羟基团(不是羟基、也不是羟基的微变化形式)，即优选 A～G、I、J类。

功能性基团R₀₁的结构分类

具体地，R₀₁的供选择的结构范围包括但不限于以下类A～类J中任一种类别中的功能性 基团、类A～类H的变化形式、类I-类J的功能性衍生物：

类A：

或类B：

或类C：

或类D：

或类E：

或类F：

或类G：

类Ga：

或类Gb：

或类H：

或类I：

或类J：

等。

上述类A～类J中的符号如E₀₂、E₀₃、M、M₅、M₈、M₁₉、M₂₀、M₂₁、M₂₂、PG₂、PG₃、 PG₄、PG₅、PG₈、Q、Q₃、Q₅、Q₆、Q₇、Q₈、Q₁₁、R₂、R₃、R₄、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₂₁、 R₂₄、R₂₇、R₃₀、W、W₂、W₃、X₆、X₁₁、X₁₂、X₁₃、Y₁等的定义参考文献CN104877127A、 WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中定义及各级优选方式，以下仅简单进 行概述，不详细展开。

其中，E₀₂和E₀₃中任一个对应于碳酰基，即不存在，另一个为OH或羟基的衍生形式，如形成酯基。

其中，M₅为成环原子，即位于环上的原子。M₅为碳原子或杂原子。M₅优选为碳原子、氮原子、磷原子或硅原子。M₅所在的环为3～50元环，优选3～32元环，更优选3～18元环， 更优选5～18元环。

M₅所在的环没有特别限制，包括但不限于

等。成环原 子数没有特别限定，优选为3～50元环，更优选为3～32，更优选为3～18。

其中，脂肪族环

为任一种脂环或脂杂环，芳香族环

为任一种芳环或芳杂环， 糖环

为具有环状单糖骨架的糖类或糖类衍生物的骨架，缩合环

为含有酰胺键、 酯键、酰亚胺、酸酐等缩合形成的化学键的环。

其中，Y₁为连接磺酰基、亚磺酰基、氧基磺酰基或氧基亚磺酰基的离去基团，优选自甲 基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、乙烯基、苯基、 苄基、对甲基苯基、4-(三氟甲氧基)苯基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基中任一种。

其中，W为F、Cl、Br或I，优选为Br或Cl。

其中，W₃为离去基团，包括但不限于F、Cl、Br、I、PhS-，优选为Br或Cl。

其中，W₂为F、Cl、Br或I，优选为I。

其中，

分 别为环骨架上含有氮原子、氮鎓离子、碳碳双键、偶氮、碳碳三键、二硫键、酸酐、二烯的 环状结构，包括但不限于碳环、杂环、苯并杂环、取代的碳环、取代的杂环或取代的苯并杂 环等。

其中，M是环上的碳原子或杂原子，包括但不限于碳原子、氮原子、磷原子、硅原子。

其中，M₈为位于环上的碳原子或杂原子。M₈优选为碳原子、氮原子、磷原子或硅原子。 M₈所在环的成环原子数没有特别限定，优选为4～50，更优选4～32，更优选为5～32，更优选 为5～18，最优选5～8。M₈可为4～50元环上的碳原子或杂原子，优选4～32元环上的碳原子、 氮原子、磷原子或硅原子，更优选5～32元环上的碳原子、氮原子、磷原子或硅原子，更优选 5～18元环上的碳原子、氮原子、磷原子或硅原子；最优选5～8元环上的碳原子、氮原子、磷 原子或硅原子。

其中，M₂₂为位于脂环或脂杂环上的碳原子或杂原子，可选自碳原子、氮原子、磷原子 或硅原子。M₂₂所在环的成环原子数，为4、5、6、7或8，优选为4、5或6。

其中，PG₈为原碳酸的保护基，D8为原酸的被保护形式。PG₈可以为单一的三价端基如

以D8为例，对应于

PG₈也可以为两个或三个独立的端基，相应地，D8对应于

H5对应于

其中，R₂为缩醛、缩酮、半缩醛、半缩酮、原酸酯、硫代缩醛、硫代缩酮、硫代半缩醛、硫代半缩酮、硫代原酸酯等结构中连接氧或硫原子的端基或二价连接基，如D7、D18、D8。

R₂可选自氢原子、R₂₁或R₃中任一种原子或基团；R₂₁为二价连接基，参与成环；R₃为连接氧基或硫基的端基。

R₂₁选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、1,2-亚苯基、亚苄基、C_1-20氧杂亚烷基、C_1-20硫杂亚烷基、C_1-20氮杂亚烷基、氮杂 芳烃基中任一种基团、任一种基团的被取代形式，任两种或任两种以上相同或不同的基团或其被取代形式的组合。R₂₁更优选1,2-亚乙基、1,3-亚丙基。

R₃为一价端基，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、 壬基、癸基、苄基、烯丙基等中任一种或任一种的被取代形式。最优选为甲基、乙基或苄基。

其中，R₄为-(R₄)C＝N⁺＝N-结构中C上的氢原子或取代基。R₄优选为氢原子、甲基、乙 基、正丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、烯丙基、丙烯基、乙 烯基、苯基、甲基苯基、丁基苯基、苄基中任一种原子或基团。R₄最优选为氢原子、甲基或 苄基。

其中，R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂各自独立地为碳碳双键(-C＝C-)上的氢原子或取代基， 且在同一分子中，R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂任两个可以彼此相同或不同。R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、 R₁₂各自独立地更优选为氢原子、氟原子或甲基。类E3中，R₈最优选甲基。

其中，R₂₄为连接于二硫键的端基，优选C_1-20烷基、芳基、芳基烃基、杂化的苯基等，如邻吡啶基。

其中，R₂₇为连接于偶氮的取代基，优选苯基、取代的苯基或杂化的苯基。

其中，R₃₀为烃基，优选C_1-20烷基、苄基、苯环氢原子被C_1-20烃基取代的苄基。

其中，M₁₉、M₂₀、M₂₁各自独立地为氧原子或硫原子，且在同一分子中，任两个可以彼此相同或不同。

其中，X₁₁为连接羰基或硫代羰基的端基，优选C_1-20烷基，更优选甲基、乙基、异丙基、 叔丁基。

其中，X₁₂为连接碳酸酯基或硫代碳酸酯基的端基，选自烃基(可以包括或不包括苯环)， 优选C_1-20烃基，更优选C_1-20烷基、苯基烃基或烃基取代的苯基。

其中，X₁₃为连接硫基的端基，选自巯基保护基或基团LG₂。当为巯基保护基时，X₁₃选自PG₂所列举组中的巯基保护基。LG₂选自C_1-20烃基、C_1-20杂烃基、取代的C_1-20烃基、取代 的杂烃基中任一种基团。LG₂更优选为叔丁基、三苯甲基、苯基、苄基、甲基苄基、叔丁基 硫基、苄基硫基、2-吡啶基硫基、2-吡啶基羰基、叔丁基氧基羰基、苯氧基羰基、苄氧基羰 基、叔丁基氧基硫代羰基、苯氧基硫代羰基、苄氧基硫代羰基、叔丁基硫基硫代羰基、苯硫 基硫代羰基、苄硫基硫代羰基、三氟乙酰基等中任一种基团。LG₂更优选为叔丁基、三苯甲 基、苯基、苄基、甲基苄基、叔丁基硫基、苄基硫基、2-吡啶基硫基等中任一种基团。LG₂最优选为甲基、乙基、烯丙基或苄基。

其中，X₆为连接于酯基中氧原子的端基，选自羟基保护基或基团LG₄。当为羟基保护基 时，X₁选自PG₄所列举组合中的羟基保护基。被保护的羟基记为OPG₄。羟基保护基没有特别限制。LG₄选自C_1-20烃基、C_1-20杂烃基、取代的C_1-20烃基、取代的杂烃基中任一种基团。 LG₄更优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、戊基、己基、烯丙基、三苯甲基、苯 基、苄基、1-乙氧基乙基、2-乙氧基乙基、甲氧基乙氧基甲基、苄氧基甲基、甲硫基甲基、 四氢吡喃基、硝基苄基、对甲氧基苄基、三氟甲基苄基、叔丁基氧基羰基、苯氧基羰基、苄 氧基羰基、乙酰基、三氟乙酰基等中任一种基团。LG₄更优选为甲基、乙基、正丙基、异丙 基、叔丁基、戊基、己基、烯丙基、三苯甲基、苯基、苄基、硝基苄基、对甲氧基苄基、三 氟甲基苄基等中任一种基团。LG₄最优选为甲基、乙基、烯丙基或苄基。

其中，Q没有特别限制，只要有助于不饱和键电子的诱导、共轭效应即可。当Q处于环 上时，可以是一个或多个。当为多个时，可以为相同结构，也可以为两种或两种以上不同结 构的组合。Q可以为原子或取代基。Q更优选为氢原子、氟原子、甲基、三氟甲基、甲氧基、甲氧羰基等中任一种原子或基团。

其中，Q₃为H原子或有助于不饱和键电子的诱导、共轭效应的基团；Q₃选自包括但不限 于术语部分列举的所有取代基的组合，只要有助于不饱和键电子的诱导、共轭效应即可。Q₃优选自氢原子、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、乙烯基、丙烯基、烯丙基、丙炔基、炔丙基、环丙 基、环丙烯基、苯基、苄基、丁基苯基、对甲基苯基、对硝基苯基、邻硝基苯基、对甲氧基 苯基、氮杂苯基、甲氧基、乙氧基、苯氧基、苄氧基、甲硫基、乙硫基、苯硫基、苄硫基、 三氟甲基、2,2,2-三氟乙基中任一种原子或基团，或任一种基团的被取代形式Q₃更优选为氢 原子、甲基、苯基、吡啶基、二氮杂苯基、三氮杂苯基。Q₃更优选为氢原子、甲基、苯基或 吡啶基。Q₃最优选为氢原子、苯基或吡啶基。

其中，Q₅选自氢原子或取代基，没有特别限制，优选自H原子、甲基、乙基或丙基。当Q₅位于环上时，可以是一个或更多个。当大于1个时，可以为相同结构，也可以为两种或两种以上不同结构的组合。Q₅所在的环包括但不限于芴、咔唑、降冰片烯、7-氧杂-双环[2.2.1] 庚-5-烯-2-基。

其中，Q₆为氢原子或甲基。Q₇为氢原子、甲基、苯基或取代的苯基。所述取代的苯基，如对甲氧基苯基。同一分子中，Q₆和Q₇可以相同或不同(也即彼此相同或不同)。

其中，Q₈为咪唑基上的取代基，没有特别限制，优选自H原子、甲基、乙基、丙基、丁基或苯基。当Q₈可以是一个或更多个。当大于1个时，可以为相同结构，也可以为两种或两种以上不同结构的组合。

其中，Q₁₁为四氮唑的氮原子上的取代基，优选苯基、取代的苯基或氮杂苯基。

其中，PG₂为巯基保护基，被保护的巯基表示为SPG₂。

其中，PG₃为炔基保护基，被保护的炔基表示为C≡CPG₃。

其中，PG₄为羟基保护基，被保护的羟基被表示为OPG₄。

其中，PG₅为氨基保护基，被保护的氨基表示为NPG₅。

PG₂、SPG₂、PG₃、PG₄、OPG、PG₅、NPG₅包括但不限于文献CN104530417A、CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中所描述及列举的结构。以CN104530417A为例，对应段[0520]～[0530]。概括地，

所述SPG₂优选硫醚、二硫醚、硅基硫醚、硫代酯等结构。具体地，SPG₂优选叔丁基硫醚、三苯甲基硫醚、取代的三苯甲基硫醚、叔丁基二甲基硅基硫醚、三异丙基硅基硫醚、苄基硫醚、取代的苄基硫醚、对硝基苄基硫醚、邻硝基苄基硫醚、乙酰基硫代酯、苯甲酰基硫代酯、三氟乙酰基硫代酯、叔丁基二硫醚、取代的苯基二硫醚、2-吡啶二硫醚等当中的任一种。

所述PG₃优选硅基，包括但不局限于以下结构：三甲基硅基、三乙基硅基、叔丁基二甲 基硅基、二甲基(1,1,2-三甲基丙基)硅基、二甲基[1,1-二甲基-3-(四氢呋喃-2H-2-氧)丙基]硅基、 联苯基二甲基硅基、三异丙基硅基、联苯基二异丙基硅基、叔丁基二苯基硅基、2-(2-羟基) 丙基等。

所述PG₄可以为醇羟基或酚羟基的保护基。OPG₄优选醚、硅醚、酯、碳酸酯、磺酸酯等结构。具体地，OPG₄优选甲基醚、1-乙氧基乙基醚、叔丁基醚、烯丙基醚、苄基醚、对甲氧 基苄基醚、邻硝基苄基醚、对硝基苄基醚、2-三氟甲基苄基醚、甲氧基甲醚、2-甲氧基乙氧 基甲基醚、苄氧基甲醚、对-甲氧基苄氧基甲基醚、甲硫基甲醚、四氢吡喃基醚、三甲基硅基醚、三乙基硅基醚、三异丙基硅基醚、叔丁基二甲基硅基醚、乙酸酯、氯乙酸酯、三氟乙酸酯、碳酸酯等当中的任一种。醚保护结构中，优选1-乙氧基乙基醚、苄基醚、对甲氧基苄基醚、邻硝基苄基醚、对硝基苄基醚、2-三氟甲基苄基醚、乙烯基乙醚、苄氧基甲醚、对-甲氧基苄氧基甲基醚、四氢吡喃基醚。

所述PG₅可以为伯胺、仲胺、联氨等的保护基。NPG₅优选氨基甲酸酯、酰胺、酰亚胺、N-烷基胺、N-芳基胺、亚胺、烯胺、咪唑、吡咯、吲哚等结构。具体地，NPG₅优选甲酰胺、 乙酰胺、三氟乙酰胺、氨基甲酸叔丁酯、氨基甲酸2-碘乙酯、氨基甲酸苄基酯、氨基甲酸9- 芴甲酯、氨基甲酸2-三甲硅基乙酯、氨基甲酸2-甲基磺酰基乙酯、氨基甲酸2-(对甲苯磺酰基)乙酯、邻苯二甲酰亚胺、二苯基亚甲胺、1,3,5-二氧氮杂环己烷、甲基氨基、三苯基甲基氨基、 叔丁基氨基、烯丙基氨基、苄基氨基、4-甲氧基苄基氨基、苄亚胺等当中的任一种。

获得D_F的方法包括但不限于CN104530417A(特别地，第960-1205段)、CN104877127A (特别地，第1004-1087段)、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中的适合 的修饰方法。

R₀₁优选之一为能与氨基、羟基、羧基、巯基、二硫连接基、醛基、酮羰基、胍基、酰胺基、叠氮基、炔基、烯基、咪唑基、吲哚基等生物相关物质或改性的生物相关物质中存在的活性基团发生反应的基团。现有技术中已公开的生物相关物质的活性基团均可作为反应对象。

R₀₁的另一组优选为具有被保护形式的反应性基团、被保护形式或盐形式，例如氨基、巯 基、羟基、醛基、马来酰亚胺基、炔基、被保护的炔基、烯基等及上述基团的被保护形式、 胺盐。优选脱保护反应容易操作及进行、且脱保护程度比较彻底的被保护形式。步骤三中的 脱保护反应可采用本领域现有技术，优选较温和、易操作、脱保护程度高的脱保护方法。例 如CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中采用的缩醛(被 保护的醛基)、被保护的马来酰亚胺基、被保护的氨基、被保护的羟基、被保护的巯基、被保 护的炔基、被保护的羧基(e.g.酯类)、氨基甲酸酯类、Boc保护基、Fmoc保护基、TBS保护基等的脱保护方法。R₀₁还优选酰卤、酰胺、被保护的酰胺、酰肼、被保护的酰肼，其中， 酰卤优选酰氯。

其中，R₀₁的优选之一为–CHO或其缩醛保护形式。

其中，R₀₁的优选之一为马来酰亚胺基，或其呋喃保护形式。

其中，R₀₁的优选之一为–NH₂、或其被保护形式、或其盐形式。

其中，R₀₁的优选之一为–COOH或其酯保护形式。

其中，R₀₁的优选之一为–N₃。

其中，R₀₁的优选之一为–C≡CH或其被保护形式。

1.2.2.反应性端基F₂

官能团源试剂的反应性端基F₂，能够与氮源试剂的反应性端基F₁发生偶合反应而生成共 价连接基L_d。F₂没有特别限制，可以为任意合适的反应性基团。F₂的供选择范围包括但不限 于文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中类A～类H 的反应性基团。

其中，二价连接基L_d是通过氮源试剂N_source的反应性基团F₁、含官能团源的试剂F_source的反应性基团F₂之间的偶合反应生成的，L_d的供选择的范围包括但不限于文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中所描述及列举的稳 定的STAG及可降解的DEGG。偶合反应时生成的醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯 键、二硫代酯键、尿烷键、一硫代氨基甲酸酯键、二硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代 碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、亚胺键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑 连接基、

等连接基导致L_d含有主链杂原子。

所述L_d含有的偶合反应生成的共价连接基包括但不限于-O-、-S-、-NX-、-C(＝O)-、 -C(＝S)、-C(＝NH)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、 -C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-O-C(＝O)-O-、 -S-C(＝O)-O-、-O-C(＝S)-O-、-O-C(＝O)-S-、-S-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-S-、-S-C(＝O)-S-、 -S-C(＝S)-S-、-NH-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-NH-、-NH-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-NH-、-NH-NH-、 -NH-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝S)-NH-、-NH-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-NH-、 -NH-NH-C(＝S)-、-C(＝S)-NH-NH-、-HC＝N-、-N＝CH-、-HC＝N-NH-、-NH-N＝CH-、 -HC＝N-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-N＝CH-、-HC＝N-O-、-O-N＝CH-、-HC＝N-S-、 -S-N＝CH-、-N＝N-、-NH-NH-C(＝O)-N＝N-、-N＝N-C(＝O)-NH-NH-、-NH-C(＝O)-NH-、 -C(＝NH)-NH-、-NH-C(＝NH)-、-NH-C(＝NH₂ ⁺)-、-C(＝NH₂ ⁺)-NH-、-C(＝NH)-O-、 -O-C(＝NH)-、-O-C(＝NH₂ ⁺)-、-C(＝NH₂ ⁺)-O-、-C(＝NH)-S-、-S-C(＝NH)-、-S-C(＝NH₂ ⁺)-、 -C(＝NH₂ ⁺)-S-、-S(＝O)₂-O-、-O-S(＝O)₂-、-S(＝O)-O-、-O-S(＝O)-、-S(＝O)₂-NH-、 -NH-S(＝O)₂-、-S(＝O)₂-NH-NH-、-NH-NH-S(＝O)₂-等中任一种或任一种的被取代形式。 其中，-O-、-S-、-NX-、-C(＝O)-、-C(＝S)、-C(＝NH)-由于是经偶合反应生成的，所以 是以醚键、硫醚键、二价叔氨键、酮、硫酮、氨基酮的形式存在，优选-CH₂-O-、-O-CH₂-、 -CH₂-S-、-S-CH₂-、-CH₂-NX-、-NX-CH₂-等。其中，X为烃基。所述的被取代形式，可 以是1个或更多个氢原子被取代，所述取代基可以为烃基或含杂原子的烃基，优选烃基。尤 其是含-NH-NH-结构的连接基，优选H原子被烃基取代。当至少2个氢原子被取代时，任 两个取代基可以彼此相同或不同。

所述L_d中可含有的经偶合反应生成的共价键的数量可以仅1个或大于1个。

最优选之一为L_d含有酰胺键。此时，氮源试剂可以直接采用氨基酸或ω-氨基羧酸类等。

本发明的偶合反应(不限于生成L_d的偶合反应)没有特别限制，只要能顺利制备通式所 示的单一功能化支化聚乙二醇即可。其反应条件，与反应生成的共价连接基类型有关，可采 用现有公开技术。概括地，例如：氨基分别与活性酯、甲酸活性酯、磺酸酯、醛、α,β-不饱 和键、羧酸基团/酰卤、磺酰卤、环氧化物、异氰酸酯、异硫氰酸酯、氰基反应得到酰胺基、 尿烷基、氨基、亚胺基(可进一步还原成仲氨基)、氨基、酰胺基、磺酰胺、氨基醇、脲键、硫脲键、脒键等二价连接基；巯基分别与含有活性酯、甲酸活性酯、磺酸酯、巯基、马来酰 亚胺基、醛、α,β-不饱和键、羧酸基团、碘代乙酰胺、酸酐反应得到硫酯基、硫代碳酸酯、 硫醚、二硫化物、硫醚、硫代半缩醛、硫醚、硫酯、硫醚、酰亚胺等二价连接基；不饱和键 与巯基反应得到硫醚基；羧基或酰卤分别与巯基、氨基反应得到硫酯基、酰胺基等基团；羟 基与羧基、异氰酸酯、环氧化物、氯甲酰氧基(氧羰酰氯)反应得到酯基、氨基甲酸酯基、 醚键、碳酸酯基等二价连接基；羰基或醛基与氨基、肼、酰肼反应得到亚胺键、腙、酰腙等 二价连接基；叠氮、炔基、烯基、巯基、共轭二烯基、马来酰亚胺基、1,2,4-三唑啉-3,5-二酮、 二硫代酯、羟胺、酰肼、丙烯酸酯、烯丙基氧基、异氰酸酯、四氮唑等反应性基团发生点击 化学反应可生成含包括但不限于三氮唑、二氢异恶唑、硫醚键等结构的相应二价连接基。文 献{Adv.Funct.Mater.,2014,24,2572}中所报道的及其引用的click反应类型及其生成的连接 基作为参考均纳入本发明中，具体如叠氮-炔基环加成反应、Diels-Alder加成反应、生成肟或 酰腙的反应、巯基-乙烯基加成反应、巯基-炔基加成反应、巯基-异氰酸酯基反应、1,3-偶极环 加成反应等。还包括环加成反应等。伯胺与一分子磺酸酯、卤代物、环氧化物、α,β-不饱和 键反应可得到二价的仲氨基，与两分子反应时，可形成三价叔氨基。又如双硫键可参与形成 三价连接基、联胺和醛基之间反应等。

所述偶合反应可生成稳定的基团，也可生成可降解的基团。

生成稳定的二价连接基的典型反应是烷基化类型，包括但不限于羟基、巯基或氨基与磺 酸酯或卤代物发生的烷基化的反应，依次对应于醚键、硫醚键、仲氨键或叔氨键的形成。可 参考包括但不限于下述文献及其引用文献的烷基化方法、烷基化试剂，优选条件简单易实施 的方法：文献“周红等.含氮杂环化合物的烷基化反应及其医学应用[J].贵州科 学,2016,(06):51-57.”、“徐海丽.Fe(acac)₂活化伯醇的仲醇β-位烷基化反应的产物选择性研究 [D].吉林大学,2016.”、“王松等.水相中Ir-N@C催化的胺和伯醇的N-烷基化反应[J].精细 化工,2015,(12):1376-1381.”、“邓文慧.有机硅化合物参与的选择性催化烯丙基烷基化反应研 究[D].杭州师范大学,2015.”、“李双艳.醇在碱促进条件下的N-烷基化和C-烯基化反应研究[D]. 温州大学,2015.”、“吴俊威.取代型N-烷基化反应专利技术综述[J].精细化工中间 体,2015,(02):1-3+52.”、“倪传法等.过渡金属促进的二氟烷基化和一氟烷基化反应研究进展[J]. 化学学报,2015,(02):90-115.”、“孙雨薇.无溶剂体系中催化胺与醇的N-烷基化反应及机理研究 [D].湖北大学,2014.”、“李琼.水相中以伯醇为烷基化试剂对酮α-烷基化的研究[D].中国石油 大学(华东),2014.”、“李琼等.酮与伯醇的α-烷基化反应研究进展[J].化学试 剂,2014,(04):315-319.”、“汤日元.C-H官能化反应合成硫醚，吲哚以及吡唑衍生物的研究[D]. 湖南大学,2014.”、“刘宁宁等.缩醛与吲哚或苯并呋喃的烷基化反应[J].有机化 学,2014,(12):2523-2528.”、“孟庆丰.萘酚碳烷基化反应的研究进展[J].广东化 工,2013,(08):75-76.”、“N-烷基化反应的选择性控制技术[J].乙醛醋酸化工,2013,(03):49.”、“单 海霞.选择性N-烷基化合成2-(N-烷基氨基)唑衍生物[D].南京理工大学,2013.”、“杨小斌等.N- 烷基化反应的研究进展[J].化学通报,2012,(12):1081-1089.”、“徐文卫.芳香族二胺的制备及 N-烷基化反应的研究[D].南京理工大学,2012.”、“乔生莉.烷基化反应的机理与影响因素[J]. 科技情报开发与经济,2011,(18):195-196.”、“沈师悦等.钯碳催化的酮与伯醇的α-烷基化反应 [J].合成化学,2009,(02):160-163.”、“王翔等.金催化的吲哚与末端炔烃的分子间烷基化反应[J]. 有机化学,2009,(03):432-436.”、“钟平等.异丁酸衍生物的烷基化反应[J].高等学校化学学 报,1993,(01):58-61.”等。

生成的二价连接基的典型代表为酰胺键、尿烷键、一硫代或二硫代氨基甲酸酯键、酯键、 碳酸酯键、硫代碳酸酯键(一硫代、二硫代或三硫代)、醚键、硫醚键、二硫键、三氮唑基、 4,5-二氢异恶唑连接基、马来酰亚胺基-巯基生成的连接基等。

并不推荐L_d中含有仲氨键或联氨键，以免在后续的PEG组分偶联反应中导致副反应的 发生。本发明中的仲氨键、联氨键指“-NH-”两端均被亚烃基封端，如-CH₂-NH-CH₂-； 而如-C(＝O)-NH-则称为酰胺键，而不视为含有仲氨键。

1.2.3.R₀₁距离氮支化中心的原子间隔

R₀₁与L_d直接相连，或通过二价连接基Z相连；Z为任意合适的基团。

R₀₁距离氮支化中心的原子间隔由L_c、L_d、Z共同决定；优选R₀₁距离支化中心的N原子不超过100个原子间隔，进一步优选不超过50个原子间隔，进一步优选不超过20个原子间隔，进一步优选不超过10个原子间隔。原子间隔太小，导致空间位阻大，R₀₁易被聚合物链 包埋，进行药物修饰时，导致反应效率低。原子间隔太大，尤其是含有较多的疏水连接基时，会加剧被亲水性聚合物链的包埋。

本发明的单一功能化支化聚乙二醇，通式(1)～(12)中由于L_c的存在，其中通式(10) 必然存在L_c和L_d，因此R₀₁距离氮支化中心至少为1个原子间隔。有的通式中L_d存在，有的 则不存在，存在时则至少2个原子间隔，若允许不存在，则至少1个原子间隔。本发明中优选至少2个原子间隔(L_d可以存在或不存在)。

优选R₀₁距离氮支化中心的原子间隔选自1、1～10、10～20、20～50、50～100中任一种， 不包括左端点，包括右端点。

Z的供选择的范围包括但不限于CN104530417A(特别地，第613～731段)、CN104877127A (特别地，第515～660段)、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中公开的 各种连接基结构，可以为稳定的STAG或可降解的DEGG，可以不含或含有杂原子，等等。 只要能使本发明的制备过程顺利实施即可。

Z提供的原子间隔没有特别限制，优选1～24个原子间隔，更优选1～12个原子间隔，更 优选1～6个原子间隔，最优选1、2或3个原子间隔。例如，羰基、硫代羰基的原子间隔为1。

具体地，Z的供选择范围包括但不限于稳定的STAG：亚烷基、二价环烷基、二价环烯基、 二价环炔基、二价环二烯烃基、芳撑、碳碳双键、碳碳三键、共轭的碳碳双键、二价脂杂环 基、二价芳杂环基、侧基含杂原子的碳链连接基、取代的二价环烯基、取代的二价环炔基、 取代的二价环二烯烃基、取代的芳撑、取代的碳碳双键、取代的共轭碳碳双键、取代的二价 脂杂环基、取代的二价芳杂环基、醚键、硫醚键、脲键、硫脲键、氨基甲酸酯基、硫代氨基 甲酸酯基、磷酸酯基、膦酸酯基、不含活泼氢的二价硅基、含硼原子的二价连接基、二价叔 氨基、羰基、硫代羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、烯胺基、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

ω-氨基羧酸骨架、中性氨基酸骨架及其衍生物骨架中 任一种二价连接基、任两种或任两种以上基团任意组合构成的稳定二价连接基(也即上述结 构单元的任意组合)。所述侧基含杂原子的碳链连接基包括但不限于氧代(＝O)、硫代(＝S)、 二价烷氨基(氨代，氨羰基类)、醚键形式的氧杂烃基、硫醚键形式的硫杂烃基、叔氨基形式 的氮杂烃基等。其中，芳撑包括但不限于苯撑、萘撑、二价蒽环等；其中，

属 于二价芳杂环。这里的“取代的”指能在本发明制备过程中稳定存在或不会导致副反应的取 代，例如烃基、烃氧基、烃硫基、N,N-二烷基氨基(叔氨基)、含酮羰基的亚烃基等一价取代 基及上述一价取代基与亚烃基的组合。所述中性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸中任一种；其中ω-氨基羧酸优选NH₂-L₅-COOH， 所述L₅的定义与优选方式与上述一致。具体地，Z的供选择范围还包括但不限于可降解的 DEGG：包括但不限于含有二硫键、乙烯醚键、酯基、硫酯基、硫代酯基、二硫代酯基、碳 酸酯基、硫代碳酸酯基、二硫代碳酸酯基、三硫代碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸 酯基、二硫代氨基甲酸酯基、缩醛基、环缩醛基、缩硫醛基、氮杂缩醛基、氮杂环缩醛基、 氮硫杂缩醛基、二硫代缩醛基、半缩醛基、硫代半缩醛基、氮杂半缩醛基、缩酮基、缩硫酮 基、氮杂缩酮基、氮杂环缩酮基、氮硫杂缩酮基、亚胺键、腙键、酰腙键、肟键、硫肟醚基、 半卡巴腙键、硫代半卡巴腙键、肼基、酰肼基、硫代碳酰肼基、偶氮羰酰肼基、硫代偶氮羰 酰肼基、肼基甲酸酯基、肼基硫代甲酸酯基、卡巴肼基、硫代卡巴肼基、偶氮基、异脲基、异硫脲基、脲基甲酸酯基、硫脲基甲酸酯基、胍基、脒基、氨基胍基、氨基脒基、亚氨酸基、 亚氨酸硫酯基、磺酸酯基、亚磺酸酯基、磺酰肼基、磺酰脲基、马来酰亚胺基、原酸酯基、 苄氧羰基、磷酸酯基、亚磷酸酯基、次磷酸酯基、膦酸酯基、磷硅烷酯基、硅烷酯基、碳酰 胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、聚酰胺基、磷酰胺基、亚磷酰胺基、焦磷酰胺基、环磷酰胺 基、异环磷酰胺基、硫代磷酰胺基、乌头酰基、肽键、核苷酸及其衍生物骨架、脱氧核苷酸 及其衍生物骨架中任一种二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合。所述肽键由 选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸的任两个 相同或不同的氨基酸键合而成。

Z优选组之一是碳链连接基，具体优选方式与L_c一致。

Z的另一组优选为含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键(氨基甲酸酯键)、硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

等中任一种含杂原子的连接基。

Z的另一组优选为含有通过烷基化反应、酰胺化反应、酯化反应、硫酯化反应、click反 应(点击反应，如叠氮-炔基环加成反应、Diels-Alder加成反应、生成肟或酰腙的反应、巯基 -乙烯基加成反应、巯基-炔基加成反应、巯基-异氰酸酯基反应等)、环加成反应、Diels-Alder 加成反应(狄尔斯-阿尔德反应)、1,3-偶极环加成反应等偶合反应生成的连接基。

本发明的优选方案之一，Z中允许含有CH₂CH₂O的重复单元，但优选重复单元数不超过 20，更优选不超过10；更优选不超过5。本发明中的“重复单元”指数量至少为2个。2个 重复单元对应–CH₂CH₂OCH₂CH₂O–结构。仅有一个CH₂CH₂O时，不视为具有重复单元。

本发明的优选方案之一，Z中含有主链杂原子但不含CH₂CH₂O的重复单元。

并不推荐Z中含有仲氨键(–NH–)或联氨键(–NH–NH–)，以免在后续的PEG组分偶 联反应中导致副反应的发生。

1.3.聚乙二醇原料或中间体

聚乙二醇原料PEG_a-L_a-CH₂-R_a(记为P_a)与PEG_b-L_b-CH₂-R_b(记为P_b)提供聚乙二醇组分，一端通过烃氧基封端，另一端具有反应性端基R_a、R_b；其中，反应性端基R_a、R_b与亚甲 基相连，该亚甲基另一端通过L_a、L_b分别连接聚乙二醇组分PEG_a、PEG_b的氧端。

1.3.1.聚乙二醇组分的末端

聚乙二醇组分PEG_a、PEG_b的末端由C_1～20烃基封端，其封端基团可以相同，也可以不同； 优选PEG_a、PEG_b采用相同的封端基团。封端基团优选C_1～10烃基，更优选C_1～6烃基。具体地， 封端基团优选为甲基、乙基、丙基(e.g.正丙基、异丙基)、丁基(e.g.正丁基、异丁基、叔丁基)、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、 十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、苯基、苄基或丁基苯基， 最优选为甲基。

也即通式(1)和通式(2)最优选PEG_a、PEG_b均为甲基封端的mPEG，进一步优选还 具有相同的分子量。其中，mPEG的结构式为CH₃O(CH₂CH₂O)_n，其中，n为任意合适的整数 (对于含该化合物的物质n指数均聚合度)。需要说明的是，本发明中的mPEG仅对结构通 式进行定义，并不限定其分子量。例如：

中的两个 mPEG的分子量可以相同也可以不同。对于单分散化合物产品的情形，EO重复单元平均数可 以相同或不同(±10％标准)。对于多分散产品，优选数均分子量相同(±10％标准)。

1.3.2.聚乙二醇组分的反应性端基R_a、R_b

R_a为能与伯氨基或仲氨基发生烷基化反应的基团，现有技术公开的反应性基团均可作为 候选。典型的如磺酸酯基、卤原子、不饱和烯基、环氧基、醛基或酮基，优选磺酸酯基、卤 原子。其中，磺酸酯优选类B中的B1；卤代物优选类C中的C7。

R_b为能与仲氨基发生酰胺化反应或硫代酰胺化反应的基团，现有技术公开的反应性基团 均可作为候选。优选R_b为能与仲氨基发生酰胺化反应的基团，典型的如羧基、上述类A中的 反应性基团(活性羧酸酯及其类似结构，不包括碳酸酯类)、酰氯、羧酸酯等。

1.3.3.二价连接基L_a、L_b

连接基L_a、L_b的长度，各自独立地优选1～24个原子间隔，更优选1～12个原子间隔，更 优选1～6个原子间隔，最优选1、2或3个原子间隔。L_a、L_b的长度可以相同或不同。优选L_a、L_b提供相同的原子间隔。

L_a、L_b供选择的范围及优选方式可各自独立地参考上述连接基Z。可以为稳定的STAG 或可降解的DEGG。

L_a、L_b可以相同或不同，优选L_a＝L_b。

L_a、L_b与PEG之间形成的连接可稳定存在，也可降解。

二价连接基L_a、L_b各自独立地优选自亚烃基或杂化的亚烃基。

L_a、L_b各自独立地优选自以下任一种结构：

(1)为碳链连接基，包括亚烃基、侧基含杂原子的碳链连接基；优选亚烃基；更优选亚 烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合；

(2)含主链杂原子；含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键、硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种连接基；

(3)含有通过烷基化反应、酰胺化反应、酯化反应、硫酯化反应、click反应、环加成反应、Diels-Alder加成反应、1,3-偶极环加成反应中任一种偶合反应生成的连接基。

例如L_a、L_b同为(1)、(2)、(3)中任一组的任一种，为同一种时，也允许结构不同， 如可为L_a为亚甲基，L_b为亚乙基；还可选自不同组：L_a为亚烃基，L_b含有酰胺键。

进一步优选L_a、L_b为相同的亚烃基，更优选C_1～12亚烷基；更优选L_a、L_b均为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基或亚戊基，最优选L_a、L_b均为亚甲基。

当L_a、L_b通过羰基连接PEG组分时，与PEG之间形成酯键连接；当L_a、L_b通过CONH 连接PEG组分时，与PEG之间形成氨基甲酸酯键连接；当L_a、L_b通过COO连接PEG组分 时，与PEG之间形成碳酸酯键连接。

1.3.4.聚乙二醇链的分子量、聚合度及多分散性

需要说明的是，没有特别限定时，本发明中所指的“分子量”对于结构通式的化合物， 指一个分子中的分子量，对于含结构通式化合物的物质则为“数均分子量”M_n。对于数均分 子量，既可以为多分散性嵌段或物质的分子量，也可以为单分散性嵌段或物质的分子量，没 有特别指明的情况下，一般特指多分散性的聚合物。没有特别写明时，单位为道尔顿，Da。 还可以用“聚合度”表征聚乙二醇链的分子量大小。相应地，优选用“数均聚合度”来表征 重复单元(氧化乙烯基单元)的个数的数均值。

含有通式(1)、(2)结构的单一官能化支化聚乙二醇的物质中，聚乙二醇链PEG_a、PEG_b各自独立地为多分散性或单分散性，可以采用聚合法、有机合成法、聚合法结合有机合成法 制备或通过商业来源获得。优选PEG_a、PEG_b同为多分散性或同为单分散性。

对于多分散性物质的PEG链，其聚合度优选1至约1500；更优选2至约1000；更优选2至约500；更优选5至约500；更优选约11至约500；更优选约22至约500；更优选约30至 约250；更优选约34至约150。上述越优选的情况，对应的PEG链段的分子量越常规，制备 越简单易控，分子量的PDI(多分散系数)越窄，性能越均一。常见的聚合法获得的线性PEG 的数均分子量约2kDa～40kDa；本发明优选2kDa～20kDa。本发明中，一个PEG链的分子 量、数均分子量均优选约500,600,700,800,900,1000,1500,2000,2500,3000,3350,3500,4000,5000,5500,6000,6500,7000,7500,8000,8500,9000,9500,10000,11000,12000,13000,14000, 15000,16000,17000,18000,19000或20000,单位为Da。更优选约1000,1500,2000,2500,3000, 3350,3500,4000,5000,5500,6000,6500,7000,7500,8000,8500,9000,9500,10000,11000或 12000Da。更优选约1000,1500,2000,3000,3350,3500,4000,5000,6000,7000,8000,9000或 10000Da。更优选约1000,1500,2000,3350,3500,4000,5000或6000Da。氧化乙烯基单元的 分子量为44Da，因此上述分子量500Da对应聚合度约11，分子量1000Da对应聚合度约22， 分子量2000Da对应聚合度约44，分子量5000Da对应聚合度约114，分子量10000Da对应 聚合度约227，分子量20000Da对应聚合度约454等。

优选之一所述PEG_a、PEG_b分子量(或数均分子量)选自2kDa～20kDa；进一步优选2kDa、 5kDa、10kDa或20kDa。此分子量范围、数值通常对应多分散性物质。其中PEG_a、PEG_b优选同为mPEG。还优选具有相同的分子量。

对于单分散性物质的PEG嵌段，单个分子中其分子量用氧化乙烯基单元数(oxyethylene， 记为EO单元)进行定义。根据现有常规技术制备的单分散性聚乙二醇的EO单元数大约在 1～70之间，包括但不限于参考文献{Expert Rev.Mol.Diagn.2013,13(4),315-319}、{J.Org. Chem.2006,71,9884-9886}、{Angew.Chem.2009,121,1274-1278}、{Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2015,25:38-42}、{Angew.Chem.Int.Ed.,2015,54:3763-3767}及上述文献所 引用文献中所列举的EO单元数。典型的单分散PEG的EO单元数包括但不限于1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、12、13、16、20、22、24、27、29、36、44、48、56、62、64、67等。 需要特别指出的是，通式(1)、(2)、(3)的单一功能化支化聚乙二醇的多分散性是由两个 PEG链的组合共同决定的，可以为单一组分，也可以为不同组分的混合，只要聚合物的PDI 为1即可。当为单一组分时，PEG_a、PEG_b链在不同分子中具有相同的EO单元数。当为不同 组分的混合物时，聚合物中每一个分子的总分子量是固定的，但其中PEG_a、PEG_b链的EO 单元数可以各自独立地相同或不同。优选不同EO单元数的PEG链组分的相对摩尔百分比是 确定的。当为不同组分的混合物时，对应的数均聚合度可以为整数，也可以为非整数。由不 同EO单元数的单分散性嵌段构成的聚合物中，若各组分含量不固定，PDI大于1，仍形成多 分散性的嵌段或物质。单分散性的PEG嵌段，单个分子EO单元数(或EO单元平均数)优 选2～70；更优选3～70；更优选3～70；更优选3～50；更优选3～25。越优选的情况，其制备方法越多样。构成单分散物质的单个分子中任一个PEG链的EO单元数优选选自2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、24、26、27、28、29、30、32、 34、36、38、40、42、44、45、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、67、68、 70中任一种。

优选之一所述PEG_a、PEG_b氧化乙烯基单元数选自2～70；优选为2～20。其中PEG_a、PEG_b优选同为mPEG。更优选EO单元数量差不超过1。该分子量范围通常针对单分散性物质。通 式(1)优选EO单元数相差不超过1。当具有通式(1)的结构，且L_a等于L_b时，优选PEG_a、PEG_b具有相等的EO单元数。

对于本发明各通式的化合物，优选PEG_a、PEG_b的分子量各自独立地选自：

(1)分子量选自2kDa～20kDa；进一步优选2kDa、5kDa、10kDa或20kDa；

(2)氧化乙烯基单元数选自2～70；优选为2～20；此时还优选EO单元数相差不超过1。

对于制备所得的单一功能化支化聚乙二醇的宏观物质，其多分散性系数与单个PEG链的 多分散性可以相同或不同，但PDI越低越好。

1.3.5.聚乙二醇原料的来源

上述的聚乙二醇原料P_a、P_b没有特别限定，可以采用现有已知的材料直接作为原料，在 已有原料基础上对含PEG_a、PEG_b的化合物进行末端基团改性获得，或者自环氧乙烷或小分 子试剂开始合成PEG组分等。其来源也没有特定限制，也可以自行合成、采用商业来源、文 献已有报道或根据本领域现有技术能够合成的原料。

1.4.形成支化结构的反应

本发明的氮支化聚乙二醇衍生物中，PEG链方向与N相邻的端基不能同时为羰基或硫代 羰基，这会形成酰亚胺结构，不稳定，容易断裂导致一个PEG链的脱离。因此，当其中一个 为羰基或硫代羰基时，另一个优选亚甲基或单价取代的亚甲基(即一个或两个一价取代基取 代的亚甲基)，最好是亚甲基(零取代)，如通式(2)。

两个PEG分支链与N之间至少一个是需要通过亚甲基或单价取代的亚甲基连接(也即至 少一个不是羰类取代的亚甲基：氧羰基、硫羰基)。当均不是羰类端基时，可以通过一步或分 步的烷基化反应实现；而当含有一个羰类端基时，另一个必然是非羰类端基，这时，需要首 先进行非羰类端基的偶合反应，才能进行羰类端基的偶合反应，如果反过来先偶合羰类端基， 那么就会由于羰类双键的存在，导致N中心的-NH-的氢原子的反应活性下降，再进行第二个 PEG链的偶合将非常困难。因此当具有上述通式(1)等侧链端基为羰类结构的支化聚乙二醇， 必须先通过烷基化反应偶合PEG_a链，此时只要能生成-CH₂NH-的共价键即可。

有机化学中，烷基化反应主要包括取代型、加成型、缩合型三种类型，使用的试剂为烃 化剂。取代型的典型烃化剂是磺酸酯或卤代物，这也是本发明优选的烷基化反应类型，优选 在碱条件下进行。加成型，典型的是不饱和双键(包括但不限于碳碳键)或环氧基之间的加 成反应，优选烃化剂为含-CH＝CH₂(乙烯基，如丙烯酸)、-CH＝CH-(如MAL)、-C(CH₃)＝CH₂ (2-甲基乙烯基，如甲基丙烯酸)或缩水甘油醚基的试剂；与烯类的加成往往需要路易斯酸 或质子酸催化，与环氧基的加成使用碱性或酸性催化剂均可。缩合型，主要指与醛或酮之间 的缩合反应，优选用活性高的醛作为烃化剂。与伯胺反应时，通过加成-消除机理进行，生成 仲氨键，也称为还原烷基化反应，其优点是能够等当量反应生成亚胺键(席夫碱)再经还原 后只偶合一个PEG链，可较大程度地避免PEG链偶联副产物的产生，可用于偶合第一个PEG 链。形成席夫碱的反应可以在质子酸催化剂或没有催化剂下自发进行，还原反应优选通过催 化加氢进行。脂肪族的醛或酮得到的亚胺键不稳定，而芳香族的醛或酮与伯胺之间的反应比 较容易进行，只需混合与简单搅拌即可。与仲胺反应时，则通过加成反应形成叔氮，可用于 第二个PEG链的偶合。这几类烷基化反应均是有机化学领域的常规技术手段，本领域技术人 员可在有机化学领域技术人员的指导下较容易的实施，本发明之前已出版的《有机化学》、《高 等有机化学》、《有机化学合成》、《基础有机化学》、《生物有机化学》等图书或教材，包括但 不限于汪世新主编，傅相锴主编，吴阿富编著，荣国斌、苏克曼编著，李艳梅，赵圣印，王 兰英主编，张振权等编，宋宏锐主编，章烨主编，章烨、张荣华主编，陈淑华、罗光荣编译， 邢其毅、徐瑞秋等编，伍丹、韦瑞松、王莹主编的《有机化学合成反应原理及新技术研究》， 及上述各种版本等均作为参考纳入本发明。本发明中没有详细赘述。

通式(2)中PEG_b通过羰基或硫代羰基-C(＝M_b)-连接N中心的结构，在偶合第一条链PEG_a后，第二个链PEG_b的偶合往往只能通过缩合反应进行，如酰胺化反应、硫代酰胺化反应，通 常反应条件较烷基化反应复杂，而且需要缩合剂、催化剂的辅助，有时还需要在加热条件下 进行。

1.4.1烷基化反应

烷基化反应可以采用本领域现有技术手段，参照本领域的各种论文、专利、图书、教材、 工具书等资料。以取代型烷基化反应为例，例如可参照专利文献CN104530417A的第1264～1280段的烷基化方法，例如氨基(伯氨基或仲氨基)和卤代物或磺酸酯之间的烷基化反应。

偶联第一个PEG组分的烷基化反应中，也即步骤二中，小分子的底物胺IM1等当量或适 当过量，反应完毕后，可采用常规技术手段除去小分子杂质。一种纯化方式可以实施多次， 还可以采用不止一种的纯化手段，例如先用合适的有机试剂进行沉淀，过滤除杂，还可进一 步使用柱层析、重结晶等方式进行二次、多次纯化。此时，磺酸酯衍生物、卤代物或醛化合 物等均可作为烃化剂。

以磺酸酯和卤代物为例。

在碱的存在下，由底物胺与磺酸酯衍生物、卤代物亲核取代得到聚乙二醇胺中间体。其 中，底物胺的摩尔当量是磺酸酯、卤代物的1至50倍，优选1～10倍，更优选1至5倍。当底物胺的用量小于磺酸酯、卤代物的1倍摩尔当量，则反应取代不完全，难以纯化。而当底物胺的摩尔当量大于磺酸酯、卤代物的50倍时，过量的试剂给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，从而导致下一步中副反应增加，增加纯化难度。

得到的产物为胺中间体(含PEG组分的仲胺)和过量的底物胺(小分子伯胺)的混合物， 其可以通过沉淀、萃取、重结晶、渗透、超滤等方式进行纯化。例如乙醚沉淀、异丙醇重结 晶、二氯甲烷萃取等。渗透、超滤的溶剂没有限制，一般可以水或者有机溶剂。

反应溶剂没有受到限制，优选非质子性溶剂，如甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，更优选二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲亚砜或四氢呋喃。

碱包括有机碱(如三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、咪唑或二异丙基乙基胺) 或无机碱(如碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙酸钠、碳酸钾或氢氧化钾)，优选有机碱，更 优选三乙胺、吡啶。碱的摩尔量为磺酸酯或卤代物摩尔当量的1至50倍，优选为1至10倍，更优选为3至5倍。

偶联第二个PEG组分时，既可采用底物胺过量，也可采用磺酸酯衍生物、卤代物过量， 以方便除杂获得高纯度产品为准，摩尔当量比例为1～50倍，优选1～10倍，更优选1至5倍。 兼顾成本因素，优选磺酸酯衍生物、卤代物过量。得到的产物为目标胺衍生物(叔胺，支化 结构)和过量的磺酸酯、卤代物的混合物(线性结构，分子量为目标产物的0.5倍)，其可以 通过渗透、膜过滤、超滤等方式进行纯化。使用的溶剂可采用常规技术手段，只要产物能溶 解即可，可以为水或有机试剂，优选二氯甲烷、三氯甲烷等。

1.4.2酰胺化反应与硫代酰胺化反应

酰胺化反应与硫代酰胺化反应也可以采用本领域现有技术手段，参照本领域的各种技术、 专利文献等资料，例如可参照专利文献CN104530417A的第1217～1233段的酰胺化方法、硫 代酰胺化方法。比如氨基(本发明的步骤三采用仲氨基)与羧酸、活性酯、酰氯等含羰基化 合物之间的缩合反应，比如氨基与硫代甲酰氯之间的缩合反应。

同样地，既可IM2过量，也可第二个PEG组分的反应原料过量，以方便除杂获得高纯度 产品为准。兼顾成本因素，优选第二个PEG组分的反应原料过量。

优选甲氧基聚乙二醇酰氯作为原料，与底物胺二级胺(-NH-)进行酰胺化反应。

以酰卤过量为例。

在碱的存在下，由底物胺与酰卤衍生物反应，生成支化结构的产物。其中，酰卤衍生物 的摩尔当量是底物胺的1至40倍，优选1至4倍，更优选1至3倍。当酰卤衍生物的摩尔当量大于底物胺的40倍时，过量的试剂给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，增加纯化难度。当酰卤衍生物的摩尔当量小于底物胺的1倍时，反应不完全，增加纯化难度。其中，过量的酰卤衍生物(线性结构，分子量为目标产物的0.5倍)在水解后得到相应的酸，可以通过阴离子离子交换树脂、渗透、超滤等手段纯化得到化合物。所述的阴离子交换树脂没有特别的限制，只要能与阴离子发生交换实现分离效果即可。优选以葡聚糖、琼脂糖、聚丙酸酯、聚苯乙烯、聚二苯乙烯等为骨架的叔胺或季铵盐的离子交换树脂。渗透、超滤的溶剂没有限制， 一般可以水或者有机溶剂，其中有机溶剂没有特别限制，只要产物可以在里面溶解即可，优 选二氯甲烷、三氯甲烷等。

反应溶剂没有受到限制，优选非质子性溶剂，如甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，更优选二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲亚砜或四氢呋喃。

碱包括有机碱(如三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、咪唑或二异丙基乙基胺)或无机 碱(如碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙酸钠、碳酸钾或氢氧化钾)，优选有机碱，更优选三乙胺、吡啶。碱的摩尔量为底物胺摩尔当量的1至100倍，优选为1至20倍，更优选为2至 10倍。

2.一步偶合法

本发明还提供另一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其是通过以下技术方案实现 的：所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(3)所示：

其中，PEG_a、L_a、L_c、L_d、F的定义及优选方式与上述一致。其中，两个PEG_a由相同的C_1～20烃氧基封端，且两个PEG_a具有相同的分子量(含化合物的产品为多分散性时分子量相近，为单分散性时分子量数值严格相等)。本发明中，同一分子中的两个或两个以上相同的符 号表示具有相同的小分子结构或聚合物通式。如两个L_a结构完全相同，而两个PEG_a具有相 同的结构通式，即相同的封端。

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一：获得含有伯氨端基及官能团端D_F的小分子中间体IM1；D_F的定义与上述一致。

所述小分子中间体IM1可采用上述两步偶合法的方式进行制备。

所述IM1还可以为NH₂-PT-COOH的酯保护化合物，其中NH₂-PT-COOH由甘氨酸、丙 氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸、NH₂-L₅-COOH中至少两 个分子缩合而成，且N-端不是肌氨酸，任一个单元的数量可以大于等于1；其中L₅为亚烷基、 二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子；该方式 仅限于R₀₁为羧基、酯保护的羧基、酰氯、酰胺或酰肼；

步骤二：控制投料比，通过烷基化反应，将两个聚乙二醇链PEG_a一步偶合到小分子中间 体IMI的氮源位置，氮源端基U_N转变为叔氮原子；R_a为能与F_N发生烷基化反应的基团；R_a包括但不限于磺酸酯基、卤原子、不饱和烯基、环氧基、醛基或酮基，优选磺酸酯基、卤原子。

步骤三：当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(3)所示的结构；当D_F等于F时该步骤省略。本发明中其余位置的类似表达，具有类似的含义，也即当所指定条件不满足时，如果附加说明，则对应的反应步骤省略。

实施一步偶合法的步骤二时，优选烃化剂(以磺酸酯、卤代物为例)的用量为伯胺的2 倍摩尔量或适当过量，以尽量减少单臂烷基化杂质、聚乙二醇磺酸酯或卤代物原料的掺杂， 两者均为线性聚乙二醇杂质。磺酸酯用量为小分子底物胺(IM1，含有两个活泼氢原子)摩 尔当量的2～100倍，更优选2～50；更优选2～20倍；更优选2～10倍。当小于2倍时，导致单 烷基化的线性聚乙二醇仲胺杂质(目标分子量的0.5倍)的存在，给纯化带来麻烦，可能混 入后续步骤，增加纯化难度；当超过100倍或用量较多时，过量的线性聚合物试剂(目标分 子量的0.5倍)给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，增加纯化难度。

得到的产物为目标胺衍生物(叔胺，支化结构)和过量的磺酸酯、卤代物的混合物(线 性结构，目标分子量的0.5倍)，其可以通过渗透、膜过滤、超滤等方式进行纯化。使用的溶 剂可采用常规技术手段，只要产物能溶解即可，可以为水或有机试剂，优选二氯甲烷、三氯 甲烷等。

基于聚合物链的多分散性质，通式(3)中的两个PEG_a链并不限定其聚合度或分子量在 数值上严格相等，而是指来源相同，故而在数值上接近(优选±10％)。当来源为单分散性的 化合物时，则允许在数值上严格相等。

优选之一L_a为亚甲基，与PEG之间形成稳定的共价连接。

优选之一L_a与PEG之间形成可降解的酯键连接。例如

对应

优选之一为L_a与PEG之间形成氨基甲酸酯键、碳酸酯连接，优选以下结构：

对应

对应

本部分的优选结构，均可采用两步偶合的方式获得。

对于L_a与PEG之间形成酯键连接的情况，还可采用另一种技术方案： 先偶合含有连接基L_a的试剂(另一端为酯保护羧基的烃化剂，优选卤代物或磺 酸酯)，再与甲氧基聚乙二醇的羟基偶合反应生成酯键。

步骤一：制备含有氮源端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1：制 备方法与上述一致；

步骤二：控制投料比，通过烷基化反应，将两分子含有连接基L_a的试剂 (F₃-CH₂-R_a)偶合到中间体IMI的氮源位置，F_N转变为叔氮原子，得到小分子 中间体IM3；其中R_a为能与F_N发生烷基化反应的基团(优选卤代物或磺酸酯)， F₃的端基为酯保护羧基；将酯基改造为羧基或酰氯(F₄)，再与两分子烷氧基聚 乙二醇(优选mPEG–OH)发生缩合反应生成酯键连接；

步骤三：当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(3)所示的结构； 当D_F等于F时该步骤省略。

对于L_a与PEG之间形成氨基甲酸酯键连接的情况，可进一步改进，先 偶合含有连接基L_a的试剂(另一端为被异氰酸酯的烃化剂，优选卤代物或磺酸 酯)，再与甲氧基聚乙二醇的羟基偶合反应生成氨基甲酸酯键。

步骤一、制备含有氮源端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1：与 上述一致；

步骤二、控制投料比，通过烷基化反应，将两分子含有连接基L_a的试剂 (F₃-CH₂-R_a)偶合到中间体IMI的氮源位置，F_N转变为叔氮原子，其中R_a为能 与F_N发生烷基化反应的基团(优选卤代物或磺酸酯)，F₃的端基为异氰酸酯基， F₄与F₃相同；再与两分子烷氧基聚乙二醇(优选mPEG–OH)发生缩合反应生 成氨基甲酸酯键连接；

步骤三：当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(3)所示的结构； 当D_F等于F时该步骤省略。

对于L_a与PEG之间形成碳酸酯键连接的情况，可进一步改进，先偶合含 有连接基L_a的试剂(另一端可转化为氧羰酰卤的烃化剂)，再与甲氧基聚乙二醇 的羟基偶合反应生成碳酸酯键。

步骤一：L_a与PEG_a形成碳酸酯键连接时，控制投料比，通过烷基化反 应，将两分子含有连接基L_a的试剂(F₃-CH₂-R_a)偶合到中间体IMI的氮源位置， F_N转变为叔氮原子，其中R_a为能与F_N生成碳酸酯键的基团，F₃的端基为被保护 羟基，F₄为氧羰酰氯基；再与两分子甲氧基聚乙二醇mPEG–OH发生缩合反应 生成碳酸酯键连接。

3.优选的单一功能化聚乙二醇结构

3.1.以中性氨基酸、ω-氨基羧酸或其衍生物为氮源试剂

其中，PEG_a、PEG_b、L_c、Z、R₀₁的定义及其优选方式是与上述一致。其中，L₂为–CH₂–、 –C(＝O)–或–C(＝S)–；优选–CH₂–或–C(＝O)–。其中，M₉为–O–、–S–或–NH–。

其中，所述两个PEG组分的分子量相同，分子量优选以下之一：

(1)分子量为2kDa～20kDa；更优选分子量为2kDa、5kDa、10kDa或20kDa；

(2)EO单元数选自2～70；更优选EO单元数相差不超过1。

其中，所述Z优选自以下任一种，且Z进一步优选具有1～10个碳原子：

(1)Z选自亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合；

(2)Z含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键、一硫代氨基甲酸酯键、二硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、亚胺键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种；优选Z含有酰胺键或氨基甲酸酯键。

Z进一步优选C_1-6亚烃基，更优选亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基；进一步优选–CH₂–、–CH₂CH₂–、–CH₂CH₂CH₂–、–CH₂CH(CH₃)–。

优选R₀₁为醛基、缩醛基、马来酰亚胺基、呋喃保护的马来酰亚胺基、氨基、被保护的氨基、胺盐、羧基、酯保护的羧基、酰卤、酰胺、被保护的酰胺、酰肼、被保护的酰肼、叠 氮基、炔基、被保护的炔基、烯基中任一种；更优选醛基、马来酰亚胺基、羧基或氨基。

其中，R₀₁的优选之一为–CHO或其缩醛保护形式。此时，M₉优选–O–或–NH–。最优选 –NH–。

其中，R₀₁的优选之一为

或其呋喃保护形式。此时，M₉优选–O–或–NH–。最优选–NH–。

其中，R₀₁的优选之一为–NH₂、或其被保护形式、或其盐形式。此时，M₉优选–NH–。

其中，R₀₁的优选之一为–COOH或其酯保护形式。此时，M₉优选–O–。

其中，R₀₁的优选之一为–N₃。此时，M₉优选–O–或–NH–。最优选–NH–。

其中，R₀₁的优选之一为–C≡CH或其被保护形式。此时，M₉优选–O–或–NH–。最优选–NH–。

进一步，L_c优选为–CH(R₂₀)–或L₅；更优选为–CH(R₂₀)–或–(CH₂)_j1–；L₅、j₁的定义及优选方式与上述一致；更优选L_c为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基。以PEG组分 为mPEG为例，分别对应以下结构式：

其中，mPEG、R₂₀、j₁的定义及其优选方式与上述一致。

其中，R₂₀优选H、–CH₃、–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)–CH₂CH₃、–Bn(其中 Bn为苄基)、–CH₂CH₂–SCH₃，更优选氢原子或甲基，最优选氢原子。

3.1.1.其中L₂为亚甲基

以醛基、马来酰亚胺基为例，制备方法如下：

步骤一、以氨基缩醛化合物或呋喃保护的马来酰亚胺的氨基取代物F_source作为原料，与 含被保护氨基的氮源试剂N_source进行偶合，形成含酰胺键的二价连接基L_d；脱除氨基保护基， 得到一端为缩醛或呋喃保护的马来酰亚胺基，另一端为伯氨基的小分子中间体；

所述氮源试剂优选甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 ω-氨基羧酸的氨基被保护形式，C-端以羧基、酰氯、羧酸酯(如苄酯、叔丁酯)、活性羧酸酯 (如琥珀酰亚胺酯)中任一种形式存在；所述活性羧酸酯包括包括但不限于类A的结构。所 述ω-氨基羧酸优选NH₂-L₅-COOH，其中L₅的定义与优选方式与上述一致。优选L_c为亚甲基、 亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基。

步骤二、加入甲氧基聚乙二醇卤代物或磺酸酯进行第一次烷基化反应，或加入甲氧基聚 乙二醇醛或酮进行还原烷基化反应，得到甲氧基聚乙二醇仲胺中间体；

步骤三、加入甲氧基聚乙二醇卤代物或磺酸酯进行第二次烷基化反应；或加入甲氧基聚 乙二醇醛或酮进行加成反应，脱除醛基或马来酰亚胺基的保护基，得到通式(7)所示的支化 聚乙二醇醛或支化聚乙二醇马来酰亚胺。

3.1.2.其中L₂为羰基

以醛基、马来酰亚胺基为例，制备方法如下：

步骤一、与3.1.1.相同。优选L_c为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基。

步骤二、与3.1.1.相同。

步骤三、加入甲氧基聚乙二醇羧酸、酰氯、羧酸酯或活性酯，进行酰胺化反应；脱除醛 基或马来酰亚胺基的保护基，得到通式(8)所示的支化聚乙二醇醛或支化聚乙二醇马来酰亚 胺。

3.2.以叠氮化合物作为氮源试剂

其中，PEG_a、PEG_b、L_c、Z、R₀₁的定义及其优选方式与上述一致。

其中，L_c优选为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且 含有至少两个碳原子。更优选为亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基。

优选L₂为亚甲基或羰基。

其中，所述Z优选自以下任一种，且Z进一步优选具有1～10个碳原子：

(1)Z选自亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合；

(2)Z含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键、一硫代氨基甲酸酯键、二硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、亚胺键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种；优选Z含有酰胺键或氨基甲酸酯键。

Z优选更优选为–CH₂–、–CH₂CH₂–、–CH₂CH₂CH₂–、–CH₂CH(CH₃)–或任意合适的基团。

制备方法如下：

步骤一、小分子氮源试剂N_source含有叠氮基，小分子官能团源试剂F_source原料含有炔基， 进行偶合反应，形成含三氮唑的二价连接基L_d；所述氮源试剂的N端裸露或被保护，N端被 保护时，还脱除氨基保护基；得到含伯氨基的小分子中间体IM1；

步骤二、加入甲氧基聚乙二醇卤代物或磺酸酯进行第一次烷基化反应，或加入甲氧基聚 乙二醇醛或酮进行还原烷基化反应，得到甲氧基聚乙二醇仲胺中间体IM2；

步骤三、加入甲氧基聚乙二醇羧酸、酰氯、羧酸酯或活性酯，进行酰胺化反应；脱除醛 基或马来酰亚胺基的保护基，得到通式(9)所示的支化聚乙二醇衍生物。

例如，以官能团源试剂

与氮源试剂2-叠氮基乙胺进行click反应，可得到 伯胺小分子中间体IM1，进而进行后续反应。

上述通式(9)中的

还可以用

(氮源试剂N_source含有叠氮基，F_source原料含有环炔基)、

(氮源试剂N_source含有炔基，F_source原料含有叠氮基)、

(氮源试剂N_source含有环炔基，F_source原料含有叠氮基)、

(氮源试剂N_source含有 马来酰亚胺基，F_source原料含有巯基)、

(氮源试剂N_source含有巯基，F_source原料含 有马来酰亚胺基)代替。

3.3.以多肽作为同时含有氮源及官能团源的中间体IM1

本发明还可直接采用C-端被保护的多肽作为原料或中间体，分步偶合或一步偶合两个聚 乙二醇分支链，得到支化聚乙二醇羧酸酯，进一步对末端进行微修饰可获得末端高官能化率 (高修饰率)的支化聚乙二醇羧酸。对末端酯基改性可一进步得到高修饰率的酰胺、酰肼衍 生物，对末端羧基进行改性可得到酰氯衍生物。

因此，本发明还提供另一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其是通过以下技术方 案实现的：所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(10)所示：

其中，PEG_a、PEG_b、L_a、L_b的定义及优选方式与上述一致。所述PEG_a、PEG_b优选均为mPEG，更优选分子量相同或EO单元数相差不超过1；所述L_a、L_b优选为亚甲基。

其中，L₃为亚甲基或羰基；

其中，R₀₁为甲羧基(COOH)、甲酸酯基、酰卤、酰胺、酰肼中任一种；酰卤优选酰氯。

其中，PT为NH₂-PT-COOH的组成部分，NH₂-PT-COOH由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸、ω-氨基羧酸中至少两个分子缩合而成， 且N-端不是肌氨酸，任一个单元的数量可以大于等于1，例如二甘氨酸、甘氨酰丙氨酸、甘 氨酰苯丙氨酸、二甘氨酰丙氨酸等；所述ω-氨基羧酸优选NH₂-L₅-COOH，其中L₅的定义与 优选方式与上述一致。

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一：获得NH₂-PT-COOH的酯保护中间体IM1；例如，叔丁酯、苄酯等。可使用商业来源，或制备获得。可采用多肽合成、有机化学等现有技术进行制备，本领域技术人员可以实施，不再赘述。

步骤二：通过烷基化反应，将第一个聚乙二醇链PEG_a偶合到中间体IMI的N-端，得到 线性聚乙二醇中间体IM2，此时N-端转化为仲氮原子；

步骤三、通过烷基化反应或酰胺化反应将第二个聚乙二醇链PEG_b偶合到中间体IM2的 仲氮原子上；

当R₀₁为甲酸酯基时，所得结构即单一功能化支化聚乙二醇羧酸酯；

当R₀₁为甲羧基时，通过水解反应脱除酯基保护，得到单一功能化支化聚乙二醇羧酸；

当R₀₁为酰卤时，脱除酯保护得到甲羧基，再改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰卤；

当R₀₁为酰胺时，对甲酸酯基用氨水改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰胺；

当R₀₁为酰肼时，对甲酸酯基用水合肼改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰肼。

所述单一功能化支化聚乙二醇的结构举例如下：

其中，R₂₃选自H、–CH₃、–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)–CH₂CH₃、–Bn、 –CH₂CH₂–SCH₃，更优选甲基；其中，p为大于1的整数；优选1～16的整数。

当L₃为亚甲基，L_a等于L_b，且PEG_a、PEG_b具有相同的端基及相同的分子量时，还可以采用一步偶合法将两个聚乙二醇组分偶联到N-端。也即以NH₂-PT-COOH的酯保护化合物作为一步偶合法的中间体IM1；此时，该方式仅限于R₀₁为羧基、酯保护的羧基、酰卤、酰胺 或酰肼。通过以下步骤制备：

步骤一：制备NH₂-PT-COOH的酯保护中间体IM1；

步骤二：通过烷基化反应，将两个PEG组分偶合到中间体IMI的N-端，得到支化聚乙二醇中间体IM2，此时N-端转化为叔氮原子；优选两个PEG组分均为甲氧基封端结构；

当R₀₁为甲酸酯基时，所得结构即单一功能化支化聚乙二醇羧酸酯；

当R₀₁为甲羧基时，通过水解反应脱除酯基保护，得到单一功能化支化聚乙二醇羧酸；

当R₀₁为酰卤时，脱除酯保护得到甲羧基，再改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰卤；

当R₀₁为酰胺时，对甲酸酯基用氨水改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰胺；

当R₀₁为酰肼时，对甲酸酯基用水合肼改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰肼。

3.4.以含支化氮中心的化合物作为氮源试剂

基于本发明的总体构思“在偶合聚合物链之前引入官能团源”，以下的技术方案也在本发 明的保护范围内。

公开一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如 通式(12)所示：

其中，PEG_a、L_a、L₂、L_c、L_d、F定义及优选方式与上述一致。

PEG_a为C_1～20烃氧基封端的聚乙二醇组分，且两个PEG_a具有相同的分子量；L_a为二价连 接基；L₂为亚甲基、羰基或硫代羰基；L_c为碳链连接基；L_d不存在，或L_d为二价连接基且含有经偶合反应生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁。该技术方案中，L_c中 与支化氮原子相邻的碳允许以羰基、硫代羰基、氨羰基等形式存在；当L_c中与支化氮原子相邻的碳为羰基、硫代羰基、氨羰基时，L₂为亚甲基。

优选L_d存在。

当L_d不存在时，R₀₁选自醛基、被保护的醛基、马来酰亚胺基、被保护的马来酰亚胺基、 氨基、被保护的氨基、胺盐、羧基、酯保护的羧基、酰卤、酰胺、被保护的酰胺、酰肼、被保护的酰肼、叠氮基、炔基、被保护的炔基、烯基中任一种；更优选醛基、缩醛基、马来酰 亚胺基、呋喃保护的马来酰亚胺基。

优选两个PEG_a为具有相同分子量的mPEG。

通过以下步骤合成：

步骤一：获得具有支化氮端B_N及官能团端D_F的小分子中间体IM3；F₆为反应性基团，能与后续步骤的PEG_a-F₅中的反应性基团F₅发生偶合反应生成共价连接；氮源端基B_N的结构为

所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R₀₁的基团；所述步骤一小分子中间体IM3的获得方式可以通过商业途径购买，也可以通过适当的有限步骤制备获得。

步骤二：通过偶合反应，将两个聚乙二醇链PEG_a通过F₅、F₆之间的偶合反应连接到小 分子中间体IM3，形成两个聚乙二醇分支链，得到支化聚乙二醇中间体；

步骤三：当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(12)所示的结构；当D_F等于F时 该步骤省略。

3.4.1.步骤一

步骤一中小分子中间体IM3的制备方法包括但不限于以下方式。

方式一：以含官能团端D_F的化合物F_source作为原料，与含支化氮端的氮源试剂N_source进 行偶合，形成二价连接基L_d；所述氮源试剂的结构为

其中，F₆'为F₆或被 保护的F₆；F₁、F₂为能反应生成二价连接基的官能团对；

当F₆'不等于F₆时，还进行脱保护，得到含有支化端基B_N及官能团端D_F的小分子中间体 IM3；当F₆'等于F₆时，进行下一步骤。

举例如下，其中PG₅为氨基保护基。

又如以官能团源试剂

与氮源试剂N₃-CH₂CH₂-N(CH₂CH₂CH₂NPG₅)₂进行 click反应。NPG₅为被保护的氨基。

方式二：以含官能团端D_F的化合物F_source作为原料，与含支化端基B_N的氮源试剂N_source进行偶合，形成二价连接基L_d；所述氮源试剂的结构为

其中，F₆'为F₆或被保护 的F₆；F₂为能与仲氨基发生烷基化反应或缩合反应的官能团，所述缩合反应优选酰胺化反应， F₂优选含磺酸酯基、卤取代基、不饱和烯基、环氧基、醛基、酮基、羧基、酰氯、羧酸酯基 等，优选磺酸酯基、卤取代基、羧基、酰氯、羧酸酯基；L_c的为亚甲基或羰基；此时L₂为亚甲基；L_d不存在。

当F₆'不等于F₆时，还进行脱保护，得到含有支化端基B_N及官能团端D_F的小分子中间体 IM3；当F₆'等于F₆时，进行下一步骤。

举例如下，其中PG₅为氨基保护基，反应性基团F₆为Br-CH₂-，官能团源D_F为 CH₂CH(OCH₃)₂含缩醛基；生成的L_c为亚甲基。

举例如下，其中PG₅为氨基保护基，反应性基团F₆为-COCl，官能团源D_F为CH₂CH₂COOCH₂CH₃含酯基；生成的L_c为羰基。

上述的IM3还可以先进行端基改性，再偶联两个PEG分支链。如先脱除酯保护，转变为 端羧基，再与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺反应，将端基改造为马来酰亚胺基。

方式三：以含官能团端D_F、反应性的支化氮端

的小分子作为原料或中间体， 对两个反应性基团F₈进行改性，得到具有目标反应性基团F₆的小分子中间体IM3；其中，F₈为不同于F₆的任意合适的反应性基团。

改性后的反应性基团F₈可选自本发明公开的及引用文献公开的任意合适的反应性端基， 包括但不限于类A～类H的结构。

3.4.2.步骤二

步骤二中，控制投料比，使PEG_a组分过量。具体参考一步偶合方法的实施方式。

3.4.3.还公开以下的制备方法

步骤一：支化聚乙二醇仲胺衍生物与含官能团端D_F的化合物F_source进行缩合反应，生 成>N-L_c-的支化结构；所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；其中，F₂为能与仲氨基进行烷基化反应或缩合反应生成共价键的反应性基团；当L₂为羰基或硫代羰基时，L_c与支化N相邻的碳不为羰基、硫代羰基；

步骤二：当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(12)所示的结构；当D_F等于F时 该步骤省略。

3.5.典型结构举例

本发明的制备方法可获得的支化聚乙二醇结构，典型举例如下及任一种的功能性端基被 保护的结构。其中的醛基、氨基、叠氮基、马来酰亚胺基可以用其他合适的、能适用本发明 制备方法的功能性基团代替。

优选之一mPEG分子量选自2kDa～20kDa；进一步优选2kDa、5kDa、10kDa或20kDa。

优选之一mPEG的氧化乙烯基单元数选自2～70；优选为2～20。

其中，R₂₂选自–CH₃、–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)–CH₂CH₃、–Bn、 –CH₂CH₂–SCH₃，更优选甲基；其中，p为大于1的整数；优选1～16的整数。

其中，R₂₀优选H原子或R₂₂。

4.等价变换

基于本发明的构思，采用其它亲水性聚合物，如聚丙醇、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羟乙 酯(PHEMA)等包含氧化乙烯基、氧化丙烯基、HEMA等单体的共聚物，代替本发明的聚乙二醇组分的技术方案，也包括在本发明范围内。采用其他的小分子试剂代替本发明的氮原 子支化试剂，能具有相同技术效果的技术方案也一并包括在本发明范围内。

4.1.采用聚合法代替偶合法引入聚乙二醇组分的技术方案，也包括在本发明范围内。以 制备单一功能化支化醛为例，结构如通式(13)所示。

其中，两个PEG_a由相同的C_1～20烃氧基封端，且两个PEG_a具有相同的分子量。两个L_a相同，且选自亚烷基、二价环烷基、苯撑的任意组合；L_c为亚烃基，优选自亚烷基、二价环 烷基、苯撑的任意组合；L_a、L_c各自独立；L_d不存在或L_d为含醚键、硫醚键、二价烷基氮中 任一种的二价连接基；R₀₁为醛基(-CHO)或其缩醛结构。

所述“任意组合”指“任一种、或任两种或两种以上的组合”。

PEG_a优选mPEG，分子量优选2kDa～20kDa，更优选2kDa、5kDa、10kDa或20kDa。

L_a优选C_1～24，更优选C_1～12，更优选C_1～6。

L_c优选C_1～24，更优选C_1～12，更优选C_1～6。

所述缩醛结构可以缩合两个一元醇，也可以缩合一个二元醇。缩合两个一元醇时优选缩 二乙醇或二甲醇。缩合一个二元醇时优选形成5～8元环。

通过以下步骤制备：

步骤一：由含两个被保护羟基的仲胺小分子(PG₄O-L_a-CH₂)₂NH与含ω-缩醛的卤代物或磺 酸酯F₂-L_c-L_d-acetal进行烷基化反应，生成含两个被保护羟基的小分子中间体IM4，结构为 (PG₄O-L_a-CH₂)₂N-L_c-L_d-acetal；其中，F₂为卤原子或磺酸酯基；

步骤二：脱除小分子中间体IM4中的两个羟基保护基，得到具有两个裸露羟基的小分子 中间体IM5，结构为(HO-L_a-CH₂)₂N-L_c-L_d-acetal；聚合方法采用文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中的聚合方法，不再赘述；

步骤三：小分子中间体IM5与碱组成共引发体系，引发环氧乙烷聚合，并用烷基封端， 得到单一功能化支化聚乙二醇缩醛，结构为(X_a-PEG-L_a-CH₂)₂N-L_c-L_d-acetal；其中，X_a为C_1～20烃基；

当R₀₁为缩醛时，反应结束；当R₀₁为-CHO时还进行步骤四；

步骤四：脱除缩醛保护基得到通式(13)所示的单一功能化支化醛 (X_a-PEG-L_a-CH₂)₂N-L_c-L_d-CHO。

优选结构为(mPEG-CH₂-CH₂)₂N-L_c-R₀₁，L_c为C_1～24亚烷基，R₀₁为-CHO。例如，两个羟基被保护的二乙醇胺、二异丙醇胺与卤代缩醛衍生物溴代乙醛缩二乙醇、3-溴丙醛二甲基乙 缩醛反应，再进行聚合、脱缩醛保护后获得支化聚乙二醇醛。

获得的端基取代率可达100％。

4.2.采用羟脯胺酸作为支化试剂，以其五元环作为支化中心，制备单一功能化支化聚乙 二醇，结构如通式(15)所示。该结构具有手性的支化中心，能够赋予被修饰的生物相关物 质分子识别功能。需要说明的是通式中的五元环中心可以是左旋也可以是右旋的。

其中，PEG_a、PEG_b、L_a、L_b、L₂、M₉、Z、R₀₁涵盖了与通式(4)一致的定义及所有优 选方式，不再赘述。

优选结构之一如通式(16)、通式(17)所示。通式(17)中，L₆为亚甲基或L₅，两个 L₆具有相同的结构，且L₅的定义及优选方式与上述一致：

上述通式(16)、通式(17)所示的单一功能化支化聚乙二醇能利用羟脯胺酸的C-羧基、 N-氨基、侧链羟基能够被选择性保护、脱保护的特点，先偶合连接官能团源，再分别偶联两 个聚乙二醇组分，获得作为目标原料或中间体的单一功能化支化聚乙二醇。

对于该类结构通式的产品，端基取代率在95％以下的技术方案也在本发明公开范围内。

5.以上述支化聚乙二醇衍生物或支化聚合物作为起始原料，进行末端改造

需要说明的是，基于本发明的单一功能化支化聚乙二醇，进一步对末端官能团进行改性， 引入不同的功能性端基，从而得到的新的单一功能化支化聚乙二醇衍生物，也在本发明中公 开。由于采用了高末端取代率的单一功能化支化聚乙二醇作为原料，产物的末端取代率与采 用常规原料相比，其末端取代率也会具有显著提高。所述对末端官能团进行改性的方法包括 但不限于专利文献CN104530417A、CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X 及各引用文献中所描述及列举的类A～类J的末端线性官能化方法。需要说明的是，新引入的 功能性端基的类型与R₀₁可以相同，而仅增加到支化中心的间距，视为不同的端基。

6.中间体及产物的纯化与表征

本发明中制备的中间体或产物可通过包括但不限于浓缩去除溶剂、萃取、重结晶、吸附 处理、柱层析、沉淀、反沉淀、薄膜透析或超临界提取等的纯化方法加以纯化。一种纯化方 式可以实施多次，还可以采用不止一种的纯化手段。对关键中间体及产物的结构、分子量、 分子量分布进行表征确认，可采用包括但不限于核磁、电泳、紫外-可见分光光度计、FTIR、 AFM、GPC、HPLC、质谱、MALDI-TOF、圆二色谱法等表征方法。对于单分散性化合物， 其分子量优选通过MALDI-TOF确认。关于核磁测试中特征峰的归属确定方法采用现有技术 已公开的方法，包括但不限于文献CN104530417A、CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378X及各引用文献中所描述及列举。末端官能化率(取代率)，即末端官能团具有目标结构的分子占产物的百分比，主要通过核磁测试特征峰的积分比换算获得，利用PEG 组分中封端基团、EO基团与单一功能团的特征峰的积分比进行分析，换算方法为本领域技术 人员所熟知，这里不再赘述。核磁测试以氢谱扫描为主，需要时也进行碳谱扫描。

7.本发明还公开上述制备方法制备的单一功能化支化聚乙二醇，末端官能化率(取代率) 优选在95％以上，更优选大于96％，更优选大于98％，更优选99％～100％。两个聚乙二醇组 分的分子量优选满足：(1)均为多分散性，分子量选自2kDa～20kDa；(2)均为单分散性， EO单元数选自2～70，且数量差不超过1。进一步优选两个均为mPEG。

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。具体实施例为进一步详细说明本发明， 并非限定本发明的保护范围。

本发明实施例中大多产物的末端取代率在99％以上：其中，醛基、酰胺、羧基、氨基、 叠氮衍生物、炔衍生物、生物素衍生物、罗丹明衍生物的取代率近100％；缩醛、呋喃保护的 马来酰亚胺基、叠氮基、炔基的取代率约100％。显著优于在支化聚乙二醇末端基础上进行后 修饰得到的取代率(大多约90％～95％)。

下述实施例中，目标产品的纯度(目标分子量)均大于95％，部分接近或基本等于100％， 不再一一写出。

实施例1支化聚乙二醇丙醛

采用分子量20kDa的官能化聚乙二醇单甲醚作为原料，制备分子量约40kDa的支化聚 乙二醇丙醛。

(1)不对称结构的支化聚乙二醇丙醛(两个PEG组分与N支化中心之间的连接基不同)

对应通式(2)，其中，L_a、L_b为亚甲基，M_b为氧原子，L_c为亚甲基，L_d为酰胺键(-CONH-)， F为丙醛基(-CH₂CH₂CHO，其中，Z为亚乙基，R₀₁为-CHO)。设计两个mPEG (CH₃O(CH₂CH₂O)_n-)分子量均约20kDa。

反应式如下所示：

制备过程如下所示：

步骤a：将10g(47.8mmol)苄氧羰基保护的甘氨酸(S1-1)溶于二氯甲烷中，加入6.5g(57mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌溶解后，向溶液中加入17.7g(85.9mmol)二 环己基碳二亚胺(DCC)，于氮气保护下反应过夜。向反应液中加入7.7g(52.4mmol)1-氨 基-3.3-二乙氧基丙烷，搅拌反应5小时，过滤除去不溶物，柱层析得到纯品S1-2(13.9g，产 率86％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.13(-OCH₂CH₃,3H),4.59(-CH(OEt)₂,1H),4.90 (Bzl,-CH₂-,2H),7.2～7.4(Bzl,Ph-,5H)。

步骤b：将13g(38.5mmol)产品S1-2溶于甲醇中，加入15％Pd/C催化剂，通入氢气脱保护反应过夜，过滤除去不溶物，浓缩滤液后通过柱层析得到氨基缩醛中间体S1-3(7.5g， 产率95％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.13(-OCH₂CH₃,3H),4.59(-CH(OEt)₂,1H)。

步骤c：将100g分子量为20kDa(5mmol，PDI＝1.02)的mPEG-OH用甲苯共沸除水 后，溶于二氯甲烷中，加入三乙胺1.1g(10.9mmol)，搅拌均匀后，冰浴下缓慢滴加1.1g(9.6mmol)甲磺酰氯，滴加完毕后室温下反应16小时。反应完毕后将反应液浓缩干燥，溶于水中，用乙酸乙酯萃取除去杂质，再用二氯甲烷萃取产物后用无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩，用异丙醇重结晶得到甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯(mPEG-OMs，84g，产率84％，PDI＝1.02， NMR测试取代率为100％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.16(-SO₂CH₃,3H),3.25(CH₃O-,3H), 3.42-3.76(-CH₂CH₂O-),4.15-4.28(-CH₂OSO₂-,2H)。

将68g(3.4mmol)mPEG-OMs溶于二氯甲烷中，加入14g(34.3mmol)氨基缩醛中间 体S1-3，室温反应24小时，反应完毕后将反应液浓缩，于乙醚中沉淀两次除去过量的小分子杂质得到甲氧基聚乙二醇缩醛中间体S1-4(60g，产率88％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.13 (-OCH₂CH₃,3H),1.74(-CH₂CH(OEt)₂,2H),3.28(CH₃O-,3H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-, -OCH₂CH₂NH-),4.59(-CH(OEt)₂,1H)。

步骤d：将40g(2mmol)甲氧基聚乙二醇缩醛中间体S1-4与44g甲氧基聚乙二醇酰氯(20kDa，PDI＝1.02，2.2mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌溶解后缓慢滴加三乙胺0.4g(4mmol)，滴加完毕后于室温反应16小时，反应完毕后浓缩反应液，加入水搅拌6小时，通过离子交换柱过柱纯化，得到支化聚乙二醇缩醛衍生物D7-1(24g，产率30％)。GPC测试分子量约40kDa。

步骤e：将20g(5mmol)支化聚乙二醇缩醛衍生物D7-1溶于水中，用盐酸调节溶液pH至2.0，搅拌反应16小时，反应完毕后向溶液中加入10％氯化钠，用碳酸氢钠调节溶液pH 为6.4±0.2，用二氯甲烷萃取，萃出液用无水硫酸镁干燥后过滤浓缩，用异丙醇重结晶得到支化聚乙二醇丙醛衍生物D6-1(18.4g，产率92％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：2.64(-CH₂CHO,2H),3.29(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-OCH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<),4.04-4.30(-NCH₂CO-, -OCH₂CO-,5H),9.8(-CHO,1H)。NMR法测定取代率约100％。GPC法测定分子量40kDa， PDI＝1.02。

(2)对称结构的支化聚乙二醇丙醛(两个PEG组分与N支化中心之间的连接基相同)

对应通式(1)，其中，L_a、L_b为亚甲基，L_c为亚甲基，L_d为酰胺键(-CONH-)，F为丙 醛基(-CH₂CH₂CHO，其中，Z为亚乙基，R₀₁为-CHO)。设计两个mPEG的分子量均约20kDa。

制备过程如下所示：

步骤a～c：重复实施例1(1)中的步骤a～c，得到甲氧基聚乙二醇缩醛中间体S1-4(31g， 产率90％)。其中，步骤c增加投料量得到100g甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯mPEG-OMs。

步骤d：采用步骤c的烷基化条件，2mmol甲氧基聚乙二醇缩醛中间体S1-4与2.5mmol 甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯，经烷基化反应、膜过滤、干燥、浓缩、重结晶纯化得到以下结构 的支化聚乙二醇缩醛衍生物D7-2(28g，产率35％)。使用一步偶合法。

步骤e：采用实施例1(1)中的步骤e的方法，保持投料比不变，脱除缩醛保护基，分离纯 化后得到聚乙二醇丙醛衍生物D6-2(18g，产率90％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.32(-OCH₃, 6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<),4.04-4.30(-NCH₂CO-,5H),9.77(-CHO,1H)。NMR 法测定取代率约100％。GPC法测定分子量40kDa，PDI＝1.02。

实施例2支化聚乙二醇丙醛(一步偶合法)

对应通式(1)，其中，L_a、L_b为亚甲基，L_c为亚甲基，L_d为酰胺键(-CONH-)，F为丙 醛基(-CH₂CH₂CHO，其中，Z为亚乙基，R₀₁为-CHO)。设计两个mPEG的分子量均约10kDa。

制备过程如下所示：

步骤a～b：重复实施例1(1)中的步骤a～b。得到氨基缩醛中间体S1-3(7.3g，产率92％)。

步骤c：采用实施例1(1)步骤c的制备方法，使用10kDa、PDI＝1.01的甲氧基聚乙二醇 作为原料，得到甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯mPEG-OMs约44g。

采用实施例1(1)步骤c的烷基化条件，2mmol氨基缩醛中间体S1-3与过量的甲氧基聚乙 二醇甲磺酸酯(8mmol)经烷基化反应、膜过滤、干燥、浓缩、重结晶纯化得到支化聚乙二 醇缩醛衍生物D7-2(11g，产率28％)。核磁测试确定结构。GPC测定分子量约20kDa。

步骤d：采用实施例1(2)中的步骤e的方法，保持投料比不变，脱除缩醛保护基，分离纯 化后得到聚乙二醇丙醛衍生物D6-3。核磁法确认产品结构。GPC法测定分子量20kDa，PDI ＝1.01。取代率为99.8％。

还分别以CH₃O(CH₂CH₂O)₆-Ms、CH₃O(CH₂CH₂O)₂₂-Ms、CH₃O(CH₂CH₂O)₄₄-Ms替换步 骤c的原料制备了单分散性的支化聚乙二醇缩醛和支化聚乙二醇丙醛(D6-4、D6-5、D6-6)， 取代率分别均为100％。此时mPEG中EO单元数分别为5、21、43，采用MALDI-TOF确认 结构和分子量，分别为546Da、1506Da、2827Da。

实施例3支化聚乙二醇叠氮衍生物

对应通式(2)，其中，L_a、L_b为亚甲基，M_b为氧原子，L_c为亚乙基，L_d为酰胺键(-CONH-)， F为-CH₂CH₂CH₂N₃，其中，Z为亚丙基，R₀₁为-N₃。设计两个mPEG的分子量均约10kDa。

制备过程如下所示：

步骤a：将10g叔丁氧羰基保护的β-丙氨酸(52.9mmol)溶于二氯甲烷中，加入7.2gN- 羟基琥珀酰亚胺(NHS，62.6mmol)搅拌溶解后，向溶液中加入19.6g二环己基碳二亚胺(DCC， 95.1mmol)，于氮气保护下反应过夜。向反应液中加入5.8g 3-叠氮丙胺(58mmol)，搅拌反 应5小时，过滤除去不溶物，柱层析得到中间体S3-2(12.6g，产率88％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.36(-C(CH₃)₃,9H),1.56-1.62(-CH₂CH₂N₃,2H),3.02-3.12(-CH₂CH₂CH₂N₃,2H),3.38-3.46(-CH₂N₃,2H)。

步骤b：配置三氟乙酸/二氯甲烷(1:2，v/v)的溶液，冰浴条件下将12g中间体S3-2(44.3 mmol)溶于二氯甲烷中向混合溶液中缓慢滴加，滴加完毕后室温反应2小时，浓缩反应液后 加入水，将水相pH调节至12.0±0.2，用二氯甲烷萃取，将萃取液用无水硫酸镁干燥后过滤， 浓缩滤液并干燥得到氨基叠氮小分子化合物S3-3(7.2g，产率95％)。叔丁基特征峰消失。

步骤c：将50g分子量为10kDa的mPEG-OH(5mmol，PDI＝1.05)用甲苯共沸除水后，溶于二氯甲烷中，加入三乙胺1.1g(10.9mmol)，搅拌均匀后，冰浴下缓慢滴加1.1g甲磺酰氯(9.6mmol)，滴加完毕后室温下反应16小时。反应完毕后将反应液浓缩干燥，溶于水中，用乙酸乙酯萃取除去杂质，再用二氯甲烷萃取产物后用无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩，用异丙醇重结晶得到甲氧基聚乙二醇磺酸酯衍生物，42g，产率84％，PDI＝1.05，NMR测试取 代率为100％。

将34g甲氧基聚乙二醇磺酸酯衍生物(3.4mmol)溶于二氯甲烷中，加入5.8g氨基叠氮小分子化合物S3-3(33.9mmol)，室温反应24小时，反应完毕后将反应液浓缩，于乙醚中沉淀两次除去过量的小分子杂质得到中间体S3-4(甲氧基聚乙二醇叠氮衍生物中间体，29g， 产率84％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.56-1.66(-CH₂CH₂N₃,2H),3.02-3.12(-CH₂CH₂CH₂N₃, 2H),3.35(-OCH₃,3H),3.38-3.46(-CH₂N₃,2H),3.45-3.72(-OCH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂NH-)。

步骤d：将20g甲氧基聚乙二醇叠氮衍生物中间体S3-4(2mmol)与22g甲氧基聚乙二醇酰氯(10kDa，PDI＝1.05，2.2mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌溶解后缓慢滴加三乙胺0.4g(4mmol)，滴加完毕后于室温反应16小时，反应完毕后浓缩反应液，加入水搅拌6小时， 通过离子交换柱过柱纯化，得到纯品G21-1(支化聚乙二醇叠氮衍生物，11.4g，产率28％)。 ¹HNMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.56-1.66(-CH₂CH₂N₃,2H),3.02-3.12(-CH₂CH₂CH₂N₃,2H),3.35 (-OCH₃,6H),3.38-3.46(-CH₂N₃,2H),3.45-3.72(-OCH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<)。分子量为20 kDa，PDI＝1.04，NMR测试分析取代率为100％。

反应式如下所示：

实施例4支化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物

对应通式(2)，其中，L_a为亚甲基，L_b为亚乙基，M_b为氧原子，L_c为-CHBn-，L_d为酰 胺键(-CONH-)，F为

其中，Z为亚乙基，R₀₁为类E1。设计PEG_a、PEG_b均为mPEG，分子量均为10kDa。

制备过程如下所示：

步骤a：将50g分子量为10kDa的mPEG-OH(5mmol，PDI＝1.02)用甲苯共沸除水后，溶于二氯甲烷中，加入三乙胺1.1g(10.9mmol)，搅拌均匀后，冰浴下缓慢滴加1.1g对甲苯磺酰氯(TsCl，9.6mmol)，滴加完毕后室温下反应16小时。反应完毕后将反应液浓缩干燥，溶于水中，用乙酸乙酯萃取除去杂质，再用二氯甲烷萃取产物后用无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩，用异丙醇重结晶得到甲氧基聚乙二醇磺酸酯衍生物，mPEG-OTs，42g，产率84％，NMR测试取代率为100％。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：2.46(-PhCH₃),3.35(-OCH₃),3.50-3.71 (-CH₂CH₂O-),4.18(-SO₂CH₃),7.4(Ph-,2H),7.8(Ph-,2H)。

将34g mPEG-OTs(3.4mmol)溶于二氯甲烷中，加入9.8g马来酰亚胺小分子试剂S4-1 (34.1mmol)，室温反应24小时，反应完毕后将反应液浓缩，于乙醚中沉淀两次除去过量的小分子杂质得到甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺衍生物中间体S4-3，重30.2g，产率89％。¹HNMR (CDCl₃)δ(ppm)：3.35(-OCH₃,3H),3.45-3.72(-OCH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂NH-),6.7-6.8 (-COCHCHCO-,2H),7.2-7.4(-C₆H₅,5H)。

步骤b：将20g S4-3(2mmol)与22g甲氧基聚乙二醇乙酰氯(10kDa，PDI＝1.02，2.2mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌溶解后缓慢滴加三乙胺0.4g(4mmol)，滴加完毕后于室温反 应16小时，反应完毕后浓缩反应液，加入水搅拌6小时，通过离子交换柱过柱得到产物E1-1(支化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物，10.4g，产率26％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.35(-OCH₃,6H),3.45-3.72(-CH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<),6.7-6.8(-COCHCHCO-,2H),7.2-7.4(-C₆H₅,5H)。分子量为20kDa，PDI＝1.02，NMR分析取代率约为100％。

还设计了PEG_a为CH₃O(CH₂CH₂O)₂₁-，PEG_b为CH₃O(CH₂CH₂O)₂₂-的结构。步骤a中， 采用CH₃O(CH₂CH₂O)₂₁-CH₂CH₂OTs代替10kDa的mPEG-OTs，采用 CH₃O(CH₂CH₂O)₂₂-CH₂COCl代替10kDa的mPEG-CH₂COCl，采用相同的方法及相同的摩尔 投料比进行制备，得到支化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物E1-2，采用核磁特征峰确认产品结构， 分析取代率为100％，采用MALDI-TOF确认分子量，1707Da。

反应式如下所示：

实施例5支化聚乙二醇炔衍生物

对应通式(2)，其中，L_a、L_b为亚甲基，M_b为氧原子，L_c为-CH(CH₃)-，L_d为酰胺键 (-CONH-)，F为-CH₂C≡CH，其中，Z为亚甲基，R₀₁为乙炔基-C≡CH。设计两个mPEG的 分子量均约10kDa。

制备过程如下所示：

步骤a：将50g分子量为10kDa的mPEG-OH(5mmol，PDI＝1.03)用甲苯共沸除水后，溶于二氯甲烷中，加入三乙胺1.1g(10.9mmol)，搅拌均匀后，冰浴下缓慢滴加1.1g甲磺酰氯(9.6mmol)，滴加完毕后室温下反应16小时。反应完毕后将反应液浓缩干燥，溶于水中，用乙酸乙酯萃取除去杂质，再用二氯甲烷萃取产物后用无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩，用异丙醇重结晶得到甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯衍生物mPEG-OMs，42g，产率84％，PDI＝1.03，NMR测试取代率为100％)。

将34g mPEG-OMs(3.4mmol)溶于二氯甲烷中，加入4.3g小分子炔化合物S5-1(34.1mmol)，室温反应24小时，反应完毕后将反应液浓缩，于乙醚中沉淀两次除去过量的小分子杂质得到甲氧基聚乙二醇炔衍生物中间体S5-2，28.6g，产率84％。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：2.4-2.5(-C≡CH,1H),3.36(-OCH₃,3H),3.45-3.72(-CH₂CH₂O-,-CH₂CH₂NH-)。

步骤b：将20g 3(2mmol)与22g甲氧基聚乙二醇乙酰氯(mPEG-CH₂COCl，10kDa， PDI＝1.02，2.2mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌溶解后缓慢滴加三乙胺0.4g(4mmol)，滴加 完毕后于室温反应16小时，反应完毕后浓缩反应液，加入水搅拌6小时，通过离子交换柱过 柱得到纯品F3-1(支化聚乙二醇炔衍生物，11.3g，产率28.3％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)： 2.4-2.5(-C≡CH,1H),3.36(-OCH₃,6H),3.45-3.72(-CH₂CH₂O-,-CH₂CH₂N<)。分子量为20kDa， PDI＝1.02，NMR测试取代率为100％。

还设计两个mPEG的分子量均约5kDa的单一功能化聚乙二醇炔，采用分子量约5kDa、 PDI＝1.01的mPEG-OMs和mPEG-CH₂COCl作为原料，采用相同的制备过程及相同的摩尔投 料比制备，得到支化聚乙二醇炔衍生物F3-2，采用核磁特征峰确认产品结构，分析取代率为 100％，采用GPC法测定分子量为10kDa。

反应式如下所示：

实施例6支化聚乙二醇羧酸衍生物(IM1为多肽或聚氨基羧酸的衍生物)

对应通式(10)，其中，L_a、L_b为亚甲基，L₃为亚甲基，PT来自二甘氨酸，R₀₁为COOH。 设计两个mPEG的分子量均约20kDa。

制备过程如下所示：

步骤a：中间体NH₂-(GLY)₂-COOBu(Bu为叔丁基，S6-3)的制备。

将甘氨酸(10g，133mmol)溶于2M NaOH(66.5mL，133mmol)中，冰浴下搅拌。 将氯甲基苄基酯(24.6g，144mmol)溶于2M NaOH(66.5mL，133mmol)中缓慢滴加至 反应液中，于2h内滴加完毕。反应液在冰浴下反应1h后，室温反应过夜。反应完毕后，用 乙醚洗涤除去过量氯甲基苄基酯，将水相用盐酸调节至pH为3.0，有沉淀析出，过滤并用0.1 M HCl洗涤，干燥后得到甘氨酸衍生物纯品S6-1(21.55g，产率77％)。MALDI-TOF确定分 子量，209Da。

将S6-1(20.9g，100mmol)，2(16.8g，100mmol)，三乙胺(10.1g，100mmol)，DMAP (4-二甲基氨基吡啶，1.2g，10mmol)和DCC(20.6g，100mmol)溶于1L干燥DCM中 室温反应过夜，反应完毕后浓缩反应液，过硅胶柱得到中间体纯品S6-2(23g，产率71％)。 ¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.56(-CH₃,9H),5.10(-PhCH₂OCONH,2H),7.2-7.4(-C₆H₅,5H)。

中间体S6-2(18.1g，56.1mmol)用Pd/C(1.8g)在甲醇(600mL)中还原得到 NH₂-(GLY)₂-COOBu中间体S6-3(10.3g，产率97％)。苄氧羰基Cbz特征峰消失。

步骤b：采用实施例1步骤c的烷基化反应方法进行第一次烷基化反应，30mmolNH₂-(GLY)₂-COOBu中间体与甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯(20kDa，PDI＝1.04，3mmol)在二 氯甲烷溶液中进行烷基化反应，室温反应24小时，反应完毕后将反应液浓缩，于乙醚中沉淀 两次除去过量的小分子杂质得到甲氧基聚乙二醇仲胺衍生物S6-4(52g，产率87％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.56(-CH₃,9H),3.38(-OCH₃,3H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-CH₂CH₂NH-)。

步骤c：进行第二次烷基化反应：2mmol甲氧基聚乙二醇仲胺衍生物S6-4与3mmol甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯(20kDa，PDI＝1.04，3mmol)进行烷基化反应，室温反应24小时， 反应完毕后浓缩反应液，加入pH＝7.0的磷酸盐缓冲液搅拌16h，通过离子交换柱层析得到 纯品S6-5(支化聚乙二醇炔衍生物中间体，40kDa，PDI＝1.04，50g，产率63％)。¹H NMR (CDCl₃)δ(ppm)：1.56(-CH₃,9H),3.38(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-CH₂CH₂N<)。

步骤d：脱除叔丁基保护，将40g S6-5(1mmol)溶于1L水中，加入NaH₂PO₄(0.25mol，30g)和氢氧化钠(0.75mol，30g)，加热至60℃水解3h，冷却后用盐酸将反应液pH调至 3，二氯甲烷萃取后浓缩，用异丙醇重结晶，得到单一功能化聚乙二醇羧酸D1-1(35g，88％)。 ¹HNMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.38(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-CH₂CH₂N<)。叔丁酯特 征峰消失。GPC测试，分子量为40kDa，PDI＝1.04。通过核磁分析，端基修饰率为100％。

步骤b～d的反应式如下所示：

实施例7支化聚乙二醇胺衍生物(L_a、L_b与PEG形成酯键连接)

对应通式(3)，其中，L_a为COCH₂，L_c为亚甲基，L_d为CONH，F为乙氨基，其中，Z 为亚乙基，R₀₁为NH₂。设计两个mPEG的分子量均约20kDa，总分子量约40kDa。

步骤a：参考实施例1步骤a的制备方法，采用甘氨酸(C₂H₅NO₂，分子量约75)作为 原料，与过量单端Boc保护的乙二胺反应，制备Boc保护的甘氨酸-乙烷-1,2-二胺

S7-1，柱层析进行纯化。MALDI-TOF确定分子量，217 Da。

步骤b：制备含有酯键的mPEG-OMs。将mPEG-OH(20kDa，PDI＝1.02，20mmol)与 缩醛保护的小分子S7-2进行缩合反应后脱保护得到含酯键的聚乙二醇中间体 mPEG-CO-CH₂CH₂-OH(20kDa，PDI＝1.03，17mmol，S7-3)，与甲磺酸酯缩合后得到含酯 键的甲氧基聚乙二醇磺酸酯衍生物S7-4，mPEG-CO-CH₂CH₂-OMs(20kDa，PDI＝1.03，产率 75％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.16(-SO₂CH₃,3H),3.34(CH₃O-,3H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-), 4.15-4.28(-CH₂OSO₂-,-CH₂OCO-,4H)。

步骤c：参考实施例6的反应条件及投料比进行第一次烷基化反应：30mmol Boc保护的 甘氨酸-乙烷-1,2-二胺S7-1与甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯S7-4(3mmol)在二氯甲烷溶液中进 行烷基化反应，室温反应24小时，反应完毕后将反应液浓缩，于乙醚中沉淀两次除去过量的 小分子杂质得到甲氧基聚乙二醇衍生物中间体S7-5(47g，产率78％)。¹H NMR(CDCl₃)δ (ppm)：1.36(-C(CH₃)₃,9H),3.35(-OCH₃,3H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-CH₂CH₂NH-),4.22 (-CH₂OCO-,2H)。

步骤d：进行第二次烷基化反应：2mmol甲氧基聚乙二醇衍生物中间体S7-5与3mmol甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯S7-4(3mmol)进行烷基化反应，室温反应24小时，反应完毕后 浓缩反应液，加入pH＝7.0的磷酸盐缓冲液搅拌16h，通过离子交换柱层析得到待脱保护中 间体S7-6(支化聚乙二醇衍生物中间体，40kDa，PDI＝1.04，42g，产率53％)。¹H NMR(CDCl₃) δ(ppm)：1.36(-C(CH₃)₃,9H),3.35(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-CH₂CH₂N<),4.22 (-CH₂OCO-,4H)。

步骤e：脱除Boc保护：将40g支化聚乙二醇衍生物中间体S7-6(1mmol)溶于200mL二氯甲烷中，冰浴下滴加三氟乙酸50mL，室温反应16h。反应完毕后浓缩，加入纯水，用 碳酸氢钠将pH调至7.0左右，二氯甲烷萃取后浓缩，用异丙醇重结晶，得到单一功能化聚乙 二醇氨基C4-1(37g，产率93％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：2.80(-CH₂NH₂,2H),3.26 (-CONHCH₂CH₂NH₂,2H),3.38(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<),4.22 (-CH₂OCO-,4H)。并且Boc的叔丁基特征峰消失。GPC测试，分子量为40kDa，PDI＝1.03。 通过核磁分析，端基修饰率为100％。

实施例8支化聚乙二醇丁醛衍生物(L_a、L_b与PEG形成氨基甲酸酯键连接)

实施例8.1.分步偶合法-氨基酸衍生物作为氮源试剂

对应通式(3)，其中，L_a为CONHCH₂，L_c为亚甲基，L_d为CONH，F为丁醛基，其中， Z为1,3-亚丙基，R₀₁为CHO。设计两个mPEG的分子量均约20kDa，总分子量约40kDa

步骤a：参考实施例1步骤a的制备方法，采用原料甘氨酸(C₂H₅NO₂，分子量约75) 作为原料，与过量1-氨基-4,4-二乙氧基丁烷反应，制备小分子化合物

柱层析进行纯化。MALDI-TOF确定分子量，218Da。

步骤b：参考实施例7的方法及投料比，与甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯 (mPEG-CO-NH-CH₂CH₂-OMs)分两步进行偶合，柱层析纯化后，采用实施例1的方法脱除 缩醛保护，萃取、过滤、干燥、浓缩、重结晶，得到D6-7所示结构的支化聚乙二醇醛基衍生 物。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.76(-CH₂CH₂CH₂CHO,2H),2.44(-CH₂CH₂CHO,2H),3.34 (-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<),9.78(-CHO,1H)。GPC测试，分子量为40 kDa，PDI＝1.03。通过核磁分析，端基修饰率为100％。

实施例8.2.仲胺作为氮源试剂

对应通式(12)，其中，L_a为CONHCH₂CH₂，L₂为亚甲基，L_c为COCH₂CH₂，L_d为CONH， F为丙醛基，其中，Z为1,2-亚乙基，R₀₁为CHO。设计两个mPEG的分子量均约20kDa， 总分子量约40kDa。

通过以下步骤制备：

步骤a：小分子中间体IM3的制备。将1-氨基-3,3-二乙氧基丙烷(100mmol，14.7g)与 过量丁二酸(1mol，118g)在DCC(37g，180mmol)、DMAP(2.2g，18mmol)存在的情 况下进行缩合反应，通过过柱提纯得到纯品S8-1(20.4，产率83％)。将S8-1(19.8g，80mmol) 溶于二氯甲烷中，加入草酰氯(20.3g，160mmol)和催化量的DMF(0.2g)，反应2h后直 接浓缩干燥得到S8-2，将S8-2无需提纯直接与2,2-二氰基二乙胺(9.8g，80mmol)在三乙 胺(9.7g，96mmol)催化下反应，通过过柱提纯得到纯品S8-3(12.1g，34mmol)。将S8-3 (12.1g，34mmol)溶于甲醇中，加入Raney Ni(7g)催化剂，将溶有NaBH₄(2.6g，68mmol) 的NaOH溶液(10M)向反应液中滴加，滴加完毕后鼓泡氢气2h后停止反应。过滤除去不 溶物，旋转蒸发除去甲醇，用二氯甲烷萃取，浓缩后过柱提纯得到纯品S8-4(11.5g，产率 94％)。

步骤b：将mPEG-SC(20kDa，PDI＝1.03，3mmol)溶于二氯甲烷中，加入三乙胺(0.6g，6mmol)搅拌均匀，将小分子S8-4(0.36g，1mmol)加入反应液中，搅拌反应16h。反 应完毕后将反应液旋干，用异丙醇重结晶。通过离子交换树脂过柱得到支化聚乙二醇缩醛中 间体S8-5(31g，78％)。将支化聚乙二醇缩醛中间体S8-5(30g，0.75mmol)溶于600mL 水中，用盐酸调节pH为2.0，搅拌反应16h，反应完毕后用二氯甲烷萃取后浓缩，用异丙醇 重结晶得到D6-8所示结构的支化聚乙二醇醛(28g，产率93％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)： 3.38(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<),9.8(-CHO,1H)。GPC测试，分子量 为40kDa，PDI＝1.03。通过核磁分析，端基修饰率为100％。

实施例9支化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(Z含酰胺键)

对应通式(7)，其中，L_c为CH₂，Z为CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂，R₀₁为

设计两个 mPEG的分子量均约20kDa，总分子量约40kDa

实施例9.1.方法一

步骤a：采用Boc保护的甘氨酸(17.5g，100mmol)与过量乙二胺(60g，1mol)在 NHS(13.7g，120mmol)和DCC(37g，180mmol)存在下反应，反应完毕后浓缩反应液， 柱层析得到纯品S9-1(18.4g，85mmol)，再取含呋喃保护马来酰亚胺基的小分子羧酸衍生 物S9-2(20.1g，85mmol)在NHS(11.6g，102mmol)和DCC(31.5g，153mmol)存在 下反应，反应完毕后浓缩反应液，加入二氯甲烷200mL，冰浴下缓慢滴加三氟乙酸50mL， 室温反应2h后浓缩反应液，柱层析进行纯化后得到小分子中间体S9-3(23.5g，70mmol)。

步骤b：参考实施例6的方法及反应摩尔比，小分子中间体S9-3与甲氧基聚乙二醇甲磺 酸酯进行两步偶合，柱层析后进行脱呋喃保护。将呋喃保护的支化聚乙二醇马来酰亚胺S9-4 (40kDa，PDI＝1.03，1mmol)溶于400mL甲苯中，加入2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT， 抗氧化剂，4g)加热至125℃搅拌反应5h，浓缩后用异丙醇重结晶，得到E1-2所示结构的 支化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(36g，产率90％)。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.3(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<),6.75(-CHCH-,2H)。GPC测试，分子量为40kDa， PDI＝1.03。通过核磁分析，端基修饰率为100％。

实施例9.2.方法二

采用NMR确认结构及分子量。末端修饰率接近100％。

步骤a：采用含呋喃保护马来酰亚胺基的小分子羧酸衍生物S9-2(23.7g，100mmol)与 过量乙二胺(60g，1mol)在NHS(13.7g，120mmol)和DCC(37g，180mmol)存在下 反应，反应完毕后浓缩反应液，柱层析得到纯品S9-5(23.2g，83mmol)，再与Boc保护的 甘氨酸(14.5g，83mmol)在NHS(11.2g，98mmol)和DCC(30.7g，149mmol)存在下 反应，反应完毕后浓缩反应液，加入二氯甲烷200mL，冰浴下缓慢滴加三氟乙酸50mL，室 温反应2h后浓缩反应液，柱层析进行纯化后得到小分子中间体S9-3(22.5g，67mmol)。

步骤b：参考实施例6的方法，与甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯两次偶合，柱层析后脱呋喃 保护，得到上述结构支化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物E1-2。

实施例9.3.方法三

参考实施例7的方法得到C4-1所示结构的支化聚乙二醇胺衍生物，mPEG₂-甘氨酸-乙二 胺(40kDa，PDI＝1.03，1mmol)，与呋喃保护的小分子S9-2(

1.2g，5mmol) 在NHS(0.68g，6mmol)和DCC(1.85g，9mmol)存在下进行缩合反应，反应完毕后浓 缩反应液，用异丙醇重结晶纯化，得到E1-2所示结构支化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(34g，产率85％)。采用NMR确认结构、GPC确定分子量。末端修饰率约98.5％。

实施例10支化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(Z含酯键)

对应通式(5)，其中，L₂为羰基，R₂₀为氢原子(对应L_c为亚甲基)，M₉为氧原子，Z 为CH₂CH₂OCOCH₂CH₂，R₀₁为

设计两个mPEG的分子量均约20kDa，总分子量约 40kDa。

通过以下步骤制备：

步骤a：采用Boc保护的甘氨酸(17.5g，100mmol)与过量乙二醇(62g，1mol)在 DCC(37.1g，180mmol)和DMAP(2.2g，18mmol)存在下进行缩合反应，反应完毕后浓 缩反应液，柱层析进行纯化，得到Boc保护的甘氨酸-乙烷-1,2-二醇(18.8g，86mmol)。将 产物S10-1(18.8g，86mmol)与呋喃保护的马来酰亚胺小分子S10-2(20.4g，86mmol)在 DCC(31.9g，155mmol)和DMAP(1.83g，15mmol)存在下进行缩合反应，反应完毕后 浓缩反应液，加入二氯甲烷200mL，冰浴下缓慢滴加三氟乙酸50mL，室温反应2h后浓缩 反应液，柱层析进行纯化后得到纯品S10-4(22g，65mmol)。

步骤b：参考实施例5的方法，与甲氧基聚乙二醇甲磺酸酯反应后，再与甲氧基聚乙二 醇乙酰氯反应，柱层析纯化后脱去呋喃保护，分离纯化，得到E1-3所示结构支化聚乙二醇马 来酰亚胺衍生物。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.37(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-, -OCH₂CH₂N<),6.75(-CHCH-,2H)。GPC测试，分子量为40kDa，PDI＝1.03。通过核磁分析 确认结构，端基修饰率为100％。

实施例11支化聚乙二醇醛(聚合法)

步骤a：配制N-Boc二乙醇胺(1当量)的0.1M二氯甲烷溶液中，加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl，2.2当量)，咪唑(2.2当量)，DMAP(0.1当量)，室温条件搅拌溶解，反 应20h。反应结束后，萃取，收集有机相，浓缩，干燥。得到醇羟基被保护的小分子中间体 S11-1(TBDMS-OCH₂CH₂)₂N-Boc。

小分子中间体S11-1用二氯甲烷溶解，搅拌溶解，冰浴下缓慢滴加三氟乙酸，室温反应2 h，浓缩，柱层析纯化，得到小分子仲胺中间体S11-2，(TBDMS-OCH₂CH₂)₂NH。¹H NMR(CDCl₃) δ(ppm)：0.92(-SiC(CH₃)₃,9H),0.14(-SiCH₃,6H),3.38(-OCH₂CH₂NH-,4H),3.84 (-OCH₂CH₂NH-,4H)。

小分子中间体S11-2用二氯甲烷溶解，加入3-氯丙醛二乙醇缩醛(1.2当量)，反应24h， 加入少量的饱和氯化铵溶液淬灭反应后，浓缩，二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤，干燥，得 到带被保护羟基的缩醛小分子中间体S11-3，(TBDMS-OCH₂CH₂)₂NCH₂CH₂(OEt)₂。¹HNMR (CDCl₃)δ(ppm)：0.14(-SiCH₃,6H),0.92(-SiC(CH₃)₃,9H),1.13(-OCH₂CH₃,3H),1.74 (-CH₂CH(OEt)₂,2H),4.59(-CH(OEt)₂,1H)。

步骤b：用四氢呋喃溶解，加入四叔丁基氟化铵(TBAF)，反应过夜，脱除TBDMS保护，硅胶过柱纯化，得到小分子引发剂S11-4，(HOCH₂CH₂)₂NCH₂CH₂(OEt)₂。核磁测试TBDMS 特征峰消失。

步骤c：无水无氧条件下加入四氢呋喃，小分子引发剂S11-4，二苯基甲基钾(1.6摩尔 量)，加入计算量的环氧乙烷，逐步升温至温度为60℃，反应48小时。加入过量的二苯基甲 基钾、碘甲烷，室温反应12小时。浓缩，无水乙醚沉淀，过滤，干燥。得到支化聚乙二醇缩醛中间体S11-5，(mPEG-OCH₂CH₂)₂NCH₂CH₂(OEt)₂。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.13 (-OCH₂CH₃,3H),1.74(-CH₂CH(OEt)₂,2H),3.28(-OCH₃,6H),3.42-3.76(-CH₂CH₂O-, -OCH₂CH₂N<),4.59(-CH(OEt)₂,1H)。GPC测试，分子量20kDa，PDI＝1.02。

步骤d：将S11-5溶于水中，用盐酸调节pH为2.0，搅拌反应16h，反应完毕后用二氯甲烷萃取后浓缩，用异丙醇重结晶得到D6-9所示结构的支化聚乙二醇醛。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：2.64(-CH₂CHO,2H),3.29(-OCH₃,6H),3.45-3.72(-OCH₂CH₂O-, -OCH₂CH₂N<,>NCH₂-),9.8(-CHO,1H)。醛基取代率为100％。GPC法测定分子量20kDa， PDI＝1.02。

改变环氧乙烷投料量，摩尔量加倍，制备了支化聚乙二醇醛D6-10。核磁测试确定结构， 取代率为100％，GPC法测定分子量40kDa，PDI＝1.03。

还采用步骤a的制备方法，用TBDMS单保护的乙二醇与过量3-氯丙醛二乙醇缩醛进行 烷基化反应，再用TBAF/THF脱除TBDMS保护，得到羟基缩醛小分子S11-6，HOCH₂CH₂OCH₂CH₂(OEt)₂。在DCM/TEA冰浴条件下与1.1当量甲磺酰氯反应，得到缩醛的 磺酸酯衍生物MsOCH₂CH₂OCH₂CH₂(OEt)₂。参照实施例1步骤c的方法与小分子仲胺中间体 S11-2经烷基化反应得到带被保护羟基的缩醛小分子中间体S11-7。采用本实施例11的步骤 b～d，依次进行脱羟基保护，环氧乙烷聚合，脱除缩醛保护，得到以下结构的支化聚乙二醇醛 D6-11。中间体和产物用核磁确定结构，用GPC测定分子量为40kDa，PDI＝1.03。

实施例12支化聚乙二醇生物素的制备

其中，R₀₁为靶向基团。两个mPEG均为CH₃O(CH₂CH₂O)₈-。

步骤a：采用原料D-生物素(C₁₀H₁₆N₂O₃S，分子量约244)作为原料，过量二乙胺反应，制备N-生物素-乙烷-1,2-二胺

柱层析进行纯化。

步骤b：参考实施例1的方法，与苄氧羰基保护的甘氨酸偶合，脱除氨基保护，得到伯 胺中间体。柱层析进行纯化。核磁测试出现δ2.80ppm(-CH₂NH₂,2H),δ3.26ppm (-CONHCH₂CH₂NH₂,2H)的特征峰。

步骤c：采用实施例1的烷基化反应、酰胺化反应方法，原料摩尔投料比不变，先后与 甲氧基聚乙二醇磺酸酯、甲氧基聚乙二醇酰氯反应，偶合两个mPEG组分，得到上述的支化 聚乙二醇生物素。中间体及终产物采用乙酸乙酯萃取除杂、过滤、浓缩、重结晶纯化。

采用MALDI-TOF确认分子量约1177Da。核磁确认结构，¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)： 3.30(-OCH₃,6H),3.58-3.70(-CH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<),4.32(-NCOCH₂O),4.25-6.48 (>CH-CH(NH-)-CH(NH-)CH₂-S,biotin,4H)。生物素的取代率约100％。

还采用N-生物素-3,6-二氧辛烷-1,8-二胺代替N-生物素-乙烷-1,2-二胺，采用相同的制备 方法制备了支化聚乙二醇生物素。MALDI-TOF确认分子量约1265Da。

实施例13支化聚乙二醇罗丹明的制备

其中，R₀₁为荧光性基团。PEG_a为CH₃O(CH₂CH₂O)₁₁-，PEG_b为CH₃O(CH₂CH₂O)₁₂-。

使用罗丹明B制备N-罗丹明-乙烷-1,2-二胺，代替生物素，采用与实施例12相同的方法， 调节PEG原料规格及投料量，制备了上述结构的支化聚乙二醇罗丹明。采用MALDI-TOF分 子量约1685Da。核磁测定结构。¹H NMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.36(-OCH₃,6H),3.56-3.71(-CH₂CH₂O-,-OCH₂CH₂N<,-N(CH₂CH₃)₂),4.32(-NCOCH₂-O)，罗丹明特征峰(1.2,6.9～7.1,7.4, 7.8,8.2)。罗丹明的取代率99.8％。

还配制罗丹明的水相溶液，制定其在555nm处紫外吸收的标准曲线，然后将样品稀释罗 丹明浓度为0.5～1.0μM测定吸光度，根据比尔定律计算罗丹明的含量。约核磁结果一致，约 100％。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明 书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理 包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (48)

1.一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(1)或通式(2)所示：

其中，PEG_a、PEG_b为相同或不同的聚乙二醇组分，各自独立，均由C_1～20烃基连接PEG组分的末端氧原子；L_a、L_b为相同或不同的二价连接基，各自独立，分别连接PEG_a、PEG_b的另一个氧端；M_b为氧原子或硫原子；L_c为碳链连接基；L_d为二价连接基，含有经偶合反应生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁；R₀₁与L_d直接相连，或通过二价连接基Z相连；

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一、以含官能团端D_F的化合物F_source作为原料，与含氮源端基U_N的化合物N_source进行偶合，形成二价连接基L_d；所述氮源端基U_N为氨基或被保护的氨基；反应式中F₁、F₂为能反应生成二价连接基的官能团对；当氮源端基U_N不含活泼氢时，进行脱保护，得到含有氮源端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1；其中F_N为伯氨基或仲氨基；所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R₀₁的基团；

步骤二、通过烷基化反应，将第一个聚乙二醇链PEG_a偶合到小分子中间体IMI的氮源位置，氮源端基F_N转变为M_N，反应式中R_a为能与F_N发生烷基化反应的基团；

当M_N不为–NH–时，还进行脱保护，得到含有–NH–的线性中间体IM2；当M_N为–NH–时，进行下一步骤；

步骤三、通过烷基化反应、酰胺化反应或硫代酰胺化反应将第二个聚乙二醇链PEG_b偶合到中间体IM2的N原子上；反应式中R_b为能与–NH–发生烷基化反应的基团；R_x为能与–NH–反应生成酰胺键或硫代酰胺键的基团；

当D_F等于F时，所得结构即对应通式(1)或通式(2)所示的结构；

当D_F不等于F时，经末端微修饰得到对应的通式(1)或通式(2)所示的结构；所述末端微修饰选自以下的化学反应：脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团。

步骤一

步骤二

步骤三

或

2.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L_c的结构满足以下任一种：

(1)L_c包含

C_3～6二价环烷基、取代的C_3～6二价环烷基、苯撑、取代的苯撑中至少一个；其中，A₁、A₂、A₃为含有1～10个碳原子的取代基，且各自独立，任两个彼此相同或不同；i、j、k为0～24的整数；

(2)L_c为C_1～24亚烃基；

(3)L_c为–CH(R₂₀)；其中，R₂₀选自H、–CH₃、–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)–CH₂CH₃、–Bn、–CH₂CH₂–SCH₃，其中Bn为苄基；

(4)L_c为L₅；其中，L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子。

3.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述氮源试剂N_source选自以下任一种：

(1)氨基羧酸、氨基酮基、氨基醛基、氨基醇中任一种化合物或上述任一种化合物的氨基被保护的形式；

(2)氮源试剂一端为氨基或被保护的氨基，另一端选自马来酰亚胺基、叠氮基、炔基、羟基、巯基、羧基、羧酸酯基、酰卤、酰胺基、酰肼中任一种基团。

4.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述氮源试剂N_source选自以下任一种：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、NH₂-L₅-COOH或上述任一种的氨基被保护形式；其中L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子。

5.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L_d选自含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键、一硫代氨基甲酸酯键、二硫代氨基甲酸酯键、二硫键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、亚胺键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种共价连接基。

6.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述R₀₁为能与生物相关物质相互反应的功能性基团；所述与生物相关物质相互反应选自以下任一种：共价键的形成、氢键的形成、光学反应和靶向作用。

7.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于所述R₀₁选自反应性基团、反应性基团的微变化形式、靶向基团、光敏性基团；所述反应性基团的微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为目标反应性基团。

8.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述R₀₁选自以下任一种结构：

(1)能与氨基、羟基、羧基、巯基、二硫连接基、醛基、酮羰基、胍基、酰胺基、叠氮基、炔基、烯基、咪唑基、吲哚基中任一种活性基团发生反应生成共价键的基团；

(2)具有被保护形式的反应性基团或者其脱保护的活性形式或者其盐形式：氨基、被保护的氨基、胺盐、巯基、被保护的巯基、羟基、被保护的羟基、醛基、缩醛基、马来酰亚胺基、呋喃保护的马来酰亚胺基、羧基、酯保护的羧基、炔基、被保护的炔基、烯基；

(3)酰卤、酰胺、被保护的酰胺、酰肼、被保护的酰肼。

9.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述R₀₁距离支化中心N原子不超过100个原子间隔，选自1、1～10、10～20、20～50、50～100中任一种；不包括左端点，包括右端点。

10.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述Z的结构选自以下任一种：

(1)Z为碳链连接基；

(2)Z中含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键、硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种连接基；

(3)Z中含有通过烷基化反应、酰胺化反应、酯化反应、硫酯化反应、点击反应、环加成反应、Diels-Alder加成反应、1,3-偶极环加成反应中任一种偶合反应生成的连接基。

11.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述Z选自以下任一种：

(1)Z中含有主链杂原子但不含重复单元CH₂CH₂O；

(2)Z中含有重复单元CH₂CH₂O，且重复单元数不超过20。

12.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述Z的结构选自以下任一种：

(1)稳定的二价连接基STAG：由亚烷基、二价环烷基、二价环烯基、二价环炔基、二价环二烯烃基、芳撑、碳碳双键、碳碳三键、共轭的碳碳双键、二价脂杂环基、二价芳杂环基、侧基含杂原子的碳链连接基、取代的二价环烯基、取代的二价环炔基、取代的二价环二烯烃基、取代的芳撑、取代的碳碳双键、取代的共轭碳碳双键、取代的二价脂杂环基、取代的二价芳杂环基、醚键、硫醚键、脲键、硫脲键、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、磷酸酯基、膦酸酯基、不含活泼氢的二价硅基、含硼原子的二价连接基、二价叔氨基、羰基、硫代羰基、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、烯胺基、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

NH₂-L₅-COOH、中性氨基酸及其衍生物骨架中任一种二价连接基、任两种或任两种以上基团任意组合构成的二价连接基；所述中性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸中任一种；其中L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子；

(2)可降解的二价连接基DEGG：含有二硫键、乙烯醚键、酯基、硫酯基、硫代酯基、二硫代酯基、碳酸酯基、硫代碳酸酯基、二硫代碳酸酯基、三硫代碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、二硫代氨基甲酸酯基、缩醛基、环缩醛基、缩硫醛基、氮杂缩醛基、氮杂环缩醛基、氮硫杂缩醛基、二硫代缩醛基、半缩醛基、硫代半缩醛基、氮杂半缩醛基、缩酮基、缩硫酮基、氮杂缩酮基、氮杂环缩酮基、氮硫杂缩酮基、亚胺键、腙键、酰腙键、肟键、硫肟醚基、半卡巴腙键、硫代半卡巴腙键、肼基、酰肼基、硫代碳酰肼基、偶氮羰酰肼基、硫代偶氮羰酰肼基、肼基甲酸酯基、肼基硫代甲酸酯基、卡巴肼基、硫代卡巴肼基、偶氮基、异脲基、异硫脲基、脲基甲酸酯基、硫脲基甲酸酯基、胍基、脒基、氨基胍基、氨基脒基、亚氨酸基、亚氨酸硫酯基、磺酸酯基、亚磺酸酯基、磺酰肼基、磺酰脲基、马来酰亚胺基、原酸酯基、苄氧羰基、磷酸酯基、亚磷酸酯基、次磷酸酯基、膦酸酯基、磷硅烷酯基、硅烷酯基、碳酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基、聚酰胺基、磷酰胺基、亚磷酰胺基、焦磷酰胺基、环磷酰胺基、异环磷酰胺基、硫代磷酰胺基、乌头酰基、肽键、核苷酸及其衍生物骨架、脱氧核苷酸及其衍生物骨架中任一种二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合；所述肽键由选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸的任两个相同或不同的氨基酸键合而成。

13.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L_a、L_b相同，且选自以下任一种结构：

(1)L_a、L_b为亚烃基或侧基含杂原子的碳链连接基；

(2)L_a、L_b含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键、硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种连接基；

(3)L_a、L_b中含有通过烷基化反应、酰胺化反应、酯化反应、硫酯化反应、click反应、环加成反应、Diels-Alder加成反应、1,3-偶极环加成反应中任一种偶合反应生成的连接基。

14.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L_a与PEG之间形成酯键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键连接。

15.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L_b与PEG之间形成酯键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键连接。

16.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述通式(1)中L_a、L_b相同，且含有羰基、-CONH-、-COO-中任一种端基。

17.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述PEG_a、PEG_b均为mPEG。

18.根据权利要求17所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述PEG_a、PEG_b分子量相同，且选自2kDa～20kDa。

19.根据权利要求18所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述PEG_a、PEG_b分子量选自2kDa、5kDa、10kDa或20kDa。

20.根据权利要求17所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述PEG_a、PEG_b的EO单元数选自2～70，且EO单元数相差不超过1。

21.根据权利要求20所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇具有通式(1)，其中L_a等于L_b，PEG_a、PEG_b具有相等的EO单元数。

22.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(4)所示：

其中，L₂为–CH₂–、–C(＝O)–或–C(＝S)–；

其中，M₉为–O–、–S–或–NH–。

23.根据权利要求22所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述两个PEG组分的分子量相同，且选自2kDa～20kDa，或EO单元数选自2～70。

24.根据权利要求22所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述R₀₁选自以下任一种结构：

(1)R₀₁为–CHO或其缩醛保护形式；M₉为–O–或–NH–；

(2)R₀₁为

或其呋喃保护形式；M₉为–O–或–NH–；

(3)R₀₁为–NH₂、或其被保护形式、或其盐形式；

(4)R₀₁为–COOH或其酯保护形式；M₉为–O–；

(5)R₀₁为–N₃；M₉为–O–或–NH–；

(6)R₀₁为–C≡CH或其被保护形式；M₉为–O–或–NH–。

25.根据权利要求22所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述Z具有1～10个碳原子，且选自以下任一种：

(1)Z选自亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合；

(2)Z含有醚键、硫醚键、酰胺键、酯键、一硫代酯键、二硫代酯键、尿烷键、一硫代氨基甲酸酯键、二硫代氨基甲酸酯键、碳酸酯键、一硫代碳酸酯键、二硫代碳酸酯键、三硫代碳酸酯键、二硫键、亚胺键、三氮唑基、4,5-二氢异恶唑连接基、

中任一种。

26.根据权利要求22所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L_c为–CH(R₂₀)–或L₅；

其中，R₂₀为H、–CH₃、–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)–CH₂CH₃、–Bn、–CH₂CH₂–SCH₃，其中Bn为苄基；

其中，L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子。

27.根据权利要求26所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构为通式(5)或通式(6)：

其中，j₁选自2～20的整数。

28.根据权利要求25所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L₂为亚甲基，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(7)所示：

其中，R₀₁选自醛基、缩醛基、马来酰亚胺基、呋喃保护的马来酰亚胺基、氨基、被保护的氨基、胺盐、羧基、酯保护的羧基、叠氮基、炔基、被保护的炔基、烯基中任一种。

29.根据权利要求28所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述R₀₁为醛基或马来酰亚胺基，所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法如下：

步骤一、以氨基缩醛化合物或呋喃保护的马来酰亚胺的氨基取代物F_source作为原料，与含被保护氨基的氮源试剂N_source进行偶合，形成含酰胺键的二价连接基L_d；脱除氨基保护基，得到一端为缩醛或呋喃保护的马来酰亚胺基，另一端为伯氨基的小分子中间体；

所述氮源试剂选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、NH₂-L₅-COOH的氨基被保护形式，C-端以羧基、酰氯、羧酸酯、活性羧酸酯中任一种形式存在；其中L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子；

步骤二、加入甲氧基聚乙二醇卤代物或磺酸酯进行第一次烷基化反应，或加入甲氧基聚乙二醇醛或酮进行还原烷基化反应，得到甲氧基聚乙二醇仲胺中间体；

步骤三、加入甲氧基聚乙二醇卤代物或磺酸酯进行第二次烷基化反应，或加入甲氧基聚乙二醇醛或酮进行加成反应；脱除醛基或马来酰亚胺基的保护基，得到通式(7)所示的支化聚乙二醇醛或支化聚乙二醇马来酰亚胺。

30.根据权利要求25所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L₂为羰基，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(8)所示：

其中，R₀₁选自醛基、缩醛基、马来酰亚胺基、呋喃保护的马来酰亚胺基、氨基、被保护的氨基、胺盐、羧基、酯保护的羧基、酰卤、酰胺、被保护的酰胺、酰肼、被保护的酰肼、叠氮基、炔基、被保护的炔基、烯基中任一种。

31.根据权利要求30所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述R₀₁为醛基或马来酰亚胺基，所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法如下：

步骤一、以氨基缩醛化合物或呋喃保护的马来酰亚胺的氨基取代物F_source作为原料，与含被保护氨基的氮源试剂N_source进行偶合，形成含酰胺键的二价连接基L_d；脱除氨基保护基，得到一端为缩醛或呋喃保护的马来酰亚胺基，另一端为伯氨基的小分子中间体；

所述氮源试剂选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、NH₂-L₅-COOH的氨基被保护形式，C-端以羧基、酰氯、羧酸酯、活性羧酸酯中任一种形式存在；其中L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子；

步骤二、加入甲氧基聚乙二醇卤代物或磺酸酯进行第一次烷基化反应，或加入甲氧基聚乙二醇醛或酮进行还原烷基化反应，得到甲氧基聚乙二醇仲胺中间体；

步骤三、加入甲氧基聚乙二醇羧酸、酰氯、羧酸酯或活性酯，进行酰胺化反应；脱除醛基或马来酰亚胺基的保护基，得到通式(8)所示的支化聚乙二醇醛或支化聚乙二醇马来酰亚胺。

32.根据权利要求1所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(9)所示：

其中，L₂为亚甲基或羰基；

其中，R₀₁为醛基、缩醛基、马来酰亚胺基、呋喃保护的马来酰亚胺基、氨基、被保护的氨基、胺盐、羧基、酯保护的羧基、酰卤、酰胺、被保护的酰胺、酰肼、被保护的酰肼、叠氮基、炔基、被保护的炔基、烯基中任一种。

33.根据权利要求32所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法如下：

步骤一、得到含伯氨基的小分子中间体IM1：小分子氮源试剂N_source含有叠氮基，小分子官能团源试剂F_source原料含有炔基，进行偶合反应，形成含三氮唑结构的二价连接基L_d；所述氮源试剂的N端裸露或被保护，N端被保护时，还脱除氨基保护基；

步骤二、加入甲氧基聚乙二醇卤代物或磺酸酯进行第一次烷基化反应，或加入甲氧基聚乙二醇醛或酮进行还原烷基化反应，得到甲氧基聚乙二醇仲胺中间体IM2；

步骤三、加入甲氧基聚乙二醇羧酸、酰氯、羧酸酯或活性酯，进行酰胺化反应；脱除醛基或马来酰亚胺基的保护基，得到通式(9)所示的支化聚乙二醇衍生物。

34.一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(3)所示：

其中，两个PEG_a由相同的C_1～20烃氧基封端，且两个PEG_a具有相同的分子量；L_a为二价连接基，连接PEG_a的另一个氧端；L_c为碳链连接基；L_d为二价连接基，含有经偶合反应生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁；R₀₁与L_d直接相连，或通过二价连接基Z相连；

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一：获得含有伯氨端基及官能团端D_F的小分子中间体IM1；所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R₀₁的基团；

步骤二：控制投料比，通过烷基化反应，将两个聚乙二醇链PEG_a一步偶合到小分子中间体IMI的氮源位置，氮源端基U_N转变为叔氮原子；R_a为能与F_N发生烷基化反应的基团；

步骤三：当D_F等于F时，上述所得产物即为通式(3)所示的结构，该步骤省略；当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(3)所示的结构。

步骤一

35.根据权利要求34所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述L_a选自以下任一种结构：

(1)L_a为C_1～12亚烷基；

(2)L_a含羰基，与PEG之间形成酯键；

(3)L_a含-CONH-，与PEG之间形成氨基甲酸酯键连接；

(4)L_a含-COO-，与PEG之间形成碳酸酯键连接。

36.一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(3)所示：

其中，PEG_a为C_1～20烃氧基封端的聚乙二醇组分，且两个PEG_a具有相同的分子量；L_a为二价连接基，与PEG_a形成酯键、氨基甲酸酯键或碳酸酯键连接；L_c为碳链连接基；L_d为二价连接基，含有经偶合反应生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁；R₀₁与L_d直接相连，或通过二价连接基Z相连；

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一、获得含有氮源端基F_N及官能团端D_F的小分子中间体IM1；其中，所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R₀₁的基团；其中F_N为伯氨基或仲氨基；

步骤二：

L_a与PEG_a形成酯键连接时，控制投料比，通过烷基化反应，将两分子含有连接基L_a的试剂(F₃-CH₂-R_a)偶合到小分子中间体IMI的氮源位置，F_N转变为叔氮原子，其中R_a为能与F_N发生烷基化反应的基团，F₃的端基为酯保护羧基；将酯基改造为羧基或酰氯(F₄)，再与两分子甲氧基聚乙二醇mPEG–OH发生缩合反应生成酯键连接；

L_a与PEG_a形成氨基甲酸酯键连接时，控制投料比，通过烷基化反应，将两分子含有连接基L_a的试剂(F₃-CH₂-R_a)偶合到小分子中间体IMI的氮源位置，F_N转变为叔氮原子，其中R_a为能与F_N发生烷基化反应的基团，F₃的端基为异氰酸酯基，F₄与F₃相同；再与两分子甲氧基聚乙二醇mPEG–OH发生缩合反应生成氨基甲酸酯键连接；

L_a与PEG_a形成碳酸酯键连接时，控制投料比，通过烷基化反应，将两分子含有连接基L_a的试剂(F₃-CH₂-R_a)偶合到小分子中间体IMI的氮源位置，F_N转变为叔氮原子，其中R_a为能与F_N生成碳酸酯键的基团，F₃的端基为被保护羟基，F₄为氧羰酰氯基；再与两分子甲氧基聚乙二醇mPEG–OH发生缩合反应生成碳酸酯键连接；

步骤三：当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(3)所示的结构；当D_F等于F时该步骤省略。

步骤一

步骤二

步骤三

37.一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(10)所示：

其中，PEG_a、PEG_b为相同或不同的聚乙二醇组分，各自独立，均由C_1～20烃基连接PEG组分的末端氧原子；L_a、L_b为相同或不同的二价连接基，各自独立，分别连接PEG_a、PEG_b的另一个氧端；

其中，L₃为亚甲基或羰基；

其中，R₀₁为甲羧基、甲酸酯基、酰卤、酰胺基、酰肼中任一种；

其中，PT为NH₂-PT-COOH的组成部分，NH₂-PT-COOH由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸、NH₂-L₅-COOH中至少两个分子缩合而成，且N-端不是肌氨酸；其中L₅为亚烷基、二价环烷基、芳撑中任一种、或任两种或两种以上的组合，且含有至少两个碳原子；

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一：获得NH₂-PT-COOH的酯保护中间体IM1；

步骤二：通过烷基化反应，将第一个聚乙二醇链PEG_a偶合到小分子中间体IMI的N-端，得到线性聚乙二醇中间体IM2，此时N-端转化为仲氮原子；

步骤三、通过烷基化反应或酰胺化反应将第二个聚乙二醇链PEG_b偶合到中间体IM2的仲氮原子上；

当R₀₁为甲酸酯基时，所得结构即单一功能化支化聚乙二醇羧酸酯；

当R₀₁为甲羧基时，通过水解反应脱除酯基保护，得到单一功能化支化聚乙二醇羧酸；

当R₀₁为酰卤时，脱除酯保护得到甲羧基，再改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰卤；

当R₀₁为酰胺时，对甲酸酯基用氨水改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰胺；

当R₀₁为酰肼时，对甲酸酯基用水合肼改性得到单一功能化支化聚乙二醇酰肼。

38.一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(12)所示：

其中，PEG_a为C_1～20烃氧基封端的聚乙二醇组分，且两个PEG_a具有相同的分子量；L_a为二价连接基；L₂为亚甲基、羰基或硫代羰基；L_c为碳链连接基，且当L_c中与支化氮原子相邻的碳为羰基、硫代羰基、氨羰基时，L₂为亚甲基；L_d不存在，或L_d为二价连接基且含有经偶合反应生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁；当L_d不存在时，R₀₁选自醛基、被保护的醛基、马来酰亚胺基、被保护的马来酰亚胺基、氨基、被保护的氨基、胺盐、羧基、酯保护的羧基、酰卤、酰胺、被保护的酰胺、酰肼、被保护的酰肼、叠氮基、炔基、被保护的炔基、烯基中任一种；

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一：获得具有支化氮端B_N及官能团端D_F的小分子中间体IM3；F₆为反应性基团，能与后续步骤的PEG_a-F₅中的反应性基团F₅发生偶合反应生成共价连接；氮源端基B_N的结构为

所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R₀₁的基团；

步骤二：通过偶合反应，将两个聚乙二醇链PEG_a通过F₅、F₆之间的偶合反应连接到小分子中间体IM3，形成两个聚乙二醇分支链，得到支化聚乙二醇中间体；

步骤三：当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(12)所示的结构；当D_F等于F时该步骤省略。

步骤一

步骤二

步骤三

39.根据权利要求38所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述步骤一通过以下任一种方式实现：

方式一：以含官能团端D_F的化合物F_source作为原料，与含支化氮端的氮源试剂N_source进行偶合，形成二价连接基L_d；所述氮源试剂的结构为

其中，F₆'为F₆或被保护的F₆；F₁、F₂为能反应生成二价连接基的官能团对；

当F₆'不等于F₆时，还进行脱保护，得到含有支化端基B_N及官能团端D_F的小分子中间体IM3；当F₆'等于F₆时，进行下一步骤；

步骤一

方式二：以含官能团端D_F的化合物F_source作为原料，与含支化端基的氮源试剂N_source进行偶合，形成二价连接基L_d；所述氮源试剂的结构为

其中，F₆'为F₆或被保护的F₆；F₂为能与仲氨基发生烷基化反应或缩合反应的官能团；

当F₆'不等于F₆时，还进行脱保护，得到含有支化端基B_N及官能团端D_F的小分子中间体IM3；当F₆'等于F₆时，进行下一步骤；

步骤一

方式三：以含官能团端D_F、反应性的支化氮端

的小分子作为原料或中间体，对两个反应性基团F₈进行改性，得到具有目标反应性基团F₆的小分子中间体IM3；其中，F₈为不同于F₆的反应性基团。

步骤一

40.一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(12)所示：

其中，PEG_a为C_1～20烃氧基封端的聚乙二醇组分，且两个PEG_a具有相同的分子量；L_a为二价连接基；L₂为亚甲基、羰基或硫代羰基；L_c为碳链连接基，当L_c中与支化氮原子相邻的碳为羰基、硫代羰基、氨羰基时，L₂为亚甲基；L_d不存在，或L_d为二价连接基且含有经偶合反应生成的共价连接基；基团F含有一个功能性端基R₀₁；当L_d不存在时，R₀₁选自醛基、被保护的醛基、马来酰亚胺基、被保护的马来酰亚胺基、氨基、被保护的氨基、胺盐、羧基、酯保护的羧基、酰卤、酰胺、被保护的酰胺、酰肼、被保护的酰肼、叠氮基、炔基、被保护的炔基、烯基中任一种；

所述单一功能化支化聚乙二醇是通过以下步骤制备的：

步骤一：支化聚乙二醇仲胺衍生物与含官能团端D_F的化合物F_source进行缩合反应，生成>N-L_c-的支化结构；所述D_F含有R₀₁或含有R₀₁的微变化形式；所述微变化形式指经过脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团中任一种化学过程，能够转变为R₀₁的基团；其中，F₂为能与仲氨基进行烷基化反应或缩合反应生成共价键的反应性基团；当L₂为羰基或硫代羰基时，L_c与支化N相邻的碳不为羰基、硫代羰基；

步骤二：当D_F不等于F时，经末端微修饰得到通式(12)所示的结构；当D_F等于F时该步骤省略。

41.一种单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构如通式(13)所示：

其中，两个PEG_a由相同的C_1～20烃氧基封端，且两个PEG_a具有相同的分子量；两个L_a为相同的C_1～24亚烃基，L_a选自亚烷基、二价环烷基、苯撑的任意组合；L_c为C_1～12亚烃基，选自亚烷基、二价环烷基、苯撑的任意组合；L_a、L_c各自独立；L_d不存在或L_d为含醚键、硫醚键、二价烷基氮中至少一种的二价连接基；R₀₁为-CHO或其缩醛结构；

通过以下步骤制备：

步骤一：由含两个被保护羟基的仲胺小分子(PG₄O-L_a-CH₂)₂NH与含ω-缩醛的卤代物或磺酸酯F₂-L_c-L_d-acetal进行烷基化反应，生成含两个被保护羟基的小分子中间体IM4，结构为(PG₄O-L_a-CH₂)₂N-L_c-L_d-acetal；其中，F₂为卤原子或磺酸酯基；

步骤二：脱除小分子中间体IM4中的两个羟基保护基，得到具有两个裸露羟基的小分子中间体IM5，结构为(HO-L_a-CH₂)₂N-L_c-L_d-acetal；

步骤三：小分子中间体IM5与碱组成共引发体系，引发环氧乙烷聚合，并用烷基封端，得到单一功能化支化聚乙二醇缩醛，结构为(X_a-PEG-L_a-CH₂)₂N-L_c-L_d-acetal；其中，X_a为C_1～20烃基；

当R₀₁为缩醛时，反应结束；当R₀₁为-CHO时还进行步骤四；

步骤四：脱除缩醛保护基得到通式(13)所示的单一功能化支化醛(X_a-PEG-L_a-CH₂)₂N-L_c-L_d-CHO。

42.根据权利要求41所述单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的结构为

其中，L_c为C_1～24亚烷基，R₀₁为-CHO；mPEG分子量为2kDa～20kDa。

43.根据权利要求1～42中任一项单一功能化支化聚乙二醇的制备方法，其特征在于，还对末端R₀₁进行官能化改性，引入不同的功能性端基。

44.根据权利要求1～42中任一项制备方法获得的单一功能化支化聚乙二醇，所述单一功能化支化聚乙二醇的末端功能性基团的修饰率大于95％。

45.根据权利要求44所述单一功能化支化聚乙二醇，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的末端功能性基团的修饰率大于98％。

46.根据权利要求44所述单一功能化支化聚乙二醇，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇的末端功能性基团的修饰率为99％～100％。

47.根据权利要求44所述的单一功能化支化聚乙二醇，其特征在于，所述单一功能化支化聚乙二醇选自以下任一结构：

其中，R₂₂选自–CH₃、–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)–CH₂CH₃、–Bn、–CH₂CH₂–SCH₃，其中Bn为苄基；

其中p为1～16的整数。

48.根据权利要求47所述的单一功能化支化聚乙二醇，其特征在于，所述两个mPEG满足以下任一种：

(1)均为多分散性，数均分子量选自2kDa～20kDa；

(2)均为单分散性，EO单元平均数选自2～70，且数量差不超过1。