CN108524505A - 用于细胞增殖相关病症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于细胞增殖相关病症的方法和组合物。本文描述了治疗和评估具有新活性突变体的受试者的方法。

Description

用于细胞增殖相关病症的方法和组合物
本申请是申请号为201080020176.3、发明名称为“用于细胞增殖相关病症的方法和组合物”且申请日为2010年3月12日的中国专利申请(PCT申请号为PCT/US2010/027253)的分案申请。
优先权要求
本申请要求2009年3月13日提交的U.S.S.N.61/160253；2009年3月16日提交的U.S.S.N.61/160664；2009年4月28日提交的U.S.S.N.61/173518；2009年5月22日提交的U.S.S.N.61/180609；2009年6月25日提交的U.S.S.N.61/220543；2009年7月22日提交的U.S.S.N.61/227649；2009年7月29日提交的U.S.S.N.61/229689；2009年10月21日提交的U.S.S.N.61/253820；和2009年12月4日提交的U.S.S.N.61/266929的优先权，各自的内容以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明涉及用于评估和治疗细胞增殖相关病症(例如，增殖病症，诸如癌症)的方法和组合物。
背景
异柠檬酸脱氢酶(也称作IDH)是参与柠檬酸循环的酶。它催化该循环的第三步：异柠檬酸的氧化脱羧，生成α-酮戊二酸(α-酮戊二酸或α-KG)和CO2，同时使NAD+转化为NADH。这是两步过程，其包括使异柠檬酸(仲醇)氧化成草酰琥珀酸(酮)，接着使β羧基脱羧为酮，形成α-酮戊二酸。所述酶的另一同种型催化相同的反应；然而，该反应与柠檬酸循环无关，在胞液以及线粒体和过氧物酶体中进行且使用NADP+而不是NAD+作为辅因子。
发明概述
本文公开的方法和组合物涉及由新活性突变酶(例如，突变的代谢途径酶)生成的新活性产物在疾病中所起的作用。发明人特别发现了与IDH突变体相关的新活性且具有所述新活性的产物在癌细胞中能够显著提高。本文公开了用于治疗患有病症或处于所述病症的风险中的受试者的方法和组合物及评估所述受试者的方法，所述病症例如是以在代谢途径酶中的新活性(例如，IDH新活性)为特征的细胞增殖相关病症。这类病症例如包括增殖病症，诸如癌症。发明人在本文中发现并公开了用于治疗以例如新活性、新活性蛋白质、新活性mRNA或新活性突变为特征的病症(例如癌症)的新型治疗剂。在实施方案中，治疗剂降低新活性或新活性产物的水平或改善新活性产物的作用。本文所述的方法也允许基于新活性基因型或表型鉴定受试者或鉴定用于所述受试者的治疗。该评估可以允许受试者与治疗最佳匹配，例如，其中受试者、治疗或二者的选择基于新活性基因型或表型的分析。例如，本文所述的方法可以允许选择治疗方案，所述治疗方案包括施用新型化合物(例如，本文公开的新型化合物)或已知化合物(例如，先前没有推荐用于所选病症的已知化合物)。在实施方案中，所述已知化合物降低新活性或新活性产物的水平或改善新活性产物的作用。本文所述的方法可以引导并提供用于选择和施用新型化合物或已知化合物或化合物的组合的基础，所述已知化合物或化合物的组合先前没有被推荐用于患有以关于代谢途径酶的体细胞新活性突变为特征的病症的受试者。在实施方案中，所述新活性基因型或表型可以充当生物标志物，它的存在表明应该施用新型或先前已知的化合物以治疗以关于代谢途径酶的体细胞新活性突变为特征的病症。本文中详细论述了具有导致产生2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)的新活性的IDH1的新活性突变体及相关病症。它们是本发明的实施方案的示例性但非限制性的实施例。
虽然不希望受理论束缚，但认为新活性产物(例如，2HG，例如R-2HG)的产生与消除之间的平衡在疾病中是重要的。新活性突变体(对于不同突变的不同程度)增加了新活性产物的水平，而其它过程(例如，在2HG(例如，R-2HG)的情况下，例如通过2HG脱氢酶的2HG的酶降解)降低了新活性产物的水平。不当的平衡与疾病有关。在实施方案中，在IDH1或IDH2上的新活性突变的最终结果导致新活性产物2HG(例如，R-2HG)在受影响细胞中的水平增加。
因此，一方面，本发明的特点在于一种治疗患有细胞增殖相关病症(例如，以有害的细胞增殖为特征的病症，例如癌症或癌症前期病症)的受试者的方法。所述细胞增殖相关病症以关于代谢途径酶的体细胞突变为特征。该突变与导致产生新活性产物的新活性有关。所述方法包括：向受试者施用治疗有效量的本文所述的治疗剂，由此来治疗所述受试者，所述治疗剂例如是降低由选定的或突变的体细胞等位基因编码的新活性产物的水平的治疗剂，例如代谢途径酶(新活性酶)的新活性的抑制剂；改善新活性产物的有害作用的治疗剂；或基于核酸的抑制剂，例如靶向新活性酶mRNA的dRNA。
在一个实施方案中，所述受试者为没有患有2-羟基戊二酸尿症或没有被诊断为患有2-羟基戊二酸尿症的受试者。
在一个实施方案中，所述受试者患有细胞增殖相关病症，例如癌症，其以由选定的或突变的等位基因编码的代谢途径酶的新活性为特征。
在一个实施方案中，所述受试者患有细胞增殖相关病症，例如癌症，其以通过由选定的或突变的等位基因编码的代谢途径酶的新活性形成的产物为特征。
在一个实施方案中，代谢途径选自导致脂肪酸生物合成的代谢途径、糖酵解、谷氨酰胺代谢、磷酸戊糖支路、核苷酸生物合成途径或脂肪酸生物合成途径。
在一个实施方案中，所述治疗剂为本文所述的治疗剂。
在一个实施方案中，所述方法包括基于患有以选定的或突变的等位基因、所述新活性或水平升高的新活性产物为特征的癌症选择受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于患有以通过由选定的或突变的等位基因编码的蛋白质的新活性形成的产物为特征的癌症选择受试者，例如，通过成像和/或光谱分析，例如基于磁共振的分析、例如MRI(磁共振成像)和/或MRS(磁共振光谱法)来测定例如在本文所述的IDH1等位基因2-羟基戊二酸(在本文中有时称为2HG)(例如R-2-羟基戊二酸(在本文中有时称为R-2HG))的情况下具有新活性的产物的存在、分布或水平。
在一个实施方案中，所述方法包括例如通过直接检查或评估受试者或从所述受试者得到的样本，例如组织、产物(例如，粪便、汗液、精液、呼气、头发或指甲)或体液(例如，血液(例如，血浆)、尿液、淋巴液或脑脊髓液或如本文公开来源的其它样本)(例如通过DNA测序、免疫分析或针对酶活性的测定)或接收关于所述受试者的这类信息来确认或测定癌症是以选定的或突变的等位基因为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括例如通过直接检查或评估受试者、新活性的水平或具有所述新活性的产物的水平或接收关于所述受试者的这类信息来进行确认或测定。在一个实施方案中，例如在本文所述的IDH1等位基因2HG(例如R-2HG)的情况下，例如通过成像方法(例如，通过基于磁共振的方法)来非侵害性地测定具有新活性的产物的存在、分布或水平。
在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用第二抗癌剂或疗法，例如手术切除或施用化学治疗剂。
另一方面，本发明的特点在于一种治疗患有细胞增殖相关病症(例如癌症前期病症或癌症)的受试者的方法。在一个实施方案中，所述受试者没有患有2-羟基戊二酸尿症或没有被诊断为患有2-羟基戊二酸尿症。所述细胞增殖相关病症以IDH(例如IDH1或IDH2)的体细胞等位基因(例如预选的等位基因或突变的等位基因)为特征，所述等位基因编码具有新活性的突变IDH(例如，IDH1或IDH2)酶。
在实施方案中，所述新活性为α羟基新活性。如本文所使用的α羟基新活性是指将α酮转化为α羟基的能力。在实施方案中，α羟基新活性随还原辅因子(例如NADPH或NADH)进行。在实施方案中，所述α羟基新活性为2HG新活性。如本文所使用的2HG新活性是指将α酮戊二酸转化为2-羟基戊二酸(在本文中有时称为2HG)，例如R-2-羟基戊二酸(在本文中有时称为R-2HG)的能力。在实施方案中，2HG新活性随还原辅因子(例如，NADPH或NADH)进行。在一个实施方案中，新活性酶(例如α羟基(例如2HG)新活性酶)可以作用于不止一种底物上，例如，不止一种α羟基底物上。
所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述类型的治疗剂，由此治疗所述受试者。
在一个实施方案中，所述治疗剂导致新活性产物(例如α羟基新活性产物，例如2HG，例如R-2HG)的水平降低。
在一个实施方案中，所述方法包括施用降低新活性(例如2HG新活性)的治疗剂。在一个实施方案中，所述方法包括施用具有新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的突变IDH蛋白质(例如，突变IDH1或突变IDH2蛋白质)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂包括表24a或表24b的化合物或具有本文所述的式(X)或式(XI)的结构的化合物。
在一个实施方案中，所述治疗剂包括基于核酸的治疗剂，例如dsRNA，例如本文所述的dsRNA。
在一个实施方案中，所述治疗剂为抑制剂，例如多肽、肽或小分子(例如，小于1,000道尔顿的分子)或适体(aptomer)，所述抑制剂与IDH1突变体或野生型亚单位结合且例如通过抑制二聚体(突变IDH1亚单位的同二聚体或突变体和野生型亚单位的异二聚体)的形成而抑制新活性。在一个实施方案中，所述抑制剂为多肽。在一个实施方案中，所述多肽相对于突变酶的新活性起显性负作用(dominant negative)。所述多肽可以对应于全长IDH1或其片段。所述多肽不必与野生型IDH1的相应残基相同，但在实施方案中，其与野生型IDH1具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同源性。
在一个实施方案中，所述治疗剂例如通过竞争与突变酶结合而降低IDH(例如IDH1或IDH2)新活性突变蛋白质对于NADH、NADPH或二价金属离子(例如Mg2+或Mn2+)的亲和性或降低NADH、NADPH或二价金属离子(例如Mg2+或Mn2+)的水平或可用性。在一个实施方案中，所述酶通过用Ca2+替代Mg2+或Mn2+而被抑制。
在一个实施方案中，所述治疗剂为降低IDH(例如IDH1或IDH2)的新活性(例如2HG新活性)水平的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为降低具有IDH(例如IDH1或IDH2突变体)的新活性的突变体产物的水平的抑制剂，例如其降低了2HG(例如R-2HG)的水平。
在一个实施方案中，所述治疗剂为如下抑制剂：
例如特异性抑制IDH(例如IDH1或IDH2)的新活性，例如本文所述的新活性，例如2HG新活性；或
抑制野生型活性和IDH(例如IDH1或IDH2)的新活性(例如本文所述的新活性，例如2HG新活性)二者。
在一个实施方案中，所述治疗剂为基于以下选择的抑制剂：
例如特异性抑制IDH(例如IDH1或IDH2)的新活性(例如本文所述的新活性，例如2HG新活性)；或
抑制野生型活性和IDH(例如IDH1或IDH2)的新活性(例如本文所述的新活性，例如2HG新活性)二者。
在一个实施方案中，所述治疗剂为降低突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质或mRNA的量的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为与突变IDH(例如IDH1或IDH2)mRNA直接相互作用(例如，其与突变IDH(例如IDH1或IDH2)mRNA结合)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质直接相互作用(例如，其与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质结合)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为例如通过与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质相互作用(例如与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质结合)来降低新活性酶活性的量的抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂不是抗体。
在一个实施方案中，所述治疗剂为作为小分子且与突变RNA(例如突变IDH1或IDH2mRNA(例如突变IDH1mRNA))相互作用，例如与突变RNA(例如突变IDH1或IDH2mRNA(例如突变IDH1mRNA))结合)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质直接相互作用(例如与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质结合)或与突变IDH mRNA(例如IDH1或IDH2mRNA)直接相互作用(例如与突变IDH mRNA(例如IDH1或IDH2mRNA)结合)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述IDH为IDH1且所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。在IDH1中与2HG新活性有关的突变包括在残基132处的突变，例如R132H、R132C、R132S、R132G、R132L或R132V(例如R132H或R132C)。
在一个实施方案中，所述IDH为IDH2且所述IDH2突变体的新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。在IDH2中与2HG新活性有关的突变包括在残基172处的突变，例如R172K、R172M、R172S、R172G或R172W。
本文所述的治疗方法可以包括评估新活性基因型或表型。可以将获得并分析样本的方法和在本文中的其它地方，例如在标题为“评估样本和/或受试者的方法”的部分中描述的受试者的体内分析与该方法相组合。
在一个实施方案中，在治疗之前或治疗之后，所述方法包括评估细胞增殖相关病症的生长、尺寸、重量、侵害性、分期或其它表型。
在一个实施方案中，在治疗之前或治疗之后，所述方法包括评估IDH(例如IDH1或IDH2)α羟基新活性基因型(例如2HG基因型)或α羟基新活性表型(例如2HG表型，例如R-2HG表型)。评估所述α羟基(例如2HG)基因型可以包括测定是否存在具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1或IDH2突变，例如具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的本文公开的突变。如本文所使用的α羟基新活性表型(例如2HG表型，例如R-2HG表型)是指α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平、α羟基新活性(例如2HG新活性)的水平或具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的突变酶(或相应mRNA)的水平。该评估可以通过本文所述的方法进行。
在一个实施方案中，可以在治疗之前和治疗之后评估受试者以测定细胞增殖相关病症是否以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)为特征。
在一个实施方案中，可以例如通过成像和/或光谱分析(例如，基于磁共振的分析，例如MRI和/或MRS)例如在治疗之前或治疗之后分析受试者体内的癌症(例如胶质瘤或脑肿瘤)以测定其是否以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括例如通过直接检查或评估受试者或得自受试者的样本或接收关于受试者的这类信息来评估以细胞增殖相关病症为特征的受试者(例如细胞，例如癌细胞)的IDH(例如IDH1或IDH2)基因型或α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)表型。(如在本文中的其它地方更详细地描述，所述评估可以例如通过DNA测序、免疫分析、例如由光谱分析(例如基于磁共振的分析，例如MRI和/或MRS测量)、诸如血清或脊髓液分析的样本分析(诸如血清或脊髓液分析)评估α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平或通过分析手术材料(例如通过质谱)来进行)。在实施方案中，该信息用以确定或确认增殖相关病症(例如癌症)是以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)为特征。在实施方案中，该信息用以测定或确认细胞增殖相关病症(例如癌症)是以本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因(例如在残基132处具有突变，例如His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu(例如His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu，更具体地是His或Cys)的IDH1等位基因)或在残基172处具有突变(例如K、M、S、G或W)的IDH2等位基因为特征。
在一个实施方案中，在开始治疗之前和/或之后，通过本文所述的方法评估或监测受试者，例如分析α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平例如以选择、诊断或预测受试者、选择抑制剂或评估对疾病的治疗或进展的响应。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为CNS的肿瘤(例如胶质瘤)、白血病(例如AML或ALL，例如B-ALL或T-ALL)、前列腺癌、纤维肉瘤、副神经节瘤、或脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征(例如B-ALL或T-ALL、前列腺癌或脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征)，且所述评估为：评估α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平；或评估IDH1或IDH2突变蛋白质的新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的存在、分布或水平。
在一个实施方案中，所述病症不是实体肿瘤。在一个实施方案中，所述病症为在诊断或治疗时没有坏死部分的肿瘤。在一个实施方案中，所述病症为在诊断或治疗时其中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的肿瘤细胞携带具有2HG新活性的IHD(例如IDH1或IDH2)突变的肿瘤。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征的癌症，例如本文所述的癌症。在一个实施方案中，所述肿瘤的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物2HG(例如R-2HG)的水平增加。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以有害(即，增加)水平的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为CNS的肿瘤，例如胶质瘤，例如，其中所述肿瘤以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。胶质瘤包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因编码在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu(例如His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu)或在Yan等中描述的任何残基。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有His的IDH1。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Ser的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有A(或除C以外的任何其它核苷酸)或在核苷酸位置395处具有A(或除G以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为C394A、C394G、C394T、G395C、G395T或G395A突变；具体地为根据序列SEQ ID NO:5的C394A或G395A突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有胶质瘤的受试者，其中所述癌症的特征以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu，更具体为His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu；或His或Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu，更具体地为His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu；或His或Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有纤维肉瘤或副神经节瘤的受试者，其中癌症以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有纤维肉瘤或副神经节瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有纤维肉瘤或副神经节瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为局部的或转移性的前列腺癌，例如前列腺腺癌，例如其中所述癌症以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。在一个实施方案中，所述癌症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加。
例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因编码在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Kang等，2009,Int.J.Cancer,125:353-355中描述的任何残基(例如His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu)。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有His或Cys的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有T(或除C以外的任何其它核苷酸)或在核苷酸位置395处具有A(或除G以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为根据序列SEQ ID NO:5的C394T或G395A突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者，其中所述癌症是以本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His或Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His或Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有前列腺癌的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为血液癌症，例如白血病，例如AML或ALL，其中所述血液癌症是以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。在一个实施方案中，所述癌症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为急性淋巴母细胞性白血病(例如成人或儿科形式)，例如其中所述急性淋巴母细胞性白血病(在本文中有时称为ALL)是以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。所述ALL可以是例如B-ALL或T-ALL。在一个实施方案中，所述癌症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，2α羟基新活性产物(例如HG，例如R-2HG)的水平增加。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因是在残基132处(SEQ ID NO:8)具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Kang等中描述的任何残基，更具体地为His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Cys的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有T(或除C以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为根据序列SEQ ID NO:5的C394T突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者，所述ALL以本文所述的IDH1等位基因(例如根据序列SEQ ID NO:8在残基132处具有Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为急性髓细胞性白血病(例如成人或儿科形式)，例如其中所述急性髓细胞性白血病(在本文中有时称为AML)是以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。在一个实施方案中，所述癌症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因为在残基132处(SEQID NO:8)具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Kang等中描述的任何残基。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Cys、His或Gly，更具体为在残基132处具有Cys的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有T(或除C以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为根据序列SEQ ID NO:5的C394T突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有急性髓细胞性淋巴母细胞性白血病(AML)的受试者，所述急性髓细胞性淋巴母细胞性白血病(AML)以本文所述的IDH1等位基因(例如根据序列SEQ ID NO:8在残基132处具有Cys、His或Gly，更具体地为在残基132处具有Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys、His或Gly，更具体为在残基132处具有Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有急性髓细胞性淋巴母细胞性白血病(AML)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有急性髓细胞性淋巴母细胞性白血病(AML)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法还包括评估所述受试者NRAS或NPMc基因突变的存在。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征，例如，其中所述脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。在一个实施方案中，所述病症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如，2HG，例如R-2HG)的水平增加。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因是在残基132处(SEQ ID NO:8)具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Kang等中描述的任何残基，更具体为His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Cys的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有T(或除C以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为根据序列SEQ ID NO:5的C394T突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者，所述脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征以本文所述的IDH1等位基因(例如根据序列SEQ ID NO:8在残基132处具有Cys、His或Gly，更具体为在残基132处具有Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys、His或Gly，更具体为在残基132处具有Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为胶质瘤，所述胶质瘤以与α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的IDH2的突变或预选的等位基因为特征。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的所述任何残基，更具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有胶质瘤的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser，更具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser；或Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser；更具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser；或Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为前列腺癌，例如前列腺腺癌，所述前列腺癌以与α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的IDH2的突变或预选的等位基因为特征。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的所述任何残基，更具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为以与α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的IDH2的突变或预选的等位基因为特征的ALL，例如B-ALL或T-ALL。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的所述任何残基。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为AML，所述AML以与α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的IDH2的突变或预选的等位基因为特征。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基，更具体为Lys、Gly、Met或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Gly的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有AML的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly或Met(更具体为Lys或Met)的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly或Met、更具体为Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有AML的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有AML的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为以IDH2的突变或预选等位基因为特征的脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ IDNO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基，更具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Gly的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly或Met，在具体的实施方案中为Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly或Met，在具体的实施方案中为Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者。
在一个实施方案中，具有所述新活性的产物为2HG(例如R-2HG)，其充当代谢物。在另一实施方案中，具有所述新活性的产物为2HG(例如R-2HG)，其充当毒素，例如致癌物。
在一些实施方案中，本文所述的方法相对于治疗癌症的其它已知方法来说可以导致副作用降低。
本文所述的治疗剂和受试者评估方法可以与其它治疗模式组合，例如与本领域已知的治疗组合。
在一个实施方案中，所述方法包括对所述受试者提供第二治疗，例如，手术切除、放射或施用化疗剂，例如，施用烷基化剂。施用所述第二治疗(或确立治疗水平)可以：在用所述抑制剂开始或治疗之前(或在确立所述抑制剂的治疗水平之前)开始；在用所述抑制剂开始或治疗之后(或在确立所述抑制剂的治疗水平之后)开始；或可与所述抑制剂同时施用，例如以使两者同时达到治疗水平。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为CNS肿瘤，例如胶质瘤，且第二疗法包括施用以下一种或多种：辐射；烷基化剂，例如替莫唑胺(temozolomide)，例如或BCNU；或HER1/EGFR酪氨酸激酶的抑制剂，例如厄洛替尼(erlotinib)，例如
第二疗法(例如在胶质瘤情况下)可以包括在脑中植入BCNU或卡莫司汀(carmustine)，例如植入膜片。
第二疗法(例如在胶质瘤情况下)可以包括施用伊马替尼(imatinib)，例如
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为前列腺癌且第二疗法包括以下一种或多种：雄激素切除；施用微管稳定剂，例如多烯紫衫醇(docetaxol)，例如或施用拓扑异构酶II抑制剂，例如米托蒽醌(mitoxantrone)。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为ALL，例如B-ALL或T-ALL，且第二疗法包括以下一种或多种：
诱导期治疗，包括施用以下一种或多种：类固醇；微管组装抑制剂，例如长春新碱；降低天冬酰胺酸(例如天冬酰胺酶)的可利用性的药剂；蒽环霉素(anthracycline)；或抗代谢物，例如甲氨喋呤(例如鞘内甲氨喋呤)或6-巯基嘌呤；
巩固期治疗，包括施用以下一种或多种：上文对于诱导期所列出的药物；抗代谢物，例如鸟嘌呤类似物，例如6-硫鸟嘌呤；烷基化剂，例如环磷酰胺(cyclophosphamide)；抗代谢物，例如AraC或阿糖胞苷(cytarabine)；或拓扑异构酶I的抑制剂，例如依托泊苷(etoposide)；或
维持期治疗，包括施用上文对于诱导期或巩固期治疗所列出的药物中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为AML且第二疗法包括施用以下一种或多种：拓扑异构酶II的抑制剂，例如柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、拓扑替康(topotecan)或米托蒽醌；拓扑异构酶I的抑制剂，例如依托泊苷；或抗代谢物，例如AraC或阿糖胞苷。
另一方面，本发明的特点在于一种评估(例如诊断)受试者(例如没有患有2-羟基戊二酸尿症或没有被诊断为患有2-羟基戊二酸尿症的受试者)的方法。所述方法包括分析与所述受试者的新活性基因型或表型相关的参数，例如分析以下一种或多种：
a)新活性产物(例如α羟基新活性的产物，例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平，例如产物2HG(例如R-2HG)的水平增加(如本文所使用的具有α羟基新活性的产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加或类似术语(例如，新活性产物的水平增加)是指与参考物(例如，在缺乏IDH突变(例如IDH1或IDH2突变)的另外类似细胞中或在得自没有所述突变的受试者的组织或产物中见到的水平)比较起来增加(如本文使用的涉及具有α羟基新活性的产物的水平的术语增加和升高互换使用))；
b)IDH1或IDH2突变蛋白质的新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的存在、分布或水平；
c)具有新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的新活性突变蛋白质(例如IDH(例如IDH1或IDH2)突变蛋白质)或相应RNA的存在、分布或水平；或
d)赋予新活性的选定的体细胞等位基因或突变(例如IDH，例如IDH1或IDH2)在得自所述受试者的以细胞增殖相关病症为特征的细胞中的存在，所述体细胞等位基因或突变编码具有新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的蛋白质，例如为本文公开的等位基因，
由此评估所述受试者。
在一个实施方案中，分析包括执行程序(例如试验)以提供关于a-d中的一个或多个的数据或信息，例如进行如下方法，其在样本中、受试者中或在所述分析中使用的装置或试剂中引起物理变化，或其导致形成代表所述数据的图像。可以将获得并分析样本的方法和在本文中的其它地方，例如在标题为“评估样本和/或受试者的方法”的部分中描述的受试者的体内分析与该方法相组合。在另一实施方案中，分析包括从来自另一方的此类试验接收数据或信息。在一个实施方案中，所述分析包括从得自另一方的此类试验接收数据或信息，且所述方法包括响应所述数据或信息对受试者施用治疗。
如本文所述，所述评估可以用于许多应用中，例如用于诊断、预后、分期、测定治疗功效、专利选择(patent selection)或药物选择中。
因此，在一个实施方案中，例如响应a-d中的一个或多个的分析，方法还包括：
诊断受试者，例如诊断受试者患有细胞增殖相关病症，例如以有害的细胞增殖为特征的病症，例如癌症或癌症前期病症；
将受试者分期，例如测定细胞增殖相关病症(例如以有害的细胞增殖为特征的病症，例如癌症或癌症前期病症)的分期；
为受试者提供预后，例如为细胞增殖相关病症(例如以有害的细胞增殖为特征的病症，例如癌症或癌症前期病症)提供预后；
测定治疗的功效，例如化疗剂、放射或手术的功效；
测定用治疗剂(例如本文所述的抑制剂)的治疗的功效；
针对细胞增殖相关病症(例如以有害的细胞增殖为特征的病症，例如癌症或癌症前期病症)的治疗选择受试者。该选择可以基于对降低新活性的需要或对改善与新活性相关的病状或由新活性引起的病状的需要。例如，如果测定受试者患有以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加或具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的突变IDH1或IDH2为特征的细胞增殖相关病症(例如癌症或癌症前期病症)，则针对用本文所述的治疗剂(例如突变体的新活性(例如将α-酮戊二酸转化为2HG，例如R-2HG)的抑制剂(例如小分子或基于核酸的抑制剂))的治疗选择受试者；
使所述分析与结果或预后相关；
提供用于分析(评估以其为基础)的值，例如与α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平相关的参数的值；
为受试者的治疗提供推荐；或
记录所述方法(例如在进行所述方法的过程中进行的测量)的结果或来自所述方法的输出，和任选地将所述记录传递给一方(例如，受试者)、保健提供者或为受试者的治疗支付的机构(例如政府、保险公司或其它第三方支付者)。
如本文所述，所述评估可以提供许多决策或治疗可以其为基础的信息。
因此，在一个实施方案中，评估的结果(例如，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加、IDH(例如IDH1或IDH2)新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的存在、具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH(例如IDH1或IDH2)突变蛋白质(或相应RNA)的存在、具有α羟基新活性(2HG新活性)的IDH(例如IDH1或IDH2)的突变体等位基因(例如本文公开的等位基因)的存在)指示：
细胞增殖相关病症，例如癌症，例如它指示原发性或转移性病变；
细胞增殖相关病症的分期；
细胞增殖相关病症的预后或结果，例如它指示较低侵袭形式的病症(如癌症)。例如，在胶质瘤情况下，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在可以指示较低侵袭形式的癌症；
治疗的功效，例如化疗剂、放射或手术的功效；
对本文公开的疗法的需要，例如对抑制本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2)新活性突变体的新活性的需要。在一个实施方案中，相对较高的水平(或突变体的存在)与对抑制本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2)突变体的新活性的需要有关；或
对治疗作出响应。该结果可以用作临床响应的非侵害性生物标志物。例如，升高的水平可以预示胶质瘤患者的较佳后果(例如，较长的预期寿命)。
如本文所述，所述评估可供于选择受试者。
因此，在一个实施方案中，所述方法包括例如响应a-d中的一个或多个的分析而选择例如用于治疗的受试者。可以基于本文所述的基础选择受试者，例如基于：
所述受试者处于在患有细胞增殖相关病症(例如白血病，诸如AML或ALL，例如B-ALL或T-ALL)或肿瘤病变(例如胶质瘤或前列腺肿瘤)的细胞中高于的正常水平的α羟基新活性产物(例如2-羟基戊二酸(例如R-2HG)的风险中或具有高于所述正常水平的α羟基新活性产物(例如2-羟基戊二酸(例如R-2HG)；
所述受试者患有以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的选定的IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因(例如IDH1或IDH2突变)为特征的增殖相关病症；
所述受试者具有选定的IDH等位基因(例如选定的IDH1或IDH2等位基因)；具有α羟基新活性(例如2HG新活性)；
所述受试者患有增殖相关病症；
所述受试者需要本文所述类型的治疗剂或能够得益于本文所述类型的治疗剂；
所述受试者需要抑制α羟基新活性(例如2HG新活性)的化合物或能够得益于所述化合物；
所述受试者需要降低α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平的化合物或能够得益于所述化合物。
在一个实施方案中，评估包括例如对于用抗肿瘤药的治疗选择受试者，确认或测定受试者具有增加的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)或增加的α羟基新活性(例如2HG新活性)或受试者需要抑制本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2)突变体的新活性。
如本文所述，通过本文所述的方法提供的评估允许选择最佳治疗方案。
因此，在一个实施方案中，所述方法包括例如响应a-d中的一个或多个的分析而选择对于受试者的治疗，例如在本文公开的基础上选择治疗。所述治疗可以是施用本文公开的治疗剂。所述治疗可以基于以下选择：
其可用于治疗以α羟基新活性(例如2HG新活性)、具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1或IDH2突变蛋白质(或相应RNA)中的一种或多种为特征的病症；
其可用于治疗在得自受试者的以细胞增殖相关病症为特征的细胞中的IDH(例如IDH1或IDH2)的选定的体细胞等位基因或突变(例如本文公开的等位基因)为特征的病症，所述选定的体细胞等位基因或突变编码具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的蛋白质；
其降低α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平；
其降低α羟基新活性(例如2HG新活性)的水平。
在一个实施方案中，评估包括例如选择治疗的受试者。
在实施方案中，所述治疗是施用本文公开的治疗剂。
所述方法也可以包括例如用响应在所述方法中进行的评估或基于所述评估而选择的治疗来治疗受试者。
因此，在一个实施方案中，所述方法包括例如响应a-d中的一个或多个的分析而对受试者施用治疗，例如施用本文所述类型的治疗剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂包括表24a或表24b的化合物或具有下述的式(X)或(XI)的结构的化合物。
在一个实施方案中，所述治疗剂包括核酸，例如dsRNA，例如本文所述的dsRNA。
在一个实施方案中，所述治疗剂为抑制剂，例如多肽、肽或小分子(例如，小于1,000道尔顿的分子)或适体(aptomer)，所述抑制剂与IDH1或IDH2突变体(例如与IDH1突变体结合的适体)或野生型亚单位结合且例如通过抑制二聚体(例如，突变IDH1或IDH2亚单位的同二聚体(例如，突变IDH1亚单位的同二聚体)或突变体和野生型亚单位的异二聚体)的形成而抑制新活性。在一个实施方案中，所述抑制剂为多肽。在一个实施方案中，所述多肽相对于突变酶的新活性起显性负作用。所述多肽可以对应于全长IDH1或IDH2或其片段(例如，所述多肽对应于全长IDH1或其片段)。所述多肽不必与野生型IDH1或IDH2(例如野生型IDH1)的相应残基相同，但在实施方案中，其与野生型IDH1或IDH2(例如，野生型IDH1)具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同源性。
在一个实施方案中，所述治疗剂例如通过竞争结合突变酶而降低IDH(例如IDH1或IDH2)新活性突变蛋白质对于NADH、NADPH或二价金属离子(例如Mg2+或Mn2+)的亲和性或降低NADH、NADPH或二价金属离子(例如Mg2+或Mn2+)的水平或可利用性。在一个实施方案中，通过用Ca2+替代Mg2+或Mn2+而抑制所述酶。
在一个实施方案中，所述治疗剂为降低IDH(例如IDH1或IDH2)的新活性(例如2HG新活性)的水平的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为降低具有IDH(例如IDH1或IDH2突变体)的新活性的突变体产物的水平的抑制剂，例如，其降低了2HG(例如R-2HG)的水平。
在一个实施方案中，所述治疗剂为如下抑制剂：
例如特异性地抑制IDH(例如IDH1或IDH2)的新活性，例如本文所述的新活性，例如2HG新活性；或
抑制IDH(例如IDH1或IDH2)的野生型活性和新活性(例如本文所述的新活性，例如2HG新活性)二者。
在一个实施方案中，所述治疗剂为基于以下选择的抑制剂：
例如特异性地抑制IDH(例如IDH1或IDH2)的新活性(例如本文所述的新活性，例如2HG新活性)；或
抑制IDH(例如IDH1或IDH2)的野生型活性和新活性(例如本文所述的新活性，例如2HG新活性)二者。
在一个实施方案中，所述治疗剂为降低突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质或mRNA的量的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为与突变IDH(例如IDH1或IDH2)mRNA直接相互作用(例如，其与突变IDH(例如IDH1或IDH2)mRNA结合)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质直接相互作用(例如，其与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质结合)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为例如通过与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质相互作用(例如与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质结合)来降低新活性酶活性的量的抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂不是抗体。
在一个实施方案中，所述治疗剂为作为小分子且与突变RNA(例如突变IDH1mRNA相互作用(例如与突变RNA(例如突变IDH1mRNA)结合)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂为与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质直接相互作用(例如与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质结合)或与突变IDH mRNA(例如IDH1或IDH2mRNA)直接相互作用(例如与突变IDH mRNA(例如IDH1或IDH2mRNA)结合)的抑制剂。
在一个实施方案中，施用所述治疗剂。
在一个实施方案中，所述治疗：例如特异性地抑制IDH1或IDH2的新活性(例如，IDH1的新活性)，例如本文所述的新活性；或抑制IDH1或IDH2的野生型活性和新活性(例如IDH1的新活性，例如本文所述的新活性)二者。在一个实施方案中，通过本文所述的方法随后评估或监测受试者，例如分析α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平例如以评估对疾病的治疗或进展的响应。
在一个实施方案中，基于以下选择所述治疗：例如特异性地抑制IDH1或IDH2的新活性(例如IDH1的新活性)，例如α羟基新活性，例如2HG新活性；或抑制IDH1或IDH2的野生型活性和新活性(例如，IDH1的新活性，例如本文所述的新活性)二者。
在一个实施方案中，所述方法包括测定除IDH1或IDH2的突变以外的突变的可能性。在实施方案中，相对高水平的2HG(例如R-2HG)指示另一突变。
在一个实施方案中，该实施方案包括对受试者选择或施用治疗，所述受试者：
还没有对于所述受试者治疗细胞增殖相关病症且所选择或施用的治疗为初始或一线治疗；
已经对于细胞增殖相关进行治疗且所选择或施用的治疗引起现有治疗改变；
已经对于细胞增殖相关进行治疗且所选择治疗引起现有治疗继续；或
已经对于细胞增殖相关病症进行治疗且所选择或施用的治疗例如与在评估之前施用的治疗或在缺乏升高水平的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的情况下施用的治疗相比不同。
在一个实施方案中，该实施方案包括对受试者选择或施用治疗，所选择或施用的治疗可以包括：
包括以不同(例如更大(或更小))剂量(例如，与在评估之前施用的治疗或将在缺乏升高水平的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的情况下施用的治疗相比不同)施用治疗剂的治疗；
包括以不同频率(例如更高或更低频率地或者根本不)(例如，与在评估之前施用的治疗或将在缺乏升高水平的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的情况下施用的治疗相比不同)施用治疗剂的治疗；
包括以不同治疗设置(例如，从治疗方案添加或删除第二治疗)(例如，与在评估之前施用的治疗或将在缺乏升高水平的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的情况下施用的治疗相比不同)施用治疗剂的治疗。
本文所述的评估受试者的方法可以包括评估新活性基因型或表型。可以将获得并分析样本的方法和在本文中的其它地方，例如在标题为“评估样本和/或受试者的方法”的部分中描述的受试者的体内分析与该方法相组合。
在一个实施方案中，所述方法包括：
使受试者(例如没有患有2-羟基戊二酸尿症的受试者)经历成像和/或光谱分析，例如基于磁共振的分析，例如MRI和/或MRS，例如成像分析，以提供例如与所述受试者体内的肿瘤(例如，胶质瘤)相关的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平的测定；
任选地在有形介质中储存关于该测定的参数，例如图像或关于得自成像分析的图像的值；和
响应于该测定，进行以下一者或多者：使该测定与后果或预后相关；提供后果或预后的指示；提供对于分析(评估以其为基础)的值，例如α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平；提供对于受试者的治疗的推荐；对于受试者选择治疗过程，例如本文所述的治疗过程，例如选择包括抑制突变IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因的新活性(例如本文所述的新活性)的治疗过程；对受试者施用治疗过程，例如本文所述的治疗过程，例如包括抑制突变IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因的新活性(例如本文所述的新活性)的治疗过程；和记录所述方法或在所述方法的过程中进行的测量(例如，上述者中的一者或多者)的结果和/或将关于上述者中的一者或多者的记录传递给一方，例如受试者、保健提供者或支付受试者的治疗的机构(例如政府、保险公司或其它第三方付款人)。
在一个实施方案中，所述方法包括例如通过直接检查或评估受试者或从所述受试者得到的样本，例如组织或体液(例如，血液(例如，血浆)、尿液、淋巴液或脑脊髓液)(例如通过DNA测序或免疫分析或评估α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG的存在、分布或水平))或接收关于所述受试者的这类信息来确认或测定所述受试者患有以如下为特征的癌症：本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因，例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu的IDH1等位基因，在具体的实施方案中，在残基132处具有His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu的IDH1等位基因或在残基132处具有His或Cys的IDH1等位基因；或在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser的IDH2等位基因。
在一个实施方案中，在治疗之前或治疗之后，所述方法包括评估细胞增殖相关病症的生长、尺寸、重量、侵害性、分期或其它表型。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为CNS肿瘤(例如胶质瘤)、白血病(例如AML或ALL，例如B-ALL或T-ALL)、前列腺癌或脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征且所述评估为a或b。在一个实施方案中，所述方法包括评估样本，例如本文所述的样本，例如组织(例如癌症样本)或体液(例如血清或血液)的α新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的增加。
在一个实施方案中，使受试者经历MRS且所述评估包括评估如磁共振测定的与2HG(例如R-2HG)相关或与2HG(例如R-2HG)对应的峰的存在或升高的量。例如，可分析受试者在约2.5ppm下的信号的存在和/或强度以测定所述受试者体内2HG(例如R-2HG)的存在和/或量。
在一个实施方案中，所述方法包括从所述受试者获得样本并分析所述样本，或例如通过使所述受试者成像并任选地在计算机上形成图像表示来分析所述受试者。
在一个实施方案中，将所述分析的结果与参考值相比较。
在一个实施方案中，测定与2HG(例如R-2HG)的存在、分布或水平相关的参数的值。可以将其与参考值相比较，所述参考值例如为没有异常存在、水平或分布的参考受试者的值，例如，没有具有IDH(例如IDH1或IDH2)突变，具有本文所述的新活性的参考受试者细胞。
在一个实施方案中，所述方法包括测定是否存在与2HG新活性相关的IDH(例如IDH1或IDH2)突变等位基因。例如，在IDH1的情况下，可以测定在残基132处与2HG新活性相关的突变的存在。例如，在IDH2的情况下，可以测定在残基172处与2HG新活性相关的突变的存在。所述测定可以包括对来自受影响细胞的编码相关氨基酸的核酸(例如基因组DNA或cDNA)进行测序。该突变可以是缺失、插入、重排或取代。该突变可以包含单个核苷酸，例如单个取代，或不止一个核苷酸，例如缺失不止一个核苷酸。
在一个实施方案中，该方法包括在以细胞增殖相关病症为特征的细胞中测定IDH1基因的位置394或395处的序列，或测定该IDH1基因中氨基酸残基132(SEQ ID NO:8)的同一性。
在一个实施方案中，所述方法包括例如通过DNA测序在以细胞增殖相关病症为特征的细胞中测定IDH2基因的位置172处的氨基酸序列。
在一个实施方案中，具有所述新活性的产物为2-HG(例如R-2HG)，其充当代谢物。在另一实施方案中，具有所述新活性的产物为2HG(例如R-2HG)，其充当毒素，例如致癌物。
在一个实施方案中，所述病症不是实体肿瘤。在一个实施方案中，所述病症为在诊断或治疗时没有坏死部分的肿瘤。在一个实施方案中，所述病症为在诊断或治疗时其中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的肿瘤细胞携带具有2HG新活性的IHD(例如IDH1或IDH2)突变的肿瘤。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征的癌症，例如本文所述的癌症。在一个实施方案中，所述肿瘤的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物2HG(例如R-2HG)的水平增加。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为CNS的肿瘤，例如胶质瘤，例如，其中所述肿瘤以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。胶质瘤包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因编码在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Yan等中描述的任何残基。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有His的IDH1。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Ser的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有A(或除C以外的任何其它核苷酸)或在核苷酸位置395处具有A(或除G以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为C394A、C394G、C394T、G395C、G395T或G395A突变，具体为根据序列SEQID NO:5的C394A或G395A突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有胶质瘤的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu(例如His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu；或His或Cys)的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH1等位基因，例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu(例如His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu；或His或Cys)的IDH1等位基因为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖病症为纤维肉瘤或副神经节瘤，其中癌症以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述细胞增殖病症为纤维肉瘤或副神经节瘤，其中癌症以本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述细胞增殖病症为纤维肉瘤或副神经节瘤，其中所述癌症以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为局部的或转移性的前列腺癌，例如前列腺腺癌，例如其中所述癌症以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。在一个实施方案中，所述癌症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加。
例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因编码在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Kang等，2009,Int.J.Cancer,125:353-355中描述的任何残基(例如His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu)。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有His或Cys的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有T(或除C以外的任何其它核苷酸)或在核苷酸位置395处具有A(或除G以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为根据序列SEQ ID NO:5的C394T或G395A突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者，其中所述癌症以本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His或Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His或Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有前列腺癌的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为血液癌症，例如白血病，例如AML或ALL，其中所述血液癌症是以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。在一个实施方案中，所述癌症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加。在一个实施方案中，所述方法包括评估血清或血液样本的增加的α新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为急性淋巴母细胞性白血病(例如成人或儿科形式)，例如其中所述急性淋巴母细胞性白血病(在本文中有时称为ALL)是以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。所述ALL可以是例如B-ALL或T-ALL。在一个实施方案中，所述癌症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，2α羟基新活性产物(例如HG，例如R-2HG)的水平增加。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因为在残基132处(SEQ ID NO:8)具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Kang等中描述的任何残基(例如His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu)。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Cys的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有T(或除C以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为根据序列SEQ ID NO:5的C394T突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者，所述ALL以本文所述的IDH1等位基因(例如根据序列SEQ ID NO:8在残基132处具有Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为急性髓细胞性白血病(例如成人或儿科形式)，例如，其中所述急性髓细胞性白血病(在本文中有时称为AML)是以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。在一个实施方案中，所述癌症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因为在残基132处(SEQID NO:8)具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Kang等中描述的任何残基(例如His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu)。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Cys、His或Gly，具体为Cys的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有T(或除C以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为根据序列SEQ ID NO:5的C394T突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有急性髓细胞性淋巴母细胞性白血病(AML)的受试者，所述急性髓细胞性淋巴母细胞性白血病(AML)以本文所述的IDH1等位基因(例如根据序列SEQ ID NO:8在残基132处具有Cys、His或Gly，具体为Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys、His或Gly，具体为Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有急性髓细胞性淋巴母细胞性白血病(AML)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有急性髓细胞性淋巴母细胞性白血病(AML)的受试者。在一个实施方案中，所述方法包括评估血清或血液样本的增加的α新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)。
在一个实施方案中，所述方法还包括评估所述受试者的NRAS或NPMc基因突变的存在。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征，例如，其中所述脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征以具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1体细胞突变体(例如本文所述的突变体)为特征。在一个实施方案中，所述病症的特征在于，与相同类型的未患病细胞相比，α羟基新活性产物(例如，2HG，例如R-2HG)的水平增加。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因为在残基132处(SEQ ID NO:8)具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Kang等中描述的任何残基，具体为His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Cys的IDH1。
在一个实施方案中，所述IDH1等位基因在核苷酸位置394处具有T(或除C以外的任何其它核苷酸)。在一个实施方案中，所述等位基因为根据序列SEQ ID NO:5的C394T突变。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者，所述脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征以本文所述的IDH1等位基因(例如根据序列SEQ ID NO:8在残基132处具有Cys的IDH1等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以具有本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有Cys的IDH1等位基因)为特征的癌症选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者。在一个实施方案中，所述方法包括评估血清或血液样本的增加的α新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为胶质瘤，所述胶质瘤以与α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的IDH2的突变或预选的等位基因为特征。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的所述任何残基，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有胶质瘤的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser；或Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser；具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser；或Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有胶质瘤的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为前列腺癌，例如前列腺腺癌，所述前列腺癌以与α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的IDH2的突变或预选的等位基因为特征。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的所述任何残基，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有前列腺癌(例如前列腺腺癌)的受试者。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为以与α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的IDH2的突变或预选的等位基因为特征的ALL，例如B-ALL或T-ALL。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有ALL(例如B-ALL或T-ALL)的受试者。在一个实施方案中，所述方法包括评估血清或血液样本的增加的α新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为AML，所述AML以与α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的IDH2的突变或预选的等位基因为特征。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有AML的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有AML的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有AML的受试者。在一个实施方案中，所述方法包括评估血清或血液样本的增加的α新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)。
在一个实施方案中，所述细胞增殖相关病症为以IDH2的突变或预选的等位基因为特征的脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQIDNO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述方法包括选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者，其中所述癌症以具有本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys或Met的IDH2等位基因)为特征的癌症选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者。
在一个实施方案中，所述方法包括基于以α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平增加为特征的癌症选择患有脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征的受试者。在一个实施方案中，所述方法包括评估血清或血液样本的增加的α新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)。
另一方面，本发明的特点在于一种本文所述的抑制剂(例如，小分子或基于核酸的抑制剂)的药物组合物。
在一个实施方案中，可以使用突变蛋白质特异试剂(例如特异性地结合IDH突变蛋白质的抗体，例如特异性地结合IDH1-R132H突变蛋白质的抗体)来检测新活性突变酶，参见，例如Y.Kato等，“A monoclonal antibody IMab-1specifically recognizes IDH1R132H,the most common glioma-derived mutation”(Kato,Biochem.Biophys.Res.Commun.(2009)描述，其全文在此以引用的方式并入。
另一方面，本发明的特点在于一种评估候选化合物的例如抑制突变酶的新活性、例如用作抗增殖或抗癌剂的能力的方法。在一个实施方案中，所述突变酶为IDH，例如IDH1或IDH2突变体，例如本文所述的突变体。在一个实施方案中，所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。所述方法包括：
任选地供应候选化合物；
使所述候选化合物与具有新活性的突变酶或者与在本文中被称为替代(proxy)酶的另一种酶(具有在本文中称为替代活性的活性，其与所述新活性相同)接触(或与包含其的细胞或细胞裂解物接触)；和
评估所述候选化合物调节(例如抑制或促进)所述新活性或所述替代活性的能力，
由此评估所述候选化合物。
在一个实施方案中，所述突变酶为突变IDH1，例如本文所述的IDH1突变体，且所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。IDH1的与2HG新活性相关的突变包括在残基132处的突变，例如R132H、R132C、R132S、R132G、R132L或R132V，更具体为R132H或R132C。
在一个实施方案中，所述突变酶为突变IDH2，例如本文所述的IDH2突变体，且所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。IDH2的与2HG新活性相关的突变包括在残基172处的突变，例如R172K、R172M、R172S、R172G或R172W。
在一个实施方案中，所述方法包括评估候选化合物抑制新活性或替代活性的能力。
在一个实施方案中，所述方法还包括评估候选化合物抑制非突变或野生型酶活性的正向反应的能力，例如，在IDH(例如IDH1或IDH2)情况下，该正向反应为异柠檬酸转化为α-酮戊二酸(或它的中间体，包括还原的羟基中间体)。
在一个实施方案中，所述接触步骤包括使候选化合物与细胞或其细胞裂解物接触，其中所述细胞包含具有新活性的突变酶或具有所述活性的酶。
在一个实施方案中，所述细胞包含突变IDH1基因的突变或预选的等位基因。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因编码在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因可以编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Yan等中描述的任何其它残基，具体为His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu。
在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有His的IDH1。
在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Ser的IDH1。
在一个实施方案中，根据序列SEQ ID NO:8(参见图2和图21)，所述等位基因为Arg132His突变或Arg132Ser突变。
在一个实施方案中，所述细胞包含突变IDH2基因的突变或预选的等位基因。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述细胞包含突变IDH基因(例如突变IDH1或IDH2基因)的异源拷贝。(异源拷贝是指通过基因工程操作引入或形成的拷贝。)
在一个实施方案中，用编码本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2，例如在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1)的核酸序列转染(例如，瞬时或稳定转染)或转导(例如，瞬时或稳定转导)细胞。在一个实施方案中，对所述IDH(例如IDH1或IDH2)进行表位附加，例如myc-附加。
在一个实施方案中，所述细胞(例如癌细胞)对于IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因是非突变或野生型。所述细胞可以包含异源IDH1或IDH2突变体。
在一个实施方案中，所述细胞为培养的细胞，例如初生细胞、次生细胞或细胞系。在一个实施方案中，所述细胞为癌细胞，例如胶质瘤细胞(例如胶质母细胞瘤细胞)、前列腺癌细胞、白血病细胞(例如ALL(例如B-ALL或T-ALL)细胞或AML细胞)或以脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征为特征的细胞。在实施方案中，所述细胞为293T细胞、U87MG细胞或LN-18细胞(例如ATCC HTB-14或CRL-2610)。
在一个实施方案中，所述细胞得自受试者，例如患有癌症的受试者，所述癌症例如为以本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因，例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu，具体为His或Cys的IDH1等位基因；或在残基172处(SEQID NO:10)具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser的IDH2等位基因为特征的癌症。
在一个实施方案中，所述评估步骤包括例如通过LC-MS评估α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)例如在细胞裂解物或培养基中的存在和/或量。
在一个实施方案中，所述评估步骤包括评估α羟基新活性(例如2HG新活性)在细胞裂解物或培养基中的存在和/或量。
在一个实施方案中，所述方法还包括例如通过LC-MS评估一种或多种TCA代谢物(例如柠檬酸、α-KG、琥珀酸、延胡索酸和/或苹果酸)(例如作为对照物)的存在/量。
在一个实施方案中，所述方法还包括例如通过分光光度计评估NADPH的氧化状态，例如在340nm下的吸光度。
在一个实施方案中，所述方法还包括评估候选化合物抑制第二酶活性(例如非突变或野生型酶活性的正向反应)的能力，例如，在IDH1或IDH2(例如IDH1)情况下，该正向反应为异柠檬酸转化为α-酮戊二酸(或它的中间体，包括还原羟基中间体)。
在一个实施方案中，所述候选化合物为小分子、多肽、肽、基于碳水化合物的分子或适体(例如，核酸适体或肽适体)。所述方法可以广泛使用且可以例如用作头道筛中的一种或多种，以确认由此或其它方法或筛生产的候选物，或通常引导药物发现或药物候选优化。
在一个实施方案中，所述方法包括在第二测定中评估(例如确认)候选化合物(例如，在所述评估步骤中符合预定水平的抑制作用的候选化合物)抑制新活性或替代活性的能力。
在一个实施方案中，所述第二测定包括重复基本方法的接触和/或评估步骤中的一个或多个。
在另一实施方案中，所述第二测定与所述第一测定不同。例如，在第一测定可以使用细胞或细胞裂解物或其它非完整动物模型的情况下，第二测定可以使用动物模型，例如肿瘤移植模型，例如具有移植在其中的IDH(例如IDH1或IDH2)突变细胞或肿瘤的小鼠。例如，具有转染的IDH(例如IDH1或IDH2)新活性突变体的U87细胞或胶质瘤(例如，胶质母细胞瘤)细胞可以作为异种移植物而植入并在测定中使用。初生人胶质瘤或AML肿瘤细胞可以移植到小鼠中以允许肿瘤繁殖并在测定中使用。具有IDH1或IDH2突变和/或其它突变(例如p53无效突变)的基因工程改造小鼠模型(GEMM)也可以用于测定中。
在一个实施方案中，所述方法包括：
任选地供应候选化合物；
使所述候选化合物与细胞接触，所述细胞包含编码在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1(例如IDH1R132H)或在残基172处具有除Arg以外的残基的IDH2(具体为，在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1)的核酸序列(例如异源序列)；和
通过LC-MS评估α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)在细胞裂解物或培养基中的存在和/或量，
由此评估所述化合物。
在一个实施方案中，将所述评估的结果与参考值相比较，所述参考值例如为对照细胞(例如具有插入其中的IDH1或IDH2(例如IDH1)的野生型或非突变拷贝的细胞)中产物(例如，α羟基新活性产物，例如2HG，例如R-2HG)的水平。
在另一方面，本发明的特点在于一种评估候选化合物的例如抑制编码具有新活性的突变酶的RNA的能力(例如用作抗增殖或抗癌剂)方法。在一个实施方案中，所述突变酶为IDH(例如IDH1或IDH2)突变体，例如本文所述的突变体。在一个实施方案中，所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。所述方法包括：
任选地供应所述候选化合物，例如基于核酸的抑制剂(例如dsRNA(例如siRNA或shRNA)、反义或微RNA)；
使所述候选化合物与编码IDH(例如IDH1或IDH2)的RNA(例如mRNA)(例如编码具有新活性的突变酶的RNA)接触(或与包含其的细胞或细胞裂解物接触)；和
评估所述候选化合物抑制所述RNA的能力，由此评估所述候选化合物。抑制RNA是指例如使RNA裂解或另外失活。
在一个实施方案中，所述RNA编码IDH(例如IDH1或IDH2)野生或突变蛋白质的全部或部分与第二蛋白质(例如报告蛋白，例如荧光蛋白，例如绿色或红色荧光蛋白)的融合物。
在一个实施方案中，所述突变酶为突变IDH1，例如本文所述的IDH1突变体，且所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。
在一个实施方案中，所述突变酶为突变IDH2，例如本文所述的IDH2突变体，且所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。
在一个实施方案中，所述接触步骤包括使所述候选化合物与细胞或其细胞裂解物接触，其中所述细胞包含编码IDH(例如IDH1或IDH2)，例如具有新活性的突变IDH(例如IDH1或IDH2)酶)的RNA。
在一个实施方案中，所述细胞包含突变IDH1基因的突变或预选的等位基因。例如，在一个实施方案中，所述IDH1等位基因编码在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1。例如，所述等位基因可以编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Yan等中描述的任何其它残基，具体为His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu。
在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有His的IDH1。
在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Ser的IDH1。
在一个实施方案中，根据序列SEQ ID NO:8(参见图2和图21)，所述等位基因为Arg132His突变或Arg132Ser突变。
在一个实施方案中，所述细胞包含突变IDH2基因的突变或预选的等位基因。例如，在一个实施方案中，所述IDH2等位基因编码在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处的Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述细胞包含野生型或突变IDH基因(例如野生型或突变IDH1或IDH2基因)的异源拷贝。(异源拷贝是指通过基因工程操作引入或形成的拷贝。)在一个实施方案中，所述异源基因包括与报告蛋白(例如荧光蛋白，例如绿色或红色荧光蛋白)的融合物。
在一个实施方案中，用编码本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2，例如在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1或在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2(例如在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1))的核酸序列转染(例如，瞬时或稳定转染)或转导(例如，瞬时或稳定转导)细胞。在一个实施方案中，对IDH(例如IDH1或IDH2)进行表位附加，例如myc-附加。
在一个实施方案中，对于IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因，所述细胞(例如癌细胞)是非突变或野生型。所述细胞可以包含异源IDH1或IDH2突变体。
在一个实施方案中，所述细胞为培养的细胞，例如初生细胞、次生细胞或细胞系。在一个实施方案中，所述细胞为癌细胞，例如胶质瘤细胞(例如胶质母细胞瘤细胞)、前列腺癌细胞、白血病细胞(例如ALL(例如B-ALL或T-ALL)细胞或AML细胞)或以脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征为特征的细胞。在实施方案中，所述细胞为293T细胞、U87MG细胞或LN-18细胞(例如ATCC HTB-14或CRL-2610)。
在一个实施方案中，所述细胞得自受试者，例如患有癌症的受试者，所述癌症例如为以本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因，例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu，具体为His或Cys的IDH1等位基因为特征的癌症。在一个实施方案中，所述癌症以在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser，具体为Lys、Gly、Met、Trp或Ser的IDH2等位基因为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括第二测定，且所述第二测定包括重复基本方法的接触和/或评估步骤中的一个或多个。
在另一实施方案中，所述第二测定与所述第一测定不同。例如，在第一测定可以使用细胞或细胞裂解物或其它非完整动物模型的情况下，第二测定可以使用动物模型。
在一个实施方案中，候选物的功效通过其对报告蛋白活性的影响来评估。
在另一方面，本发明的特点在于一种评估候选化合物的例如抑制编码具有新活性的突变酶的RNA转录的能力(例如用作抗增殖或抗癌剂)的方法。在一个实施方案中，所述突变酶为IDH(例如IDH1或IDH2)突变体，例如本文所述的突变体。在一个实施方案中，所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。所述方法包括：
任选第供应所述候选化合物，例如小分子、多肽、肽、适体、基于碳水化合物的分子或基于核酸的分子；
使所述候选化合物与包含细胞或细胞裂解物的体系接触；和
评估所述候选化合物抑制IDH(例如IDH1或IDH2)RNA的翻译(例如)的能力，
由此评估所述候选化合物。
在一个实施方案中，所述体系包含编码IDH(例如IDH1或IDH2)野生型或突变蛋白质的全部或部分与第二蛋白质(例如报告蛋白，例如荧光蛋白，例如绿色或红色荧光蛋白)的融合物的基因。
在一个实施方案中，所述突变酶为突变IDH1，例如本文所述的IDH1突变体，且所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。
在一个实施方案中，所述突变酶为突变IDH2，例如本文所述的IDH2突变体，且所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性。
在一个实施方案中，所述体系包含野生型或突变IDH基因(例如野生型或突变IDH1或IDH2基因)的异源拷贝。(异源拷贝是指通过基因工程操作引入或形成的拷贝。)在一个实施方案中，所述异源基因包括与报告蛋白(例如荧光蛋白，例如绿色或红色荧光蛋白)的融合物。
在一个实施方案中，对于IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因，所述细胞(例如癌细胞)是非突变或野生型。所述细胞可以包含异源IDH1或IDH2突变体。
在一个实施方案中，所述细胞为培养的细胞，例如初生细胞、次生细胞或细胞系。在一个实施方案中，所述细胞为癌细胞，例如胶质瘤细胞(例如胶质母细胞瘤细胞)、前列腺癌细胞、白血病细胞(例如ALL(例如B-ALL或T-ALL)细胞或AML细胞)或以脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征为特征的细胞。在实施方案中，所述细胞为293T细胞、U87MG细胞或LN-18细胞(例如ATCC HTB-14或CRL-2610)。
在一个实施方案中，所述细胞得自受试者，例如患有癌症的受试者，所述癌症例如为以本文所述的IDH(例如IDH1或IDH2)等位基因，例如在残基132处(SEQ ID NO:8)具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu，具体为His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu的IDH1等位基因为特征的癌症。在一个实施方案中，所述癌症以在残基172处(SEQ ID NO:10)具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser的IDH2等位基因为特征。
在一个实施方案中，所述方法包括第二测定且所述第二测定包括重复所述方法。
在另一实施方案中，所述第二测定与所述第一测定不同。例如，在第一测定可以使用细胞或细胞裂解物或其它非整体动物模型的情况下，第二测定可以使用动物模型。
在一个实施方案中，候选物的功效通过其对报告蛋白活性的影响来评估。
在另一方面，本发明的特点在于一种在动物模型中评估本文所述的候选化合物(例如治疗剂或抑制剂)的方法。所述候选化合物可以为例如小分子、多肽、肽、适体、基于碳水化合物的分子或基于核酸的分子。所述方法包括使候选物与动物模型接触并且评估所述动物模型。
在一个实施方案中，评估包括：
测定化合物对动物的一般健康的影响；
测定所述化合物对所述动物的体重的影响；
测定所述化合物对肝功能(例如肝酶)的影响；
测定所述化合物对所述动物的心血管系统的影响；
测定所述化合物对神经功能(例如神经肌肉控制或响应)的影响；
测定所述化合物对进食或饮水的影响；
测定所述化合物在所述动物中的分布；
测定所述化合物在所述动物中或在所述动物的组织或器官中的持久性，例如测定血浆半衰期；或
测定所述化合物对所述动物中选定的细胞的影响；
测定所述化合物对肿瘤(例如内源性肿瘤或由引入来自相同或不同物种的细胞而产生的肿瘤)的生长、尺寸、重量、侵害性或其它表型的影响。
在一个实施方案中，所述动物为非人灵长类动物，例如猕猴或黑猩猩。
在一个实施方案中，所述动物为啮齿类动物，例如大鼠或小鼠。
在一个实施方案中，所述动物为大型动物，例如，除了非人灵长类动物外，狗或猪。
在一个实施方案中，记录该评估并任选地传递给另一方。
在一方面，本发明提供一种评估或加工治疗剂(例如本文中提到的治疗剂，例如导致具有新活性的IDH(例如IDH1或IDH2)突变体的产物的水平降低的治疗剂)的方法。在一个实施方案中，所述新活性为α羟基新活性，例如2HG新活性，且α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的水平降低。
所述方法包括：
例如通过试验样本提供与治疗剂的性质相关的参数(例如抑制α-酮戊二酸到2-羟基戊二酸(即2HG)，例如R-2-羟基戊二酸(即R-2HG)的转化的能力)的值(例如试验值)，和
任选地提供对所述参数测定的值是否符合预选标准(例如存在或存在于预选范围内)的测定，
由此评估或加工所述治疗剂。
在一个实施方案中，所述治疗剂由政府机构(例如FDA)批准用于人类。
在一个实施方案中，所述参数与抑制2HG新活性的能力相关，且例如所述治疗剂为与IDH1或IDH2蛋白质结合且降低α羟基新活性(例如2HG新活性)的抑制剂。
在一个实施方案中，所述参数与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质的水平相关，且例如所述治疗剂为降低IDH1或IDH2突变蛋白质的水平的抑制剂。
在一个实施方案中，所述参数与编码突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质的RNA的水平相关，且例如所述治疗剂降低编码IDH1或IDH2突变蛋白质的RNA(例如mRNA)的水平。
在一个实施方案中，所述方法包括使所述治疗剂与突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质(或相应RNA)接触。
在一个实施方案中，所述方法包括提供对参数测定的值与参考值的比较，由此评估所述治疗剂。在一个实施方案中，所述比较包括测定对所述治疗剂测定的试验值与参考值是否具有预选的关系，例如测定其是否符合所述参考值。该值未必是数值，而是例如可以仅为活性是否存在的指示。
在一个实施方案中，所述方法包括测定试验值是否等于或大于参考值，其是否小于或等于参考值，或其是否属于一定范围(一个或两个终点包括在内或排除在外)内。在一个实施方案中，可以例如在计算机可读记录中记录试验值或是否符合预选标准的指示。
在一个实施方案中，根据是否符合预选标准而采取判断或步骤，例如将含有治疗剂或成批治疗剂的样本归类、选择、接受或舍弃、分发或保留、加工成药物产品、运送、移送到不同场所、配制、标记、包装、接触容器或放入容器(例如不透气或不透液的容器)、分发到商业、或销售或标价出售，或制定或改变记录以反映该测定。例如，基于测定的结果或是否存在活性，或在与参考标准的比较时，例如如刚才描述可以加工从其中取得样本的批料。
活性的存在或水平的评估可以显示治疗剂是否符合参考标准。
在一个实施方案中，本文公开的方法和组合物从工艺观点上来看可以用于例如监测或确保批次间的一致性或品质，或相对于参考值(例如预选值)评估样本。
在一个实施方案中，所述方法可以用以测定试验批次的治疗剂是否可以预期具有性质中的一种或多种。这类性质可以包括在治疗剂的产品插页中所列的性质、在概要(例如US Pharmacopea)中出现的性质或管理机构(例如FDA)对于商业用途要求的性质。
在一个实施方案中，所述方法包括测试治疗剂对IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质的野生型活性的影响，并且提供测定的值是否符合预选标准(例如存在或存在于预选范围内)的测定。
在一个实施方案中，所述方法包括：
使作为具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1的抑制剂的治疗剂与具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1突变体接触，
测定与α羟基新活性(例如2HG新活性)的抑制相关的值，和
比较所测定的值与参考值，例如对α羟基新活性(例如2HG新活性)的抑制的一系列值。在一个实施方案中，所述参考值为FDA要求值，例如分发标准。
在一个实施方案中，所述方法包括：
使作为编码具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的突变IDH1的mRNA的抑制剂的治疗剂与编码具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的IDH1突变体的mRNA接触，
测定与所述mRNA的抑制相关的值，和
比较所测定的值与参考值，例如对所述mRNA的抑制的一系列值。在一个实施方案中，所述参考值为FDA要求值，例如分发标准。
在一方面，本发明的特点在于一种评估治疗剂(例如本文提及的治疗剂)的样本的方法，其包括接收关于所述治疗剂的活性的数据；提供包括所述数据且任选地包括一批治疗剂的标识符的记录；将所述记录提交给决策者，例如政府机构，例如FDA；任选地，从所述决策者接收讯息；任选地，基于来自决策者的讯息判断是否分发销售该批治疗剂。在一个实施方案中，所述方法还包括分发或另外加工(例如如本文所述)样本。
在另一方面，本发明的特点在于一种为用于患有细胞增殖相关病症的受试者的用本文所述的治疗剂(例如IDH(例如IDH1或IDH2)新活性的抑制剂)的治疗选择支付种类的方法。所述方法包括：
提供(例如接收)受试者是否对增加水平的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)或新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)、具有新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的突变IDH1或IDH2(或相应RNA)或突变IDH(例如IDH1或IDH2)体细胞基因(例如本文所述的突变体)为阳性的评估，以及
进行以下的至少一者：(1)如果所述受试者为阳性，则选择第一支付种类，和(2)如果所述受试者不为阳性，则选择第二支付种类。
在一个实施方案中，将该选择记录例如在病历系统中。
在一个实施方案中，所述方法包括评估受试者是否对增加水平的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)或新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)为阳性。
在一个实施方案中，所述方法包括请求所述评估。
在一个实施方案中，通过本文所述的方法对受试者进行所述评估。
在一个实施方案中，所述方法包括例如通过计算机、光盘、电话、传真、电子邮件或信件将该选择传递给另一方。
在一个实施方案中，所述方法包括制定或批准对于所述治疗的支付。
在一个实施方案中，支付由一方给第二方。在一些实施方案中，第一方不是受试者。在一些实施方案中，第一方选自第三方付款人、保险公司、雇主、雇主发起的健康计划、HMO或政府机构。在一些实施方案中，第二方选自受试者、保健提供者、治疗医师、HMO、医院、政府机构或销售或供应药物的机构。在一些实施方案中，第一方为保险公司且第二方选自受试者、保健提供者、治疗医师、HMO、医院、政府机构或销售或供应药物的机构。在一些实施方案中，第一方为政府机构且第二方选自受试者、保健提供者、治疗医师、HMO、医院、保险公司或销售或供应药物的机构。
如本文所使用的细胞增殖相关病症为以有害的细胞增殖为特征的病症或以引起有害的细胞增殖的倾向为特征的病症(有时称为癌症前期病症)。以有害的细胞增殖为特征的病症的实例包括癌症，例如CNS的肿瘤，例如胶质瘤。胶质瘤包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤。其它实例包括血液癌症，例如白血病，例如AML(例如成人或儿科形式)或ALL(例如B-ALL或T-ALL(例如成人或儿科形式))；局部的或转移性的前列腺癌，例如前列腺腺癌、纤维肉瘤和副神经节瘤；具体为白血病，例如AML(例如成人或儿科形式)或ALL(例如B-ALL或T-ALL(例如成人或儿科形式))；局部的或转移性的前列腺癌，例如前列腺腺癌。以引起有害的细胞增殖的倾向为特征的病症的实例包括脊髓发育不良或脊髓发育不良综合征，其为由骨髓血细胞的低效生成(或发育不良)和转化到AML的风险为标志的血液病状的各种集合。
如本文所使用，特异性地抑制新活性(和类似措辞)是指与野生型酶活性相比突变酶新活性受到显著更大程度的抑制。例如，“特异性地抑制突变IDH1(或IDH2)的2HG新活性”是指与野生型IDH1(或IDH2)活性的正向反应(异柠檬酸到α酮戊二酸的转化)相比2HG新活性受到显著更大程度的抑制。在实施方案中，所述新活性被抑制得比野生型活性多至少2、5、10或100倍。在实施方案中，对IDH(例如IDH1或IDH2)的2HG新活性具有特异性的抑制剂也将抑制另一种脱氢酶，例如苹果酸脱氢酶。在其它实施方案中，所述特异性抑制剂确实抑制其它脱氢酶，例如苹果酸脱氢酶。
如本文所使用的以突变或等位基因为特征的细胞增殖相关病症(例如癌症)是指具有相当大数量的携带突变或等位基因的细胞的细胞增殖相关病症。在一个实施方案中，至少10％、25％、50％、75％、90％、95％或99％的细胞增殖相关病症细胞(例如，癌细胞)或例如得自肿瘤或得自受影响的血细胞的癌细胞的代表性平均或典型样本携带突变或等位基因的至少一种拷贝。以具有2HG新活性的突变IDH(例如突变IDH1或突变IDH2)为特征的细胞增殖相关病症是示例性的。在一个实施方案中，所述突变或等位基因以所指示的频率作为杂合体存在。
本文使用的“SNP”为在基因组(或其它共用序列)中的单个核苷酸(A、T、C或G)在物种成员之间(或在个体中配对的染色体之间)不同时出现的DNA序列变化。
如本文所使用的受试者可以是人类或非人受试者。非人受试者包括非人灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)或其它非人动物。
本发明的一个或多个实施方案的细节在以下说明书中阐述。从说明书和附图以及权利要求将显而易见本发明的其它特点、目的和优势。
附图简述
图1描绘pET41a-IDH1的DNA序列验证和相对于公开的IDH1 CDS的比对。IDH1(CDS)的序列对应于SEQ ID NO:5。pET41a-IDH1的序列对应于SEQ ID NO:6，且“共有”序列对应于SEQ ID NO:7。
图2描绘根据SEQ ID NO:8的R132S和R132H突变体的DNA序列验证。图21中提供IDH1(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。
图3描绘野生型IDH1蛋白质在Ni-琼脂糖柱上的分离。
图4描绘在Ni柱分级之前和之后野生型IDH1在SDS凝胶上的蛋白质分析。T：总蛋白质；I：不溶部分；S：可溶部分；L：用于上样在Ni-柱上的样本。图中的数字指示部分的号码。收集部分#17-#27用于进一步纯化。
图5A描绘野生型IDH1蛋白质通过SEC柱S-200的分离。
图5B描绘在S-200柱分级之前和之后野生型IDH1在SDS凝胶上的蛋白质分析。M：分子量标准；Ni：在S-200之前的镍柱部分；S200：得自SEC柱的部分。
图6描绘突变R132S蛋白质在Ni-琼脂糖柱上的分离。
图7描绘在Ni柱分级之前和之后突变R132S在SDS凝胶上的蛋白质分析。M：蛋白质分子量标准(KDa)：116、66.2、45、35、25、18.4、14.4；T：总细胞蛋白质；So：可溶部分；In：不溶部分；Ft：穿透液(flow through)。#3-#7指示相应洗脱部分的号码。
图8A描绘突变R132S蛋白质通过SEC柱S-200的分离。
图8B描绘在S-200柱分级之后突变R132S在SDS凝胶上的蛋白质分析。M：分子量标准；R132S：得自SEC柱的部分。
图9描绘突变R132H蛋白质在Ni-琼脂糖柱上的分离。
图10描绘在Ni柱分级之前和之后突变R132H在SDS凝胶上的蛋白质分析。M：蛋白质分子量标准(KDa)：116、66.2、45、35、25、18.4、14.4；T：总细胞蛋白质；So：可溶部分；In：不溶部分；Ft：穿透液；#5-#10指示相应洗脱部分的号码；Ni：一起得自Ni-琼脂糖柱，池#5至#10的样本。
图11A描绘突变R132H蛋白质通过SEC柱S-200的分离。
图11B描绘在S-200柱分级之后突变R132H在SDS凝胶上的蛋白质分析。M：分子量标准；R132H：得自SEC柱的部分。
图12A描绘在异柠檬酸到α-酮戊二酸的氧化脱羧中IDH1野生型的Michaelis-Menten曲线。
图12B描绘在异柠檬酸到α-酮戊二酸的氧化脱羧中R132H突变酶的Michaelis-Menten曲线。
图12C描绘在异柠檬酸到α-酮戊二酸的氧化脱羧中R132S突变酶的Michaelis-Menten曲线。
图13A描绘野生型IDH1的α-KG抑制作用。
图13B描绘R132H突变酶的α-KG抑制作用。
图13C描绘R132S突变酶的α-KG抑制作用。
图14描绘在α-酮戊二酸到2-羟基戊二酸的转化中的IDH1野生型、R132H和R132S。
图15A描绘R132H突变酶的底物-浓度速度曲线。
图15B描绘R132S突变酶的底物-浓度速度曲线。
图16描绘在有NADH时，α-酮戊二酸到2-羟基戊二酸的转化中的IDH1野生型、R132H和R132S。
图17A描绘对于IDH1野生型的草酰苹果酸抑制作用。
图17B描绘对于R132H的草酰苹果酸抑制作用。
图17C描绘对于R132S的草酰苹果酸抑制作用。
图18A描绘对照反应的LC-MS/MS分析。
图18B描绘含有酶的反应的LC-MS/MS分析。
图18C描绘加标对照反应的LC-MS/MS分析。
图19描绘α-羟基戊二酸的LC-MS/MS分析。
图20描绘显示R132H消耗α-KG以生成2-羟基戊二酸的LC-MS/MS分析。
图21描绘如在基因库登录号NP_005887.2(GI No.28178825)(记录时期：2009年5月10日)中所述的IDH1的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。
图21A为如在基因库登录号NM_005896.2(记录时期：2009年5月10日；GINo.28178824)中呈现的IDH1的cDNA序列(SEQ ID NO:8)。
图21B为如在基因库登录号NM_005896.2(记录时期：2009年5月10日；GINo.28178824)中所述的IDH1的mRNA序列(SEQ ID NO:9)。
图22为如在基因库登录号NM_002168.2(记录时期：2009年8月16日；GI28178831)中呈现的IDH2的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
图22A为如在基因库登录号NM_002168(记录时期：2009年8月16日；GI28178831)中呈现的IDH2的cDNA序列(SEQ ID NO:11)。
图22B为如在基因库登录号NM_002168.2(记录时期：2009年8月16日；GI28178831)中呈现的IDH2的mRNA序列(SEQ ID NO:12)。
图23描绘对于突变酶R132H和R132S的正向反应(异柠檬酸到α-KG)的进程。
图24A描绘衍生2-HG外消旋混合物的LC-MS/MS分析。
图24B描绘衍生R-2HG标准物的LC-MS/MS分析。
图24C描绘共注入衍生2-HG外消旋物和R-2-HG标准物的LC-MS/MS分析。
图24D描绘衍生新活性反应产物的LC-MS/MS分析。
图24E描绘共注入新活性酶反应产物和R-2-HG标准物的LC-MS/MS分析。
图24F描绘共注入新活性酶反应产物和2-HG外消旋混合物的LC-MS/MS分析。
图25描绘来自由ICDH1R132H引起的α-KG还原的2-HG对异柠檬酸到α-KG的野生型ICDH1催化氧化脱羧的抑制效应。
图26A描绘2-HG在表达野生型或IDH-1R132H突变蛋白质的CRL-2610细胞系中的水平。
图26B描绘2-HG在表达野生型或IDH-1R132H突变蛋白质的HTB-14细胞系中的水平。
图27描绘人IDH1基因组DNA：内含子/第二外显子序列。
图28描绘2HG在含有IDH1的R132突变的人恶性胶质瘤中的浓度。将通过外科切除术获得的人胶质瘤样本进行速冻，测定基因型以分类为野生型(WT)(N＝10)或携带R132突变等位基因(突变体)(n＝12)且提取代谢物用于LC-MS分析。在12种突变肿瘤中，10种携带R132H突变，一种携带R132S突变且一种携带R132G突变。各符号代表在各肿瘤样本中发现的所列代谢物的量。红线指示组样本平均值。经由学生t试验，在WT和R132突变IDH1突变肿瘤之间观察到的2HG差异在统计上是显著的(p<0.0001)。αKG、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸或异柠檬酸的水平在WT和R132突变IDH1肿瘤之间在统计上没有显著差异。
图29A描绘R132H突变IDH1的结构分析。左边以“封闭”构象示出R132H突变IDH1和WT IDH1的重叠结构。右边以“开放”构象示出WT IDH1与突变IDH1的重叠结构以用于对比。
图29B描绘含有αKG和NADPH的R132H IDH1(左边)和野生型(WT)IDH1(右边)活性部位的放大结构比较。除了在残基132处的改变之外，催化残基Tyr 139和Lys 212的位置不同，并且与R132H突变酶比较，对于WT中的催化氢化物转移来说，αKG相对于NADPH定向不同。
图30A描绘在评估重组人野生型(WT)和R132H突变(R132H)IDH1酶用NADP+作为辅因子使异柠檬酸氧化脱羧为αKG时的IDH1R132H突变体的酶性质。使用不同浓度的酶来产生曲线。
图30B描绘在评估WT和R132H突变IDH1酶用NADPH作为辅因子还原αKG时IDH R132突变体的酶性质。使用不同浓度的酶来产生曲线。
图30C示出如对WT和R132H IDH1酶所测量的氧化和还原反应的动力学参数。不能测定WT酶的还原活性的Km和kcat值，因为在任何底物浓度下都不能检测到可测量的酶活性。
图31A描绘鉴定2HG为重组人R132H突变IDH1的还原反应产物的LC-MS/MS分析。
图31B描绘通过R132H突变IDH1生成的2HG的二乙酰基-L-酒石酸酐衍生和2HG手性的LC-MS/MS分析。依照对于仅R(-)和S(+)形式(2HG外消旋物)或与反应产物(Rxn+外消旋物)一起的信号，示出仅还原反应(rxn)产物、仅R(-)-2HG标准物和两者一起(Rxn+R(-)-2HG)的归一化LC-MS/MS信号。
图32A描绘用于结晶的C-末端亲和性-纯化标记IDH1R132S蛋白质的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。
图32B描绘IDH1R132S蛋白质样本的FPLC分析的色谱图。
图33描绘从含有5mM NADP、5mM异柠檬酸、10mM Ca2+的蛋白质溶液中获得的晶体。使用结晶的悬滴法沉淀物溶液含有100mM MES(pH 6.0)和20％PEG 6000。
图34描绘从含有5mM NADP、5mMα-酮戊二酸、10mM Ca2+的蛋白质溶液中获得的晶体。沉淀物含有100mM MES(pH 6.5)和12％PEG 20000。
图35为描绘与野生型IDH2相比IDH2-R172K突变酶中升高的NADPH还原催化活性的条形图。
图36A-C为描绘以下的图：(A)通过LC-MS分析来自IDH1/2野生型(n＝10)、和在呈现和复发时获得的IDH1/2突变体(n＝16)患者白血病细胞及在培养基中生长14天的IDH1R132突变白血病细胞(n＝14)的提取物以测量2-HG的水平；和(B)在患有IDH1野生型或IDH1R132突变白血病的患者的血清中测量的2-HG。在(A)和(B)中，各点代表单个患者样本。菱形代表野生型，圆形代表IDH1突变体，且三角形代表IDH2突变体。横条指示平均值。(*)指示相对于野生型患者细胞在统计上的显著差异(p<0.05)。(C)描绘IDH1R132突变体和IDH1野生型AML细胞的体外生长曲线。
图37为描绘通过LC-MS测定的来自在初始呈现和复发时获得的携带IDH1/2突变体(n＝16)或野生型(n＝10)等位基因的AML患者的白血病细胞的提取物的α-KG、琥珀酸、苹果酸和延胡索酸的水平的结果的图表。各点代表单个患者样本。开圆代表野生型，闭圆代表IDH1突变体，且三角形代表IDH2突变体。横条代表平均值。在野生型AML样本和IDH1/2突变体AML样本之间没有统计上的显著差异。
图38描绘使用重组IDH1R132C和IDH2R172K的体外反应的LC-MS分析的图示，确认2-HG而不是异柠檬酸为突变酶反应的最终产物。
图39A和图39B描绘(A)在伴随NADP还原为NADPH的情况下异柠檬酸氧化脱羧为α-酮戊二酸的野生型IDH1酶催化作用；和(B)α-酮戊二酸到2-羟基戊二酸同时NADPH氧化为NADP的IDH1R132C突变体还原。这些分别被称为“正向”和“部分逆向”反应。
详细描述
发明人已经发现一些突变形式的酶(例如IDH1或IDH2)具有增加的功能(在本文中称为新活性)，其可以在细胞增殖相关病症(例如增殖病症，如癌症)的治疗中作为靶标。例如，在代谢途径酶的情况下，增加的功能或新活性可以充当癌症治疗的靶标。本文公开了用于治疗细胞增殖相关病症(例如增殖病症，诸如癌症)的方法和组合物。所述方法包括通过施用治疗有效量的IDH1或IDH2(例如IDH1)的抑制剂(例如小分子或核酸)来治疗患有胶质瘤或脑肿瘤的受试者，所述胶质瘤或脑肿瘤的特征在于编码在位置132位处具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu(例如His)的IDH1的根据序列SEQ ID NO:5的预选IDH1等位基因(例如在位置394处具有A的等位基因(诸如C394A、C394G、C394T、G395C、G395T或G395A突变(例如C394A突变体))或在位置395具有A的等位基因(例如G395A突变体))；或编码在位置172具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser的IDH2的预选IDH2等位基因和具有本文公开的新活性。基于核酸的抑制剂例如为dsRNA，例如包含表7-14的有义链和反义链的一级序列的dsRNA。所述dsRNA由两个单独的链组成，或者由折叠以形成发夹结构(例如短发夹RNA(shRNA))的单链组成。在一些实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为反义核酸，如具有重叠或包括表7-14中提供的反义序列的序列的反义核酸。
酶的新活性
如本文所使用的新活性是指由例如在酶的活性部位的突变(例如点突变，例如替换)产生的活性。在一个实施方案中，所述新活性在野生型或非突变酶中基本不存在。这在本文中有时称为第一级新活性。第一级新活性的一个实例为“增加的功能”，其中突变酶增加新催化活性。在一个实施方案中，所述新活性存在于野生型或非突变酶中，但是其水平小于在突变酶中见到的水平的10％、5％、1％、0.1％、0.01％或0.001％。这在本文中有时称为第二级新活性。第二级新活性的一个实例为“增加的功能”，其中突变酶具有相对于缺乏突变的酶所具有的催化活性速率的增加，例如5倍增加。
在一些实施方案中，酶的非突变形式(例如野生型形式)使物质A(例如异柠檬酸)转化为物质B(例如α-酮戊二酸)，且新活性使物质B(例如α-酮戊二酸)转化为有时称为新活性产物的物质C(例如2-羟基戊二酸，例如R-2-羟基戊二酸)。在一些实施方案中，所述酶处于代谢途径中，例如导致脂肪酸生物合成的代谢途径、糖酵解、谷氨酰胺代谢、磷酸戊糖支路、核苷酸生物合成途径或脂肪酸生物合成途径，例如IDH1或IDH2。
在一些实施方案中，酶的非突变形式(例如野生型形式)使物质A转化为物质B，且新活性使物质B转化为物质A。在一些实施方案中，所述酶处于代谢途径中，例如导致脂肪酸生物合成的代谢途径、糖酵解、谷氨酰胺代谢、磷酸戊糖支路、核苷酸生物合成途径或脂肪酸生物合成途径。
异柠檬酸脱氢酶
异柠檬酸脱氢酶(IDH)催化异柠檬酸到2-氧化戊二酸酯(即，α-酮戊二酸)的氧化脱羧。这些酶属于两个不同的亚类，其中的一个亚类利用NAD(+)作为电子受体，且另一个亚类利用NADP(+)作为电子受体。已经报道了五种异柠檬酸脱氢酶：3种NAD(+)-依赖性异柠檬酸脱氢酶，它们位于线粒体基质，且两种NADP(+)-依赖性异柠檬酸脱氢酶，其中之一是线粒体的且另一者是胞质的。每种NADP(+)-依赖性同功酶为同二聚体。
IDH1(异柠檬酸脱氢酶1(NADP+)，胞质)也称作IDH；IDP；IDCD；IDPC或PICD。由该基因编码的蛋白质为在细胞质和过氧化物酶体中发现的NADP(+)-依赖性异柠檬酸脱氢酶。它含有PTS-1过氧化物酶靶向信号序列。该酶在过氧化物酶体中的存在暗示在用于内过氧化物酶体还原(诸如2,4-二烯酰基-CoAs到3-烯酰基-CoAs的转化)以及消耗2-氧化戊二酸的过氧化物酶体反应(即植烷酸的α-羟基化作用)的NADPH的再生中的作用。该胞质酶在胞质NADPH生产中起到显著的作用。
人IDH1基因编码414个氨基酸的蛋白质。人IDH1的核苷酸和氨基酸序列可以分别以基因库条目NM_005896.2和NP_005887.2找到。IDH1的核苷酸和氨基酸序列也描述在例如Nekrutenko等，Mol.Biol.Evol.15:1674-1684(1998)；Geisbrecht等，J.Biol.Chem.274:30527-30533(1999)；Wiemann等，Genome Res.11:422-435(2001)；The MGC Project Team,Genome Res.14:2121-2127(2004)；Lubec等，提交(DEC-2008)给UniProtKB；Kullmann等，提交(JUN-1996)给the EMBL/基因库/DDBJ数据库；和Sjoeblom等，Science 314:268-274(2006)。
IDH2(异柠檬酸脱氢酶2(NADP+)，线粒体)也称作IDH；IDP；IDHM；IDPM；ICD-M；或mNADP-IDH。由该基因编码的蛋白质为在线粒体中发现的NADP(+)-依赖性异柠檬酸脱氢酶。它在中间代谢和能量生产中起作用。该蛋白质可与丙酮酸脱氢酶复合物紧密相关或相互作用。人IDH2基因编码452个氨基酸的蛋白质。IDH2的核苷酸和氨基酸序列可以分别以基因库条目NM_002168.2和NP_002159.2找到。人IDH2的核苷酸和氨基酸序列也描述在例如Huh等，提交(NOV-1992)给EMBL/基因库/DDBJ数据库；和The MGC Project Team,Genome Res.14:2121-2127(2004)。
非突变(例如野生型)IDH1例如在正向反应中催化异柠檬酸氧化脱羧为α-酮戊二酸，由此将NAD+(NADP+)还原为NADP(NADPH)：
异柠檬酸+NAD+(NADP+)→α-KG+CO2+NADH(NADPH)+H+。
在一些实施方案中，突变IDH1的新活性可以具有使α-酮戊二酸转化为2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)的能力：
α-KG+NADH(NADPH)+H+→2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)+NAD+(NADP+)。
在一些实施方案中，所述新活性可以是丙酮酸或苹果酸还原为相应的α-羟基化合物。
在一个实施方案中，突变IDH1的新活性可以由在残基132处具有His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Yan等中描述的任何其它突变(例如，His、Ser、Cys、Gly、Val或Leu；或His、Ser、Cys或Lys)的突变IDH1产生。在一些实施方案中，突变IDH2的新活性可以由在残基172处具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr或Ser(例如，Lys、Gly、Met、Trp或Ser；或Gly、Met或Lys)或在Yan H等中描述的任何其它突变的突变IDH2产生。示例性突变包括以下：R132H、R132C、R132S、R132G、R132L和R132V。
在一些实施方案中，突变IDH1和/或IDH2(例如，具有本文所述的新活性的突变IDH1和/或IDH2)可以导致2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)在受试者体内的水平增加。2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)在受试者体内(例如在受试者的脑中)的积累可能有害。例如，在一些实施方案中，2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)的水平升高可以导致和/或预示着在受试者体内的癌症，诸如中枢神经系统的癌症，例如脑肿瘤，例如胶质瘤，例如多形性胶质母细胞瘤(GBM)。因此，在一些实施方案中，本文所述的方法包括对受试者施用所述新活性的抑制剂。
2-羟基戊二酸的检测
可以例如通过LC/MS检测2-羟基戊二酸。为了检测培养基中的分泌的2-羟基戊二酸，可以收集条件培养基的500μL等分样本，与甲醇以80:20混合，且在4℃下以3,000rpm离心20分钟。可收集所得上清液且在LC-MS/MS之前将其在-80℃下保存以评估2-羟基戊二酸的水平。为了测量全细胞相关代谢物，可吸出培养基且例如可在非汇合密度下收获细胞。可以使用多种不同的液相色谱(LC)分离方法。各方法可以通过负电喷射电离(ESI，-3.0kV)偶联到在多反应监测(MRM)模式下操作的三重-四极质谱仪，其中MS参数对于输注代谢物标准溶液优化。根据先前报道的方法(Luo等，J Chromatogr A 1147,153-64,2007)的变型，可以在水性流动相中通过使用10mM三丁基胺作为离子配对剂的逆相色谱法分离代谢物。一种方法允许TCA代谢物分析：t＝0，50％B；t＝5，95％B；t＝7，95％B；t＝8，0％B，其中B是指100％甲醇的有机流动相。另一方法对2-羟基戊二酸具有特异性，其经5分钟运行50％-95％B(如上定义的缓冲剂)的快速线性梯度。如上所述，可以将Synergi Hydro-RP,100mm×2mm,2.1μm粒度(Phenomonex)用作柱。可以通过与已知浓度下的纯代谢物标准物比较峰面积来量化代谢物。如例如在Munger等Nat Biotechnol 26,1179-86,2008中所述，可以进行从13C-谷氨酰胺的代谢物流量研究。
在一个实施方案中，评估2HG，例如R-2HG，且分析物(测定以其为基础)为2HG，例如R-2HG。在一个实施方案中，分析物(测定以其为基础)为在进行分析方法的过程中形成的2HG(例如R-2HG)的衍生物。例如，这一衍生物可以是在MS分析中形成的衍生物。衍生物可以包括盐加合物(例如Na加合物)、水合变体或例如如在MS分析中形成的也是盐加合物(例如Na加合物)的水合变体。示例性的2HG衍生物包括脱水衍生物，如下面提供的化合物或它的盐加合物：
评估样本和/或受试者的方法
本部分提供获得和分析样本的方法和分析受试者的方法。
所述方法的实施方案包括评估与IDH(例如IDH1或IDH2)、α羟基新活性(例如2HG新活性)相关的一个或多个参数，例如以评估IDH1或IDH2 2HG新活性基因型或表型。可以进行所述评估例如以选择、诊断或预测受试者，选择治疗剂(例如抑制剂)或评估对疾病的治疗或进展的响应。在一个实施方案中，可在开始治疗之前和/或之后进行的评估至少部分地基于得自受试者的肿瘤样本、癌细胞样本或癌症前期细胞样本的分析。例如，可以通过评估与α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在或水平相关的参数来分析得自患者的样本的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在或水平。可通过色谱法(例如，通过LC-MS分析)来测定样本中的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)。它还可以通过与特异性结合试剂(例如抗体)接触来测定，所述特异性结合试剂与α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)结合，且允许检测。在一个实施方案中，分析所述样本的新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的水平。在一个实施方案中，分析所述样本的具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质(或相应RNA)的存在。例如，可以使用突变蛋白质特异性试剂(例如与IDH突变蛋白质特异性结合的抗体，例如与IDH1-R132H突变蛋白质或IDH2-R172突变蛋白质(例如IDH1-R132H突变蛋白质)特异性结合的抗体)来检测新活性突变酶。在一个实施方案中，对得自样本的核酸进行测序以测定是否存在本文公开的IDH1或IDH2的选定的等位基因或突变。在一个实施方案中，所述分析不同于直接测定突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质(或相应RNA)的存在或对IDH(例如IDH1或IDH2)基因的进行测序。在一个实施方案中，所述分析不同于直接测定(例如其不同于对基因组DNA或cDNA进行测序)在IDH1的残基132处的突变和/或在IDH2的残基172处的突变的存在。例如，所述分析可以是α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的检测或突变的α羟基新活性(例如2HG新活性)的测量。在一个实施方案中，将样本从患者体内移出并进行分析。在一个实施方案中，所述评估可以包括以下的一个或多个：进行所述样本的分析；请求分析所述样本；请求来自所述样本的分析的结果；或接收来自所述样本的分析的所述结果。(本文中通常来说，分析可以包括以下的一个或两个：进行下面的方法或从已经进行下面的方法的另一方接收数据。)
在一个实施方案中，可以在开始治疗之前和/或之后进行的评估至少部分地基于组织(例如除肿瘤样本之外的组织)或体液或身体产物的分析。示例性的组织包括淋巴结、皮肤、毛囊和指甲。示例性的体液包括血液、血浆、尿液、淋巴液、泪液、汗液、唾液、精液和脑脊髓液。示例性的身体产物包括呼出气。例如，可以通过评估与α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在或水平相关的参数来分析组织、液体或产物的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在或水平。可以通过色谱法(例如，通过LC-MS分析)来测定样本中的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)。它还可以通过与特异性结合试剂(例如抗体)接触来测定，所述特异性结合试剂与α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)结合，且允许检测。在存在足够水平的实施方案中，可分析组织、液体或产物的新活性(例如α羟基新活性，例如2HG新活性)的水平。在一个实施方案中，分析所述样本的具有α羟基新活性(例如2HG新活性)的突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质(或相应RNA)的存在。例如，可以使用突变蛋白质特异性试剂(例如与IDH突变蛋白质特异性结合的抗体，例如与IDH1-R132H突变蛋白质或IDH2-R172突变蛋白质(例如IDH1-R132H突变蛋白质)特异性结合的抗体)来检测新活性突变酶。在一个实施方案中，对得自样本的核酸进行测序以测定是否存在本文公开的IDH1或IDH2的选定的等位基因或突变。在一个实施方案中，所述分析不同于直接测定突变IDH(例如IDH1或IDH2)蛋白质(或相应RNA)的存在或对IDH(例如IDH1或IDH2)基因的进行测序。例如，所述分析可以是α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的检测或2HG新活性的测量。在一个实施方案中，将组织、液体或产物从患者体内移出并分析。在一个实施方案中，所述评估可以包括以下的一个或多个：进行所述组织、液体或产物的分析；请求分析所述组织、液体或产物；请求来自所述组织、体液或产物的分析的结果；或接收来自所述组织、液体或产物的分析的所述结果。
在一个实施方案中，可以在开始治疗之前和/或之后进行的评估至少部分地基于受试者的α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)成像。在实施方案中，使用磁共振方法来评估受试者体内α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)的存在、分布或水平。在一个实施方案中，对所述受试者进行成像和/或光谱分析，例如基于磁共振的分析，例如MRI和/或MRS，例如分析，且任选地形成对应于α羟基新活性产物(例如2HG，例如R-2HG)、或肿瘤的存在、分布或水平的图像。任选地将所述图像或与所述图像相关的值保存在有形介质中和/或传递到第二位置。在一个实施方案中，所述评估可以包括以下的一个或多个：进行成像分析；请求成像分析；请求来自成像分析的结果；或接收来自成像分析的结果。
治疗增殖病症的方法
本文描述了例如通过抑制突变酶的新活性来治疗细胞增殖相关病症(例如癌症，例如胶质瘤)的方法，所述突变酶例如是代谢途径(例如导致脂肪酸生物合成的代谢途径、糖酵解、谷氨酰胺代谢、磷酸戊糖支路、核苷酸生物合成途径或脂肪酸生物合成途径)中的酶，例如IDH1或IDH2。所述癌症可以一种或多种突变酶(例如代谢途径中的酶，例如IDH1或IDH2，所述代谢途径例如是导致脂肪酸生物合成的代谢途径、糖酵解、谷氨酰胺代谢、磷酸戊糖支路、核苷酸生物合成途径或脂肪酸生物合成途径)中存在的新活性(诸如增加的功能)为特征。在一些实施方案中，所述增加的功能为使α-酮戊二酸转化为2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)。
用于治疗癌症的化合物
可以例如使用本文所述的测定评估候选化合物对新活性的调节(例如抑制)。也可以评估候选化合物对野生型或非突变活性的调节(例如抑制)。例如，可以测定具有任何活性(例如酶活性)的产物或副产物的形成，因此评估候选化合物。在一些实施方案中，可以通过测量来自酶学测定的一个或多个读数来评估所述活性(例如，野生型/非突变或新活性)。例如，可以例如使用诸如荧光或放射标记底物的方法测量底物和/或产物的性质和/或量方面的改变。示例性的底物和/或产物包括α-酮戊二酸、CO2、NADP、NADPH、NAD、NADH和2-羟基戊二酸，例如R-2-羟基戊二酸。在一些实施方案中，还可以将酶的反应速率评估为酶反应的产物的性质和/或量。除了测量潜在的酶活性以外，可以通过在使潜在底物、辅因子或酶活性调节剂与酶结合后使蛋白质荧光淬灭来检测活性(例如野生型/非突变或新活性)。
在一个实施方案中，可以通过NAD或NADP辅因子的OD340或荧光的改变来监测测定的进展。在另一实施方案中，可使反应进展以连续模式或终点模式偶联到第二酶测定系统以便增加测定的动态范围。例如，可以通过向反应中加入过量的心肌黄酶和rezasarin而进行终点测定。心肌黄酶消耗剩余的NADPH或NADH，同时生成得自rezasarin的试卤灵(resorufin)。试卤灵是可以通过在Ex544Em590下荧光进行测量的高度荧光产物。这不仅终止了反应，而且产生了具有比辅因子的荧光性大的量子产率的容易检测的信号。
可以通过使一级反应的产物偶联到产生具有更大动态范围或更方面的检测模式的可检测结果的二级酶反应而实施连续测定。例如，在反应混合物中包含醛脱氢酶(ALDH)(其为NADP+依赖性酶)和6-甲氧基-2-萘甲醛(ALDH的生色底物)将以取决于由异柠檬酸脱氢酶引起的NADP+生成的速率而导致生成荧光产物6-甲氧基-2-萘甲酸酯(napthoate)(Ex310Em 360)。包含偶联酶(诸如醛脱氢酶)具有无论产生NADP+还是NAD+而允许筛选新活性的附加益处，因为这种酶可以利用二者。另外，由于使“逆向”测定所需要的NADPH或NADH辅因子再生，因此使辅因子循环回到IDH酶的偶联酶体系具有容许连续测定在大大低于Km的辅因子浓度下进行以便增强辅因子结合的竞争性抑制剂的检测的另外优势。
在活性(例如野生型/非突变体或新活性)筛选的第三实施方案中，可以对IDH底物、辅因子或产物中的一种或多种在确定的原子处用放射性或“重”元素进行同位素标记，以便通过化学反应跟踪特定的底物或底物的原子。例如，α-KG、异柠檬酸或2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)的α碳可以是14C或13C。可以通过本领域的技术人员已知的方式(例如质谱分析或辐射测量HPLC)来分析所形成产物的量、速率、身份和结构。
抑制新活性(例如，本文所述的新活性)的化合物可以包括例如小分子、核酸、蛋白质和抗体。
示例性的小分子包括例如与酶结合且降低其活性(例如本文所述的新活性)的小分子。抑制剂的结合可以阻止底物进入酶活性部位和/或阻碍所述酶催化它的反应。抑制剂结合是可逆或不可逆的。不可逆的抑制剂通常与所述酶反应且使其发生化学变化。这些抑制剂可以修饰酶活性所需要的关键氨基酸残基。相比之下，可逆的抑制剂非共价结合，并且取决于这些抑制剂是否与酶、酶-底物复合物或二者结合而产生不同类型的抑制作用。
在一些实施方案中，所述小分子为草酰苹果酸、草酰延胡索酸或草酰琥珀酸。
在一些实施方案中，所述小分子为式(X)的化合物，或如表24a中所列的化合物。式(X)的化合物提供如下：
其中X为C1-C6亚烷基(例如亚甲基)、C(O)或C(O)C1-C6亚烷基；其中X被任选地取代；
R1为卤素(例如，氟)、C1-C6烷基、C1-C6卤烷基、羟基、C1-C6烷氧基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、-C(O)OH或C(O)OC1-C6烷基；和
m为0、1、2或3。
在一些实施方案中，所述化合物为式(XI)的化合物或其药学上可接受的盐或表24b中所列的化合物，
其中：
W、X、Y和Z各自独立地选自CH或N；
B和B1独立地选自氢、烷基或在与其所连接的碳合在一起时形成羰基；
Q为C＝O或SO2；
D和D1独立地选自键、氧或NRc；
A为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
R1独立地选自烷基、酰基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、杂环烷基、环烷基烷基、芳烷基和杂芳烷基；其各自可以任选地被0-3次出现的Rd取代；
R3各自独立地选自卤素、卤烷基、烷基和-ORa；
Ra各自独立地选自烷基和卤烷基；
Rb各自独立地为烷基；
Rc各自独立地选自氢、烷基和烯基；
Rd各自独立地选自卤素、卤烷基、烷基、硝基、氰基和-ORa，或两个Rd与其所连接的碳原子一起形成任选取代的杂环基；
n为0、1或2；
h为0、1或2；且
g为0、1或2。
在一些实施方案中，所述小分子为新活性(例如，相对于野生型活性)的选择性抑制剂。
可以使用核酸例如通过降低酶的表达而抑制新活性，例如本文所述的新活性。示例性的核酸包括例如siRNA、shRNA、反义RNA、适体和核酶。可以使用本领域已知的方法针对特定基因序列选择抑制分子，例如siRNA分子。
也可以使用蛋白质通过直接或间接与酶和/或底物结合或与酶和/或底物竞争结合而抑制新活性，例如本文所述的新活性。示例性的蛋白质包括例如可溶性受体、肽和抗体。示例性的抗体包括例如全抗体或保留其与酶或底物结合的能力的抗体片段。
可以被测试抑制本文所述的新活性(例如与突变IDH1相关的新活性)的示例性的候选化合物描述于以下参考文献中，各参考文献以引用的方式并入本文：Bioorganic&Medicinal Chemistry(2008),16(7),3580-3586；Free Radical Biology&Medicine(2007),42(1),44-51；KR2005036293A；Applied and Environmental Microbiology(2005),71(9),5465-5475；KR 2002095553A；美国专利Appl.US 2004067234A1；PCTInt.Appl.(2002)；WO 2002033063A1；Journal of Organic Chemistry(1996),61(14),4527-4531；Biochimica et Biophysica Acta,Enzymology(1976),452(2),302-9；Journalof Biological Chemistry(1975),250(16),6351-4；Bollettino-Societa Italiana diBiologia Sperimentale(1972),48(23),1031-5；Journal of Biological Chemistry(1969),244(20),5709-12。
异构体
一些化合物可以一种或多种特定几何、光学、对映异构体、非对映异构体、差向异构、阿托(atropic)、立体异构、互变异构、构象或端基异构形式存在，包括(但不限于)：顺式和反式(cis-and trans-forms)；E-形式和Z-形式；c-、t-和r-形式；内向形式和外向形式；R-、S-和内消旋形式；D-形式和L-形式；d-形式和l-形式；(+)和(-)形式；酮基-形式、烯醇-形式和烯醇化物-形式；顺式和反式(syn-and anti-forms)；向斜形式和背斜形式；α-形式和β-形式；轴向形式和赤道形式；舟式、椅式、扭曲式、封套式和半椅式；及其组合，在下文中通称为“异构体”(或“异构形式”)。
在一个实施方案中，本文所述的化合物(例如新活性或2-HG的抑制剂)为本文所述的立体异构体的对映异构富集的异构体。例如，所述化合物具有至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的对映异构体过量。当在本文中使用时，对映异构体是指分子结构彼此具有镜像关系的一对化学化合物中的任一种。
在一个实施方案中，对应于所选立体中心(例如2-羟基戊二酸的2-位)，本文公开的化合物的制备对于具有所选立体化学(例如R或S)的异构体富集。2HG可以从商业来源购买或可以使用本领域已知的方法(例如，如Org.Syn.Coll vol.,7,P-99,1990中所述)来制备。例如，所述化合物具有对应于具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的所选立体中心的所选立体化学的化合物的纯度。
在一个实施方案中，本文公开的组合物包括制备本文公开的化合物，该化合物富集在所选立体中心(例如2-羟基戊二酸的2-位)具有所选立体化学(例如R或S)的结构。示例性的R/S构象可以是在本文所述的实施例中提供的那些。
如本文所使用的“富集制备”是在题述化合物内富集一种、两种、三种或更多种所选立体中心的所选立体构象。示例性的所选立体中心和其示例性的立体构象可以选自在本文中(例如，在本文所述的实施例中)提供的那些。富集是指所述制剂中例如至少60％的化合物分子具有所选立体中心的所选立体化学。在一个实施方案中，其为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。富集是指题述分子的水平，且除非指定，否则不暗含方法局限性。
应注意到，除如下文对于互变异构形式所论述之外，特别排除在本文使用的术语“异构体”之外的为结构(或构成)异构体(即，在原子之间的连接不同，而不是仅仅原子的空间位置不同的异构体)。例如，提到甲氧基-OCH3，不应理解为提到其结构异构体羟甲基-CH2OH。类似地，提到邻氯苯基不应理解为提到其结构异构体间氯苯基。然而，提到一类结构很可能包括属于这类的结构异构形式(例如，C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基和对甲氧基苯基)。
上述排除并不涉及互变异构形式，例如酮基形式、烯醇形式和烯醇化物形式，如在例如以下互变异构对中：酮基/烯醇(以下说明)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮基和硝基/酸式硝基。
应注意到，特别包括在术语“异构体”中的是具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H、2H(D)和3H(T)；C可以是任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以是任何同位素形式，包括16O和18O；等。除非另有规定，否则提到特定化合物包括所有这类异构形式，包括其(完全或部分)外消旋及其它混合物。用于制备(例如，不对称合成)和分离(例如，分步结晶和色谱方法)这类异构形式的方法在本领域中是已知的或通过以已知方式改编本文中指出的方法或已知方法来容易地获得。
盐
可方便或希望制备、纯化和/或操作活性化合物的相应盐，例如药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例论述在Berge等，1977,“Pharmaceutically AcceptableSalts(药学上可接受的盐).”J.Pharm.ScL.第66卷，第1-19页中。
例如，如果化合物为阴离子的或具有可为阴离子的官能团(例如，-COOH可为-COO-)，则可以用合适的阳离子形成盐。合适的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子，诸如Na+和K+；碱土金属阳离子，诸如Ca2+和Mg2+；及其它阳离子，诸如Al3+。合适的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4+)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2+、NHR3+、NR4+)。一些合适的取代的铵离子的实例为来源于以下的铵离子：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常用季铵离子的实例为N(CH3)4+。
如果化合物为阳离子的或具有可为阳离子的官能团(例如，-NH2可为-NH3+)，则可以用合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的实例包括但不限于来源于以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
合适的有机阴离子的实例包括但不限于来源于以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、延胡索酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、草酰乙酸、羟基萘羧酸、羟乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲烷磺酸、粘液酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯基乙酸、苯基磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸和缬草酸。合适的聚合有机阴离子的实例包括但不限于来源于以下聚合酸的阴离子：鞣酸、羧甲基纤维素。
除非另有规定，否则提到特定化合物也包括其盐形式。
化学上受保护的形式
可能方便或希望制备、纯化和/或操作化学上受保护形式的活性化合物。术语“化学上受保护的形式”在本文中以常规化学意义使用，且属于其中一个或多个反应性官能团受保护以免在指定条件(例如pH、温度、辐射、溶剂等)下发生不合需要的化学反应的化合物。在实践中，采用熟知的化学方法来可逆地致使官能团不起反应，所述官能团另外在指定条件下将起反应。在化学上受保护的形式中，一个或多个反应性官能团是受保护或保护基团(也称作被掩蔽或掩蔽基团或被封闭或封闭基团)的形式。通过保护反应性官能团，可以在不影响受保护基团的情况下进行涉及其它不受保护的反应性官能团的反应；通常在随后的步骤中，在基本不影响分子的剩余部分的情况下，可以将保护基除去。参见，例如Protective Groups in Organic Synthesis(T.Green和P.Wuts；第3版；John Wiley andSons,1999)。除非另有规定，否则提到特定化合物也包括其化学上受保护的形式。
各种这样的“保护”、“封闭”或“掩蔽”方法广泛使用且在有机合成中所熟知。例如，可以衍生具有两个非等效反应性官能团(其二者在指定条件下都将反应)的化合物以使所述官能团中的一个“受保护”，因此在指定条件下不起反应；这样保护之后，可以将所述化合物用作实际上仅有一个反应性官能团的反应物。在所需反应(涉及另一官能团)完成之后，可以使受保护基团“去保护”以使其回到其最初官能性。
例如，可以将羟基保护为醚(-OR)或酯(-OC(＝O)R)，例如保护为：叔丁基醚；苄基醚、二苯甲基(二苯基甲基)醚或三苯甲基(三苯基甲基)醚；三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基醚；或乙酰基酯(-OC(＝O)CH3,-OAc)。
例如，可以将醛或酮基分别保护为缩醛(R-CH(OR)2)或缩酮(R2C(OR)2)，其中可以通过与例如伯醇反应使羰基(>C＝O)转化为二醚(>C(OR)2)。可以通过在酸存在下使用大大过量的水进行水解而容易地再生所述醛基或酮基。
例如，可以将胺基保护为例如酰胺(-NRCO-R)或尿烷(-NRCO-OR)，例如：甲基酰胺(-NHCO-CH3)；苄氧基酰胺(-NHCO-OCH2C6H5,-NH-Cbz)；叔丁氧基酰胺(-NHCO-OC(CH3)3,-NH-Boc)；2-联苯基-2-丙氧基酰胺(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5,-NH-Bpoc)、9-芴基甲氧基酰胺(-NH-Fmoc)、6-硝基藜芦氧基酰胺(-NH-Nvoc)、2-三甲基甲硅烷基乙氧基酰胺(-NH-Teoc)、2,2,2-三氯乙氧基酰胺(-NH-Troc)、烯丙氧基酰胺(-NH-Alloc)、2(-苯基磺酰基)乙氧基酰胺(-NH-Psec)；或在合适情况下(例如环胺)，保护为硝基氧基团(>N-O<<)。
例如，可以将羧酸基团保护为酯，例如：C^烷基酯(例如甲基酯；叔丁基酯)；Cvr卤烷基酯(例如C1-7三卤烷基酯)；三C1-7烷基甲硅烷基-Ci.7烷基酯；或C5.2o芳基-C1-7烷基酯(例如苄基酯；硝基苄基酯)；或酰胺，例如甲基酰胺。
例如，可以将硫醇基保护为硫醚(-SR)，例如：苄硫醚；乙酰氨基甲基醚(-S-CH2NHC(＝O)CH3)。
基于核酸的抑制剂
用于抑制IDH(例如IDH1)的基于核酸的抑制剂可以是例如双链RNA(dsRNA)(其例如通过RNA干扰(RNAi机制)起作用)、反义RNA或微RNA(miRNA)。在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂与靶目标mRNA结合且例如通过裂解靶mRNA而抑制由其生成蛋白质。
双链RNA(dsRNA)
可用于降低IDH1或IDH2突变功能的基于核酸的抑制剂例如为dsRNA，如通过RNAi机制起作用的dsRNA。RNAi是指由短干扰RNA(siRNA)介导的在动物体内的序列特异性转录后基因沉默的过程。如本文所使用的dsRNA被理解为包括siRNA。通常，通过dsRNA实现的IDH(例如IDH1)的抑制作用并不触发由蛋白激酶PKR和2',5'-寡腺苷酸合成酶的dsRNA介导的活化而产生的干扰素响应，所述蛋白激酶PKR和2',5'-寡腺苷酸合成酶导致由核糖核酸酶L引起的mRNA的非特异性裂解。
靶向IDH(例如IDH1)酶(例如野生型或突变IDH1)的dsRNA可以是未被修饰的或经化学修饰的。所述dsRNA可以化学合成，由载体中表达或酶促合成。本发明的特点还在于能够通过RNA干扰(RNAi)调节细胞中的IDH1基因表达或活性的各种经化学修饰的合成dsRNA分子。诸如通过增加对体内核酸酶降低的抵抗性和/或通过改善细胞吸收，使用化学修饰的dsRNA改善天然dsRNA分子的各种性质。
靶向核酸的dsRNA可以主要由两个单独的RNA组成，或者主要由一个RNA链组成，所述RNA链折叠以形成发夹结构。发夹dsRNA通常被称为shRNA。
靶向IDH(例如突变或野生型IDH1)基因的shRNA可以由载体(例如病毒载体，如慢病毒或腺病毒载体)表达。在某些实施方案中，将通过筛选siRNA库(诸如腺病毒或慢病毒siRNA库)来鉴定用于抑制IDH1基因的表达的合适dsRNA。
在一个实施方案中，靶向IDH(例如IDH1)的dsRNA的长度为约15至约30个碱基对，例如约16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个碱基对。在另一实施方案中，所述dsRNA包括约1至约3(例如约1、2或3)个核苷酸的悬垂端。“悬垂”是指dsRNA的一个链的3'-端延伸超出另一链的5'-端，或者反之亦然。所述dsRNA可以在dsRNA分子的一端或两端具有悬垂部分。在一些实施方案中，单链悬垂部分位于反义链的3'-末端，或者位于有义链的3'-末端。在一些实施方案中，所述悬垂部分为TT或UU二核苷酸悬垂部分，例如TT或UU二核苷酸悬垂部分。例如，在一个实施方案中，所述dsRNA包括21个核苷酸的反义链、19个碱基对的双链区和3'-末端二核苷酸。在又一实施方案中，dsRNA包括双链核酸，其中两端为钝端，或者一端为钝端。
在一个实施方案中，所述dsRNA包含第一链和第二链，各链的长度为约18至约28个核苷酸，例如约19至约23个核苷酸，所述dsRNA的第一链包含与IDH(例如IDH1)RNA具有足够互补性的核苷酸序列以便使dsRNA经由RNA干扰直接裂解IDH(例如IDH1)mRNA，且所述dsRNA的第二链包含与第一链互补的核苷酸序列。
在一个实施方案中，靶向IDH(例如IDH1)基因的dsRNA可以靶向所述基因的野生型和突变形式，或可以靶向该基因的不同等位同种型。例如，所述dsRNA将靶向不同同种型中的两个或更多个中相同的序列。在一个实施方案中，所述dsRNA靶向在位置395具有G或在位置394具有C的IDH1(例如野生型IDH1RNA)和在位置395具有A或在位置394具有A(诸如C394A、C394G、C394T、G395C、G395T或G395A突变)的IDH1(例如，携带G395A和/或C394A突变的IDH1RNA)(图2)。
在一个实施方案中，dsRNA将优选或特异性地靶向突变IDHRNA或特定的IDH多态性RNA。在一些实施方案中，所述IDH在位置394或395具有突变，如C394A、C394G、C394T、G395C、G395T或G395A突变。例如，在一个实施方案中，所述dsRNA靶向在位置395携带A(例如G395A)的IDH1RNA，且在另一实施方案中，所述dsRNA靶向在位置394携带A(例如C394A突变)的IDH1RNA。
在一个实施方案中，靶向IDH RNA的dsRNA包括一处或多处化学修饰。这类化学修饰的非限制性实例包括而不限于硫代磷酸核苷酸间连键、2'-脱氧核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和末端丙三基和/或反向脱氧脱碱基残基合并。已经显示这类化学修饰保持细胞中的RNAi活性，而同时显著增加这些化合物的血清稳定性。此外，一个或多个硫代磷酸取代耐受性良好且已经显示使对于改性的dsRNA构建体的血清稳定性显著增加。
在一个实施方案中，靶向IDH(例如IDH1)RNA的dsRNA包括被修饰、同时保持介导RNAi的能力的核苷酸。可以使用修饰的核苷酸来改善体外或体内特性，如稳定性、活性和/或生物可用性。例如，所述dsRNA可以包括占分子中存在的核苷酸总数的一定百分数的修饰核苷酸。因而，所述dsRNA通常可以包括约5％至约100％的修饰的核苷酸(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％修饰的核苷酸)。
在一些实施方案中，靶向IDH(例如IDH1)的dsRNA的长度为约21个核苷酸。在另一实施方案中，所述dsRNA不含任何核糖核苷酸，且在另一实施方案中，所述dsRNA包含一个或多个核糖核苷酸。在一个实施方案中，所述dsRNA分子的各链独立地包含约15至约30(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核苷酸，其中各链包含与另一链的核苷酸互补的约15至约30(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核苷酸。在一个实施方案中，所述dsRNA的一个链包含与IDH1或IDH2基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且所述dsRNA的第二链包含基本类似于IDH1或IDH2基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。
在一个实施方案中，靶向IDH1或IDH2的dsRNA包含具有与IDH1或IDH2基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的反义区和具有基本类似于IDH1或IDH2基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列的有义区。在一个实施方案中，所述反义区和所述有义区独立地包含约15至约30(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核苷酸，其中所述反义区包含约15至约30(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个与所述有义区的核苷酸互补的核苷酸。
如本文所使用的术语“dsRNA”意欲包括能够调节序列特异性RNAi的核酸分子，诸如短干涉RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干涉寡核苷酸、短干涉核酸、短干涉修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。另外，如本文所使用的术语“RNAi”意欲包括序列特异性RNA干扰，诸如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传。
基于核酸的IDH抑制剂
在一个实施方案中，所述抑制剂为基于核酸的抑制剂，诸如靶向突变IDH(例如突变IDH1或IDH2)的双链RNA(dsRNA)或反义RNA。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂(例如dsRNA或反义分子)降低或抑制IDH1的表达，所述IDH1根据SEQ ID NO:8的序列(也参见图21)在残基132处除了Arg之外具有例如His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Yan等，N.Eng.J.Med.360:765-73中描述的任何残基。在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂降低或抑制在残基132处具有His的IDH1酶的表达。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为靶向编码本文所述的IDH1等位基因(例如在残基132处具有除Arg之外的残基的IDH1等位基因)的mRNA的dsRNA。例如，所述等位基因编码根据序列SEQ ID NO:8(也参见图21)在残基132处的His、Ser、Cys、Gly、Val、Pro或Leu或在Yan等中描述的任何残基。
在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有His的IDH1。
在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基132处具有Ser的IDH1。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为靶向IDH1的dsRNA，所述IDH1为例如在核苷酸位置394处具有A或T(或除C以外的核苷酸)或在核苷酸位置395处具有A(或除G以外的核苷酸)的IDH1，例如根据SEQ ID NO:8的IDH1序列(也参见图21A)携带C394T突变或G395A突变的突变等位基因。
在一个实施方案中，所述dsRNA例如通过靶向在野生型和突变转录物之间相同的IDH1mRNA的区域而靶向在核苷酸位置394处具有除C以外的例如A或T或在核苷酸位置395处具有除G以外的例如A的IDH1(例如突变体)和在核苷酸位置394处具有C或在核苷酸位置395处具有G的IDH1(例如野生型)。在又一实施方案中，所述dsRNA靶向特定的突变或多态性(如单核苷酸多态性(SNP))等位基因，而不是野生型等位基因。在这种情况下，所述基于核酸的抑制剂(例如dsRNA)靶向含有突变的IDH1的区域。
在一些实施方案中，与野生型IDH1的产物相比，基于核酸的抑制剂(例如dsRNA)优选地或特异性地抑制突变IDH1的产物。在一些实施方案中，所述IDH在位置394或395具有突变，诸如C394A、C394G、C394T、G395C、G395T或G395A突变。例如，在一个实施方案中，dsRNA靶向携带突变(例如，根据SEQ ID NO:5的C394A、C394T或G395A突变)的IDH1mRNA的区域。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为dsRNA，其包含具有在表7-14中呈现的一级序列的有义链和反义链。在另一实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为反义寡核苷酸，其包含表7-14中呈现的反义一级序列的全部或部分，或靶向与表7-14的dsRNA相同或基本相同的区域。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂降低或抑制IDH2的表达，所述IDH2根据SEQ ID NO:10氨基酸序列(也参见图22)在残基172处具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基。在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂降低或抑制在残基172处具有Lys的IDH2酶的表达。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为靶向编码本文所述的IDH2等位基因(例如在残基172处具有除Arg之外的残基的IDH2等位基因)的mRNA的dsRNA。例如，所述等位基因根据序列SEQ ID NO:10(也参见图22)在残基172处可具有Lys、Gly、Met、Trp、Thr、Ser或在Yan等中描述的任何残基。
在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Lys的IDH2。
在一个实施方案中，所述等位基因编码在残基172处具有Met的IDH2。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为靶向IDH2的dsRNA，所述IDH2为例如在核苷酸位置514处具有G或T(或除A或C以外的核苷酸)或在核苷酸位置515处具有A或T或C(或除G以外的核苷酸)的IDH2，例如根据SEQ ID NO:10的IDH2序列(也参见图22A)携带A514G突变或G515T或G515A突变的突变等位基因。在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为靶向IDH2的dsRNA，所述IDH2为例如根据SEQ ID NO:10的IDH2序列在核苷酸位置516处具有C或T(或除G或A以外的核苷酸)的IDH2。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为靶向IDH2的dsRNA，所述IDH2为例如根据SEQ ID NO:10的IDH2序列在核苷酸位置514处具有G或在核苷酸位置515处具有T或在核苷酸位置515处具有A的IDH2。
在一个实施方案中，所述dsRNA例如通过靶向在野生型和突变转录物之间相同的IDH2mRNA的区域而靶向在核苷酸位置514处具有除A以外的例如G或T或在核苷酸位置515处具有除G以外的例如A或C或T，(例如突变体)或除G以外的例如C或T的IDH2，和在核苷酸位置514处具有A或在核苷酸位515处具有G或在核苷酸位置516处具有G的IDH2(例如野生型)。在又一实施方案中，所述dsRNA靶向特定的突变或多态性(如单核苷酸多态性(SNP))等位基因，而不是野生型等位基因。在这种情况下，所述基于核酸的抑制剂(例如dsRNA)靶向含有突变的IDH2的区域。
在一些实施方案中，与野生型IDH2的产物相比，基于核酸的抑制剂(例如dsRNA)优选地或特异性地抑制突变IDH2的产物。例如，在一个实施方案中，dsRNA靶向携带突变(例如，根据SEQ ID NO:10的A514G或G515T或G515U突变)的IDH2mRNA的区域。
在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为dsRNA，其包含具有在表15-23中呈现的一级序列的有义链和反义链。在另一实施方案中，所述基于核酸的抑制剂为反义寡核苷酸，其包含表15-23中呈现的反义一级序列的全部或部分，或靶向与表15-23的dsRNA相同或基本相同的区域。
在一个实施方案中，将所述基于核酸的抑制剂递送到脑，例如直接递送到脑，例如通过鞘内或脑室内递送。所述基于核酸的抑制剂也可以从可植入的装置递送。在一个实施方案中，所述基于核酸的抑制剂通过使用例如导管和任选的泵通过输注来递送。
反义
合适的基于核酸的抑制剂包括反义核酸。虽然不受理论限制，但是认为反义抑制作用通常基于寡核苷酸链或片段的基于氢键的杂交，使得至少一条链或片段裂解，降解或另外使其不可用。
反义试剂可以与IDH1或IDH2DNA结合。在实施方案中，其抑制复制和转录。虽然不受理论限制，但是认为反义试剂也可以起到如下作用：抑制靶RNA移位例如到蛋白质翻译部位、蛋白质从RNA翻译、RNA剪接以产生一个或多个RNA种类和涉及RNA的催化活性或复合物形成。
反义试剂可能具有如上所述的适于dsRNA的化学修饰。
反义试剂可以包含例如约8至约80个核碱基(即，约8至约80个核苷酸)，例如约8至约50个核碱基或约12至约30个核碱基。反义化合物包括核酶、外源指导序列(EGS)寡核苷酸(oligozymes)和与靶核酸杂交并调节其表达的其它短催化RNA或催化寡核苷酸。反义化合物可以包括与靶基因中的序列互补的一段至少8个连续核碱基。寡核苷酸不必与其将特异性杂交的靶核酸序列100％互补。在寡核苷酸与靶标的结合干扰靶分子的正常功能而导致实用性损失时，寡核苷酸特异性杂交，且存在足够程度的互补性以避免寡核苷酸与非靶序列在需要特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗情况下的生理条件下或在体外测定情况下，其中进行所述体外测定的条件下)的非特异性结合。
反义寡核苷酸与mRNA(例如编码IDH1或IDH2的mRNA)的杂交可干扰mRNA的正常功能中的一种或多种。虽然不受理论限制，但是认为将被干扰的mRNA的功能包括所有关键功能，例如RNA移位到蛋白质翻译部位、蛋白质从RNA翻译、RNA剪接以产生一个或多个mRNA种类和RNA可能参与的催化活性。特异性蛋白质与RNA的结合也可以被反义寡核苷酸与RNA的杂交所干扰。
示例性的反义化合物包括与靶核酸特异性杂交的DNA或RNA序列，例如编码IDH1或IDH2的mRNA。互补区可延续约8至约80个核碱基。所述化合物可包括一个或多个修饰的核碱基。修饰的核碱基可能包括例如5-取代嘧啶，诸如5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶和C5-丙炔基嘧啶(诸如C5-丙炔基胞嘧啶和C5-丙炔基尿嘧啶)。其它合适的修饰的核碱基包括N4-(C1-C12)烷基氨基胞嘧啶和N4,N4-(C1-C12)二烷基氨基胞嘧啶。修饰的核碱基还可包括7-取代-5-氮杂-7-氮杂嘌呤和7-取代-7-氮杂嘌呤，例如7-碘-7-氮杂嘌呤、7-氰基-7-氮杂嘌呤、7-氨基羰基-7-氮杂嘌呤。这些核碱基的实例包括6-氨基-7-碘-7-氮杂嘌呤、6-氨基-7-氰基-7-氮杂嘌呤、6-氨基-7-氨基羰基-7-氮杂嘌呤、2-氨基-6-羟基-7-碘-7-氮杂嘌呤、2-氨基-6-羟基-7-氰基-7-氮杂嘌呤和2-氨基-6-羟基-7-氨基羰基-7-氮杂嘌呤。此外，N6-(C1-C12)烷基氨基嘌呤和N6,N6-(C1-C12)二烷基氨基嘌呤(包括N6-甲基氨基腺嘌呤和N6,N6-二甲基氨基腺嘌呤)也是合适的修饰的核碱基。类似地，例如包括6-硫鸟嘌呤的其它6-取代嘌呤可构成适当修饰的核碱基。其它合适的核碱基包括2-硫尿嘧啶、8-溴腺嘌呤、8-溴鸟嘌呤、2-氟腺嘌呤和2-氟鸟嘌呤。任何上述修饰的核碱基的衍生物也是合适的。任何前述化合物的取代基可以包括C1-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、卤素、氨基、酰氨基、硝基、硫基、磺酰基、羧基、烷氧基、烷基羰基、烷氧基羰基等。
微RNA
在一些实施方案中，适合靶向IDH(例如IDH1)的基于核酸的抑制剂为微RNA(miRNA)。miRNA为通过mRNA裂解、翻译阻遏/抑制或异染色质沉默调节靶mRNA的表达的单链RNA。miRNA的长度为18至25个核苷酸，通常为21至23个核苷酸。在一些实施方案中，所述miRNA包括化学修饰，诸如一种或多种本文所述的修饰。
在一些实施方案中，靶向IDH的基于核酸的抑制剂与靶IDH(例如IDH1或IDH2)mRNA具有部分互补性(即，小于100％的互补性)。例如，部分互补性可包括各种错配或非碱基配对核苷酸(例如，1、2、3、4、5或更多个错配或非碱基配对核苷酸，诸如核苷酸突起)，其可产生在基于核酸的抑制剂和相应靶核酸分子的反义链或反义区之间产生的突起、环或悬垂部分。
本文所述的基于核酸的抑制剂(例如本文所述的反义核酸)可以合并到基因构建体中以用作基因治疗方案的一部分以递送可以用于在细胞内表达并生成试剂的核酸。具有这类组分的表达构建体可以在任何生物学有效的载体(例如能够将组分基因有效递送到体内细胞中的任何制剂或组合物)中施用。方法包括将题述基因插入病毒载体中，所述病毒载体包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒-1或重组细菌或真核质粒。病毒载体直接转染细胞；可以借助于例如阳离子脂质体(lipofectin)或衍生(例如抗体缀合)的聚赖氨酸缀合物、短杆菌肽S、人造病毒包膜或其它这类细胞内获利者(earner)以及直接注入基因构建体或体内进行CaPO4沉淀而递送质粒DNA。
在一个实施方案中，将核酸在体内引入细胞中包括使用含有核酸(例如cDNA)的病毒载体。用病毒载体感染细胞具有大部分靶细胞可接收核酸的优势。另外，例如通过病毒载体中所含的cDNA在病毒载体内编码的分子在已接受病毒载体核酸的细胞中有效表达。
可以将逆转录病毒载体和腺病毒伴随病毒载体用作用于将外源基因在体内特定转移到人体内的重组基因递送系统。这些载体提供基因到细胞的有效递送，且将转移的核酸稳定整合到宿主的染色体DNA中。产生重组逆转录病毒和用这类病毒体外或体内感染细胞的方案可以见于Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等(编)Greene Publishing Associates(1989)，9.10-9.14部分及其它标准物实验手册中。合适逆转录病毒的实例包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它们对为本领域的技术人员是已知的。用于制备同向性逆转录病毒系统和双嗜性逆转录病毒系统的合适的包装病毒细胞系的实例包括Crip、Cre、2和Am。逆转录病毒已经用于将多种基因在体外和/或体内引入许多不同类型的细胞中，包括上皮细胞(参见，例如Eglitis等，(1985)Science 230:1395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464；Wilson等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018；Armentano等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6141-6145；Huber等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8039-8043；Ferry等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381；Chowdhury等，(1991)Science 254:1802-1805；vanBeusechem等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644；Kay等，(1992)HumanGene Therapy 3:641-647；Dai等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895；Hwu等，(1993)J.Immunol.150:4104-4115；美国专利No.4,868,116和No.4,980,286；PCT公开No.WO 89/07136、No.WO 89/02468、No.WO 89/05345和No.WO 92/07573)。
另一病毒基因递送系统利用腺病毒衍生的载体。参见，例如Berkner等，(1988)BioTechniques 6:616；Rosenfeld等，(1991)Science 252:431-434；和Rosenfeld等，(1992)Cell 68:143-155。自腺病毒株Ad 5型d1324或其它腺病毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)衍生的合适腺病毒载体是本领域的技术人员已知的。
可用于递送题述基因的又一病毒载体系统为腺病毒伴随病毒(AAV)。参见，例如Flotte等，(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356；Samulski等，(1989)J.Virol.63:3822-3828；和McLaughlin等，(1989)J.Virol.62:1963-1973。
药物组合物
本文描绘的组合物包含本文描绘的化合物以及以有效实现疾病或疾病症状(包括本文所述的那些)的调节的其它治疗剂(如果存在)。
术语“药学上可接受的载体或佐剂”是指可以与本发明的化合物一起施用给患者并且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时不会破坏其药理学活性且无毒的载体或佐剂。
可以用在本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物包括但不限于离子交换剂；氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；自乳化药物递送系统(SEDDS)，诸如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸；药物剂型中使用的表面活性剂，诸如吐温或其它类似的聚合递送基质；血清蛋白质，诸如人血清白蛋白；缓冲物质，如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐；或电解液，诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、石蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精(诸如α-、β-和γ-环糊精)或化学修饰的衍生物(诸如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精)或其它溶解的衍生物也可以有利地用以增强本文所述式的化合物的递送。
可以将含有IDH(例如IDH1)的抑制剂的药物组合物直接施用到中枢神经系统，诸如施用到脑脊髓液或脑中。递送可以例如以丸剂形式或通过连续泵输注进行。在某些实施方案中，递送通过鞘内递送或通过脑室内注射直接递送到脑中。导管和任选的泵可用于递送。抑制剂可以在可植入装置中递送并从其中释放，所述可植入装置例如为与肿瘤组织的手术去除联合而植入的装置。例如，为了递送到脑中，所述递送可以类似于用Gliadel的递送，所述Gliadel为生物聚合物膜片，其被设计用来将卡莫司汀直接递送到在切除脑肿瘤之后产生的手术空腔中。所述Gliadel膜片缓慢溶解并递送卡莫司汀。
例如，可以使用泵和/或导管系统将本文公开的治疗剂(例如，基于核酸抑制剂，例如siRNA)直接施用到CNS，例如脑。在一个实施方案中，将泵植入皮肤下面。在一个实施方案中，且将与泵连接的导管插入CNS中，例如插入脑或脊柱中。在一个实施方案中，泵(诸如得自Medtronic的IsoMed药物泵)递送基于核酸的抑制剂的剂量，例如恒定剂量。在一个实施方案中，所述泵是程序控制的，以便在预定时间间隔施用可变或恒定的剂量。例如，得自Medtronic的IsoMed药物泵(或类似装置)可以用以施用恒定供应的抑制剂，或SynchroMedII药物泵(或类似装置)可以用以施用可变剂量方案。
美国专利7,044,932、6,620,151、6,283949和6,685,452中描述的方法和装置可以用于本文所述的方法中。
本发明的药物组合物可以经口、肠道外、通过吸入、局部、直肠、鼻、口腔、阴道或通过植入的储罐施用，优选通过口服或注射施用。本发明的药物组合物可含有任何常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。在一些情况下，可以用药学上可接受的酸、碱或缓冲剂调节制剂的pH以增强所配制化合物或其递送形式的稳定性。本文使用的术语肠道外包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
所述药物组合物可以是无菌可注射制剂形式，例如，作为无菌可注射水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散或湿润剂(诸如吐温80)和悬浮剂来配制。所述无菌可注射制剂也可以是无毒的肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。其中，可以使用的可接受的媒介物和溶剂为甘露醇、水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。另外，通常将无菌的不挥发性油用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的硬化油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯的。脂肪酸(诸如油酸及其甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，正如天然的药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或通常用于配制药学上可接受的剂型(诸如乳剂和/或悬浮液)的羧甲基纤维素或类似分散剂。出于配制的目的，也可以使用其它常用的表面活性剂(诸如吐温类或斯潘(Span))和/或其它类似乳化剂或通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其它剂型的生物可用性增强剂。
本发明的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型经口施用，所述剂型包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水性悬浮液、分散液和溶液。在片剂供口服使用的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也可以加入润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊形式经口施用来说，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当经口施用水性悬浮液和/或乳剂时，可以使活性成分悬浮或溶解于与乳化剂和/或悬浮剂结合的油相中。如果需要，则可以加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。
本发明的药物组合物也可以以用于直肠施用的栓剂形式施用。可以通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中熔化以释放活性组分。这类材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
在所需治疗涉及可通过局部施用而容易到达的区域或器官时，可使用本发明的药物组合物的局部施用。对于局部施用到皮肤，应该用含有悬浮或溶解于载体中的活性组分的合适软膏配制药物组合物。用于局部施用本发明的化合物的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，所述药物组合物可以用含有活性化合物的合适洗液或乳膏配制，所述活性化合物用合适的乳化剂悬浮或溶解于载体中。合适的载体包括但不限于矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、十六烷基酯蜡、十六硬脂酸酯、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本发明的药物组合物也可以通过直肠栓剂剂型或以合适的灌肠剂剂型局部施用到下肠道。局部透皮贴剂也包括在本发明中。
本发明的药物组合物可以通过鼻气雾剂或吸入施用。这类组合物根据药物配制领域中熟知的技术制备且可以使用苯甲醇或其它合适的防腐剂、增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其它增溶或分散剂制备为盐水中的溶液。
在本发明的组合物包含本文所述的式的化合物与一种或多种另外治疗剂或预防剂的组合时，所述化合物和所述另外试剂二者应该以单一疗法方案中通常施用剂量的约1-100％且更优选约5-95％的剂量水平存在。所述另外试剂可以作为多次剂量方案的一部分与本发明的化合物单独施用。或者，那些试剂可以是与在单组合物中的本发明化合物混合在一起的单剂型的一部分。
本文所述的化合物可以例如通过静脉内、动脉内、皮下(subdermally)、腹腔内、肌肉内或皮下(subcutaneously)注射施用；或经口、口腔、鼻、透粘膜、局部施用；以眼用制剂施用；或通过吸入施用，其中剂量范围为约0.02至约100mg/kg体重，或者剂量介于1mg和1000mg/剂，每4至120小时，或根据特定药物的要求。本文的方法预期施用有效量的化合物或化合物组合物以实现期望的或规定的效应。通常，本发明的药物组合物将每日约1至约6次或者以连续输注形式施用。这类施用可以用作慢性疗法或急性疗法。可以与载体材料组合以生成单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和特定施用模式而改变。典型制剂将含有约5％至约95％的活性化合物(w/w)。或者，这类制剂含有约20％至约80％的活性化合物。
可能需要比上述剂量更高或更低的剂量。对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、疾病、病状或症状的严重性和过程、疾病、病状或症状的患者处置和治疗医师的判断。
在改善患者的病状时，如果需要，可以施用维持剂量的本发明的化合物、组合物或组合。随后，可以根据症状将施用的剂量或频率或二者降低到在症状已经缓解到期望水平时保持改善的病状的水平。然而，在疾病症状任何复发时患者可能需要基于长期的间歇治疗。
试剂盒
本文所述的化合物可以提供在试剂盒中。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含(a)本文所述的化合物，例如包含本文所述化合物的组合物(其中，例如所述化合物可为本文所述的抑制剂)，和任选地(b)信息材料。所述信息材料可以是涉及本文所述的方法和/或本文所述的化合物的用途的描述性、指导性、销售性或其它材料。
在一个实施方案中，所述试剂盒提供用于评估受试者的材料。所述评估可以例如用于：鉴定具有有害水平(例如比正常或野生型细胞中存在的水平高)的2HG、2HG新活性或具有2HG新活性的突变IDH1或IDH2蛋白质(或相应RNA)，或具有以2HG新活性为特征的IDH1或IDH2的体细胞突变中的任一者的受试者；例如基于具有增加水平的2HG、2HG新活性或具有2HG新活性的突变IDH1或IDH2蛋白质(或相应RNA)，或具有以2HG新活性为特征的IDH1或IDH2的体细胞突变，对受试者进行诊断、预后或分期；例如基于具有增加水平的2HG、2HG新活性或具有2HG新活性的突变IDH1或IDH2蛋白质(或相应RNA)，或具有以2HG新活性为特征的IDH1或IDH2的体细胞突变的受试者，选择治疗或评估治疗的功效。所述试剂盒可以包含用于评估的一种或多种试剂，例如在本文的其它地方提到的试剂。可以包含检测试剂，例如，抗体或其它特异性结合试剂。可以包含标准物或参考样本，例如阳性或阴性对照标准物。例如，如果评估基于2HG的存在，则所述试剂盒可以包含用于测定(例如LC-MS测定)的试剂，例如阳性或阴性对照标准物。
如果评估基于2HG新活性的存在，则试剂盒可以包含用于测定2HG新活性的试剂，例如在本文的其它地方提到的那些试剂中的一种或多种。如果评估是基于测序，则试剂盒可以包含用于对相关核酸进行测序以用于鉴定IHD(例如IDH1或IDH2)新活性突变体的引物或其它物质。例如，所述试剂盒可以含有以供同一性讯问(即IDH1的残基132的测序)以测定新活性突变体是否存在的试剂。所述试剂盒可以包含核酸，例如低聚体，例如引物，其允许对编码IDH1的残基132的核苷酸进行测序。在一个实施方案中，所述试剂盒包含核酸，所述核酸的杂交或被扩增的能力取决于IDH1的残基132的同一性。在其它实施方案中，所述试剂盒包含试剂，例如可以鉴定新活性突变体(例如由在IDH1的132处的新活性突变体编码的蛋白质)的存在的抗体或其它特异性结合分子。如下所述，试剂盒也可以包含缓冲剂、溶剂和与评估相关的信息。
在一个实施方案中，所述信息材料可以包括关于化合物生产、化合物分子量、浓度、有效日期、批次或生产地址信息等的信息。在一个实施方案中，所述信息材料涉及施用化合物的方法。
在一个实施方案中，所述信息材料可以包括以合适的方式施用本文所述化合物的说明以进行本文所述的方法，例如以合适的施用剂量、剂型或模式(例如本文所述的施用剂量、剂型或模式)。在另一实施方案中，所述信息材料可以包括对合适的受试者(例如人，例如患有本文所述病症或处于本文所述病症的风险中的人)施用本文所述化合物的说明。
所述试剂盒的信息材料在其形式方面不受限制。在很多情况下，所述信息材料(例如说明)以印刷品，例如印刷文本、图画和/或照片，例如标签或印刷纸张提供。然而，所述信息材料也可以以其它格式提供，诸如盲文、计算机可读材料、视频记录或录音。在另一实施方案中，所述试剂盒的信息材料为联系信息，例如实际地址、电子邮件地址、网址或电话号码，其中所述试剂盒的使用者可以获得关于本文所述化合物和/或其在本文所述方法中的用途的大量信息。当然，所述信息材料也可以以格式的任何组合提供。
除了本文所述的化合物之外，所述试剂盒的组合物可以包含其它成分，诸如溶剂或缓冲剂、稳定剂、防腐剂、调味剂(例如苦味拮抗剂或甜味剂)、香料或其它化妆品成分和/或用于治疗本文所述的病状或病症的第二药剂。或者，除了本文所述的化合物之外，其它成分可以包含在试剂盒中，但在不同组合物或容器中。在这类实施方案中，所述试剂盒可以包含用于将本文所述化合物与所述其它成分混合或用于与其它成分一起使用本文所述化合物的说明。
本文所述的化合物可以以任何形式(例如液态、干燥或冻干形式)提供。优选本文所述的化合物为基本纯和/或无菌的。当本文所述的化合物以液体溶液提供时，所述液体溶液优选为水溶液，优选无菌水溶液。当本文所述的化合物以干燥形式提供时，通常通过加入合适的溶剂来进行重构。所述溶剂(例如无菌水或缓冲剂)可以任选地提供于试剂盒中。
所述试剂盒可以包括用于供含有本文所述化合物的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，所述试剂盒含有用于组合物和信息材料的单独容器、分配器或隔室。例如，所述组合物可以容纳在瓶子、小瓶或注射器中，且所述信息材料可以容纳在塑料套管或封包中。在其它实施方案中，所述试剂盒的单独元件容纳在单独未分开的容器内。例如，所述组合物容纳在具有以标签形式附着到其上的信息材料的瓶子、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多个(例如一包)单独容器，其各自包含本文所述化合物的一个或多个单位剂型(例如本文所述的剂型)。例如，所述试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔封包或泡罩包装，其各自含有本文所述化合物的单个单位剂量。所述试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如，对水分或蒸发的改变是不可渗透的)和/或不透光的。
所述试剂盒任选地包括适合施用组合物的装置，例如注射器、吸入器、移液管、镊子、计量药匙、滴管(例如眼滴管)、拭子(例如棉拭子或木拭子)或任何这类递送装置。在一个实施方案中，所述装置为例如封装的用于手术插入的医学植入装置。
组合疗法
在一些实施方案中，将本文所述的化合物或组合物与另外的癌症治疗一起施用。示例性的癌症治疗包括例如：手术、化学疗法、靶向疗法(诸如抗体疗法)、免疫疗法和激素疗法。以下提供这些治疗中的每一种的实例。
化学疗法
在一些实施方案中，将本文所述的化合物或组合物与化学疗法一起施用。化学疗法为用可破坏癌细胞的药物治疗癌症。“化学疗法”通常是指通常影响迅速分裂的细胞的细胞毒素药物，与靶向疗法形成对比。化学疗法药物以各种可能的方式干扰细胞分裂，例如干扰DNA的复制或新形成的染色体的分离。大多数形式的化学疗法靶向所有迅速分裂细胞且对癌细胞没有特异性，尽管一定程度的特异性可来自使许多癌细胞不能修复DNA损伤，而正常细胞通常可以修复DNA损伤。
在癌症治疗中使用的化疗剂的实例包括例如抗代谢物(例如，叶酸、嘌呤和嘧啶衍生物)和烷化剂(例如氮芥、亚硝基脲、铂、烷基磺酸盐、肼、三氮烯、氮丙啶、纺锤体抑制剂、细胞毒素剂、拓扑异构酶抑制剂等)。示例性的药剂包括阿柔比星(Aclarubicin)、放线菌素(Actinomycin)、阿维A酸(Alitretinon)、六甲蜜胺(Altretamine)、氨基喋呤(Aminopterin)、氨基酮戊酸(Aminolevulinic acid)、氨柔比星(Amrubicin)、安吖啶(Amsacrine)、阿那格雷(Anagrelide)、三氧化二砷、天门冬酰胺酶、阿曲生坦(Atrasentan)、贝洛替康(Belotecan)、蓓萨罗丁(Bexarotene)、苯达莫司汀(endamustine)、博来霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、白消安(Busulfan)、喜树碱(Camptothecin)、卡培他滨(Capecitabine)、卡铂(Carboplatin)、卡波醌(Carboquone)、卡莫氟(Carmofur)、卡莫司汀(Carmustine)、塞来昔布(Celecoxib)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、氮芥(Chlormethine)、顺铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、左旋门冬酰胺酶(Crisantaspase)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、氮烯咪胺(Dacarbazine)、放线菌素D(Dactinomycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、地西他滨(Decitabine)、秋水仙胺(Demecolcine)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、多柔比星(Doxorubicin)、乙丙昔罗(Efaproxiral)、伊利司莫(Elesclomol)、依沙芦星(Elsamitrucin)、依诺他滨(Enocitabine)、表柔比星(Epirubicin)、雌莫司汀(Estramustine)、依托格鲁(Etoglucid)、依托泊苷(Etoposide)、氮尿苷(Floxuridine)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil，5FU)、福莫司汀(Fotemustine)、吉西他宾(Gemcitabine)、Gliadel植入物、羟基脲(Hydroxycarbamide)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊立替康(Irinotecan)、伊洛福芬(Irofulven)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、拉洛他赛(Larotaxel)、亚叶酸(Leucovorin)、多柔比星脂质体、柔红霉素脂质体、氯尼达明(Lonidamine)、洛莫司汀(Lomustine)、硫蒽酮(Lucanthone)、甘露舒凡(Mannosulfan)、马索罗酚(Masoprocol)、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、美司钠(Mesna)、甲氨喋呤(Methotrexate)、氨乙酰丙酸甲酯(Methyl aminolevulinate)、二溴甘露醇(Mitobronitol)、米托胍腙(Mitoguazone)、米托坦(Mitotane)、丝裂霉素(Mitomycin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、奈达铂(Nedaplatin)、尼莫司汀(Nimustine)、奥利默森纳(Oblimersen)、奥马他辛(Omacetaxine)、欧塔紫杉醇(Ortataxel)、奥克赛铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、培门冬酶(Pegaspargase)、培美曲塞(Pemetrexed)、喷司他丁(Pentostatin)、吡柔比星(Pirarubicin)、匹杉琼(Pixantrone)、普卡霉素(Plicamycin)、卟吩姆钠(Porfimer sodium)、泼尼莫司汀(Prednimustine)、甲基苄肼(Procarbazine)、雷替曲赛(Raltitrexed)、雷诺莫司汀(Ranimustine)、鲁比替康(Rubitecan)、沙帕他滨(Sapacitabine)、司莫司汀(Semustine)、腺病毒载体定位码基因注射剂(Sitimagene ceradenovec)、沙铂(Strataplatin)、链佐星(Streptozocin)、他拉泊芬(Talaporfin)、替加氟-尿嘧啶(Tegafur-uracil)、替莫泊芬(Temoporfin)、替莫唑胺、替尼泊苷(Teniposide)、紫杉烷类(Tesetaxel)、睾内酯、四硝酸酯、塞替派(Thiotepa)、噻唑呋林(Tiazofurine)、硫鸟嘌呤、替吡法尼(Tipifarnib)、拓扑替康、曲贝替定(Trabectedin)、三亚胺醌(Triaziquone)、曲他胺(Triethylenemelamine)、三铂(Triplatin)、维A酸(Tretinoin)、曲奥舒凡(Treosulfan)、曲洛磷胺(Trofosfamide)、乌拉莫司汀(Uramustine)、伐柔比星(Valrubicin)、维替泊芬(Verteporfin)、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、长春氟宁(Vinflunine)、长春瑞宾(Vinorelbine)、伏立诺他(Vorinostat)、左柔比星(Zorubicin)及本文所述的其它细胞抑制或细胞毒素剂。
因为一些药物一起作用时比单独作用要好，因此通常同时提供两种或更多种药物。通常，将两种或更多种化学化学治疗剂用作组合化学疗法。在一些实施方案中，所述化学治疗剂(包括组合化学疗法)可以与本文所述的化合物(例如，苯乙双胍)组合使用。
靶向疗法
在一些实施方案中，将本文所述的化合物或组合物与靶向疗法一起施用。靶向疗法构成对癌细胞的解除控制的蛋白质具有特异性的药剂的用途。小分子靶向治疗药物通常是在癌细胞内的突变、过度表达或另外关键的蛋白质上的酶结构域的抑制剂。突出的实例为酪氨酸激酶抑制剂，诸如阿西替尼(Axitinib)、博舒替尼(Bosutinib)、西地尼布(Cediranib)、达沙替尼(desatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来他替尼(Lestaurtinib)、尼罗替尼(Nilotinib)、司马沙尼(Semaxanib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)和凡德他尼(Nilotinib)以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，诸如夫拉平度(Alvocidib)和塞利西利(Seliciclib)。单克隆抗体疗法为其中治疗剂为与癌细胞表面上的蛋白质特异性结合的抗体的另一策略。实例包括通常用于乳腺癌的抗-HER2/neu抗体曲妥珠单抗(trastuzumab，)和通常用于多种B细胞恶性肿瘤的抗-CD20抗体利妥昔单抗(rituximab)和托西莫单抗(Tositumomab)。其它示例性的抗体包括西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)、曲妥珠单抗、阿仑单抗(Alemtuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、依决洛单抗(Edrecolomab)和吉妥单抗(Gemtuzumab)。示例性的融合蛋白包括阿柏西普(Aflibercept)和地尼白介素(Denileukin diftitox)。在一些实施方案中，所述靶向疗法可以与本文所述的化合物(例如双胍，诸如二甲双胍或苯乙双胍，优选苯乙双胍)组合使用。
靶向疗法还可以涉及可以与细胞表面受体或肿瘤周围受影响的细胞外基质结合的作为“引导装置”的小肽。如果与这些肽连接的放射性核素(例如RGD)在细胞附近衰变，则所述核素最终杀死癌细胞。这类疗法的实例包括
免疫疗法
在一些实施方案中，将本文所述的化合物或组合物与免疫疗法一起施用。癌症免疫疗法是指设计用来诱导患者自身的免疫系统抗击肿瘤的不同组的治疗策略。用于产生对抗肿瘤的免疫响应的当前方法包括用于表浅性膀胱癌的血管内BCG免疫疗法和使用干扰素及其它细胞因子以诱导肾细胞癌和黑素瘤患者中的免疫响应。
同种异体造血干细胞移植可被认为是一种形式的免疫疗法，因为供体免疫细胞常以移植物-对-肿瘤效应攻击肿瘤。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂可以与本文所述的化合物或组合物组合使用。
激素疗法
在一些实施方案中，将本文所述的化合物或组合物与激素疗法一起施用。可以通过提供或阻断某些激素而抑制一些癌症的生长。激素敏感性肿瘤的常见实例包括某些类型的乳腺癌和前列腺癌。除去或阻断雌激素或睾酮常常是重要的附加治疗。在某些癌症中，激素激动剂(诸如孕激素)的施用在治疗上可以是有益的。在一些实施方案中，所述激素治疗剂可以与本文所述的化合物或组合物组合使用。
在一些实施方案中，在治疗神经系统中的癌症(例如中枢神经系统中的癌症，例如脑肿瘤，例如胶质瘤，例如多形性胶质母细胞瘤(GBM))中，将本文所述的化合物或组合物与另外的癌症治疗(例如手术切除)一起施用。
若干研究已经表明多于25％的胶质母细胞瘤患者从辅助化学疗法获得了显著的存活率益处。荟萃分析(meta-analyse)已经表明辅助化学疗法引起一年存活率增加6-10％。
替莫唑胺是用于新近诊断为患有多形性胶质母细胞瘤的人的口服活性烷化剂。其在2005年3月已经被美国食品和药物管理局(FDA)批准。研究已显示该药物耐受性良好且提供存活益处。佐剂和伴随的替莫唑胺与辐射一起与以下方面的显著改善相关：相对于单独辐射，中值无进展的生存率(6.9对5个月)、总生存率(14.6对12.1个月)和2年生存的可能性(26％对10％)。
亚硝基脲：BCNU(卡莫司汀)-聚合物膜片(Gliadel)在2002年已被FDA批准。虽然Gliadel膜片被一些人用于初步治疗，但是它们在最大的这种III期试验中在中值存活率方面仅显示了相对于对照剂的适度增加(13.8对11.6个月)，且与CSF渗漏速率增加及继发于水肿和质量效应的颅内压增加相关。
MGMT为促进替莫唑胺抗性的DNA修复酶。在约45％的胶质母细胞瘤多态型中发现的MGMT启动子的甲基化引起基因的表观遗传沉默、降低肿瘤细胞的DNA修复能力和增加对替莫唑胺的敏感性。
当具有和没有MGMT启动子甲基化的患者用替莫唑胺治疗时，小组分别具有21.7个月对12.7个月的中值生存率和46％对13.8％的2年存活率。
虽然替莫唑胺是目前治疗多形性胶质母细胞瘤的一线药剂，但是不利的MGMT甲基化状况能够有助于选择适于将来治疗调查研究的患者。
O6-苄基鸟嘌呤和MGMT的其它抑制剂以及MGMT的RNA干扰介导的沉默提供用以增加替莫唑胺及其它烷基化抗肿瘤药的有效性的有前途的方法，且这类试剂处于活性研究中。
卡莫司汀(BCNU)和顺铂已经是针对恶性胶质瘤而使用的原始化疗剂。使用的所有药剂具有不大于30-40％的响应率，且大部分落入10-20％的范围。
得自旧金山加利福尼亚大学的数据表明，对于胶质母细胞瘤的治疗，手术和随后的放射疗法引起1年存活率、3年存活率和5年存活率分别为44％、6％和0％。比较起来，手术和随后的放射疗法和使用基于亚硝基脲的方案的化学疗法引起1年存活率、3年存活率和5年存活率分别为46％、18％和18％。
对脑肿瘤使用化疗剂的一个主要障碍在于血脑屏障(BBB)将许多药剂有效地排除在CNS之外。为此，正在研发颅内药物递送的新方法以将较高浓度的化疗剂递送到肿瘤细胞，而同时避免这些药物的不利的全身效应。
通过颅内导管由压力驱动的化疗剂的输注(也称作增强对流递送(CED))具有沿压力梯度而不是通过单纯扩散递送药物的优势。用药剂(包括BCNU和拓扑替康)，CED已经在动物模型中显示有前途的结果。
最初试图研究经动脉内路径而不是静脉内路径递送化疗剂。遗憾的是没有观察到存活优势。
用于复发性多形性胶质母细胞瘤的化学疗法提供适度的(如果有的话)益处，且使用了若干种药剂。在一个有222名患者的随机研究中，卡莫司汀膜片相对于对照剂使6月存活率从36％增加到56％，尽管在治疗组和严重颅内感染之间存在显著关联。
测定脑肿瘤的基因型可以应用于分类针对各种新疗法的临床试验层的患者。
当与伊立替康一起使用时，抗血管生成剂贝伐单抗使复发性胶质瘤患者的6月存活率提高到46％(与用替莫唑胺治疗的患者的21％相比较)。已经显示用于复发性多形性胶质母细胞瘤的该贝伐单抗与伊立替康的组合相对于单独的贝伐单抗提高了存活率。抗血管生成剂也减少了瘤周水肿，可能减少必需的皮质类固醇剂量。
一些胶质母细胞瘤响应吉非替尼或厄洛替尼(酪氨酸激酶抑制剂)。突变EGFR(EGFRviii)和PTEN在胶质母细胞瘤细胞中的同时存在与对酪氨酸激酶抑制剂的响应相关，而p-akt增加预示着效应降低。其它靶标包括PDGFR、VEGFR、mTOR、法呢酰基转移酶(farnesyltransferase)和PI3K。
其它可能的治疗方式包括伊马替尼、基因疗法、肽和树突细胞疫苗、合成的氯毒素和放射性标记的药物和抗体。
患者选择/监测
本文描述了治疗受试者体内的细胞增殖相关病症(例如癌症)的方法和鉴定适于本文所述治疗的受试者的方法。本文还描述了预测处于发展中的癌症(例如与酶(例如代谢途径中的酶，诸如IDH1和/或IDH2)的突变有关的癌症)的风险中的受试者的方法。所述癌症以一种或多种突变酶(例如，代谢途径(例如，导致脂肪酸生物合成的代谢途径、糖酵解、谷氨酰胺代谢、磷酸戊糖支路、核苷酸生物合成途径或脂肪酸生物合成途径)中的酶，例如IDH1或IDH2)中存在新活性，诸如增加的功能为特征。可以基于受试者具有具有新活性(例如本文所述的新活性)的突变基因来选择所述受试者。本文使用的“选择”是指全部或部分地在所述基础上选择。
在一些实施方案中，基于测定受试者具有本文所述的突变酶(例如，代谢途径(例如导致脂肪酸生物合成的代谢途径、糖酵解、谷氨酰胺代谢、磷酸戊糖支路、核苷酸生物合成途径或脂肪酸生物合成途径)中的酶，例如IDH1或IDH2)来选择对于用本文所述的化合物的治疗的受试者。在一些实施方案中，所述突变酶具有新活性且在该基础上选择患者。所述酶的新活性可以例如通过评估受试者或得自其的样本(例如组织或体液)的所述酶的底物、辅因子和/或产物的存在或量来鉴定。底物、辅因子和/或产物的存在和/或量可以对应于野生型/非突变活性或可以对应于酶的新活性。可以用于鉴别(例如评估)酶的新活性的示例性体液包括胎儿周围的羊水、水状液、血液(例如血浆)、脑脊髓液、耳垢、食糜、考珀液(Cowper's fluid)、女性射出液、间质液、淋巴液、乳汁、粘液(例如鼻排液或痰)、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物或呕吐物。
在一些实施方案中，可以使用磁共振来评估受试者的酶的新活性。例如，在突变酶为IDH1或IDH2且新活性为使α-酮戊二酸转化为2-羟基戊二酸的情况下，可以评估受试者的2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)的存在和/或相对于没有具有上述新活性的IDH1或IDH2的突变的受试者中存在的2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)的量来说升高量的2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)。在一些实施方案中，可以通过如由磁共振测定的对应于2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)的峰的存在或量升高来测定IDH1或IDH2的新活性。例如，可以评估受试者的约2.5ppm下的信号的存在和/或强度以测定在所述受试者体内2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸)的存在和/或量。这可以与本文对于突变酶IDH所述的新活性相关和/或预示该新活性。类似地，在约2.5ppm下的信号的存在、强度和/或缺乏可以预示对治疗的响应且由此用作临床反应的非侵害性生物标志。
也可以使用本领域的技术人员已知的其它技术来评估突变酶(诸如IDH)的新活性。例如，可以测量标记的底物、辅因子和/或反应产物的存在或量，诸如13C或14C标记的底物、辅因子和/或反应产物。可以通过评估野生型/非突变酶的正向反应(诸如突变IDH1或IDH2酶(具体为突变IDH1酶)为异柠檬酸氧化脱羧为α-酮戊二酸)和/或对应于新活性的反应(例如，突变IDH1或IDH2酶(具体为突变IDH1酶)为α-酮戊二酸转化为2-羟基戊二酸(例如R-2-羟基戊二酸))来评估所述新活性。
病症
本文公开的IDH相关方法(例如评估或治疗受试者的方法)针对患有以IDH突变体(例如具有新活性(例如2HG新活性)的IDH1或IDH2突变体)为特征的细胞增殖相关病症的受试者。已经显示一些以下病症的实例以IDH1或IDH2突变为特征。其它可以例如通过对细胞样本测序以测定在IDH1的氨基酸132处或在IDH2的氨基酸172处存在体细胞突变来分析。在不受理论束缚的情况下，预期给定类型癌症的一部分肿瘤将具有有2HG新活性的IDH(例如IDH1或IDH2)突变体。
所公开的方法可用于评估或治疗增殖病症，例如评估或治疗实体肿瘤、软组织肿瘤及其转移，其中所述实体肿瘤、软组织肿瘤或其转移为本文所述的癌症。示例性的实体肿瘤包括各种器官系统的恶性肿瘤(例如，肉瘤、腺癌和癌)，诸如脑、肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)及泌尿生殖(例如肾、泌尿上皮或睾丸肿瘤)道、咽、前列腺和卵巢的恶性肿瘤。示例性的腺癌包括结肠直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺非小细胞癌瘤和小肠癌症。所公开的方法也可用于评估或治疗非实体癌症。
本文所述的方法可以与任何癌症(例如由国家癌症研究所描述的那些)一起使用。可以评估癌症以测定其是否使用本文所述的方法。由国家癌症研究所描述的示例性癌症包括：成人急性淋巴母细胞性白血病；儿童急性淋巴母细胞性白血病；成人急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；AIDS相关淋巴瘤；AIDS相关恶性肿瘤；肛门癌；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤；肝外胆管癌；膀胱癌；儿童膀胱癌；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童脑干胶质瘤；成人脑肿瘤；儿童脑肿瘤脑干胶质瘤；儿童脑肿瘤小脑星形细胞瘤；儿童脑肿瘤大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；儿童脑肿瘤室管膜瘤；儿童脑肿瘤髓母细胞瘤；儿童幕上原始神经外胚叶瘤肿瘤；儿童脑肿瘤视路和下丘脑胶质瘤；儿童脑肿瘤(其它)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；儿童乳腺癌；男性乳腺癌；儿童支气管腺瘤/类癌瘤；儿童类癌瘤肿瘤；肠胃类癌瘤肿瘤；肾上腺皮质癌；小岛细胞癌；未知原发性癌；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性脊髓增殖病症；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；儿童结肠直肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；儿童室管膜瘤；卵巢上皮癌；食道癌；儿童食道癌；尤文氏肿瘤(Ewing's Family of Tumor)；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌眼内黑素瘤；眼癌成视网膜细胞瘤；胆囊癌；胃癌；儿童胃癌；胃肠道类癌肿瘤；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；妊娠期滋养叶瘤；儿童脑干胶质瘤；儿童视路和下丘脑胶质瘤；毛细胞白血病；头颈部癌；成人(原发性)肝细胞性(肝)癌；儿童(原发性)肝细胞性(肝)；成人何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin'sLymphoma)；儿童何杰金氏淋巴瘤；妊娠期何杰金氏淋巴瘤；咽下部癌；儿童下丘脑和视路胶质瘤；眼内黑素瘤；小岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤(Kaposi's Sarcoma)；肾癌；喉癌；儿童喉癌；成人急性成淋巴细胞白血病；儿童急性成淋巴细胞白血病；成人急性骨髓性白血病；儿童急性骨髓性白血病；慢性淋巴细胞白血病；慢性骨髓性白血病；毛细胞白血病；唇和口腔癌；成人(原发性)肝癌；儿童(原发性)肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；成人急性成淋巴细胞白血病；儿童急性成淋巴细胞白血病；慢性淋巴细胞白血症；AIDS相关淋巴瘤；中枢神经系统(原发性)淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；成人何杰金氏淋巴瘤；儿童何杰金氏淋巴瘤；妊娠期何杰金氏淋巴瘤；成人非何杰金氏淋巴瘤；儿童非何杰金氏淋巴瘤；妊娠期非何杰金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Macroglobulinemia,Waldenstrom's)；男性乳腺癌；成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童髓母细胞瘤；黑素瘤；眼内黑素瘤；默克尔细胞癌(Merkel CellCarcinoma)；恶性间皮瘤；具有隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌；儿童多发性内分泌瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；阿利贝尔氏病(Mycosis Fungoides)；脊髓发育不良综合征；慢性骨髓性白血病；儿童急性骨髓性白血病；多发性骨髓瘤；慢性脊髓增殖病症；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；儿童鼻咽癌；神经母细胞瘤；成人非何杰金氏淋巴瘤；儿童非何杰金氏淋巴瘤；妊娠期非何杰金氏淋巴瘤；非小细胞肺癌；儿童口腔癌；口腔和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性度肿瘤；胰腺癌；儿童胰腺癌；小岛细胞胰腺癌；鼻窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；儿童松果状和幕上原始神经外胚叶瘤肿瘤；垂体瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺胚细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和何杰金氏淋巴瘤；妊娠和非何杰金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；成人原发性肝癌；儿童原发性肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；成视网膜细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾腺癌；儿童唾腺癌；肉瘤尤文氏肿瘤肉瘤；卡波济氏肉瘤(Sarcoma,Kaposi's)；(骨肉瘤)/骨恶性纤维组织细胞瘤肉瘤；儿童横纹肌肉瘤肉瘤；成人软组织肉瘤；儿童软组织肉瘤；赛谢综合征(SezarySyndrome)；皮肤癌；儿童皮肤癌；皮肤癌(黑素瘤)；默克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；成人软组织肉瘤癌；儿童软组织肉瘤癌；具有隐匿性原发性转移性的鳞状颈癌；胃癌；儿童胃癌；儿童幕上原始神经外胚叶瘤肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；睾丸癌；儿童胸腺瘤；恶性胸腺瘤；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；妊娠期滋养叶瘤；儿童未知原发性部位癌症；儿童的罕见癌症；输尿管和肾盂移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视路和下丘脑胶质瘤；外阴癌；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；和韦尔姆斯氏瘤(Wilms'Tumor)。根据本文所述的方法也可以治疗或预防上述癌症的转移。
例如通过抑制突变酶(例如，代谢途径(例如导致脂肪酸生物合成的代谢途径、糖酵解、谷氨酰胺代谢、磷酸戊糖支路、核苷酸生物合成途径或脂肪酸生物合成途径)中的酶，例如IDH1或IDH2)的新活性，本文所述的方法可用于治疗神经系统中的癌症，例如脑肿瘤，例如胶质瘤，例如多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
可以根据由世界健康组织(WHO)确立的组织病理学和临床标准将胶质瘤(一种类型的脑肿瘤)分类为I级-IV级。通常认为WHO I级胶质瘤为良性的。WHO II或III级胶质瘤是侵害性的，进展到较高等级的病变。WHO IV级肿瘤(胶质母细胞瘤)是最具侵害性的形式。示例性的脑肿瘤包括例如星形细胞肿瘤(例如纤维性星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤、星形细胞瘤、巨细胞胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤、继发性胶质母细胞瘤、原发性成人胶质母细胞瘤和原发性儿科胶质母细胞瘤)；少突胶质细胞肿瘤(例如，少突神经胶质瘤和多形性少突神经胶质瘤)；少突星形细胞肿瘤(例如少突星形细胞瘤和退行性少突星形细胞瘤)；室管膜瘤(例如，粘液乳头状室管膜瘤和退行性室管膜瘤)；髓母细胞瘤；原发性神经外胚叶瘤、许旺氏细胞瘤(schwannoma)、脑膜瘤、非典型性脑膜瘤、退行性脑膜瘤；和垂体腺瘤。示例性的癌症描述在Acta Neuropathol(2008)116:597-602和NEngl J Med.2009年2月19日；360(8):765-73中，其内容各自以引用的方式并入本文。
在实施方案中，所述病症为胶质母细胞瘤。
在一个实施方案中，所述病症为前列腺癌，例如在TNM分期系统上的T1(例如T1a、T1b和T1c)、T2(例如T2a、T2b和T2c)、T3(例如T3a和T3b)和T4期。在实施方案中，所述前列腺癌为G1、G2、G3或G4级(其中数字越大表明与正常组织差别越大)。前列腺癌的类型包括例如前列腺腺癌、小细胞癌、鳞状癌、肉瘤和移行细胞癌。
本发明的方法和组合物可以与本领域已知的治疗相结合。对于前列腺癌的本领域已知的治疗可以包括例如主动监视；手术(例如根治性前列腺切除术、经尿道前列腺切除、睾丸切除术和冷冻手术)；放射疗法，包括短程疗法(前列腺短程疗法)和外放射疗法；高强度聚焦超声波(HIFU)；化学疗法；冷冻手术；激素疗法(例如抗雄激素(例如氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和醋酸环丙孕酮、酮康唑(ketoconazole)、胺鲁米特(aminoglutethimide))、GnRH拮抗剂(例如阿巴瑞克(abarelix)))；或其组合。
本文所述的所有参考文献都以引用的方式明确地并入本文。
实施例
实施例1 IDH1克隆、诱变、表达和纯化
1.将野生型IDH1克隆到pET41a中，在C-末端产生His8标记。
IDH1基因编码区(cDNA)从Invitrogen以pENTR221载体(www.invitrogen.com,Cat#B-068487_Ultimate_ORF)购买。设计寡核苷酸以在5’端用NdeI和在3’端用XhoI扩增出IDH1的编码区。(IDH1-f:TAATCATATGTCCAAAAAAATCAGT(SEQ ID NO:1),IDH1-r:TAATCTCGAGTGAAAGTTTGGCCTGAGCTAGTT(SEQ ID NO:2))。将PCR产物克隆到NdeI/XhoI裂解的pET41a载体中。载体pET41a的NdeI/XhoI裂解物释放质粒的GST部分，且产生没有N-末端GST融合的C-末端His8标记(SEQ ID NO:3)。IDH1的原始终止密码子变为丝氨酸，因此最终IDH1蛋白质中的接界序列为：Ser-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His-His-His-Stop(SEQID NO:4)。
选择C-末端His标记策略代替N-末端His标记策略，因为C-末端标记可能不会消极地影响IDH1蛋白质折叠或活性。参见，例如Xu X等，J Biol Chem.2004年8月6日；279(32):33946-57。
通过DNA测序确认pET41a-IDH1质粒的序列。图1示出ET41a-IDH1的详细序列验证和相对于下文公开的IDH1CDS的比对。
2.IDH1定点诱变以产生IDHr132s和IDHr132h突变体。
进行定点诱变以使R132转化为S或H，DNA测序确认G395突变为A(在IDH1蛋白中产生Arg→His突变)，且C394突变为A(在IDH1蛋白中产生Arg→Ser)。定点诱变的详细方法描述在MultiSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，目录号200531)的使用手册中。图2示出这类突变的DNA序列验证。突出显示的核苷酸在诱变中成功地改变：G395→A突变允许氨基酸Arg132→His；C394→A突变允许氨基酸Arg132→Ser。
3.IDH1蛋白质表达和纯化。
IDHwt、IDHR132S和IDHR132H蛋白质在大肠杆菌株Rosetta中表达且根据以下详细程序纯化。活性IDH1蛋白质是二聚体形式，且收集对应于二聚体形式的SEC柱部分/峰以用于这些蛋白质的催化活性的酶学分析和交叉比较。
A.细胞培养：
振荡下，使细胞在LB(20μg/ml卡那霉素)中37℃下生长，直到OD600达到0.6。使温度变为18℃且通过加入IPTG达到1mM的最后浓度来诱发蛋白质。在IPTG诱发之后12-16小时收集细胞。
B.缓冲体系：
裂解缓冲液：20mM Tris(pH7.4)、0.1％Triton X-100、500mM NaCl、1mM PMSF、5mMβ-巯基乙醇、10％甘油。
Ni-柱缓冲液A：20mM Tris(pH7.4)、500mM NaCl、5mMβ-巯基乙醇、10％甘油。
Ni-柱缓冲液B：20mM Tris(pH7.4)、500mM NaCl、5mMβ-巯基乙醇、500mM咪唑、10％甘油。
凝胶过滤缓冲液C：200mM NaCl、50mM Tris 7.5、5mMβ-巯基乙醇、2mM MnSO4、10％甘油。
C.蛋白纯化程序
1.使细胞沉淀再悬浮于裂解缓冲液(1g细胞/5-10ml缓冲液)中。
2.通过使细胞通过15,000psi的压力下的微射流均质机3次而破碎细胞。
3.于4℃下以20,000g离心(Beckman Avanti J-26XP)30分钟之后从上清液中收集可溶蛋白质。
4.由缓冲液A平衡5-10ml的Ni-柱，直到A280值达到基线。将上清液上样到5-mlNi-琼脂糖柱上(2ml/min)。通过10-20CV洗涤缓冲液(90％缓冲液A+10％缓冲液B)洗涤该柱，直至A280达到基线(2mL/min)
5.通过10-100％缓冲液B(20CV)的线性梯度以2mL/min的流速洗脱蛋白质，且以2毫升/管收集样本部分。
6.在SDS-PAGE凝胶上分析样本。
7.收集样本且相对于200x凝胶过滤缓冲液渗析2次(1小时和>4小时)。
8.将样本浓缩到10ml。
9.由缓冲液C平衡200ml的S-200凝胶过滤柱，直到A280值达到基线。将样本上样到凝胶过滤柱上(0.5ml/min)。
10.通过10CV缓冲液C洗涤该柱，以2-4毫升/管收集部分。
11.在SDS-PAGE凝胶上分析样本且测定蛋白质浓度。
D.蛋白质纯化结果
将野生型IDH1的纯化的结果示出在图3、图4、图5A和图5B中。
将突变IDH1R132S的纯化的结果示出在图6、图7、图8A和图8B中。
将野生型IDH1R132H的纯化的结果示出在图9、图10、图11A和图11B中。
实施例2IDH1野生型和突变体的酶学分析
1.异柠檬酸到α-酮戊二酸(α-KG)的氧化脱羧中的IDH1野生型和突变体R132H和R132S的分析。
A.方法
为了测定酶在异柠檬酸到α-酮戊二酸(α-KG)方向的氧化脱羧中的催化效率，进行反应以测定异柠檬酸的Vmax和Km。在这些反应中，底物不同，而辅因子保持恒定的500μM。所有反应都在150mM NaCl、20mM Tris-Cl(pH 7.5)、10％甘油和0.03％(w/v)BSA中进行。反应进行，接着进行340nM下的光谱学分析监测辅因子的氧化状态的改变。加入足够的酶以产生10分钟内吸光度的线性变化。
B.ICDH1R132H和ICDH1R132S对于异柠檬酸到α-KG的转化受损。
异柠檬酸浓度与反应速度的关系的Michaelis-Menten曲线呈现于图12A-12C中。将动力学参数汇总于表1中。所有数据都通过最小二乘回归分析拟合到希尔(Hill)方程。
表1
两种突变酶显示希尔系数降低和异柠檬酸的Km增加，提示底物结合的协同性损失和/或对于底物的亲和性降低。R132H酶也显示Vmax降低，提示kcat较低。R132S显示Vmax增加，提示kcat增加，尽管达到此是以Km增加20,000倍为代价，使得与野生型酶相比，对催化效率的总体影响大大降低。与野生型相比，突变体的相对催化效率(描述为Vmax/Km)显著较低。这些突变的体内效应将降低异柠檬酸到α-KG的通量转化。
C.ICDH1 R132H和R132S突变体在异柠檬酸到α-酮戊二酸(α-KG)的氧化脱羧中显 示降低的产物抑制作用。
对于代谢酶对照物的熟知的调节机制为反馈抑制，其中该反应的产物充当生成酶的负调节剂。为了检查R132S或R132H突变体是否保持这种调节机制，测定在异柠檬酸到α-酮戊二酸的氧化脱羧中对于α-KG的Ki。数据呈现于图13A-13C中且汇总于表2中。在所有情况下，α-KG充当异柠檬酸底物的竞争性抑制剂。然而，与野生型酶相比，R132H和R132S对反馈抑制的敏感性显示20倍和13倍增加。
表2
酶 Ki(μM)
野生型 612.2
R132H 28.6
R132S 45.3
D.MnCl2在异柠檬酸到α-酮戊二酸(α-KG)的氧化脱羧中的影响。
可以用MgCl2替代MnCl2以检查异柠檬酸到α-酮戊二酸(α-KG)的氧化脱羧是否有任何差异。
E.R132突变对草酰苹果酸对IDH1的抑制效应的影响
该实施例的目的是检查IDH1R132S和IDH1R132H在异柠檬酸到α-酮戊二酸(α-KG)的氧化脱羧中对已知IDH1抑制剂草酰苹果酸的敏感性。进行实验以检查R132突变是否避免草酰苹果酸的抑制作用。
最后浓度：Tris 7.520mM、NaCl 150mM、MnCl22mM、甘油10％、BSA 0.03％、NADP0.5mM、IDH1野生型1.5μg/ml、IDH1 R132S30μg/ml、IDH1 R132H 60μg/ml、DL-异柠檬酸(5-650μM)。结果汇总于图17和表3中。R132S突变显示对草酰苹果酸抑制作用的敏感性增加约两倍，而R132H突变基本未受影响。在所有三种情况下，观察到对于异柠檬酸的相同的完全竞争模式的抑制作用。
表3
酶 草酰苹果酸Ki(μM)
野生型 955.4
R132S 510
R132H 950.8
F.突变酶的正向反应(异柠檬酸到α-KG)没有进行完全。
组合含有ICDH1R132S或ICDH1R132H的正向反应且通过还原的NADPH辅因子的OD340的增加而监测反应进程。观察(图23)到，这些反应以正向反应进行一段时间，且然后以逆反应进行且使在反应早期还原的辅因子氧化，基本达到试验开始时存在的起始浓度。加入另外的异柠檬酸重新开始正向反应一段时间，但又没有诱发反应到进行完全。相反，体系回到NADPH的初始浓度。该实验提示，除了α-KG到异柠檬酸的转化以外，突变酶进行逆反应。
2.α-酮戊二酸(α-KG)的还原中的IDH1野生型和突变体R132H和R132S的分析
A.方法
为了测定酶在α-酮戊二酸(α-KG)的还原中的催化效率，进行反应以测定Vmax和α-KG的Km。在这些反应中，底物不同，而辅因子保持恒定的500μM。所有反应都在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)、10％甘油、0.03％(w/v)BSA、5mM MgCl2和40mM碳酸氢钠中进行。反应进行，接着进行340nM下光谱学分析监测辅因子的氧化状态的改变。加入足够的酶以产生10分钟内吸光度的线性变化。
B.R132H和R132S突变酶而不是野生型酶支持α-KG的还原。
为了测试突变酶和野生型酶进行α-KG的还原的能力，将40μg/ml酶在如上所述的α-酮戊二酸(α-KG)的还原的条件下孵育。结果呈现于图14中。野生型酶不能消耗NADPH，而R132S和R132H还原α-KG且消耗NADPH。
C.由R132H和R132S突变体引起的α-KG的还原在α-KG的生理学相关浓度下在体外 发生。
为了测定由突变酶进行的α-KG的还原的动力学参数，如图15A-15B中所呈现，进行底物滴定实验。R132H保持如异柠檬酸的氧化脱羧中所见的希尔型底物相互作用，但显示阳性底物协同结合。与异柠檬酸的氧化脱羧中的野生型酶相比，R132S显示到Michaelis-Menten动力学的转化外加非竞争性底物抑制作用。突变酶的酶参数呈现于表4中。因为在如上所述的实验中野生型酶没有消耗可以测量的NADPH，所以不进行完全的动力学检查。
表4
R132S突变体对α-KG还原的相对催化效率比R132H突变体高约10倍。生物后果为，与R132H相比，代谢通量率在表达R132S的细胞中将更大。
D.用NADH的α-酮戊二酸的还原中IDH1野生型和突变体R132H和R132S的分析。
为了评估突变酶在α-酮戊二酸的还原中利用NADH的能力，进行以下实验。最后浓度：NaHCO3 40mM、MgCl2 5mM、甘油10％、K2HPO4 50mM、BSA 0.03％、NADH 0.5mM、野生型IDH15μg/ml、R132S 30μg/ml、R132H 60μg/ml、α-酮戊二酸5mM。
结果示出在图16和表5中。R132S突变体证明了利用NADH的能力，而野生型和R132H显示在α-酮戊二酸存在下没有可以测量的NADH消耗。
表5：在α-酮戊二酸存在下由R132S引起的NADH消耗
小结
为了了解R132突变如何改变IDH1的酶性质，从大肠杆菌中生成并纯化野生型和R132H突变IDH1蛋白质。当使用纯化的野生型或R132H突变IDH1蛋白质测量异柠檬酸的NADP+-依赖性氧化脱羧时，确认，如由对异柠檬酸和MgCl2二者的结合亲和性缺失以及催化转换降低1000倍(图30A和图30C)所显而易见，R132H突变损害IDH1催化该反应的能力(Yan,H.等，N Engl J Med 360,765-73(2009)；Zhao,S.等，Science 324,261-5(2009))。相比之下，当使用野生型IDH1蛋白质或R132H突变IDH1蛋白质评估αKG的NADPH-依赖性还原时，仅R132H突变体能够以可以测量的速率催化该反应(图30和图30C)。该增加的αKG还原率的一部分由R132H突变IDH1对辅因子NADPH和底物αKG的结合亲和性的增加产生(图30C)。总之，这些数据证明，虽然R132H突变导致对异柠檬酸的氧化脱羧的酶功能损失，但该突变也对αKG的NADPH-依赖性还原产生了增加的酶功能。
2:突变IDH1的分析
R132H突变体没有引起α-KG到异柠檬酸的转化。
使用标准实验方法，配置API2000质谱仪用于α-KG和异柠檬酸的最佳检测(表6)。选择并调整MRM检测通道(MRM transition)以使得各分析物通过唯一的检测通道监测。随后，组合含有1mMα-KG、1mM NADPH和ICDH1R132H的酶反应且如由降低到340nM下光学吸光度的基线所判断将该反应进行完全。同时进行其中省去该酶的对照反应。用甲醇以1:1对反应物进行骤冷，提取且通过LC-MS/MS进行分析。
图18A呈现指示αKG在缺乏酶的情况下没有被消耗且不存在可检测的异柠檬酸的对照反应。图18B呈现含R132H酶的反应，其中α-KG已被消耗但没有检测到异柠檬酸。图18C呈现含酶反应的第二分析，其中已经对异柠檬酸加入标准品达到1mM的最后浓度，证明α-KG已经以大于0.01％的任何可评估浓度转化为异柠檬酸，配置的分析系统将能够检测α-KG在含酶反应中的存在。该实验的结论为，虽然α-KG被R132H消耗，但没生成异柠檬酸。该实验指示R132H突变体的一种新活性为将α-KG还原为除异柠檬酸以外的化合物。
R132H突变体使α-KG还原为2-羟基戊二酸。
使用标准实验方法，配置API2000质谱仪用于2-羟基戊二酸(表6和图19)的最佳检测。研究上所述的对照反应和含酶反应的反应产物的2-羟基戊二酸的存在，图20。在对照反应中，没有检测到2-羟基戊二酸，而在含有R132H的反应中，检测到了2-羟基戊二酸。该数据确认R132H突变体的一种新活性为使α-KG还原为2-羟基戊二酸。
为了测定R132H突变蛋白质是否由αKG直接生成2HG，使用阴离子模式三重四极电喷雾LC-MS检查突变IDH1反应的产物。这些实验确认，通过与已知代谢标准物相比较，2HG为通过纯化的R132H突变蛋白质产生的NADPH-依赖性αKG还原的直接产物(图31A)。没有观察到αKG到异柠檬酸的转化。
可以通过用DATAN(二乙酰基-L-酒石酸)衍生且将其保留时间与已知的R和S标准物的保留时间比较来测定反应产物的对映异构体特异性。该方法描述于Struys等，ClinChem 50:1391-1395(2004)中。α-羟基戊二酸的R或S对映异构体通过ICDH1 R132H的立体特异性生成可以使细胞中存在的其它酶的生物活性改性。也可能发生外消旋生成。
例如，可以测量α-羟基戊二酸对利用α-KG作为底物的酶的酶活性的抑制效应。在一个实施方案中，α-羟基戊二酸可以是野生型ICDH1的底物或产物类似物抑制剂。在另一实施方案中，α-羟基戊二酸可以是HIF1脯氨酰羟化酶的底物或产物类似物抑制剂。在前一情况下，由R132H的酶产物引起的野生型ICDH1的抑制作用将降低αKG在细胞中的循环水平。在后一情况下，HIF1脯氨酰羟化酶的抑制作用将引起HIF1稳定化且诱导细胞响应的低氧响应群组。
ICDH R132H将αKG还原为2-羟基戊二酸的R-对映异构体。
存在ICDHR132H还原反应产物(将α-酮戊二酸转化为2-羟基戊二酸)的两种可能的对映异构体，其中手性中心位于α-碳位置。示例性的产物描绘于以下。
这些被本领域中有经验的人员分别称为R(或pro-R)和S(或pro-S)对映异构体。为了测定哪种形式或二者是由于如上所述的ICDH1新活性而产生的，在如下所述的程序中测定反应产物中各手性形式的相对量。
如上所述，α-KG到2-HG的还原是在NADPH存在下通过ICDHR132H进行，且通过核苷酸辅因子在340nM下的消光系数的改变来监测反应进展；一旦判断反应完成，则用甲醇提取反应物且在氮气流中彻底干燥。同时，将手性纯的R-2-HG和R-2-HG与S-2-HG的外消旋混合物(通过将α-KG纯化学还原为2-HG生成)的样本再悬浮在ddH2O中，同样用甲醇提取并干燥。
随后将反应产物或手性标准物再悬浮于含有50g/L DATAN的二氯甲烷:乙酸(4:1)的溶液中，且加热到75℃历时30分钟，以在如下所述的方案中促进2-HG的衍生：
在冷却到室温之后，将衍生反应物彻底干燥且再悬浮于ddH2O中以用于在LC-MS/MS系统上分析。使用2x150mM C18柱以90:10(甲酸铵(pH 3.6):甲醇)的200μl/min的等度流速且使用XIC和以负离子模式的诊断MRM检测通道363/147监测2-HG-DATAN复合物的保留时间来在API2000 LC-MS MS系统上进行反应产物和手性标准物的分析。
应注意到，在如下所述的实验中的保留时间接近且精确到+/-1分钟内；在4分钟时见到的高度可重现的峰为柱转换阀的伪象，它的存在对于从实验中得出的结论没有结果。
注入外消旋混合物在保留时间为8和10分钟时产生两个等面积的峰(图24A)，而注入R-2-HG标准物在10分钟时产生>95％面积的主峰和在8分钟时产生<5％面积的小峰(图24B)；指示R-2-HG标准物为约95％R和5％S。因此，该方法允许分离R-2-HG手性形式和S-2-HG手性形式和测定各自在给定样本中的相对量。共同注入外消旋混合物和R-2-HG标准物在8和10分钟时产生两个峰，在10分钟时的较大峰由将剩余的pro-R-形式(标准物)加到R-2-HG与S-2-HG的先前相等的混合物中而产生(图24C)。这些实验允许将8分钟峰指定为S-2-HG形式且将10分钟峰指定为R-2-HG形式。
仅注入衍生的新活性酶反应产物在10分钟时产生单个峰，提示新活性反应产物为手性纯的R-2-HG(图24D)。共同注入新活性反应产物和R-2-HG标准物在10分钟时产生>95％面积的主峰(图24E)和在8分钟时产生<5％面积的单个小峰(先前在仅注入R-2-HG标准物时观察到)，确认新活性产物的手性为R。共同注入外消旋混合物和新活性反应产物(图24F)在10分钟时产生60％面积的峰和在8分钟时产生40％面积的峰；在外消旋样本中观察到自先前对称峰面积的偏差是由于由加入新活性反应产物所促进的R-2-HG形式的过量存在。
这些实验允许得出结论为ICDH1新活性为将α-KG高度特异性手性还原为R-2-HG。
其它IDH1突变的酶性质
为了测定由R132H突变引起的改变的酶性质是否由在人胶质瘤中发现的其它R132突变所共有，产生重组R132C、R132L和R132S突变IDH1蛋白质且评估酶性质。类似于R132H突变蛋白质，R132C、R132L和R132S突变都产生对于αKG的NADPH-依赖性还原的增加的功能(数据未示出)。因此，除了异柠檬酸的受损氧化脱羧以外，在人胶质瘤中发现的IDH1突变之中所共有的一个常见特点是催化αKG的直接NADPH-依赖性还原的能力。
含有IDH-1 R132H突变蛋白质的胶质母细胞瘤细胞系中的2-HG生成的鉴定。
表达野生型或突变IDH-1蛋白质的基因工程改造胶质母细胞瘤细胞系的产生。克隆在载体pCMV6中的人异柠檬酸脱氢酶1(IDH1；参考ID:NM_005896)的羧基末端Myc-DDK-标记的开放阅读框(ORF)克隆从商业供应商Origen Inc.获得。载体pCMV6含有卡那霉素和新霉素抗性盒用于在细菌和哺乳动物细胞体系中选择。利用标准分子生物学诱变技术来改变在ORF的碱基对364处的DNA序列以引入从鸟嘌呤到腺嘌呤的碱基对变化，产生位置132处的氨基酸编码从精氨酸(野生型)到组氨酸的改变(突变体；或R132H)。特异性DNA序列改变通过用于DNA序列分析的标准方法来确认。将亲本载体pCMV6(没有插入物)、pCMV6-野生型IDH1或pCMV6-R132H转染到标准生长培养基(DMEM；含有10％胎牛血清的Dulbecco'smodified Eagles Medium)中的永生化人胶质母细胞瘤细胞系CRL-2610(LN-18)或HTB-14(U-87)中。在转染后约24小时，将细胞培养物以750μg/ml(CRL-2610)或500μg/ml(HTB-14)的浓度转移到含有G418钠盐的DMEM中以在培养物中选择表达整合的DNA盒的细胞，所述整合的DNA盒表达新霉素选择标记和人野生型或R132H的ORF二者。产生抗G418细胞的汇集群，且使用鉴定人IDH1抗原或工程改造羧基末端MYC-DDK表达标记的商业抗体通过细胞裂解物的标准蛋白质印迹分析确认野生型IDH1或R132 IDH1的表达。随后利用这些稳定的克隆池进行代谢物制备和分析。
用于代谢物制备和分析的程序。使用标准哺乳动物组织培养技术，使表达野生型或突变IDH-1蛋白质的胶质母细胞瘤细胞系(CRL-2610和HTB-14)在含有10％FCS、25mM葡萄糖、4mM谷氨酰胺和G418抗生素(对于CRL-2610为750μg/ml；对于HTB-14为500μg/ml)的DMEM培养基上生长以确保进行选择以保持转染的突变体表达序列。在为代谢物提取实验作准备时，以1×106个细胞的密度是细胞传代在10cm的圆形培养皿中。在代谢物提取之前约12小时，将培养基改变(8毫升/板)为含有10％渗析FCS(10,000mwco)、5mM葡萄糖、4mM谷氨酰胺和G-418抗生素(如之前所述)的DMEM；渗析的FCS从培养基中除去多个小分子且能够进行代谢物水平的细胞培养物特异性评估。在代谢物提取之前2小时，再次改变培养基。代谢物提取通过以下完成：在无菌罩中从培养皿迅速吸出培养基，立即将培养皿放入盛有干冰的托盘中以将其冷却到-80℃，且尽快地加入在干冰/丙酮浴中预冷却到-80℃的2.6mL 80％MeOH/20％水。随后通过用无菌聚乙烯细胞刮铲(Corning#3008)刮除这些冷却的甲醇提取的细胞而从培养皿中物理分离，使其进入悬浮液中并转移到15mL圆锥形小瓶中，随后冷却到-20℃。将另外1.0mL 80％MeOH/20％水施加到冷却的培养皿中且重复细胞铲除程序，以产生3.6mL的最后提取体积。将提取物以20,000×g离心30分钟以使细胞碎片沉淀，且将3.0mL上清液转移到螺旋帽冷冻机小瓶中并在-80℃下储存，直至准备用于分析。
在为分析作准备时，将提取物从冷冻机中移出并在氮鼓风机上干燥以除去甲醇。100％水性样本通过LCMS分析如下。将提取物(10μl)注射到逆相HPLC柱(Synergi 150mm×2mm，Phenomenex Inc.)中且使用在水性10mM三丁胺、15mM乙酸(缓冲液A)中的LCMS-级甲醇(缓冲液B)的线性梯度(以200μL/min经45分钟从3％缓冲液B运行到95％缓冲液B)洗脱。使用三重四极杆质谱仪检测洗脱的代谢物离子，三重四极杆质谱仪经调整以根据对于38种已知中心代谢物(包括2-羟基戊二酸)的分子量和裂解谱以负模式用多反应监测模式转换组(MRM’s)来检测(通过先前输注已知的化合物标准物来优化MRM参数)。使用分析软件(Applied Biosystems,Inc.)处理数据，且使用得自在已知浓度下的代谢物标准物的注入混合物的恢复曲线将代谢物信号强度转化为绝对浓度。将最终代谢物浓度记录为至少三次重复的平均值+/-标准偏差。
结果.分析揭示在表达IDH-1 R132H突变蛋白质的细胞中的显著更高水平的2-HG。如图26A所示，在表达IDH-1 R132H突变蛋白质的CRL-2610细胞系中的2-HG水平比在表达野生型蛋白质的相同细胞系中的2-HG水平高约28倍。类似地，如图26B所示，在表达IDH-1R132H突变蛋白质的HTB-14细胞系中的2-HG水平比在表达野生型蛋白质的相同细胞系中的2-HG水平高约38倍。
含有异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)的氨基酸132处的突变的人胶质母细胞瘤中的2-羟基戊二酸(2-HG)生成的评估
在编码异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)的转录物中核苷酸位置395(氨基酸密码子132)处的杂合体细胞突变可能发生在脑肿瘤中。
组织来源：在外科切除术期间获得人脑肿瘤，将其在液氮中速冻并在-80℃下储存。使用标准临床病理学分类和分级将该组织进行临床归类为胶质瘤。
基因组序列分析以鉴定含有野生型异柠檬酸脱氢酶(IDH1)或改变氨基酸132的突变的脑肿瘤样本。使用标准方法从50-100mg脑肿瘤组织中分离基因组DNA。随后对分离的基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)程序以扩增含有人IDH1的内含子和第二外显子序列的基因组DNA的295个碱基对片段(图27)。在图27中，内含子序列以小写字体示出；第二外显子IDH1DNA序列以大写字体示出；正向(5’)和反向(3’)引物序列以加下划线的字体示出；在人胶质瘤亚组中突变的鸟苷酸以加下划线的加粗字体示出。
随后使用标准方案对扩增的DNA片段进行测序且进行序列比对以将序列归类为野生型或在扩增PCR片段的碱基对170处的鸟苷酸处的突变体。肿瘤被鉴定为含有如下基因组DNA，其具有鸟嘌呤(野生型)的两种拷贝或一种含有鸟嘌呤序列的IDH1等位基因和另一种在扩增产物的碱基对170处含有腺嘌呤(突变体)序列的IDH1等位基因的混合或单等位基因组合(表15)。如先前已报道，核苷酸改变引起人IDH1蛋白的氨基酸位置132从精氨酸(野生型)变为组氨酸(突变体)。
表15.在得自人胶质瘤样本的扩增基因组DNA的碱基对170处的序列变化。
用于代谢物制备和分析的程序。代谢物提取通过将10X体积(m/v比)的-80℃的甲醇:水混合物(80％:20％)加到脑组织(约100mg)中、接着在4℃下均质30秒来实现。随后将这些冷却、甲醇提取的均质组织以14,000rpm离心30分钟以使细胞和组织碎片沉淀且将澄清的组织上清液转移到螺旋帽冷冻机小瓶中且在-80℃下储存。为了分析，将2X体积的三丁胺(10mM)乙酸(10mM)(pH 5.5)加到样本中并通过LCMS分析如下。使用Millex-FG 0.20微米盘过滤样本提取物且将10μL注入逆相HPLC柱(Synergi 150mm×2mm，Phenomenex Inc.)中，且使用匀变到80％甲醇:10mM三丁胺:10mM乙酸的具有10mM三丁胺和10mM乙酸的线性梯度LCMS-级甲醇(50％)以200μL/min洗脱6分钟。使用三重四极杆质谱仪检测洗脱的代谢物离子，该三重四极杆质谱仪经调整以根据对于8种已知中心代谢物(包括2-羟基戊二酸)的分子量和裂解谱以负模式用多反应监测模式检测通道组(MRM’s)来检测(通过先前输注已知的化合物标准物来优化MRM参数)。使用分析软件(Applied Biosystems,Inc.)处理数据且通过标准峰积分方法获得代谢物信号强度。
结果.分析揭示在表达IDH-1R132H突变蛋白的细胞肿瘤样本中的显著更高水平的2-HG。数据汇总于表16和图28中。
表16
为了测定2HG生成是否是具有IDH1突变的肿瘤的特征，从对于IDH1为野生型或突变的人恶性胶质瘤中提取代谢物。已经提示在用突变IDH1转染的细胞中的αKG水平减少(Zhao,S.等，Science 324,261-5(2009))。12个具有各种R132突变的肿瘤样本的平均αKG水平略小于在10种对于IDH1来说为野生型的肿瘤中观察到的平均αKG水平。该αKG的差异在统计上不显著，且在野生型肿瘤和突变肿瘤二者中都观察到αKG水平的范围。相比之下，在含有R132IDH1突变的所有肿瘤中发现增加的2HG水平。检查的所有R132突变IDH1肿瘤具有5-35μmol 2HG/g肿瘤，而具有野生型IDH1的肿瘤具有低于100倍以上的2HG。在R132突变肿瘤中2HG的该增加在统计上显著(p<0.0001)。确认(R)-2HG为在肿瘤样本中存在的异构体(数据未示出)。这些数据一起确立，与在IDH1中的R132突变相关的新酶活性引起在具有这些突变的人脑肿瘤中生成2HG。
已知2HG积聚在遗传性代谢病症2-羟基戊二酸尿症中。该疾病由酶2-羟基戊二酸脱氢酶的缺陷引起，这使得2HG转化为αKG(Struys,E.A.等，Am J Hum Genet 76,358-60(2005))。如由MRI和CSF分析所评估，患有2-羟基戊二酸脱氢酶缺陷的患者在脑中积聚2HG，发展为脑白质病，且具有发展为脑肿瘤的增加的风险(Aghili,M.,Zahedi,F.&Rafiee,JNeurooncol 91,233-6(2009)；Kolker,S.,Mayatepek,E.&Hoffmann,G.F.Neuropediatrics33,225-31(2002)；Wajner,M.,Latini,A.,Wyse,A.T.&Dutra-Filho,C.S.J Inherit MetabDis 27,427-48(2004))。此外，2HG的脑水平升高引起ROS水平增加(Kolker,S.等，Eur JNeurosci 16,21-8(2002)；Latini,A.等，Eur J Neurosci 17,2017-22(2003))，可能促进癌症风险增加。2HG用作NMDA受体激动剂的能力可以促进该效应(Kolker,S.等，Eur JNeurosci 16,21-8(2002))。2HG也可能因竞争性抑制谷氨酸和/或αKG利用酶而对细胞具有毒性。这些包括转氨酶，其允许利用谷氨酸氮用于氨基酸和核酸生物合成；以及αKG-依赖性脯氨酰氢化酶，诸如调节Hif1α水平的那些。已经报道Hif1α的改变由突变IDH1蛋白质表达引起(Zhao,S.等，Science 324,261-5(2009))。不管机制如何，看来可能是细胞由于IDH1的R132突变而造成的2HG增加的功能促进肿瘤生成。具有2-羟基戊二酸脱氢酶缺陷的患者具有CNS恶性肿瘤的高风险(Aghili,M.,Zahedi,F.&Rafiee,E.J Neurooncol 91,233-6(2009))。突变IDH1直接作用于αKG的能力可以解释IDH1突变在得自CNS组织的肿瘤中盛行，其独特之处在于高水平的谷氨酸吸收和在细胞溶质中易于转化为αKG(Tsacopoulos,M.JPhysiol Paris 96,283-8(2002))，由此提供对于2HG产生的高水平底物。突变IDH1的活性与野生型酶的活性的表观共显性与疾病的遗传学一致，其中仅该基因的单个拷贝突变。如上文所讨论，野生型IDH1能够为突变酶直接提供NADPH和αKG。这些数据也证明R132到组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸或亮氨酸的突变共有催化αKG到2HG的NADPH-依赖性转化的能力。这些发现帮助澄清了为何没有发现在IDH1的其它氨基酸残基处的突变，包括对催化活性必要的其它残基。最后，这些发现的临床含义在于它们提示2HG生成将鉴定患有IDH1突变脑肿瘤的患者。这对于预测具有IDH1突变的患者存活比以其它突变为特征的胶质瘤的患者更久将是重要的(Parsons,D.W.等，Science 321,1807-12(2008))。另外，患有低级胶质瘤的患者可以得益于2HG生成所产生的治疗抑制作用。突变IDH1对2HG生成的抑制可以减慢或中断低级胶质瘤转化成致命的二级胶质母细胞瘤，改变该疾病的过程。
α-KG的ICDH1 R132H还原的反应产物抑制由野生型ICDH1引起的异柠檬酸的氧化脱羧。
组合含有野生型ICDH1、NADP和α-KG的反应(在如上所述的条件下)，以滴定系列向其中加入(R)-2-羟基戊二酸或α-KG到2-羟基戊二酸的ICDH1R1321H突变还原的反应产物。显示反应产物2-HG抑制由野生型ICDH1引起的异柠檬酸的氧化脱羧，而(R)-2-羟基戊二酸没有显示对该反应速率的任何影响。因为α-KG到2-HG的ICDH1R132H突变还原仅存在两种可能的手性产物，且(R)-2-HG在该测定中没有显示抑制作用，由此可见该突变反应的产物为(S)-2-HG形式。该实验呈现于图25中。
为了测定所生成的2HG的手性，将R132H反应的产物用二乙酰基-L-酒石酸酐衍生，其允许通过简单的逆相LC分离2HG的(S)和(R)对映异构体且通过串联质谱检测产物(Struys,E.A.,Jansen,E.E.,Verhoeven,N.M.&Jakobs,C.Clin Chem 50,1391-5(2004))(图31B)。使用外消旋物和R(-)-2HG标准物确认对应于2HG的(S)和(R)异构体的峰。将来自R132H的反应产物与R(-)-2HG峰共洗脱，证明R(-)立体异构体为通过R132H突变IDH1由αKG生成的产物。
突变酶的反应产物能够抑制已知在细胞内发生的代谢反应的观察结果提示该反应产物也可以抑制利用α-KG、异柠檬酸或柠檬酸作为底物或者在体内或体外生成其作为产物的其它反应。
实施例3 IDH1野生型和突变体的代谢组学分析
代谢组学研究可以提供R132突变为何对携带这类突变的GBM患者赋予存活优势的机械学基础。
1.GBM肿瘤细胞系的代谢组学：野生型对R132突变体
可以鉴定具有R132突变的细胞系并描绘其特性。可以对具有广泛范围的代谢物的最接近的代谢物池进行实验。
2.GBM细胞系的草酰苹果酸治疗
草酰苹果酸是IDH1的竞争性抑制剂。可以检查在IDH1被小分子抑制时NADPH的改变(代谢组学)。
3.原发性GBM肿瘤的代谢组学：野生型对R132突变
可以鉴定具有R132突变的原发性肿瘤。可以对具有广泛范围的代谢物的最接近的代谢物池进行实验。
4.检测在过度表达IDH1 132突变体的细胞中的2-羟基戊二酸
细胞中IDH1 132突变体的过度表达可导致2-羟基戊二酸的水平升高和/或α-酮戊二酸的水平降低。可以进行代谢组学实验以证明该突变对细胞代谢物池的后果。
实施例4作为癌症靶标的IDH1的评估
可以进行shRNAmir可诱导的敲除以检查细胞表型和代谢组学特性。可以利用HTS级IDH1酶。本文所述的IDH突变可以用于患者选择。
实施例5 siRNA
IDH1
示例性的siRNA呈现于下表中。可以使用本领域已知的方法来选择其它siRNA。可以例如通过测定siRNA使IDH(例如IDH1)例如在体外系统中(例如在培养的细胞，例如HeLa细胞或培养的胶质瘤细胞中)沉默的能力来评估siRNA。也可以使用用于使靶标沉默的本领域已知的siRNA，参见，例如Silencing of cytosolic NADP+dependent isoccitratedehydrogenase by small interfering RNA enhances the sensitivity of HeLa cellstoward stauropine，Lee等，2009,Free Radical Research,43:165-173。
使用在万维网jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/可以得到的siRNA选择工具来产生表7中的siRNA(除条目1356之外)。(Yuan等，Nucl.Acids.Res.2004 32:W130-W134。)还可以使用其它选择工具。条目1356自Silencing of cytosolic NADP+dependentisoccitrate dehydrogenase by small interfering RNA enhances the sensitivityof HeLacells toward stauropine，Lee等，2009,Free Radical Research,43:165-173改编。
表7、8、9、10、11、12、13和14中的siRNA代表覆盖根据基因库登陆号NM_005896.2(SEQ ID NO:9，图22)在核苷酸位置628和629处的IDH1mRNA的候选物。
例如，如本文中所述，可以对各表中的RNA进行修饰。修饰包括化学修饰以增强性质(例如抗降解性)或使用悬垂部分。例如，在表中的有义链和反义链中的一个或两个可以在3'端包括另外的二核苷酸，例如TT、UU、dTdT。
表7.靶向野生型IDH1的siRNA
表8.靶向野生型IDH1的siRNA
表9.靶向G395A突变IDH1(SEQ ID NO:5)的siRNA(相当于SEQ ID NO:9的G629A(图 21B))
表10.靶向C394A突变IDH1(SEQ ID NO:5)的siRNA(相当于SEQ ID NO:9的C628A (图21B))(Arg132Ser(SEQ ID NO:8))
表11.靶向C394U突变IDH1(SEQ ID NO:5)的siRNA(相当于SEQ ID NO:9的C628U (图21B))(Arg132Cys(SEQ ID NO:8))
表12.靶向C394G突变IDH1(SEQ ID NO:5)的siRNA(相当于SEQ ID NO:9的C628G (图21B))(Arg132Gly(SEQ ID NO:8))
表13.靶向G395C突变IDH1(SEQ ID NO:5)的siRNA(相当于SEQ ID NO:9的G629C (图21B))(Arg132Pro(SEQ ID NO:8))
表14.靶向G395U突变IDH1(SEQ ID NO:5)的siRNA(相当于SEQ ID NO:9的G629U (图21B))(Arg132Leu(SEQ ID NO:8))
IDH2
示例性的siRNA呈现于下表中。可以使用本领域已知的方法来选择其它siRNA。可以例如通过测定siRNA使例如IDH2例如在体外体系中(例如在培养的细胞，例如Hela细胞或培养的胶质瘤细胞中)沉默的能力来评估siRNA。例如：
使用万维网jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/可以得到的siRNA选择工具来产生表15中的siRNA。(Yuan等，Nucl.Acids.Res.2004 32:W130-W134。)还可以使用其它选择工具。条目1356自Silencing of cytosolic NADP+ dependent isoccitrate dehydrogenaseby small interfering RNA enhances the sensitivity of HeLa cells towardstauropine，Lee等，2009,Free Radical Research,43:165-173改编。
表16-23中的siRNA代表覆盖根据基因库登陆号NM_002168.2(登记日期：2009年8月16日；GI28178831)呈现的mRNA序列(SEQ ID NO12，图22B；相当于由SEQ ID NO:11(图22A)代表的cDNA序列的核苷酸位置514、515和516)在核苷酸位置600、601和602处的IDH2mRNA的候选物。
例如，如本文中所述，可以对表中的RNA进行修饰。修饰包括化学修饰以增强性质(例如抗降解性)或使用悬垂部分。例如，表中的有义链和反义链中的一个或两个可以在3'端处包括另外的二核苷酸，例如TT、UU、dTdT。
表15.靶向野生型IDH2的siRNA
表16.靶向野生型IDH2的siRNA
表17.靶向A514G突变IDH2的siRNA(相当于SEQ ID NO：12的A600G)(图22B)
表18.靶向A514U突变IDH2的siRNA(相当于SEQ ID NO：12的A600U)(图22B)
表19.靶向G515A突变IDH2的siRNA(相当于SEQ ID NO：12的G601A)(图22B)
表20.靶向G515C突变IDH2的siRNA(相当于SEQ ID NO：12的G601C)(图22B)
表21.靶向G515U突变IDH2的siRNA(相当于SEQ ID NO：12的G601U)(图22B)
表22.靶向G516C突变IDH2的siRNA(相当于SEQ ID NO：12的G602CU)(图22B)
表23.靶向G516U突变IDH2的siRNA(相当于SEQ ID NO：12的G602U)(图22B)
实施例6 R132H突变IDH1的结构分析
为了确定R132突变如何改变IDH1的酶性质，以分辨率分析与αKG、NADPH和Ca2+结合的R132H突变IDH1的晶体结构。
同二聚R132H突变酶的总体四极结构采用先前对于野生型酶描述的相同的封闭催化感受态构象(在图29A中示出为单体)(Xu,X.等，J Biol Chem 279,33946-57(2004))。按照2HG产物的手性测定，如在将生成R(-)-2HG的取向中对于氢负离子转移到αKG所预期，定位NADPH。
通过R132改变为组氨酸注意到两个重要特点：对催化构象平衡的影响和活性部位的重组。位于相对刚性的小结构域中的β折叠顶上，R132充当门控残基且似乎编排开放构象与封闭构象之间的铰链移动。R132的胍盐部分以接近的距离从开放构象摇摆到封闭构象。组氨酸取代精氨酸可能改变平衡以有利于封闭构象，该封闭构象形成使辅因子和底物有效结合的催化裂口，这部分解释了由R132H突变酶表现的对于NADPH的高亲和性。该特点可有利于在其中NADPH浓度较低的环境中αKG到R(-)-2HG的NADPH-依赖性还原。其次，与野生型酶相比，对突变IDH1结构的催化口袋的精细检查不仅显示在R132的胍盐与异柠檬酸的α/β羧化物之间的关键盐桥相互作用的预期损失以及与金属离子配位的网络的改变，而且显示活性部位的出乎意料的重组。突变到组氨酸引起高度保守的残基Y139从A亚单位和K212’从B亚单位的显著移位，这两者都被认为是该酶家族催化作用的关键(Aktas,D.F.&Cook,P.F.Biochemistry 48,3565-77(2009))。尤其是，Y139的羟基部分现在占据异柠檬酸的β-羧化物的空间。另外，观察到，与异柠檬酸相比，αKG的显著复位(其中αKG的远端羧化物现在指向上)以使得与N96和S94新接触。总之，该单个R132突变引起形成与野生型IDH1相比不同的活性部位。
实施例7材料和方法
概要
通过标准分子生物学技术将R132H、R132C、R132L和R132S突变引入人IDH1中。将293T和人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和LN-18在DMEM,10％胎牛血清中培养。使用标准技术转染并选择细胞。使用IDHc抗体(Santa Cruz Biotechnology)、IDH1抗体(proteintech)、MYC标记抗体(Cell Signaling Technology)和IDH2抗体(Abcam)通过蛋白质印迹分析来测定蛋白表达水平。根据先前报道方法(Lu,W.,Kimball,E.&Rabinowitz,J.D.J Am Soc MassSpectrom 17,37-50(2006))的相近变型使用80％水性甲醇(-80℃)从培养细胞和从组织样本中提取代谢物且进行组织刮除或均质化以破坏细胞。通过在异柠檬酸和NADP或αKG和NADPH存在下跟踪NADPH荧光性随时间的变化来评价细胞裂解物中的酶活性。对于使用重组IDH1酶的酶测定来说，蛋白质在大肠杆菌中生成且使用Ni亲和色谱法，接着使用SephacrylS-200尺寸排阻色谱法纯化。通过在异柠檬酸和NADP或αKG和NADPH存在下使用停流分光光度计跟踪340nm时的NADPH UV吸光度的变化来评价重组IDH1蛋白质的酶活性。如先前所述测定2HG的手性(Struys,E.A.,Jansen,E.E.,Verhoeven,N.M.&Jakobs,C.Clin Chem 50,1391-5(2004))。对于结晶学研究，将在20mM Tris(pH 7.4)、100mM NaCl中的10mg/mL的纯化的重组IDH1(R132H)与10mMNADPH、10mM氯化钙和75mMαKG预孵育60分钟。在20℃下，使用相对于100mM MES(pH 6.5)、20％PEG6000的良好溶液(well-solution)的3μL混合液滴2:1(蛋白质:沉淀物)通过气相扩散平衡获得晶体。在知情同意作为UCLA IRB批准研究方案的一部分之后获得患者肿瘤样本。在手术切除术之后获得脑肿瘤样本，将其在通过液氮冷却的异戊烷中速冻并在-80℃下储存。使用如先前所述的标准分子生物学技术测定各样本的IDH1突变状况(Yan,H.等，N Engl J Med 360,765-73(2009))。提取代谢物且通过如上所述的LC-MS/MS分析。全部方法都可用于补充材料。
补充方法
ICDH1野生型和突变体在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化。人异柠檬酸脱氢酶1(cDNA)(IDH1；参考ID NM_005896)的开放阅读框(ORF)克隆从Invitrogen以pENTR221(Carlsbad，CA)和从Origene Inc.以pCMV6(Rockville,MD)购买。为了用野生型或突变IDH1转染细胞，利用标准分子生物学诱变技术来改变pCMV6中的ORF的碱基对395处的DNA序列以引入从鸟嘌呤到腺嘌呤的碱基对改变，这引起在132位处氨基酸编码从精氨酸(野生型)改变为组氨酸(突变；或R132H)，且通过标准DNA测序方法来确认。对于293T细胞转染，在有或没有羧基-末端Myc-DDK-标记的情况下，将野生型和R132H突变IDH1亚克隆到pCMV-Sport6中。对于稳定细胞系的产生，使用在pCMV6中的构建体。对于在大肠杆菌中的表达，使用设计用来分别在5’端和3’端增加NDEI和XHO1限制性位点的引物通过PCR来从pENTR221扩增编码区。将所得片段克隆到载体pET41a(EMD Biosciences,Madison,WI)中以实现C-末端His8-标记的大肠杆菌表达。使用多点突变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)对pET41a-ICHD1质粒进行定点诱变以使G395变为A，引起Arg到His的突变。将R132C、R132L和R132S突变以类似方式引入pET41a-ICHD1中。
如下在大肠杆菌RosettaTM菌株(Invitrogen,Carlsbad,CA)中表达野生型和突变蛋白质且从其中纯化。使细胞在LB(20μg/ml卡那霉素)中在37℃下在振荡下生长，直到OD600达到0.6。使温度变为18℃且通过加入IPTG达到最后浓度1mM来诱导蛋白质表达。在12-16小时的IPTG诱导之后，使细胞再悬浮于裂解缓冲液(20mMTris(pH7.4)、0.1％TritonX-100、500mM NaCl、1mM PMSF、5mMβ-巯基乙醇、10％甘油)中并通过微流化破坏。将20,000g上清液上样到用镍柱缓冲液A(20mM Tris(pH7.4)、500mM NaCl、5mMβ-巯基乙醇、10％甘油)平衡的金属螯合物亲和性树脂(MCAC)上并以20柱体积洗涤。从柱的洗脱通过在镍柱缓冲液A中的10％至100％镍柱缓冲液B(20mM Tris(pH7.4)、500mM NaCl、5mMβ-巯基乙醇、500mM咪唑、10％甘油)的20-柱体积线性梯度实现。含有目标蛋白质的部分通过SDS-PAGE鉴定，将其汇集并相对于200-体积过量的凝胶过滤缓冲液(200mM NaCl、50mM Tris 7.5、5mMβ-巯基乙醇、2mM MnSO4、10％甘油)渗析两次，随后使用Centricon(Millipore,Billerica,MA)离心浓缩仪浓缩到10ml。活性二聚体的纯化通过将来自MCAC柱的洗脱液施加到用凝胶过滤缓冲液平衡的Sephacryl S-200(GE Life Sciences,Piscataway,NJ)柱并用20柱体积的相同缓冲液洗脱该柱来实现。通过SDS-PAGE鉴定对应于二聚蛋白质的保留时间的部分且将其汇集，在-80℃下储存。
细胞系和细胞培养物。在具有10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modifiedEagles Medium)中培养293T细胞且根据制造商指导书在具有Fugene 6(Roche)或Lipofectamine 2000(Invitrogen)的6孔板中使用基于pCMV-6的IDH-1构建体转染。将亲本载体pCMV6(没有插入物)、pCMV6-野生型IDH1或pCMV6-R132H转染到在具有10％胎牛血清的DMEM中培养的人胶质母细胞瘤细胞系(分别为U87MG；LN-18(ATCC、HTB-14和CRL-2610))中。在转染后约24小时，将细胞培养物转移到含有G418钠盐的浓度为500μg/ml(U87MG)或750μg/ml(LN-18)的培养基中以选择稳定的转染子。产生抗G418细胞的汇集群且野生型IDH1或R132IDH1的表达通过标准蛋白质印迹分析确认。
蛋白质印迹。对于在293细胞中的瞬时转染实验，在用标准RIPA缓冲液转染后72小时，使细胞裂解。通过SDS-PAGE分离裂解物，将其转移到硝化纤维中并用山羊-抗-IDHc抗体(Santa Cruz Biotechnology sc49996)或兔-抗-MYC标记抗体(Cell SignalingTechnology#2278)探测且随后用HRP-缀合的驴-抗-山羊抗体或HRP-缀合的山羊-抗-兔抗体(Santa Cruz Biotechnology sc2004)检测。确认野生型IDH1和R132H IDH1二者的表达的IDH1抗体从Proteintech获得。所使用的IDH2小鼠单克隆抗体从Abcam获得。
通过LC-MS/MS检测在纯化酶反应中的异柠檬酸、αKG和2HG。如通过在340nm下的NADPH的氧化状态的测量判断，将如文中所述进行的酶反应进行完全。将反应物用8体积的甲醇提取，且离心以除去沉淀的蛋白质。将上清液在氮气流下干燥并再悬浮于H2O中。在API2000LC-MS/MS(Applied Biosystems,Foster City,CA)上进行分析。在150×2mm，4μMSynergi Hydro-RP 80A柱上使用缓冲液A(10mM三丁胺、15mM乙酸、3％(v/v)在水中的甲醇)和缓冲液B(甲醇)的梯度使用MRM检测通道来进行样本分离和分析。
基于细胞裂解物的酶测定。在用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的M-PER裂解缓冲液转染后24小时获得用于测量酶活性的293T细胞裂解物。在将裂解物超声处理并以12,000g离心之后，将上清液收集并对于总蛋白质浓度归一化。为了测量IDH氧化活性，将3μg裂解物蛋白质加到200μl含有33mM Tris-乙酸盐缓冲液(pH 7.4)、1.3mMMgCl2、0.33mM EDTA、100μMβ-NADP和不同浓度的D-(+)-苏-异柠檬酸的测定溶液中。反映NADPH生成的340nm下的吸光度是在SpectraMax 190分光光度计(Molecular Devices)上每20秒测量，历时30分钟。数据点代表每种裂解物的重复3次的平均活性，对集中于每5分钟的5个时间点之中取平均值。为了测量IDH还原活性，将3μg裂解物蛋白质加到200μl含有33mM Tris-乙酸盐(pH7.4)、1.3mM MgCl2、25μMβ-NADP、40mM NaHCO3和0.6mMαKG的测定溶液中。测量340nm吸光度随时间的降低以评估NADPH消耗量，每种裂解物重复3次。
重组IDH1酶测定。所有反应都在标准酶反应缓冲液(150mM NaCl、20mM Tris-Cl(pH 7.5)、10％甘油、5mM MgCl2和0.03％(w/v)牛血清蛋白)中进行。为了测定动力学参数，加入足够酶以产生线性反应，历时1至5秒。通过在SFM-400停流分光光度计(BioLogic,Knoxville,TN)中观察在340nm下辅因子的还原状态来监测反应进程。用Sigmaplot软件包(Systat Software,San Jose,CA)使用对于标准动力学模型的曲线拟合算法来测定酶常数。
测定来自酶反应和肿瘤的反应产物的手性。使酶反应进行完全且用如上所述的甲醇提取，随后在通过LC-MS/MS解析和分析之前将其用对映异构纯的酒石酸衍生。在充分干燥之后，使样本再悬浮于新鲜制备的在二氯甲烷:乙酸(4:1)中的50mg/ml(2R,3R)-(+)-酒石酸中并在75℃下孵育30分钟。在冷却到室温之后，将样本以14,000g短暂离心，在氮气流下干燥且再悬浮于H2O中。在API200 LC-MS/MS(Applied Biosystems,Foster City,CA)上使用在Luna C18(2)150x 2mm，5μM柱上的90:10(2mM甲酸铵(pH 3.6):MeOH)的等度流来进行分析。使用362.9/146.6MRM检测通道和以下仪器设置来检测酒石酸衍生的2HG：DP-1、FP-310、EP-4、CE-12、CXP-26。类似地进行(R)-2HG标准物、2HG外消旋混合物和甲醇-提取的肿瘤生物质(q.v.)的分析。
结晶学条件。在20℃下使用相对于100mM MES(pH 6.5)、20％PEG 6000的良好溶液的3μL混合液滴2:1(蛋白质:沉淀物)通过气相扩散平衡获得晶体。
蛋白质表征。约90mg人胞质异柠檬酸脱氢酶(HcIDH)由Agios供应给XtalBioStructures。该蛋白质为具有11-残基C-末端亲和性纯化标记(序列SLEHHHHHHHH)的工程改造突变形式R132S。计算的单体分子量为48.0kDa且理论pI为6.50。在-80℃下将浓度为约6mg/mL浓度的蛋白质以1-mL等分样本储存在50mM Tris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl、5mMβ-巯基乙醇和10％甘油中。如图32A所示，进行SDS-PAGE以测试蛋白质纯度且进行抗组氨酸蛋白质印迹以证明该蛋白质确实是his-标记的。将该蛋白质的样本注入FPLC尺寸排阻柱中以评估样本纯度并测定在溶液中的聚合状态。图32B为该操作的色谱图，显示在估算的87.6kDa下出现的单个峰，提示IDH在pH 7.4下作为二聚体存在。在结晶之前，使用Amicon离心浓缩仪将蛋白质交换到20mM Tris-HCl(pH 7.4)和100mM NaCl中。此时，蛋白质也被浓缩到约15mg/mL。在该蛋白质浓度和离子强度下，蛋白质易于形成可检测水平的沉淀物。在旋出沉淀物之后，溶液在4℃下在约10mg/mL下稳定。
初始结晶尝试。获得衍射品质晶体的策略来源于文献条件，具体为“Structuresof Human Cytosolic NADP-dependent Isocitrate Dehydrogenase Reveal a NovelSelf-regulatory Mechanism of Activity,”Xu等，(2005)J.Biol.Chem.279:33946-56。在该研究中，生成两种晶型的HcIDH野生型蛋白质。一种晶型含有其“二元配合物”IDH-NADP，其从悬滴以四方晶系空间群P43212结晶。液滴由相等份数的蛋白质溶液(15mg/mL IDH、10mMNADP)和由100mM MES(pH 6.5)和12％PEG 20000组成的沉淀物形成。另一晶型含有其“四元配合物”IDH-NADP/异柠檬酸/Ca2+，其使用100mM MES(pH 5.9)和20％PEG 6000以单斜晶系空间群P21结晶作为沉淀物。在此，已将10mM DL-异柠檬酸和10mM氯化钙加到蛋白质溶液中。在该研究中结晶R132S突变体的初次尝试围绕具有很少改变的这两种所报道的条件。以下列出可能不同的结晶的组分；在筛选过程中试验了这些组分的若干不同组合。
在蛋白质溶液中：
HcIDH(R132S) 始终约10mg/mL或约0.2mM
Tris-HCl(pH 7.4) 始终20mM
NaCl 始终100mM
NADP+/NADPH 不存在或5mM NADP+(没有尝试NADPH)
DL-异柠檬酸三钠盐 不存在或5mM
氯化钙 不存在或10mM
在沉淀物中： 100mM MES(pH 6.5)和12％PEG 20000或
100mM MES(pH 6.0)和20％PEG 6000
液滴大小： 始终3μL
液滴比： 2:1、1:1或1:2(蛋白质:沉淀物)
在形成悬滴之后，始终观察到乳白色沉淀物。在2-4天之后在20℃下检查时，大多数液滴显示致密沉淀或相分离。在一些情况下，沉淀物下沉且其是来自已经生长的这些类型的小晶体液滴，例如，如图33所示。
晶体优化。一旦获得真实晶体，下一步骤将是优化以及时且一致的方式获得IDH-NADP/异柠檬酸/Ca2+的更大且更规则形状的晶体的条件。最佳筛选集中于从5.7到6.2改变pH，从50mM到200mM改变MES浓度和从20％到25％改变PEG 6000浓度。同样，建立较大的液滴(5-6μl)且液滴比再次不同。这些尝试没能生成较大的衍射品质的晶体，但是确实使上文报道的结果得以再现。观察到致密的沉淀物、油相分离或小晶体。
使用α-酮戊二酸。在异柠檬酸晶体的优化的同时，进行其它筛选以获得代之以与α-酮戊二酸复合的IDH(R132S)的晶体。蛋白质溶液一贯为在20mM Tris-HCl(pH 7.4)和100mM NaCl中的10mg/mL IDH。以该顺序加入以下各物：5mM NADP、5mMα-酮戊二酸(游离酸，用NaOH对pH进行平衡)和10mM氯化钙。在建立液滴之前，使该蛋白质与这些化合物孵育至少1小时。沉淀物为100mM MES(pH 6.5)和12％PEG 20000或100mM MES(pH 6.5)和20％PEG6000。此外，最初见到沉淀或相分离，但在一些液滴中，形成小晶体。在液滴之一的边缘形成单个大晶体，图片如下。这是在以下结构测定中使用的单晶。图34示出由含有5mM NADP、5mMα-酮戊二酸、10mM Ca2+的蛋白质溶液获得的晶体。沉淀物含有100mM MES(pH 6.5)和12％PEG 20000。
低温条件。为了将晶体运送到X射线源并在低温结晶学期间保护晶体，需要合适的低温保护剂。非常广泛地使用甘油且其是首选。将低温溶液基本上制为蛋白质缓冲液和沉淀物溶液外加甘油的混合物：20mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM NaCl、5mM NADP、5mMα-酮戊二酸、10mM氯化钙、100mM MES(pH 6.5)、12％PEG 20000和12.5％甘油或25％甘油。以两个步骤将晶体转移到低温溶液中。首先，将5μL的该12.5％甘油溶液直接加到液滴中并孵育10分钟，留意晶体的可能开裂。将该液体从液滴中除去且将10μL的该25％甘油溶液加在晶体之上。此外，将其孵育10分钟，收获到尼龙绳中并将其投入液氮中。将晶体浸没在液氮真空瓶中储存以便于运输。
数据收集和处理。在氮气流下在接近-170℃的温度下将冷冻的晶体安装在RigakuRAXIS IV X射线仪上。使用来自旋转铜阳极有效来源的波长辐射、1°振荡和10分钟暴露用图像板检测器来收集200°数据组。用作冷冻保护剂的25％甘油的存在对于适当冷冻来说是足够的，因为没有观察到晶体开裂迹象(分裂斑点或重叠晶格)。在 分辨率下观察到漫射环，很可能由冰冻所引起。X射线衍射图显示清晰的晶格平面和合理的斑点分离，尽管沿一个倒易轴的空间相当小(b＝275.3)。用HKL2000(Otwinowski and Minor,1997)为该数据编索引为分辨率到空间群P21212。已知HcIDH的三种结构，指定为封闭型(1T0L)、开放型(1T09亚单位A)和半开放型(1T09亚单位B)。使用仅来自这三种形式的蛋白质原子用CCP4程序PHASER(Bailey,1994)进行分子置换。仅封闭型用不对称单元中的6个蛋白质亚单位产生成功的分子置换结果。晶胞含有约53.8％溶剂。
模型精化。使用CCP4程序REFMAC5，进行刚性体精化以适合不对称单元中的6个IDH亚单位中的每一个。接着进行在每个蛋白质亚单位中的3个结构域的刚性体精化。利用相关亚单位对的非结晶对称平均值的限制性精化产生具有33％的R晶体和42％的R游离的初始结构。使用图形程序COOT(Emsley和Cowtan,2004)进行模型建立和真实空间精化。计算差异图且这显示在强电子密度中，NADP配体和钙离子的6个单个拷贝用COOT手动拟合。α-酮戊二酸结构的密度不太确定且在使用2Fo-Fc复合省略图对结合位点蛋白残基进行拟合之后将其拟合。应用与手动真实空间密度拟合耦合的自动Ramachandran曲线优化来改善整体几何形态和适合性。用最后一轮的NCS的限制性精化产生30.1％的R晶体和35.2％的R游离。
工作组/试验组中的反射 68,755/3,608(5.0％)
Rcryst 30.1％
Rfree 35.2％
对于IDH(R132S)-NADP/α-酮戊二酸/Ca2+的X射线数据和精化统计
对于所有数据和在最高分辨率壳中的数据给出完整度和R-合并。最高壳值在括号中。
aR因数＝Σhkl|Fo-Fc|/ΣhklFo，其中Fo和Fc分别为对于在精化中使用的所有反射hkl的观察和计算的结构因数幅度。
bR-游离是对于未在精化中使用的5％的数据计算。
其中 且相概率P(α)＝exp(A cosα+B sinα+C cos(2α)+D sin(2α))，其中A、B、C和D为Hendrickson-Lattman系数且α为相。
IDH(R132S)-NADP/α-酮戊二酸/Ca2+的立体化学
通过PROCHECK(Laskowski RA,MacArthur MW,Moss DS,Thornton JM(1993)JAppl Crystallogr 26:283-291.)产生。
d关于主链和侧链二面角和主链共价力(键长和键角)的G因数。值应该理想地为-0.5或高于-1.0。
临床试样、代谢物提取和分析。在手术切除术期间获得人脑肿瘤样本，将其在通过液氮冷却的异戊烷中速冻并在-80℃下储存。使用如由WHO确立的标准临床病理学分类和分级进行组织的临床归类。展开基因组序列分析以鉴定含有野生型异柠檬酸脱氢酶(IDH1)或改变氨基酸132的突变的脑肿瘤样本。使用标准方法从50-100mg脑肿瘤组织中分离基因组DNA。对分离的基因组DNA使用聚合酶链式反应以扩增含有人IDH1的内含子和第二外显子序列和通过标准分子生物学技术评估的突变状态的基因组DNA的295个碱基对片段。
通过将10X体积(m/v比)的-80℃的甲醇:水混合物(80％:20％)加入到脑组织(约100mg)中，接着在4℃下均质化30秒来完成代谢物提取。随后将这些冷却的甲醇提取的均质化组织以14,000rpm离心30分钟以使细胞和组织碎片沉淀且将澄清的组织上清液转移到螺旋帽冷冻机小瓶中且在-80℃下储存。为了分析，将2X体积的三丁胺(10mM)乙酸(10mM)(pH5.5)加到样本中并通过LCMS分析如下。使用Millex-FG 0.20微米盘过滤样本提取物且将10μL注入逆相HPLC柱(Synergi 150mm×2mm，Phenomenex Inc.)中，且使用匀变到80％甲醇:10mM三丁胺:10mM乙酸的具有10mM三丁胺和10mM乙酸的线性梯度LCMS-级甲醇(50％)以200μL/min洗脱6分钟。使用三重四极杆质谱仪检测洗脱的代谢物离子，该三重四极杆质谱仪经调谐以根据对于8种已知中心代谢物(包括2-羟基戊二酸)的分子量和裂解谱以负模式用多反应监测模式检测通道组(MRM’s)来检测。使用分析软件(Applied Biosystems,Inc.)处理数据且通过标准峰积分方法获得代谢物信号强度。
实施例9抑制IDH1 R132H的化合物
在标准384-孔板中体积为76μl的测定缓冲液(150mM NaCl、10mM MgCl2、20mMTris(pH 7.5)、0.03％牛血清蛋白)中如下进行测定：向25μl底物混合物(8μM NADPH、2mMαKG)中加入在DMSO中的1μl测试化合物。将该板进行短暂离心，且随后加入25μl酶混合物(0.2μg/ml ICDH1R132H)，接着短暂离心并以100RPM振荡。将反应物在室温下孵育50分钟，随后加入25μl检测混合物(30μM刃天青(resazurin)，36μg/ml))且将混合物在室温下进一步孵育5分钟。通过荧光光谱法在Ex544Em590c/o 590下检测刃天青到试卤灵的转化。
表24a示出IDH1R132H抑制剂的5种实例的野生型对突变体的选择性特性。在1x KmNADPH下进行野生型IDH1测定，相反，在10x或100x Km NADPH下进行IDHR132H测定。第二实例显示即使是在100μM下也没有抑制作用。同样，第一实例的IC50＝5.74μM，但当在100x Km下测定时，显著移位，指示直接NADPH-竞争性抑制剂。对野生型对突变体的选择性可以大于20倍。
表24a
抑制IDH1R132H的另外示例性化合物提供在下表24b中。
实施例10.与野生型IDH2酶相比，突变酶IDH2-R172K具有升高的NADPH还原催化活 性。
对于酶IDH2-R172K、野生型IDH2、IDH1-R132H和野生型IDH1测量NADPH还原活性。各反应的最终反应物浓度如下：20mM Tris 7.5、150mM NaCl、2mM MnCl2、10％甘油、0.03％BSA、酶(1-120μg/mL)、1mM NADPH和5mMαKG(α酮戊二酸)。所得特异性活性(μmol/min/mg)以图表形式呈现于图35中。结果指示，与野生型IDH2相比，突变IDH2具有升高的还原活性，尽管突变IDH2酶和野生型IDH2酶都能够在饱和水平的反应物αKG和NADPH下产生2HG(2-羟基戊二酸)。
实施例11：2-HG积聚在具有IDH1/2突变的AML中。
患者和临床数据
在诊断和复发时，遵循REB批准的知情同意书从AML患者采集周围血液和骨髓。通过ficol泛影钠离心而分离细胞，且在-150℃下储存在10％DMSO、40％FCS和50％α-MEM培养基中。将患者血清在-80℃下储存。在大学健康网络(University Health Network)(加拿大，多伦多)的诊断实验室中进行细胞遗传学和分子测试。对患者亚组(n＝132)给予使用由柔红霉素和阿糖胞苷组成的标准诱导和巩固化学治疗方案的一致的初始治疗。
IDH1和IDH2基因型
使用Qiagen Puregene试剂盒(Valencia CA)从白血病细胞和细胞系中提取DNA。对于样本亚组(n＝96)，使用Qiagen RNeasy试剂盒从白血病细胞中提取RNA，且将其逆转录为cDNA用于测定IDH1和IDH2的基因型。使用Sequenom MassARRAYTM平台(Sequenom,SanDiego,CA)在大学健康网络(加拿大，多伦多)的分析遗传技术中心测定IDH1和IDH2基因型。通过在ABI PRISM 3130XL基因分析仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)上直接进行测序来确认阳性结果。
细胞系
从Mark Minden(Ontario Cancer Institute,Toronto,Canada)的实验室获得AML细胞系(OCI/AML-1、OCI/AML-2、OCI/AML-3、OCI/AML-4、OCI/AML-5、HL-60、MV-4-11、THP-1、K562和KG1A)和5637细胞。将初生AML细胞在补充有20％胎牛血清和10％如先前所述13的5637细胞条件培养基的α-MEM培养基中培养。通过在Vi-CELL自动细胞计数器(BeckmanCoulter,Fullarton,CA)上对如由台盼蓝拒染所评估的活细胞进行计数而产生生长曲线。
IDH1和IDH2蛋白质的表达/纯化
从OriGene Technologies(Rockville,MD)购买人IDH1cDNA(参考ID NM_005896)和IDH2cDNA(参考ID NM_002168)。对于在大肠杆菌中的表达，使用设计用来分别在5’端和3’端增加NDEI和XHO1限制性位点的引物通过PCR来扩增编码区。将对于IDH1的所得片段(全长)和对于IDH2的所得片段(残基40-452)克隆到载体pET41a(EMD Biosciences,Madison,WI)中以实现C-末端His8-标记蛋白质的大肠杆菌表达。使用LightningSite-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)对pET41a-IDH1和pET41a-IDH2质粒进行定点诱变以将IDH1cDNA中的C394改变为T，产生R132C突变，且将IDH2cDNA中G515改变为A，产生R172K突变。在大肠杆菌RosettaTM(DE3)菌株中表达野生型IDH1蛋白和突变IDH1蛋白且根据制造商指导书(Invitrogen,Carlsbad,CA)从其中纯化。通过共转染编码相应IDH2克隆和pG-KJE8表达伴侣蛋白的表达质粒实现IDH2蛋白的过度表达。
IDH1/2活性测定
通过跟踪在异柠檬酸和NADP+(正向反应)或αKG和NADPH(逆反应)存在下340nm下于SFM-400停流分光光度计(BioLogic,Knoxville,TN)中NADPH的吸光度随时间的改变来评估酶活性。所有反应都在标准酶反应缓冲液(150mM NaCl、20mM Tris-Cl(pH 7.5)、10mMMgCl2和0.03％(w/v)牛血清蛋白)中进行。对于测定动力学参数，加入足够酶以产生线性反应，历时1-5秒。用Sigmaplot软件包(Systat Software,San Jose,CA)使用对于标准动力学模型的曲线拟合算法来测定酶结合常数。对于测定kcat，将酶与5X Km的底物和辅因子孵育；通过OD340随时间的变化来测定NADPH或NADP的消耗。在两种情况下，对于NADPH，使用消光系数6200M-1cm-1。
2-HG和代谢物分析
使用如先前所述的80％水性甲醇(-80℃)从培养细胞、初生白血病细胞和血清中提取代谢物。对于细胞提取，将冷冻的活组织检查物在37℃下迅速解冻，且使2百万个细胞的等分样本在4℃下离心。使沉淀再悬浮于-80℃的80％甲醇中。对于血清提取，将1ml血清迅速解冻且与4ml的-80℃甲醇混合。将所有提取物都在4℃下以13000rpm离心以除去沉淀物，在室温下干燥且在-80℃下储存，直到通过LC-MS分析。通过与负模式电喷雾三重四极MS联合的离子配对逆相LC使用多反应监测来测定代谢物水平(2-HG、α-KG、琥珀酸、延胡索酸和苹果酸)，且将积分洗脱峰与代谢物标准曲线比较以便如所述绝对量化。
统计分析
使用Fisher's精确检验来测试野生型IDH1/2和突变IDH1/2患者之间类别变项的差异。使用单因素方差分析，接着用校正用于多重比较的学生t检验来测试在IDH1活性和代谢物浓度方面的差异。p<0.05的差异被视为是显著的。
结果
为了研究IDH1 R132突变在AML中的作用，为了鉴定在活细胞组织库中的突变样本对从在Princess Margaret Hospital中治疗的一系列145名AML患者获得的初次呈现的白血病细胞进行基因型测定。在这些患者中的11名(8％)中发现杂合IDH1R132突变(表25)。在AML中观察到的IDH1突变谱看似与在CNS肿瘤中见到的不同。在CNS中，大多数突变(80-90％)为IDH1 R132H取代，而观察到5名患者、4名患者和2名患者分别具有IDH1 R132H突变、IDH1 R132C突变和IDH1 R132G突变(表25)。在四种情况下，同样从在复发时取得的样本中得到白血病细胞。IDH1突变保留在这些样本中的4/4中(表25)。具有IDH1突变的患者之一已经从早期的脊髓发育不良综合征(MDS)发展到了AML。当分析来自该患者的先前MDS的细胞时，发现IDH1为野生型。测定另外14名具有MDS的患者基因型，且发现所有患者的IDH1都为野生型，提示IDH1突变不是该疾病的共同特点。在来自IDH1突变患者亚组(n＝8)的样本中，使用逆转录RNA来测定基因型以评估突变和野生型等位基因的相对表达。Seqenom基因型测定显示这些样本的平衡等位基因峰，指示表达了野生型基因和突变基因二者。也测定10种确立的AML细胞系的基因型(OCI/AML-1、OCI/AML-2、OCI/AML-3、OCI/AML-4、OCI/AML-5、HL-60、MV-4-11、THP-1、K562和KG1A)且没有一个携带IDH1R132突变。
表25：鉴定13名携带IDH1R132或IDH2R172突变的AML患者*
表25
*NPM1表示核磷蛋白1，和FLT FMS-相关酪氨酸激酶抑制剂3。na指示对一些患者没有得到的一些数据。
建立用于测量该组AML样本中的2-HG的代谢物筛选测定。2-HG的水平比具有IDH1R132突变的样本中高约50倍(表25、图36A、表26)。2-HG在具有IDH1 R132突变AML的患者的血清中也升高(图36B)。在IDH1的残基132处的具体氨基酸取代与该组患者中的2-HG的水平之间没有关系。
表26：在单个IDH1/2突变体和野生型AML细胞中的代谢物浓度*
*IDH1/2表示异柠檬酸脱氢酶1和2；2-HG：2-羟基戊二酸；且α-KG：α-酮戊二酸。
代谢物测量并非对于所有患者都可用。
由于有限的患者样本而没有进行新陈代谢测量
指示在复发时获得的样本。
具有野生型IDH1的两种样本也显示高水平的2-HG(表25)。高2-HG浓度有助于这两种AML样本中的IDH2基因测序，这确认了两种样本中IDH2R172K突变的存在(表25)。
有或没有IDH1/2突变的患者的临床特征的评估揭示IDH1/2突变与正常染色体组型之间的显著相关性(p＝0.05)，但在这两组之间没有其它差异(表27)。值得注意的是，接受一致治疗的患者亚组(n＝136)在治疗响应方面没有差异。这些发现与鉴定AML中的IDH1突变的初始报告一致。
表27：IDH1/突变体和野生型患者的特征*
*对于加减值，值指示平均值，且±指示标准偏差。IDH1/2表示异柠檬酸脱氢酶1和2，WBC：白细胞计数，FLT3：FMS-相关酪氨酸激酶抑制剂3，和NPM1：核磷蛋白1。
P-值使用学生t-检验计算。
P-值使用Fisher’s精确检验计算。
将来自野生型和IDH1突变患者的AML细胞板体外培养。在IDH1 R132突变细胞和IDH1野生型细胞的生长率和生活力方面没有差异，两组在培养物中增殖的能力都显示高度变化性，正如由初生AML细胞的特征一样(图36C)。IDH1 R132突变细胞中的2-HG水平与其在培养物中的生长率或生活力之间没有关系。在培养14天之后，突变AML细胞保留其IDH1R132突变(11/11)，且继续积聚高水平的2-HG(图36A)，进一步确认IDH1 R132突变导致2-HG在AML细胞中生成和积聚。
为了研究IDH1/2突变对最接近IDH反应的细胞代谢物的浓度的影响，测量具有IDH1/2突变的AML细胞中和在一组与AML亚型和细胞生成特性匹配的野生型AML细胞中的α-KG、琥珀酸、苹果酸和延胡索酸的水平。发现，与IDH1野生型细胞相比，没有一种代谢物在IDH1突变体方面有极大的改变(图27，补充表26)。α-KG的平均水平在IDH1/2突变AML细胞中没有改变，提示如先前所假设，突变没有降低这种代谢物的浓度。为了确认IDH1的R132C突变和IDH2的R172K突变赋予生成2-HG的新型酶活性，测定重组突变酶的α-KG的NADPH-依赖性还原。当在完成酶测定后通过LC-MS分析样本时，将2-HG鉴定为IDH1 R132C突变酶和IDH2R172K突变酶的最终产物(图38)。通过LC-MS没有检测到异柠檬酸，指示2-HG为该反应的唯一产物(图38)。即使在含有用CO2饱和的NaHCO3的缓冲液中进行还原反应时，该观察结果仍然适用。患有AML的一大部分的IDH1突变患者具有IDH1 R132C突变(表25)。为了在生物化学方面表征突变IDH1 R132C，在体外评估重组R132C蛋白的酶性质。动力学分析显示R132C取代严重损害异柠檬酸到α-KG的氧化脱羧，其中kcat显著降低，尽管对辅因子NADP+的亲和力保持基本不变(表28)。然而，与先前描述的R132H突变酶不同，R132C突变导致对异柠檬酸的亲和力(KM)显著损失和净异柠檬酸代谢效率(kcat/KM)超过6个数量级的降低(表28)。这提示在AML情况下酶活性的底物水平调节方面的可能差异。虽然在R132处的半胱氨酸取代使异柠檬酸到α-KG的正常转化失活，但是IDH1R132C突变酶获得了以NADPH依赖方式催化α-KG到2-HG的还原的能力(图39)。与野生型酶相比，突变IDH1 R132C的该还原反应非常高效(kcat/KM)，这是由于NADPH和α-KG底物的结合亲和力(KM)的大大增加(表28)。
表28：IDH1 R132C突变酶的动力学参数
*n/a指示没有可以测量的活性。
序列表
<110> 安吉奥斯医药品有限公司
<120> 用于细胞增殖相关病症的方法和组合物
<130> C2081-7013WO
<140> PCT/US2010/027253
<141> 2010-03-12
<150> 61/266,929
<151> 2009-12-04
<150> 61/253,820
<151> 2009-10-21
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<150> 61/160,664
<151> 2009-03-16
<150> 61/160,253
<151> 2009-03-13
<160> 804
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明:合成寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的说明: 合成8xHis标记
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<220>
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gggcgtttta aagacatctt tcaggagata tatgacaagc agtacaagtc ccagtttgaa 720
gctcaaaaga tctggtatga gcataggctc atcgacgaca tggtggccca agctatgaaa 780
tcagagggag gcttcatctg ggcctgtaaa aactatgatg gtgacgtgca gtcggactct 840
gtggcccaag ggtatggctc tctcggcatg atgaccagcg tgctggtttg tccagatggc 900
aagacagtag aagcagaggc tgcccacggg actgtaaccc gtcactaccg catgtaccag 960
aaaggacagg agacgtccac caatcccatt gcttccattt ttgcctggac cagagggtta 1020
gcccacagag caaagcttga taacaataaa gagcttgcct tctttgcaaa tgctttggaa 1080
gaagtctcta ttgagacaat tgaggctggc ttcatgacca aggacttggc tgcttgcatt 1140
aaaggtttac ccaatgtgca acgttctgac tacttgaata catttgagtt catggataaa 1200
cttggagaaa acttgaagat caaactagct caggccaaac tttaa 1245
<210> 9
<211> 2339
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
cctgtggtcc cgggtttctg cagagtctac ttcagaagcg gaggcactgg gagtccggtt 60
tgggattgcc aggctgtggt tgtgagtctg agcttgtgag cggctgtggc gccccaactc 120
ttcgccagca tatcatcccg gcaggcgata aactacattc agttgagtct gcaagactgg 180
gaggaactgg ggtgataaga aatctattca ctgtcaaggt ttattgaagt caaaatgtcc 240
aaaaaaatca gtggcggttc tgtggtagag atgcaaggag atgaaatgac acgaatcatt 300
tgggaattga ttaaagagaa actcattttt ccctacgtgg aattggatct acatagctat 360
gatttaggca tagagaatcg tgatgccacc aacgaccaag tcaccaagga tgctgcagaa 420
gctataaaga agcataatgt tggcgtcaaa tgtgccacta tcactcctga tgagaagagg 480
gttgaggagt tcaagttgaa acaaatgtgg aaatcaccaa atggcaccat acgaaatatt 540
ctgggtggca cggtcttcag agaagccatt atctgcaaaa atatcccccg gcttgtgagt 600
ggatgggtaa aacctatcat cataggtcgt catgcttatg gggatcaata cagagcaact 660
gattttgttg ttcctgggcc tggaaaagta gagataacct acacaccaag tgacggaacc 720
caaaaggtga catacctggt acataacttt gaagaaggtg gtggtgttgc catggggatg 780
tataatcaag ataagtcaat tgaagatttt gcacacagtt ccttccaaat ggctctgtct 840
aagggttggc ctttgtatct gagcaccaaa aacactattc tgaagaaata tgatgggcgt 900
tttaaagaca tctttcagga gatatatgac aagcagtaca agtcccagtt tgaagctcaa 960
aagatctggt atgagcatag gctcatcgac gacatggtgg cccaagctat gaaatcagag 1020
ggaggcttca tctgggcctg taaaaactat gatggtgacg tgcagtcgga ctctgtggcc 1080
caagggtatg gctctctcgg catgatgacc agcgtgctgg tttgtccaga tggcaagaca 1140
gtagaagcag aggctgccca cgggactgta acccgtcact accgcatgta ccagaaagga 1200
caggagacgt ccaccaatcc cattgcttcc atttttgcct ggaccagagg gttagcccac 1260
agagcaaagc ttgataacaa taaagagctt gccttctttg caaatgcttt ggaagaagtc 1320
tctattgaga caattgaggc tggcttcatg accaaggact tggctgcttg cattaaaggt 1380
ttacccaatg tgcaacgttc tgactacttg aatacatttg agttcatgga taaacttgga 1440
gaaaacttga agatcaaact agctcaggcc aaactttaag ttcatacctg agctaagaag 1500
gataattgtc ttttggtaac taggtctaca ggtttacatt tttctgtgtt acactcaagg 1560
ataaaggcaa aatcaatttt gtaatttgtt tagaagccag agtttatctt ttctataagt 1620
ttacagcctt tttcttatat atacagttat tgccaccttt gtgaacatgg caagggactt 1680
ttttacaatt tttattttat tttctagtac cagcctagga attcggttag tactcatttg 1740
tattcactgt cactttttct catgttctaa ttataaatga ccaaaatcaa gattgctcaa 1800
aagggtaaat gatagccaca gtattgctcc ctaaaatatg cataaagtag aaattcactg 1860
ccttcccctc ctgtccatga ccttgggcac agggaagttc tggtgtcata gatatcccgt 1920
tttgtgaggt agagctgtgc attaaacttg cacatgactg gaacgaagta tgagtgcaac 1980
tcaaatgtgt tgaagatact gcagtcattt ttgtaaagac cttgctgaat gtttccaata 2040
gactaaatac tgtttaggcc gcaggagagt ttggaatccg gaataaatac tacctggagg 2100
tttgtcctct ccatttttct ctttctcctc ctggcctggc ctgaatatta tactactcta 2160
aatagcatat ttcatccaag tgcaataatg taagctgaat cttttttgga cttctgctgg 2220
cctgttttat ttcttttata taaatgtgat ttctcagaaa ttgatattaa acactatctt 2280
atcttctcct gaactgttga ttttaattaa aattaagtgc taattaccaa aaaaaaaaa 2339
<210> 10
<211> 452
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Ala Gly Tyr Leu Arg Val Val Arg Ser Leu Cys Arg Ala Ser Gly
1 5 10 15
Ser Arg Pro Ala Trp Ala Pro Ala Ala Leu Thr Ala Pro Thr Ser Gln
20 25 30
Glu Gln Pro Arg Arg His Tyr Ala Asp Lys Arg Ile Lys Val Ala Lys
35 40 45
Pro Val Val Glu Met Asp Gly Asp Glu Met Thr Arg Ile Ile Trp Gln
50 55 60
Phe Ile Lys Glu Lys Leu Ile Leu Pro His Val Asp Ile Gln Leu Lys
65 70 75 80
Tyr Phe Asp Leu Gly Leu Pro Asn Arg Asp Gln Thr Asp Asp Gln Val
85 90 95
Thr Ile Asp Ser Ala Leu Ala Thr Gln Lys Tyr Ser Val Ala Val Lys
100 105 110
Cys Ala Thr Ile Thr Pro Asp Glu Ala Arg Val Glu Glu Phe Lys Leu
115 120 125
Lys Lys Met Trp Lys Ser Pro Asn Gly Thr Ile Arg Asn Ile Leu Gly
130 135 140
Gly Thr Val Phe Arg Glu Pro Ile Ile Cys Lys Asn Ile Pro Arg Leu
145 150 155 160
Val Pro Gly Trp Thr Lys Pro Ile Thr Ile Gly Arg His Ala His Gly
165 170 175
Asp Gln Tyr Lys Ala Thr Asp Phe Val Ala Asp Arg Ala Gly Thr Phe
180 185 190
Lys Met Val Phe Thr Pro Lys Asp Gly Ser Gly Val Lys Glu Trp Glu
195 200 205
Val Tyr Asn Phe Pro Ala Gly Gly Val Gly Met Gly Met Tyr Asn Thr
210 215 220
Asp Glu Ser Ile Ser Gly Phe Ala His Ser Cys Phe Gln Tyr Ala Ile
225 230 235 240
Gln Lys Lys Trp Pro Leu Tyr Met Ser Thr Lys Asn Thr Ile Leu Lys
245 250 255
Ala Tyr Asp Gly Arg Phe Lys Asp Ile Phe Gln Glu Ile Phe Asp Lys
260 265 270
His Tyr Lys Thr Asp Phe Asp Lys Asn Lys Ile Trp Tyr Glu His Arg
275 280 285
Leu Ile Asp Asp Met Val Ala Gln Val Leu Lys Ser Ser Gly Gly Phe
290 295 300
Val Trp Ala Cys Lys Asn Tyr Asp Gly Asp Val Gln Ser Asp Ile Leu
305 310 315 320
Ala Gln Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Met Thr Ser Val Leu Val Cys
325 330 335
Pro Asp Gly Lys Thr Ile Glu Ala Glu Ala Ala His Gly Thr Val Thr
340 345 350
Arg His Tyr Arg Glu His Gln Lys Gly Arg Pro Thr Ser Thr Asn Pro
355 360 365
Ile Ala Ser Ile Phe Ala Trp Thr Arg Gly Leu Glu His Arg Gly Lys
370 375 380
Leu Asp Gly Asn Gln Asp Leu Ile Arg Phe Ala Gln Met Leu Glu Lys
385 390 395 400
Val Cys Val Glu Thr Val Glu Ser Gly Ala Met Thr Lys Asp Leu Ala
405 410 415
Gly Cys Ile His Gly Leu Ser Asn Val Lys Leu Asn Glu His Phe Leu
420 425 430
Asn Thr Thr Asp Phe Leu Asp Thr Ile Lys Ser Asn Leu Asp Arg Ala
435 440 445
Leu Gly Arg Gln
450
<210> 11
<211> 1359
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
atggccggct acctgcgggt cgtgcgctcg ctctgcagag cctcaggctc gcggccggcc 60
tgggcgccgg cggccctgac agcccccacc tcgcaagagc agccgcggcg ccactatgcc 120
gacaaaagga tcaaggtggc gaagcccgtg gtggagatgg atggtgatga gatgacccgt 180
attatctggc agttcatcaa ggagaagctc atcctgcccc acgtggacat ccagctaaag 240
tattttgacc tcgggctccc aaaccgtgac cagactgatg accaggtcac cattgactct 300
gcactggcca cccagaagta cagtgtggct gtcaagtgtg ccaccatcac ccctgatgag 360
gcccgtgtgg aagagttcaa gctgaagaag atgtggaaaa gtcccaatgg aactatccgg 420
aacatcctgg gggggactgt cttccgggag cccatcatct gcaaaaacat cccacgccta 480
gtccctggct ggaccaagcc catcaccatt ggcaggcacg cccatggcga ccagtacaag 540
gccacagact ttgtggcaga ccgggccggc actttcaaaa tggtcttcac cccaaaagat 600
ggcagtggtg tcaaggagtg ggaagtgtac aacttccccg caggcggcgt gggcatgggc 660
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cagaagaaat ggccgctgta catgagcacc aagaacacca tactgaaagc ctacgatggg 780
cgtttcaagg acatcttcca ggagatcttt gacaagcact ataagaccga cttcgacaag 840
aataagatct ggtatgagca ccggctcatt gatgacatgg tggctcaggt cctcaagtct 900
tcgggtggct ttgtgtgggc ctgcaagaac tatgacggag atgtgcagtc agacatcctg 960
gcccagggct ttggctccct tggcctgatg acgtccgtcc tggtctgccc tgatgggaag 1020
acgattgagg ctgaggccgc tcatgggacc gtcacccgcc actatcggga gcaccagaag 1080
ggccggccca ccagcaccaa ccccatcgcc agcatctttg cctggacacg tggcctggag 1140
caccggggga agctggatgg gaaccaagac ctcatcaggt ttgcccagat gctggagaag 1200
gtgtgcgtgg agacggtgga gagtggagcc atgaccaagg acctggcggg ctgcattcac 1260
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atcaagagca acctggacag agccctgggc aggcagtag 1359
<210> 12
<211> 1740
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
ccagcgttag cccgcggcca ggcagccggg aggagcggcg cgcgctcgga cctctcccgc 60
cctgctcgtt cgctctccag cttgggatgg ccggctacct gcgggtcgtg cgctcgctct 120
gcagagcctc aggctcgcgg ccggcctggg cgccggcggc cctgacagcc cccacctcgc 180
aagagcagcc gcggcgccac tatgccgaca aaaggatcaa ggtggcgaag cccgtggtgg 240
agatggatgg tgatgagatg acccgtatta tctggcagtt catcaaggag aagctcatcc 300
tgccccacgt ggacatccag ctaaagtatt ttgacctcgg gctcccaaac cgtgaccaga 360
ctgatgacca ggtcaccatt gactctgcac tggccaccca gaagtacagt gtggctgtca 420
agtgtgccac catcacccct gatgaggccc gtgtggaaga gttcaagctg aagaagatgt 480
ggaaaagtcc caatggaact atccggaaca tcctgggggg gactgtcttc cgggagccca 540
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ggcacgccca tggcgaccag tacaaggcca cagactttgt ggcagaccgg gccggcactt 660
tcaaaatggt cttcacccca aaagatggca gtggtgtcaa ggagtgggaa gtgtacaact 720
tccccgcagg cggcgtgggc atgggcatgt acaacaccga cgagtccatc tcaggttttg 780
cgcacagctg cttccagtat gccatccaga agaaatggcc gctgtacatg agcaccaaga 840
acaccatact gaaagcctac gatgggcgtt tcaaggacat cttccaggag atctttgaca 900
agcactataa gaccgacttc gacaagaata agatctggta tgagcaccgg ctcattgatg 960
acatggtggc tcaggtcctc aagtcttcgg gtggctttgt gtgggcctgc aagaactatg 1020
acggagatgt gcagtcagac atcctggccc agggctttgg ctcccttggc ctgatgacgt 1080
ccgtcctggt ctgccctgat gggaagacga ttgaggctga ggccgctcat gggaccgtca 1140
cccgccacta tcgggagcac cagaagggcc ggcccaccag caccaacccc atcgccagca 1200
tctttgcctg gacacgtggc ctggagcacc gggggaagct ggatgggaac caagacctca 1260
tcaggtttgc ccagatgctg gagaaggtgt gcgtggagac ggtggagagt ggagccatga 1320
ccaaggacct ggcgggctgc attcacggcc tcagcaatgt gaagctgaac gagcacttcc 1380
tgaacaccac ggacttcctc gacaccatca agagcaacct ggacagagcc ctgggcaggc 1440
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tcctgagcgc ggcagagggt gagcctcaca gcccctctct ggaggccttt ctaggggatg 1560
tttttttata agccagatgt ttttaaaagc atatgtgtgt ttcccctcat ggtgacgtga 1620
ggcaggagca gtgcgtttta cctcagccag tcagtatgtt ttgcatactg taatttatat 1680
tgcccttgga acacatggtg ccatatttag ctactaaaaa gctcttcaca aaaaaaaaaa 1740
<210> 13
<211> 414
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Ser Lys Lys Ile Ser Gly Gly Ser Val Val Glu Met Gln Gly Asp
1 5 10 15
Glu Met Thr Arg Ile Ile Trp Glu Leu Ile Lys Glu Lys Leu Ile Phe
20 25 30
Pro Tyr Val Glu Leu Asp Leu His Ser Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Asn
35 40 45
Arg Asp Ala Thr Asn Asp Gln Val Thr Lys Asp Ala Ala Glu Ala Ile
50 55 60
Lys Lys His Asn Val Gly Val Lys Cys Ala Thr Ile Thr Pro Asp Glu
65 70 75 80
Lys Arg Val Glu Glu Phe Lys Leu Lys Gln Met Trp Lys Ser Pro Asn
85 90 95
Gly Thr Ile Arg Asn Ile Leu Gly Gly Thr Val Phe Arg Glu Ala Ile
100 105 110
Ile Cys Lys Asn Ile Pro Arg Leu Val Ser Gly Trp Val Lys Pro Ile
115 120 125
Ile Ile Gly Arg His Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr Arg Ala Thr Asp Phe
130 135 140
Val Val Pro Gly Pro Gly Lys Val Glu Ile Thr Tyr Thr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Gly Thr Gln Lys Val Thr Tyr Leu Val His Asn Phe Glu Glu Gly Gly
165 170 175
Gly Val Ala Met Gly Met Tyr Asn Gln Asp Lys Ser Ile Glu Asp Phe
180 185 190
Ala His Ser Ser Phe Gln Met Ala Leu Ser Lys Gly Trp Pro Leu Tyr
195 200 205
Leu Ser Thr Lys Asn Thr Ile Leu Lys Lys Tyr Asp Gly Arg Phe Lys
210 215 220
Asp Ile Phe Gln Glu Ile Tyr Asp Lys Gln Tyr Lys Ser Gln Phe Glu
225 230 235 240
Ala Gln Lys Ile Trp Tyr Glu His Arg Leu Ile Asp Asp Met Val Ala
245 250 255
Gln Ala Met Lys Ser Glu Gly Gly Phe Ile Trp Ala Cys Lys Asn Tyr
260 265 270
Asp Gly Asp Val Gln Ser Asp Ser Val Ala Gln Gly Tyr Gly Ser Leu
275 280 285
Gly Met Met Thr Ser Val Leu Val Cys Pro Asp Gly Lys Thr Val Glu
290 295 300
Ala Glu Ala Ala His Gly Thr Val Thr Arg His Tyr Arg Met Tyr Gln
305 310 315 320
Lys Gly Gln Glu Thr Ser Thr Asn Pro Ile Ala Ser Ile Phe Ala Trp
325 330 335
Thr Arg Gly Leu Ala His Arg Ala Lys Leu Asp Asn Asn Lys Glu Leu
340 345 350
Ala Phe Phe Ala Asn Ala Leu Glu Glu Val Ser Ile Glu Thr Ile Glu
355 360 365
Ala Gly Phe Met Thr Lys Asp Leu Ala Ala Cys Ile Lys Gly Leu Pro
370 375 380
Asn Val Gln Arg Ser Asp Tyr Leu Asn Thr Phe Glu Phe Met Asp Lys
385 390 395 400
Leu Gly Glu Asn Leu Lys Ile Lys Leu Ala Gln Ala Lys Leu
405 410
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 14
gguuucugca gagucuacu 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 15
aguagacucu gcagaaacc 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 16
cucuucgcca gcauaucau 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 17
augauaugcu ggcgaagag 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 18
ggcaggcgau aaacuacau 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 19
auguaguuua ucgccugcc 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 20
gcgauaaacu acauucagu 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 21
acugaaugua guuuaucgc 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 22
gaaaucuauu cacugucaa 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 23
uugacaguga auagauuuc 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 24
guucuguggu agagaugca 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 25
ugcaucucua ccacagaac 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 26
gcaaggagau gaaaugaca 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 27
ugucauuuca ucuccuugc 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 28
ggagaugaaa ugacacgaa 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 29
uucgugucau uucaucucc 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 30
gagaugaaau gacacgaau 19
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 31
auucguguca uuucaucuc 19
<210> 32
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 32
gaugaaauga cacgaauca 19
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 33
ugauucgugu cauuucauc 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 34
cgaaucauuu gggaauuga 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 35
ucaauuccca aaugauucg 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 36
gggaauugau uaaagagaa 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 37
uucucuuuaa ucaauuccc 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 38
ccuacgugga auuggaucu 19
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 39
agauccaauu ccacguagg 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 40
cuacguggaa uuggaucua 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 41
uagauccaau uccacguag 19
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 42
ggaucuacau agcuaugau 19
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 43
aucauagcua uguagaucc 19
<210> 44
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 44
gcuaugauuu aggcauaga 19
<210> 45
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 45
ucuaugccua aaucauagc 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 46
ggaugcugca gaagcuaua 19
<210> 47
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 47
uauagcuucu gcagcaucc 19
<210> 48
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 48
cagaagcuau aaagaagca 19
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 49
ugcuucuuua uagcuucug 19
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 50
gaagcuauaa agaagcaua 19
<210> 51
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 51
uaugcuucuu uauagcuuc 19
<210> 52
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 52
gcauaauguu ggcgucaaa 19
<210> 53
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 53
uuugacgcca acauuaugc 19
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 54
cugaugagaa gaggguuga 19
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 55
ucaacccucu ucucaucag 19
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 56
guugaggagu ucaaguuga 19
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 57
ucaacuugaa cuccucaac 19
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 58
gaguucaagu ugaaacaaa 19
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 59
uuuguuucaa cuugaacuc 19
<210> 60
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 60
guugaaacaa auguggaaa 19
<210> 61
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 61
uuuccacauu uguuucaac 19
<210> 62
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 62
caaaugugga aaucaccaa 19
<210> 63
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 63
uuggugauuu ccacauuug 19
<210> 64
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 64
ccaaauggca ccauacgaa 19
<210> 65
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 65
uucguauggu gccauuugg 19
<210> 66
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 66
cauacgaaau auucugggu 19
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 67
acccagaaua uuucguaug 19
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 68
gagaagccau uaucugcaa 19
<210> 69
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 69
uugcagauaa uggcuucuc 19
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 70
cuaucaucau aggucguca 19
<210> 71
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 71
ugacgaccua ugaugauag 19
<210> 72
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 72
caucauaggu cgucaugcu 19
<210> 73
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 73
agcaugacga ccuaugaug 19
<210> 74
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 74
cauaggucgu caugcuuau 19
<210> 75
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 75
auaagcauga cgaccuaug 19
<210> 76
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 76
gagauaaccu acacaccaa 19
<210> 77
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 77
uuggugugua gguuaucuc 19
<210> 78
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 78
ccugguacau aacuuugaa 19
<210> 79
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 79
uucaaaguua uguaccagg 19
<210> 80
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 80
cuuugaagaa ggugguggu 19
<210> 81
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 81
accaccaccu ucuucaaag 19
<210> 82
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 82
gggauguaua aucaagaua 19
<210> 83
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 83
uaucuugauu auacauccc 19
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 84
gcacacaguu ccuuccaaa 19
<210> 85
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 85
uuuggaagga acugugugc 19
<210> 86
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 86
guuccuucca aauggcucu 19
<210> 87
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 87
agagccauuu ggaaggaac 19
<210> 88
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 88
gguuggccuu uguaucuga 19
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 89
ucagauacaa aggccaacc 19
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 90
cuuuguaucu gagcaccaa 19
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 91
uuggugcuca gauacaaag 19
<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 92
gaagaaauau gaugggcgu 19
<210> 93
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 93
acgcccauca uauuucuuc 19
<210> 94
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 94
gucccaguuu gaagcucaa 19
<210> 95
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 95
uugagcuuca aacugggac 19
<210> 96
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 96
gguaugagca uaggcucau 19
<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 97
augagccuau gcucauacc 19
<210> 98
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 98
ggcccaagcu augaaauca 19
<210> 99
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 99
ugauuucaua gcuugggcc 19
<210> 100
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 100
cccaagcuau gaaaucaga 19
<210> 101
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 101
ucugauuuca uagcuuggg 19
<210> 102
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 102
cagauggcaa gacaguaga 19
<210> 103
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 103
ucuacugucu ugccaucug 19
<210> 104
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 104
gcaagacagu agaagcaga 19
<210> 105
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 105
ucugcuucua cugucuugc 19
<210> 106
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 106
gcauguacca gaaaggaca 19
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 107
uguccuuucu gguacaugc 19
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 108
ccaaucccau ugcuuccau 19
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 109
auggaagcaa ugggauugg 19
<210> 110
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 110
ccacagagca aagcuugau 19
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 111
aucaagcuuu gcucugugg 19
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 112
cacagagcaa agcuugaua 19
<210> 113
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 113
uaucaagcuu ugcucugug 19
<210> 114
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 114
gagcaaagcu ugauaacaa 19
<210> 115
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 115
uuguuaucaa gcuuugcuc 19
<210> 116
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 116
gagcuugccu ucuuugcaa 19
<210> 117
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 117
uugcaaagaa ggcaagcuc 19
<210> 118
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 118
cuuugcaaau gcuuuggaa 19
<210> 119
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 119
uuccaaagca uuugcaaag 19
<210> 120
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 120
caaaugcuuu ggaagaagu 19
<210> 121
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 121
acuucuucca aagcauuug 19
<210> 122
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 122
cuuuggaaga agucucuau 19
<210> 123
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 123
auagagacuu cuuccaaag 19
<210> 124
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 124
gaagaagucu cuauugaga 19
<210> 125
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 125
ucucaauaga gacuucuuc 19
<210> 126
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 126
gaagucucua uugagacaa 19
<210> 127
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 127
uugucucaau agagacuuc 19
<210> 128
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 128
ggacuuggcu gcuugcauu 19
<210> 129
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 129
aaugcaagca gccaagucc 19
<210> 130
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 130
cuuggcugcu ugcauuaaa 19
<210> 131
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 131
uuuaaugcaa gcagccaag 19
<210> 132
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 132
cauuaaaggu uuacccaau 19
<210> 133
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 133
auuggguaaa ccuuuaaug 19
<210> 134
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 134
ccaaugugca acguucuga 19
<210> 135
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 135
ucagaacguu gcacauugg 19
<210> 136
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 136
gugcaacguu cugacuacu 19
<210> 137
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 137
aguagucaga acguugcac 19
<210> 138
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 138
cguucugacu acuugaaua 19
<210> 139
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 139
uauucaagua gucagaacg 19
<210> 140
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 140
cauuugaguu cauggauaa 19
<210> 141
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 141
uuauccauga acucaaaug 19
<210> 142
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 142
guucauggau aaacuugga 19
<210> 143
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 143
uccaaguuua uccaugaac 19
<210> 144
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 144
cauggauaaa cuuggagaa 19
<210> 145
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 145
uucuccaagu uuauccaug 19
<210> 146
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 146
caaacuagcu caggccaaa 19
<210> 147
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 147
uuuggccuga gcuaguuug 19
<210> 148
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 148
ccugagcuaa gaaggauaa 19
<210> 149
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 149
uuauccuucu uagcucagg 19
<210> 150
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 150
cuaagaagga uaauugucu 19
<210> 151
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 151
agacaauuau ccuucuuag 19
<210> 152
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 152
cuguguuaca cucaaggau 19
<210> 153
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 153
auccuugagu guaacacag 19
<210> 154
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 154
guguuacacu caaggauaa 19
<210> 155
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 155
uuauccuuga guguaacac 19
<210> 156
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 156
cacucaagga uaaaggcaa 19
<210> 157
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 157
uugccuuuau ccuugagug 19
<210> 158
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 158
guaauuuguu uagaagcca 19
<210> 159
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 159
uggcuucuaa acaaauuac 19
<210> 160
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 160
guuauugcca ccuuuguga 19
<210> 161
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 161
ucacaaaggu ggcaauaac 19
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 162
cagccuagga auucgguua 19
<210> 163
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 163
uaaccgaauu ccuaggcug 19
<210> 164
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 164
gccuaggaau ucgguuagu 19
<210> 165
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 165
acuaaccgaa uuccuaggc 19
<210> 166
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 166
ccuaggaauu cgguuagua 19
<210> 167
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 167
uacuaaccga auuccuagg 19
<210> 168
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 168
ggaauucggu uaguacuca 19
<210> 169
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 169
ugaguacuaa ccgaauucc 19
<210> 170
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 170
gaauucgguu aguacucau 19
<210> 171
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 171
augaguacua accgaauuc 19
<210> 172
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 172
gguuaguacu cauuuguau 19
<210> 173
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 173
auacaaauga guacuaacc 19
<210> 174
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 174
guacucauuu guauucacu 19
<210> 175
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 175
agugaauaca aaugaguac 19
<210> 176
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 176
gguaaaugau agccacagu 19
<210> 177
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 177
acuguggcua ucauuuacc 19
<210> 178
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 178
guaaaugaua gccacagua 19
<210> 179
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 179
uacuguggcu aucauuuac 19
<210> 180
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 180
ccacaguauu gcucccuaa 19
<210> 181
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 181
uuagggagca auacugugg 19
<210> 182
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 182
gggaaguucu ggugucaua 19
<210> 183
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 183
uaugacacca gaacuuccc 19
<210> 184
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 184
guucuggugu cauagauau 19
<210> 185
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 185
auaucuauga caccagaac 19
<210> 186
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 186
gcugugcauu aaacuugca 19
<210> 187
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 187
ugcaaguuua augcacagc 19
<210> 188
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 188
gugcauuaaa cuugcacau 19
<210> 189
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 189
augugcaagu uuaaugcac 19
<210> 190
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 190
gcauuaaacu ugcacauga 19
<210> 191
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 191
ucaugugcaa guuuaaugc 19
<210> 192
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 192
caugacugga acgaaguau 19
<210> 193
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 193
auacuucguu ccagucaug 19
<210> 194
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 194
ggaacgaagu augagugca 19
<210> 195
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 195
ugcacucaua cuucguucc 19
<210> 196
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 196
gaacgaagua ugagugcaa 19
<210> 197
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 197
uugcacucau acuucguuc 19
<210> 198
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 198
gagugcaacu caaaugugu 19
<210> 199
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 199
acacauuuga guugcacuc 19
<210> 200
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 200
gcaacucaaa uguguugaa 19
<210> 201
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 201
uucaacacau uugaguugc 19
<210> 202
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 202
caaauguguu gaagauacu 19
<210> 203
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 203
aguaucuuca acacauuug 19
<210> 204
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 204
guguugaaga uacugcagu 19
<210> 205
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 205
acugcaguau cuucaacac 19
<210> 206
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 206
guugaagaua cugcaguca 19
<210> 207
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 207
ugacugcagu aucuucaac 19
<210> 208
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 208
ccuugcugaa uguuuccaa 19
<210> 209
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 209
uuggaaacau ucagcaagg 19
<210> 210
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 210
cuugcugaau guuuccaau 19
<210> 211
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 211
auuggaaaca uucagcaag 19
<210> 212
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 212
gcugaauguu uccaauaga 19
<210> 213
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 213
ucuauuggaa acauucagc 19
<210> 214
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 214
ccaauagacu aaauacugu 19
<210> 215
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 215
acaguauuua gucuauugg 19
<210> 216
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 216
gaguuuggaa uccggaaua 19
<210> 217
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 217
uauuccggau uccaaacuc 19
<210> 218
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 218
ggaauccgga auaaauacu 19
<210> 219
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 219
aguauuuauu ccggauucc 19
<210> 220
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 220
gaauccggaa uaaauacua 19
<210> 221
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 221
uaguauuuau uccggauuc 19
<210> 222
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 222
ggaauaaaua cuaccugga 19
<210> 223
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 223
uccagguagu auuuauucc 19
<210> 224
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 224
ggccuggccu gaauauuau 19
<210> 225
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 225
auaauauuca ggccaggcc 19
<210> 226
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 226
gccugaauau uauacuacu 19
<210> 227
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 227
aguaguauaa uauucaggc 19
<210> 228
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 228
cuggccugaa uauuauacu 19
<210> 229
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 229
aguauaauau ucaggccag 19
<210> 230
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 230
cauauuucau ccaagugca 19
<210> 231
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 231
ugcacuugga ugaaauaug 19
<210> 232
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 232
gugcaauaau guaagcuga 19
<210> 233
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 233
ucagcuuaca uuauugcac 19
<210> 234
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 234
gcaauaaugu aagcugaau 19
<210> 235
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 235
auucagcuua cauuauugc 19
<210> 236
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 236
cacuaucuua ucuucuccu 19
<210> 237
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 237
aggagaagau aagauagug 19
<210> 238
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 238
cuucuccuga acuguugau 19
<210> 239
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 239
aucaacaguu caggagaag 19
<210> 240
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 240
aaccuaucau cauaggucg 19
<210> 241
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 241
cgaccuauga ugauagguu 19
<210> 242
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 242
accuaucauc auaggucgu 19
<210> 243
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 243
acgaccuaug augauaggu 19
<210> 244
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 244
ccuaucauca uaggucguc 19
<210> 245
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 245
gacgaccuau gaugauagg 19
<210> 246
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 246
cuaucaucau aggucguca 19
<210> 247
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 247
ugacgaccua ugaugauag 19
<210> 248
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 248
uaucaucaua ggucgucau 19
<210> 249
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 249
augacgaccu augaugaua 19
<210> 250
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 250
aucaucauag gucgucaug 19
<210> 251
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 251
caugacgacc uaugaugau 19
<210> 252
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 252
ucaucauagg ucgucaugc 19
<210> 253
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 253
gcaugacgac cuaugauga 19
<210> 254
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 254
caucauaggu cgucaugcu 19
<210> 255
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 255
agcaugacga ccuaugaug 19
<210> 256
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 256
aucauagguc gucaugcuu 19
<210> 257
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 257
aagcaugacg accuaugau 19
<210> 258
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 258
ucauaggucg ucaugcuua 19
<210> 259
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 259
uaagcaugac gaccuauga 19
<210> 260
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 260
cauaggucgu caugcuuau 19
<210> 261
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 261
auaagcauga cgaccuaug 19
<210> 262
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 262
auaggucguc augcuuaug 19
<210> 263
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 263
cauaagcaug acgaccuau 19
<210> 264
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 264
uaggucguca ugcuuaugg 19
<210> 265
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 265
ccauaagcau gacgaccua 19
<210> 266
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 266
aggucgucau gcuuauggg 19
<210> 267
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 267
cccauaagca ugacgaccu 19
<210> 268
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 268
ggucgucaug cuuaugggg 19
<210> 269
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 269
ccccauaagc augacgacc 19
<210> 270
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 270
gucgucaugc uuaugggga 19
<210> 271
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 271
ucccauaagc augacgacc 19
<210> 272
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 272
ucgucaugcu uauggggau 19
<210> 273
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 273
aucccauaag caugacgac 19
<210> 274
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 274
aaccuaucau cauagguca 19
<210> 275
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 275
ugaccuauga ugauagguu 19
<210> 276
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 276
accuaucauc auaggucau 19
<210> 277
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 277
augaccuaug augauaggu 19
<210> 278
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 278
ccuaucauca uaggucauc 19
<210> 279
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 279
gaugaccuau gaugauagg 19
<210> 280
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 280
cuaucaucau aggucauca 19
<210> 281
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 281
ugaugaccua ugaugauag 19
<210> 282
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 282
uaucaucaua ggucaucau 19
<210> 283
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 283
augaugaccu augaugaua 19
<210> 284
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 284
aucaucauag gucaucaug 19
<210> 285
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 285
caugaugacc uaugaugau 19
<210> 286
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 286
ucaucauagg ucaucaugc 19
<210> 287
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 287
gcaugaugac cuaugauga 19
<210> 288
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 288
caucauaggu caucaugcu 19
<210> 289
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 289
agcaugauga ccuaugaug 19
<210> 290
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 290
aucauagguc aucaugcuu 19
<210> 291
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 291
aagcaugaug accuaugau 19
<210> 292
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 292
ucauagguca ucaugcuua 19
<210> 293
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 293
uaagcaugau gaccuauga 19
<210> 294
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 294
cauaggucau caugcuuau 19
<210> 295
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 295
auaagcauga ugaccuaug 19
<210> 296
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 296
auaggucauc augcuuaug 19
<210> 297
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 297
cauaagcaug augaccuau 19
<210> 298
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 298
uaggucauca ugcuuaugg 19
<210> 299
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 299
ccauaagcau gaugaccua 19
<210> 300
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 300
aggucaucau gcuuauggg 19
<210> 301
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 301
cccauaagca ugaugaccu 19
<210> 302
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 302
ggucaucaug cuuaugggg 19
<210> 303
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 303
ccccauaagc augaugacc 19
<210> 304
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 304
gucaucaugc uuaugggga 19
<210> 305
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 305
uccccauaag caugaugac 19
<210> 306
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 306
ucaucaugcu uauggggau 19
<210> 307
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 307
auccccauaa gcaugauga 19
<210> 308
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 308
aaccuaucau cauagguag 19
<210> 309
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 309
cuaccuauga ugauagguu 19
<210> 310
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 310
accuaucauc auagguagu 19
<210> 311
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 311
acuaccuaug augauaggu 19
<210> 312
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 312
ccuaucauca uagguaguc 19
<210> 313
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 313
gacuaccuau gaugauagg 19
<210> 314
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 314
cuaucaucau agguaguca 19
<210> 315
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 315
ugacuaccua ugaugauag 19
<210> 316
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 316
uaucaucaua gguagucau 19
<210> 317
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 317
augacuaccu augaugaua 19
<210> 318
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 318
aucaucauag guagucaug 19
<210> 319
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 319
caugacuacc uaugaugau 19
<210> 320
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 320
ucaucauagg uagucaugc 19
<210> 321
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 321
gcaugacuac cuaugauga 19
<210> 322
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 322
caucauaggu agucaugcu 19
<210> 323
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 323
agcaugacua ccuaugaug 19
<210> 324
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 324
aucauaggua gucaugcuu 19
<210> 325
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 325
aagcaugacu accuaugau 19
<210> 326
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 326
ucauagguag ucaugcuua 19
<210> 327
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 327
uaagcaugac uaccuauga 19
<210> 328
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 328
cauagguagu caugcuuau 19
<210> 329
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 329
auaagcauga cuaccuaug 19
<210> 330
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 330
auagguaguc augcuuaug 19
<210> 331
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 331
cauaagcaug acuaccuau 19
<210> 332
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 332
uagguaguca ugcuuaugg 19
<210> 333
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 333
ccauaagcau gacuaccua 19
<210> 334
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 334
agguagucau gcuuauggg 19
<210> 335
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 335
cccauaagca ugacuaccu 19
<210> 336
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 336
gguagucaug cuuaugggg 19
<210> 337
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 337
ccccauaagc augacuacc 19
<210> 338
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 338
guagucaugc uuaugggga 19
<210> 339
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 339
uccccauaag caugacuac 19
<210> 340
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 340
uagucaugcu uauggggau 19
<210> 341
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 341
auccccauaa gcaugacua 19
<210> 342
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 342
aaccuaucau cauagguug 19
<210> 343
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 343
caaccuauga ugauagguu 19
<210> 344
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 344
accuaucauc auagguugu 19
<210> 345
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 345
acaaccuaug augauaggu 19
<210> 346
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 346
ccuaucauca uagguuguc 19
<210> 347
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 347
gacaaccuau gaugauagg 19
<210> 348
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 348
cuaucaucau agguuguca 19
<210> 349
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 349
ugacaaccua ugaugauag 19
<210> 350
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 350
uaucaucaua gguugucau 19
<210> 351
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 351
augacaaccu augaugaua 19
<210> 352
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 352
aucaucauag guugucaug 19
<210> 353
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 353
caugacaacc uaugaugau 19
<210> 354
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 354
ucaucauagg uugucaugc 19
<210> 355
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 355
gcaugacaac cuaugauga 19
<210> 356
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 356
caucauaggu ugucaugcu 19
<210> 357
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 357
agcaugacaa ccuaugaug 19
<210> 358
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 358
aucauagguu gucaugcuu 19
<210> 359
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 359
aagcaugaca accuaugau 19
<210> 360
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 360
ucauagguug ucaugcuua 19
<210> 361
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 361
uaagcaugac aaccuauga 19
<210> 362
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 362
cauagguugu caugcuuau 19
<210> 363
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 363
auaagcauga caaccuaug 19
<210> 364
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 364
auagguuguc augcuuaug 19
<210> 365
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 365
cauaagcaug acaaccuau 19
<210> 366
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 366
uagguuguca ugcuuaugg 19
<210> 367
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 367
ccauaagcau gacaaccua 19
<210> 368
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 368
agguugucau gcuuauggg 19
<210> 369
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 369
cccauaagca ugacaaccu 19
<210> 370
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 370
gguugucaug cuuaugggg 19
<210> 371
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 371
ccccauaagc augacaacc 19
<210> 372
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 372
guugucaugc uuaugggga 19
<210> 373
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 373
uccccauaag caugacaac 19
<210> 374
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 374
uugucaugcu uauggggau 19
<210> 375
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 375
auccccauaa gcaugacaa 19
<210> 376
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 376
aaccuaucau cauaggugg 19
<210> 377
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 377
ccaccuauga ugauagguu 19
<210> 378
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 378
accuaucauc auagguggu 19
<210> 379
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 379
accaccuaug augauaggu 19
<210> 380
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 380
ccuaucauca uaggugguc 19
<210> 381
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 381
gaccaccuau gaugauagg 19
<210> 382
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 382
cuaucaucau aggugguca 19
<210> 383
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 383
ugaccaccua ugaugauag 19
<210> 384
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 384
uaucaucaua gguggucau 19
<210> 385
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 385
augaccaccu augaugaua 19
<210> 386
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 386
aucaucauag guggucaug 19
<210> 387
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 387
caugaccacc uaugaugau 19
<210> 388
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 388
ucaucauagg uggucaugc 19
<210> 389
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 389
gcaugaccac cuaugauga 19
<210> 390
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 390
caucauaggu ggucaugcu 19
<210> 391
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 391
agcaugacca ccuaugaug 19
<210> 392
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 392
aucauaggug gucaugcuu 19
<210> 393
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 393
aagcaugacc accuaugau 19
<210> 394
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 394
ucauaggugg ucaugcuua 19
<210> 395
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 395
uaagcaugac caccuauga 19
<210> 396
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 396
cauagguggu caugcuuau 19
<210> 397
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 397
auaagcauga ccaccuaug 19
<210> 398
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 398
auaggugguc augcuuaug 19
<210> 399
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 399
cauaagcaug accaccuau 19
<210> 400
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 400
uaggugguca ugcuuaugg 19
<210> 401
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 401
ccauaagcau gaccaccua 19
<210> 402
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 402
agguugucau gcuuauggg 19
<210> 403
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 403
cccauaagca ugaccaccu 19
<210> 404
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 404
gguugucaug cuuaugggg 19
<210> 405
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 405
ccccauaagc augaccacc 19
<210> 406
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 406
guugucaugc uuaugggga 19
<210> 407
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 407
uccccauaag caugaccac 19
<210> 408
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 408
uugucaugcu uauggggau 19
<210> 409
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 409
auccccauaa gcaugacca 19
<210> 410
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 410
aaccuaucau cauaggucg 19
<210> 411
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 411
cgaccuauga ugauagguu 19
<210> 412
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 412
accuaucauc auaggucgu 19
<210> 413
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 413
acgaccuaug augauaggu 19
<210> 414
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 414
ccuaucauca uaggucguc 19
<210> 415
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 415
gacgaccuau gaugauagg 19
<210> 416
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 416
cuaucaucau aggucguca 19
<210> 417
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 417
ugacgaccua ugaugauag 19
<210> 418
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 418
uaucaucaua ggucgucau 19
<210> 419
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 419
augacgaccu augaugaua 19
<210> 420
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 420
aucaucauag gucgucaug 19
<210> 421
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 421
caugacgacc uaugaugau 19
<210> 422
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 422
ucaucauagg ucgucaugc 19
<210> 423
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 423
gcaugacgac cuaugauga 19
<210> 424
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 424
caucauaggu cgucaugcu 19
<210> 425
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 425
agcaugacga ccuaugaug 19
<210> 426
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 426
aucauagguc gucaugcuu 19
<210> 427
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 427
aagcaugacg accuaugau 19
<210> 428
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 428
ucauaggucg ucaugcuua 19
<210> 429
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 429
uaagcaugac gaccuauga 19
<210> 430
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 430
cauaggucgu caugcuuau 19
<210> 431
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 431
auaagcauga cgaccuaug 19
<210> 432
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 432
auaggucguc augcuuaug 19
<210> 433
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 433
cauaagcaug acgaccuau 19
<210> 434
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 434
uaggucguca ugcuuaugg 19
<210> 435
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 435
ccauaagcau gacgaccua 19
<210> 436
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 436
aggucgucau gcuuauggg 19
<210> 437
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 437
cccauaagca ugacgaccu 19
<210> 438
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 438
ggucgucaug cuuaugggg 19
<210> 439
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 439
ccccauaagc augacgacc 19
<210> 440
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 440
gucgucaugc uuaugggga 19
<210> 441
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 441
uccccauaag caugacgac 19
<210> 442
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 442
ucgucaugcu uauggggau 19
<210> 443
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 443
auccccauaa gcaugacga 19
<210> 444
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 444
aaccuaucau cauaggucu 19
<210> 445
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 445
agaccuauga ugauagguu 19
<210> 446
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 446
accuaucauc auaggucuu 19
<210> 447
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 447
aagaccuaug augauaggu 19
<210> 448
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 448
ccuaucauca uaggucuuc 19
<210> 449
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 449
gaagaccuau gaugauagg 19
<210> 450
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 450
cuaucaucau aggucuuca 19
<210> 451
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 451
ugaagaccua ugaugauag 19
<210> 452
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 452
uaucaucaua ggucuucau 19
<210> 453
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 453
augaagaccu augaugaua 19
<210> 454
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 454
aucaucauag gucuucaug 19
<210> 455
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 455
caugaagacc uaugaugau 19
<210> 456
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 456
ucaucauagg ucuucaugc 19
<210> 457
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 457
gcaugaagac cuaugauga 19
<210> 458
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 458
caucauaggu cuucaugcu 19
<210> 459
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 459
agcaugaaga ccuaugaug 19
<210> 460
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 460
aucauagguc uucaugcuu 19
<210> 461
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 461
aagcaugaag accuaugau 19
<210> 462
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 462
ucauaggucu ucaugcuua 19
<210> 463
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 463
uaagcaugaa gaccuauga 19
<210> 464
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 464
cauaggucuu caugcuuau 19
<210> 465
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 465
auaagcauga agaccuaug 19
<210> 466
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 466
auaggucuuc augcuuaug 19
<210> 467
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 467
cauaagcaug aagaccuau 19
<210> 468
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 468
uaggucuuca ugcuuaugg 19
<210> 469
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 469
ccauaagcau gaagaccua 19
<210> 470
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 470
aggucuucau gcuuauggg 19
<210> 471
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 471
cccauaagca ugaagaccu 19
<210> 472
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 472
ggucuucaug cuuaugggg 19
<210> 473
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 473
ccccauaagc augaagacc 19
<210> 474
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 474
gucuucaugc uuaugggga 19
<210> 475
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 475
uccccauaag caugaagac 19
<210> 476
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 476
ucuucaugcu uauggggau 19
<210> 477
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 477
auccccauaa gcaugaaga 19
<210> 478
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 478
gugaugagau gacccguau 19
<210> 479
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 479
auacggguca ucucaucac 19
<210> 480
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 480
gaugagauga cccguauua 19
<210> 481
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 481
uaauacgggu caucucauc 19
<210> 482
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 482
cguauuaucu ggcaguuca 19
<210> 483
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 483
ugaacugcca gauaauacg 19
<210> 484
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 484
ggcaguucau caaggagaa 19
<210> 485
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 485
uucuccuuga ugaacugcc 19
<210> 486
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 486
guguggaaga guucaagcu 19
<210> 487
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 487
agcuugaacu cuuccacac 19
<210> 488
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 488
guggaagagu ucaagcuga 19
<210> 489
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 489
ucagcuugaa cucuuccac 19
<210> 490
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 490
gaagaguuca agcugaaga 19
<210> 491
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 491
ucuucagcuu gaacucuuc 19
<210> 492
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 492
caguaugcca uccagaaga 19
<210> 493
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 493
ucuucuggau ggcauacug 19
<210> 494
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 494
cuguacauga gcaccaaga 19
<210> 495
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 495
ucuuggugcu cauguacag 19
<210> 496
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 496
gcaccaagaa caccauacu 19
<210> 497
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 497
aguauggugu ucuuggugc 19
<210> 498
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 498
ccauacugaa agccuacga 19
<210> 499
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 499
ucguaggcuu ucaguaugg 19
<210> 500
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 500
cauacugaaa gccuacgau 19
<210> 501
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 501
aucguaggcu uucaguaug 19
<210> 502
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 502
guuucaagga caucuucca 19
<210> 503
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 503
uggaagaugu ccuugaaac 19
<210> 504
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 504
ccgacuucga caagaauaa 19
<210> 505
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 505
uuauucuugu cgaagucgg 19
<210> 506
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 506
gacuucgaca agaauaaga 19
<210> 507
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 507
ucuuauucuu gucgaaguc 19
<210> 508
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 508
gacaagaaua agaucuggu 19
<210> 509
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 509
accagaucuu auucuuguc 19
<210> 510
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 510
ggcucauuga ugacauggu 19
<210> 511
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 511
accaugucau caaugagcc 19
<210> 512
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 512
gcaagaacua ugacggaga 19
<210> 513
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 513
ucuccgucau aguucuugc 19
<210> 514
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 514
caagaacuau gacggagau 19
<210> 515
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 515
aucuccguca uaguucuug 19
<210> 516
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 516
gagaugugca gucagacau 19
<210> 517
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 517
augucugacu gcacaucuc 19
<210> 518
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 518
cugaugggaa gacgauuga 19
<210> 519
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 519
ucaaucgucu ucccaucag 19
<210> 520
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 520
gcaaugugaa gcugaacga 19
<210> 521
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 521
ucguucagcu ucacauugc 19
<210> 522
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 522
cuguaauuua uauugcccu 19
<210> 523
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 523
agggcaauau aaauuacag 19
<210> 524
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 524
cauggugcca uauuuagcu 19
<210> 525
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 525
agcuaaauau ggcaccaug 19
<210> 526
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 526
ggugccauau uuagcuacu 19
<210> 527
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 527
aguagcuaaa uauggcacc 19
<210> 528
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 528
gugccauauu uagcuacua 19
<210> 529
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 529
uaguagcuaa auauggcac 19
<210> 530
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 530
gccauauuua gcuacuaaa 19
<210> 531
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 531
uuuaguagcu aaauauggc 19
<210> 532
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 532
gcccaucacc auuggcagg 19
<210> 533
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 533
ccugccaaug gugaugggc 19
<210> 534
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 534
cccaucacca uuggcaggc 19
<210> 535
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 535
gccugccaau ggugauggg 19
<210> 536
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 536
ccaucaccau uggcaggca 19
<210> 537
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 537
ugccugccaa uggugaugg 19
<210> 538
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 538
caucaccauu ggcaggcac 19
<210> 539
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 539
gugccugcca auggugaug 19
<210> 540
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 540
aucaccauug gcaggcacg 19
<210> 541
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 541
cgugccugcc aauggugau 19
<210> 542
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 542
ucaccauugg caggcacgc 19
<210> 543
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 543
gcgugccugc caaugguga 19
<210> 544
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 544
caccauuggc aggcacgcc 19
<210> 545
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 545
ggcgugccug ccaauggug 19
<210> 546
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 546
accauuggca ggcacgccc 19
<210> 547
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 547
gggcgugccu gccaauggu 19
<210> 548
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 548
ccauuggcag gcacgccca 19
<210> 549
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 549
ugggcgugcc ugccaaugg 19
<210> 550
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 550
cauuggcagg cacgcccau 19
<210> 551
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 551
augggcgugc cugccaaug 19
<210> 552
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 552
auuggcaggc acgcccaug 19
<210> 553
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 553
caugggcgug ccugccaau 19
<210> 554
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 554
uuggcaggca cgcccaugg 19
<210> 555
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 555
ccaugggcgu gccugccaa 19
<210> 556
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 556
uggcaggcac gcccauggc 19
<210> 557
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 557
gccaugggcg ugccugcca 19
<210> 558
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 558
ggcaggcacg cccauggcg 19
<210> 559
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 559
cgccaugggc gugccugcc 19
<210> 560
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 560
gcaggcacgc ccauggcga 19
<210> 561
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 561
ucgccauggg cgugccugc 19
<210> 562
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 562
caggcacgcc cauggcgac 19
<210> 563
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 563
gucgccaugg gcgugccug 19
<210> 564
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 564
aggcacgccc auggcgacc 19
<210> 565
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 565
ggucgccaug ggcgugccu 19
<210> 566
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 566
gcccaucacc auuggcggg 19
<210> 567
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 567
cccgccaaug gugaugggc 19
<210> 568
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 568
cccaucacca uuggcgggc 19
<210> 569
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 569
gcccgccaau ggugauggg 19
<210> 570
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 570
ccaucaccau uggcgggca 19
<210> 571
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 571
ugcccgccaa uggugaugg 19
<210> 572
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 572
caucaccauu ggcgggcac 19
<210> 573
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 573
gugcccgcca auggugaug 19
<210> 574
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 574
aucaccauug gcgggcacg 19
<210> 575
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 575
cgugcccgcc aauggugau 19
<210> 576
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 576
ucaccauugg cgggcacgc 19
<210> 577
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 577
gcgugcccgc caaugguga 19
<210> 578
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 578
caccauuggc gggcacgcc 19
<210> 579
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 579
ggcgugcccg ccaauggug 19
<210> 580
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 580
accauuggcg ggcacgccc 19
<210> 581
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 581
gggcgugccc gccaauggu 19
<210> 582
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 582
ccauuggcgg gcacgccca 19
<210> 583
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 583
ugggcgugcc cgccaaugg 19
<210> 584
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 584
cauuggcggg cacgcccau 19
<210> 585
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 585
augggcgugc ccgccaaug 19
<210> 586
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 586
auuggcgggc acgcccaug 19
<210> 587
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 587
caugggcgug cccgccaau 19
<210> 588
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 588
uuggcgggca cgcccaugg 19
<210> 589
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 589
ccaugggcgu gcccgccaa 19
<210> 590
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 590
uggcgggcac gcccauggc 19
<210> 591
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 591
gccaugggcg ugcccgcca 19
<210> 592
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 592
ggcgggcacg cccauggcg 19
<210> 593
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 593
cgccaugggc gugcccgcc 19
<210> 594
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 594
gcgggcacgc ccauggcga 19
<210> 595
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 595
ucgccauggg cgugcccgc 19
<210> 596
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 596
cgggcacgcc cauggcgac 19
<210> 597
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 597
gucgccaugg gcgugcccg 19
<210> 598
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 598
gggcacgccc auggcgacc 19
<210> 599
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 599
ggucgccaug ggcgugccc 19
<210> 600
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 600
gcccaucacc auuggcugg 19
<210> 601
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 601
ccagccaaug gugaugggc 19
<210> 602
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 602
cccaucacca uuggcuggc 19
<210> 603
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 603
gccagccaau ggugauggg 19
<210> 604
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 604
ccaucaccau uggcuggca 19
<210> 605
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 605
ugccagccaa uggugaugg 19
<210> 606
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 606
caucaccauu ggcuggcac 19
<210> 607
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 607
gugccagcca auggugaug 19
<210> 608
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 608
aucaccauug gcuggcacg 19
<210> 609
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 609
cgugccagcc aauggugau 19
<210> 610
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 610
ucaccauugg cuggcacgc 19
<210> 611
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 611
gcgugccagc caaugguga 19
<210> 612
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 612
caccauuggc uggcacgcc 19
<210> 613
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 613
ggcgugccag ccaauggug 19
<210> 614
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 614
accauuggcu ggcacgccc 19
<210> 615
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 615
gggcgugcca gccaauggu 19
<210> 616
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 616
ccauuggcug gcacgccca 19
<210> 617
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 617
ugggcgugcc agccaaugg 19
<210> 618
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 618
cauuggcugg cacgcccau 19
<210> 619
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 619
augggcgugc cagccaaug 19
<210> 620
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 620
auuggcuggc acgcccaug 19
<210> 621
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 621
caugggcgug ccagccaau 19
<210> 622
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 622
uuggcuggca cgcccaugg 19
<210> 623
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 623
ccaugggcgu gccagccaa 19
<210> 624
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 624
uggcuggcac gcccauggc 19
<210> 625
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 625
gccaugggcg ugccagcca 19
<210> 626
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 626
ggcuggcacg cccauggcg 19
<210> 627
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 627
cgccaugggc gugccagcc 19
<210> 628
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 628
gcuggcacgc ccauggcga 19
<210> 629
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 629
ucgccauggg cgugccagc 19
<210> 630
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 630
cuggcacgcc cauggcgac 19
<210> 631
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 631
gucgccaugg gcgugccag 19
<210> 632
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 632
uggcacgccc auggcgacc 19
<210> 633
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 633
ggucgccaug ggcgugcca 19
<210> 634
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 634
gcccaucacc auuggcaag 19
<210> 635
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 635
cuugccaaug gugaugggc 19
<210> 636
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 636
cccaucacca uuggcaagc 19
<210> 637
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 637
gcuugccaau ggugauggg 19
<210> 638
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 638
ccaucaccau uggcaagca 19
<210> 639
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 639
ugcuugccaa uggugaugg 19
<210> 640
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 640
caucaccauu ggcaagcac 19
<210> 641
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 641
gugcuugcca auggugaug 19
<210> 642
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 642
aucaccauug gcaagcacg 19
<210> 643
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 643
cgugcuugcc aauggugau 19
<210> 644
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 644
ucaccauugg caagcacgc 19
<210> 645
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 645
gcgugcuugc caaugguga 19
<210> 646
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 646
caccauuggc aagcacgcc 19
<210> 647
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 647
ggcgugcuug ccaauggug 19
<210> 648
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 648
accauuggca agcacgccc 19
<210> 649
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 649
gggcgugcuu gccaauggu 19
<210> 650
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 650
ccauuggcaa gcacgccca 19
<210> 651
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 651
ugggcgugcu ugccaaugg 19
<210> 652
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 652
cauuggcaag cacgcccau 19
<210> 653
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 653
augggcgugc uugccaaug 19
<210> 654
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 654
auuggcaagc acgcccaug 19
<210> 655
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 655
caugggcgug cuugccaau 19
<210> 656
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 656
uuggcaagca cgcccaugg 19
<210> 657
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 657
ccaugggcgu gcuugccaa 19
<210> 658
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 658
uggcaagcac gcccauggc 19
<210> 659
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 659
gccaugggcg ugcuugcca 19
<210> 660
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 660
ggcaagcacg cccauggcg 19
<210> 661
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 661
cgccaugggc gugcuugcc 19
<210> 662
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 662
gcaagcacgc ccauggcga 19
<210> 663
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 663
ucgccauggg cgugcuugc 19
<210> 664
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 664
caagcacgcc cauggcgac 19
<210> 665
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 665
gucgccaugg gcgugcuug 19
<210> 666
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 666
aagcacgccc auggcgacc 19
<210> 667
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 667
ggucgccaug ggcgugcuu 19
<210> 668
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 668
gcccaucacc auuggcacg 19
<210> 669
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 669
cgugccaaug gugaugggc 19
<210> 670
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 670
cccaucacca uuggcacgc 19
<210> 671
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 671
gcgugccaau ggugauggg 19
<210> 672
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 672
ccaucaccau uggcacgca 19
<210> 673
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 673
ugcgugccaa uggugaugg 19
<210> 674
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 674
caucaccauu ggcacgcac 19
<210> 675
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 675
gugcgugcca auggugaug 19
<210> 676
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 676
aucaccauug gcacgcacg 19
<210> 677
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 677
cgugcgugcc aauggugau 19
<210> 678
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 678
ucaccauugg cacgcacgc 19
<210> 679
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 679
gcgugcgugc caaugguga 19
<210> 680
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 680
caccauuggc acgcacgcc 19
<210> 681
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 681
ggcgugcgug ccaauggug 19
<210> 682
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 682
accauuggca cgcacgccc 19
<210> 683
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 683
gggcgugcgu gccaauggu 19
<210> 684
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 684
ccauuggcac gcacgccca 19
<210> 685
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 685
ugggcgugcg ugccaaugg 19
<210> 686
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 686
cauuggcacg cacgcccau 19
<210> 687
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 687
augggcgugc gugccaaug 19
<210> 688
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 688
auuggcacgc acgcccaug 19
<210> 689
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 689
caugggcgug cgugccaau 19
<210> 690
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 690
uuggcacgca cgcccaugg 19
<210> 691
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 691
ccaugggcgu gcgugccaa 19
<210> 692
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 692
uggcacgcac gcccauggc 19
<210> 693
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 693
gccaugggcg ugcgugcca 19
<210> 694
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 694
ggcacgcacg cccauggcg 19
<210> 695
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 695
cgccaugggc gugcgugcc 19
<210> 696
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 696
gcacgcacgc ccauggcga 19
<210> 697
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 697
ucgccauggg cgugcgugc 19
<210> 698
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 698
cacgcacgcc cauggcgac 19
<210> 699
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 699
gucgccaugg gcgugcgug 19
<210> 700
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 700
acgcacgccc auggcgacc 19
<210> 701
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 701
ggucgccaug ggcgugcgu 19
<210> 702
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 702
gcccaucacc auuggcaug 19
<210> 703
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 703
caugccaaug gugaugggc 19
<210> 704
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 704
cccaucacca uuggcaugc 19
<210> 705
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 705
gcaugccaau ggugauggg 19
<210> 706
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 706
ccaucaccau uggcaugca 19
<210> 707
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 707
ugcaugccaa uggugaugg 19
<210> 708
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 708
caucaccauu ggcaugcac 19
<210> 709
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 709
gugcaugcca auggugaug 19
<210> 710
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 710
aucaccauug gcaugcacg 19
<210> 711
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 711
cgugcaugcc aauggugau 19
<210> 712
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 712
ucaccauugg caugcacgc 19
<210> 713
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 713
gcgugcaugc caaugguga 19
<210> 714
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 714
caccauuggc augcacgcc 19
<210> 715
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 715
ggcgugcaug ccaauggug 19
<210> 716
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 716
accauuggca ugcacgccc 19
<210> 717
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 717
gggcgugcau gccaauggu 19
<210> 718
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 718
ccauuggcau gcacgccca 19
<210> 719
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 719
ugggcgugca ugccaaugg 19
<210> 720
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 720
cauuggcaug cacgcccau 19
<210> 721
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 721
augggcgugc augccaaug 19
<210> 722
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 722
auuggcaugc acgcccaug 19
<210> 723
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 723
caugggcgug caugccaau 19
<210> 724
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 724
uuggcaugca cgcccaugg 19
<210> 725
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 725
ccaugggcgu gcaugccaa 19
<210> 726
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 726
uggcaugcac gcccauggc 19
<210> 727
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 727
gccaugggcg ugcaugcca 19
<210> 728
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 728
ggcaugcacg cccauggcg 19
<210> 729
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 729
cgccaugggc gugcaugcc 19
<210> 730
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 730
gcaugcacgc ccauggcga 19
<210> 731
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 731
ucgccauggg cgugcaugc 19
<210> 732
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 732
caugcacgcc cauggcgac 19
<210> 733
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 733
gucgccaugg gcgugcaug 19
<210> 734
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 734
augcacgccc auggcgacc 19
<210> 735
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 735
ggucgccaug ggcgugcau 19
<210> 736
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 736
gcccaucacc auuggcagc 19
<210> 737
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 737
gcugccaaug gugaugggc 19
<210> 738
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 738
cccaucacca uuggcagcc 19
<210> 739
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 739
ggcugccaau ggugauggg 19
<210> 740
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 740
ccaucaccau uggcagcca 19
<210> 741
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 741
uggcugccaa uggugaugg 19
<210> 742
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 742
caucaccauu ggcagccac 19
<210> 743
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 743
guggcugcca auggugaug 19
<210> 744
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 744
aucaccauug gcagccacg 19
<210> 745
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 745
cguggcugcc aauggugau 19
<210> 746
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 746
ucaccauugg cagccacgc 19
<210> 747
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 747
gcguggcugc caaugguga 19
<210> 748
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 748
caccauuggc agccacgcc 19
<210> 749
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 749
ggcguggcug ccaauggug 19
<210> 750
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 750
accauuggca gccacgccc 19
<210> 751
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 751
gggcguggcu gccaauggu 19
<210> 752
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 752
ccauuggcag ccacgccca 19
<210> 753
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 753
ugggcguggc ugccaaugg 19
<210> 754
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 754
cauuggcagc cacgcccau 19
<210> 755
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 755
augggcgugg cugccaaug 19
<210> 756
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 756
auuggcagcc acgcccaug 19
<210> 757
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 757
caugggcgug gcugccaau 19
<210> 758
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 758
uuggcagcca cgcccaugg 19
<210> 759
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 759
ccaugggcgu ggcugccaa 19
<210> 760
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 760
uggcagccac gcccauggc 19
<210> 761
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 761
gccaugggcg uggcugcca 19
<210> 762
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 762
ggcagccacg cccauggcg 19
<210> 763
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 763
cgccaugggc guggcugcc 19
<210> 764
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 764
gcagccacgc ccauggcga 19
<210> 765
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 765
ucgccauggg cguggcugc 19
<210> 766
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 766
cagccacgcc cauggcgac 19
<210> 767
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 767
gucgccaugg gcguggcug 19
<210> 768
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 768
agccacgccc auggcgacc 19
<210> 769
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 769
ggucgccaug ggcguggcu 19
<210> 770
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 770
gcccaucacc auuggcagu 19
<210> 771
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 771
acugccaaug gugaugggc 19
<210> 772
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 772
cccaucacca uuggcaguc 19
<210> 773
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 773
gacugccaau ggugauggg 19
<210> 774
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 774
ccaucaccau uggcaguca 19
<210> 775
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 775
ugacugccaa uggugaugg 19
<210> 776
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 776
caucaccauu ggcagucac 19
<210> 777
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 777
gugacugcca auggugaug 19
<210> 778
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 778
aucaccauug gcagucacg 19
<210> 779
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 779
cgugacugcc aauggugau 19
<210> 780
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 780
ucaccauugg cagucacgc 19
<210> 781
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 781
gcgugacugc caaugguga 19
<210> 782
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 782
caccauuggc agucacgcc 19
<210> 783
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 783
ggcgugacug ccaauggug 19
<210> 784
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 784
accauuggca gucacgccc 19
<210> 785
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 785
gggcgugacu gccaauggu 19
<210> 786
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 786
ccauuggcag ucacgccca 19
<210> 787
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 787
ugggcgugac ugccaaugg 19
<210> 788
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 788
cauuggcagu cacgcccau 19
<210> 789
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 789
augggcguga cugccaaug 19
<210> 790
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 790
auuggcaguc acgcccaug 19
<210> 791
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 791
caugggcgug acugccaau 19
<210> 792
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 792
uuggcaguca cgcccaugg 19
<210> 793
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 793
ccaugggcgu gacugccaa 19
<210> 794
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 794
uggcagucac gcccauggc 19
<210> 795
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 795
gccaugggcg ugacugcca 19
<210> 796
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 796
ggcagucacg cccauggcg 19
<210> 797
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 797
cgccaugggc gugacugcc 19
<210> 798
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 798
gcagucacgc ccauggcga 19
<210> 799
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 799
ucgccauggg cgugacugc 19
<210> 800
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 800
cagucacgcc cauggcgac 19
<210> 801
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 801
gucgccaugg gcgugacug 19
<210> 802
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 802
agucacgccc auggcgacc 19
<210> 803
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成寡核苷酸
<400> 803
ggucgccaug ggcgugacu 19
<210> 804
<211> 489
<212> DNA
<213> 智人
<400> 804
gcataatgag ctctatatgc catcactgca gttgtaggtt ataactatcc atttgtctga 60
aaaactttgc ttctaatttt tctctttcaa gctatgattt aggcatagag aatcgtgatg 120
ccaccaacga ccaagtcacc aaggatgctg cagaagctat aaagaagcat aatgttggcg 180
tcaaatgtgc cactatcact cctgatgaga agagggttga ggagttcaag ttgaaacaaa 240
tgtggaaatc accaaatggc accatacgaa atattctggg tggcacggtc ttcagagaag 300
ccattatctg caaaaatatc ccccggcttg tgagtggatg ggtaaaacct atcatcatag 360
gtcgtcatgc ttatggggat caagtaagtc atgttggcaa taatgtgatt ttgcatgbtg 420
gcccagaaat ttccaacttg tatgtgtttt attcttatct tttggtatct acacccatta 480
agcaaggta 489

Claims (40)

1.一种治疗患有细胞增殖相关病症的受试者的方法，所述细胞增殖相关病症的特征在于：i)存在具有2HG新活性的突变IDH或ii)2HG的水平升高，其中所述受试者为没有患有2-羟基戊二酸尿症或没有被诊断为患有2-羟基戊二酸尿症的受试者，所述方法包括对有需要的所述受试者施用治疗有效量的以下一种或多种：
降低受试者体内升高水平的2HG的治疗剂，
具有2HG新活性的所述突变IDH的抑制剂，
改善受试者体内升高水平的2HG的有害作用的治疗剂，或
基于核酸的抑制剂，其靶向编码具有2HG新活性的所述突变IDH的mRNA，
由此治疗所述受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞增殖相关病症为癌症或癌症前期病症。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述癌症为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤、纤维肉瘤、副神经节瘤、前列腺癌、急性淋巴母细胞性白血病或急性骨髓性白血病。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法包括对所述受试者施用具有2HG新活性的所述突变IDH的抑制剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述突变IDH为突变IDH1。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述突变IDH1为IDH1R132X。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述突变IDH1为IDH1R132H、IDH1R132C、IDH1R132S、IDH1R132G、IDH1R132L或IDH1R132V。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述突变IDH1为IDH1R132H或IDH1R132C。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述突变IDH为突变IDH2。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述突变IDH2为IDH2R172X。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述突变IDH2为IDH2R172K、IDH2R172M、IDH2R172S、IDH2R172G或IDH2R172W。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述突变IDH2为IDH2R172K。
14.根据权利要求1或5所述的方法，其中具有2HG新活性的突变IDH的抑制剂为
a.式(X)的化合物：
其中X为C1-C6亚烷基(例如亚甲基)、C(O)或C(O)C1-C6亚烷基；其中X被任选地取代；
R1为卤素(例如氟)、C1-C6烷基、C1-C6卤烷基、羟基、C1-C6烷氧基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、-C(O)OH或C(O)OC1-C6烷基；且
m为0、1、2或3；或
b.选自下表中的化合物中的任一种的化合物：
表24a
15.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括施用改善受试者体内升高的2HG的有害作用的治疗剂。
16.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括施用基于核酸的抑制剂，所述基于核酸的抑制剂选择性地靶向编码具有2HG新活性的所述突变IDH的mRNA。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，所述方法包括对有需要的所述受试者施用第二抗癌剂或疗法。
18.一种评估受试者癌症的存在或对癌症的敏感性的方法，其包括分析所述受试者或得自所述受试者的样本的以下一项或多项：
a)2HG的存在、分布或水平，其中所述受试者没有患有2-羟基戊二酸尿症或没有被诊断为患有2-羟基戊二酸尿症；
b)突变IDH1酶或突变IDH2酶的存在、分布或水平，所述突变IDH1酶和所述突变IDH2酶都具有2HG新活性；
c)编码突变IDH1酶或突变IDH2酶的RNA的存在、分布或水平，所述突变IDH1酶和所述突变IDH2酶都具有2HG新活性；或
d)编码突变IDH1酶或突变IDH2酶的DNA的存在，所述突变IDH1酶和所述突变IDH2酶都具有2HG新活性，
由此评估所述受试者的这种癌症。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述癌症为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤、纤维肉瘤、副神经节瘤、前列腺癌、急性淋巴母细胞性白血病或急性骨髓性白血病。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，所述方法包括分析：两者都具有2HG新活性的突变IDH1酶或突变IDH2酶或编码两者都具有2HG新活性的突变IDH1酶或突变IDH2酶的RNA的存在、分布或水平。
22.根据权利要求21所述的方法，所述方法包括通过DNA测序、免疫分析或酶活性测定评估所述受试者的组织、产物或体液。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述突变IDH1为IDH1R132X。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述突变IDH1为IDH1R132H、IDH1R132C、IDH1R132S、IDH1R132G、IDH1R132L或IDH1R132V。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述突变IDH1为IDH1R132H或IDH1R132C。
26.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述突变IDH2为IDH2R172X。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述突变IDH2为IDH2R172K、IDH2R172M、IDH2R172S、IDH2R172G或IDH2R172W。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述突变IDH2为IDH2R172K。
29.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，所述方法包括分析2HG的存在、分布或水平。
30.根据权利要求29所述的方法，其中通过成像或光谱分析非侵害性地测定2HG的存在、分布或水平。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述成像或光谱分析包括磁共振成像或磁共振光谱法。
32.根据权利要求29所述的方法，其中通过评估所述受试者的组织、产物或体液来测定2HG的存在、分布或水平。
33.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，还包括根据权利要求21-28中任一项所述的方法。
34.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，还包括根据权利要求29-32中任一项所述的方法。
35.一种评估候选化合物的抑制突变IDH的2HG新活性的能力的方法，所述方法包括：
使所述候选化合物与具有2HG新活性的突变IDH接触；和
评估所述候选化合物调节所述2HG新活性的能力，
由此评估所述候选化合物。
36.一种评估候选化合物抑制编码具有2HG新活性的突变IDH的RNA的翻译的能力或抑制具有2HG新活性的突变IDH的能力的方法，所述方法包括：
使所述候选化合物与编码具有2HG新活性的突变IDH的RNA或与包含细胞或细胞裂解物的体系接触；和
评估所述候选化合物抑制所述RNA的翻译或抑制具有2HG新活性的突变IDH的能力，
由此评估所述候选化合物。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述突变IDH为突变IDH1。
38.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述突变IDH为突变IDH2。
39.一种为用于患有细胞增殖相关病症的受试者的用具有2HG新活性的突变IDH的抑制剂的治疗选择支付种类的方法，所述方法包括：
提供所述受试者是否对增加水平的2HG新活性产物或2HG新活性或具有2HG新活性的突变IDH1或突变IDH2为阳性的评估，和
进行以下的至少一者：(1)如果所述受试者为阳性，则选择第一支付种类，和(2)如果所述受试者不为阳性，则选择第二支付种类。
40.一种药物组合物，其包含：
a.式(X)的化合物：
其中X为C1-C6亚烷基、C(O)或C(O)C1-C6亚烷基；其中X被任选地取代；
R1为卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤烷基、羟基、C1-C6烷氧基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、-C(O)OH或C(O)OC1-C6烷基；且
m为0、1、2或3；或
b.选自下表中的化合物中的任一种的化合物：
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2736125C (en) 2008-09-03 2019-04-09 The Johns Hopkins University Genetic alterations in isocitrate dehydrogenase and other genes in malignant glioma
ES2740424T3 (es) 2009-03-13 2020-02-05 Agios Pharmaceuticals Inc Métodos y composiciones para trastornos relacionados con la proliferación celular
WO2010118063A2 (en) 2009-04-06 2010-10-14 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions and related methods of use
EP2427441B1 (en) 2009-05-04 2016-12-14 Agios Pharmaceuticals, Inc. Pkm2 activators for use in the treatment of cancer
SG10201403696UA (en) 2009-06-29 2014-10-30 Agios Pharmaceuticals Inc Therapeutic compounds and compositions
WO2011002816A1 (en) 2009-06-29 2011-01-06 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions and related methods of use
ES2594402T3 (es) 2009-10-21 2016-12-20 Agios Pharmaceuticals, Inc. Métodos y composiciones para trastornos relacionados con la proliferación celular
WO2011050211A2 (en) 2009-10-21 2011-04-28 Agios Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for cell-proliferation-related disorders
ES2642109T3 (es) * 2009-12-09 2017-11-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Compuestos terapéuticamente activos para su uso en el tratamiento de cáncer caracterizados por tener una mutación de IDH
US20130197106A1 (en) * 2010-04-01 2013-08-01 Agios Pharmaceuticals, Inc Methods of identifying a candidate compound
WO2012006506A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Metabolic gene, enzyme, and flux targets for cancer therapy
WO2012083246A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-21 Agios Pharmaceuticals, Inc. Novel n- (4- (azetidine - 1 - carbonyl) phenyl) - (hetero - ) arylsulfonamide derivatives as pyruvate kinase m2 (pmk2) modulators
EP2655350B1 (en) 2010-12-21 2016-03-09 Agios Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic pkm2 activators
TWI549947B (zh) 2010-12-29 2016-09-21 阿吉歐斯製藥公司 治療化合物及組成物
TR201809699T4 (tr) 2011-05-03 2018-07-23 Agios Pharmaceuticals Inc Tedavi̇de kullanilmaya yöneli̇k pi̇ruvat ki̇naz akti̇vatörleri̇.
CN103608016A (zh) 2011-05-03 2014-02-26 安吉奥斯医药品有限公司 丙酮酸激酶激活剂在治疗中的用途
WO2012151448A1 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Agios Pharmaceuticals, Inc. Pyruvate kinase activators for use in therapy
US9322020B2 (en) * 2011-06-06 2016-04-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of isocitrate dehydrogenase (IDH1) gene expression
CN102827170A (zh) 2011-06-17 2012-12-19 安吉奥斯医药品有限公司 治疗活性组合物和它们的使用方法
CN102827073A (zh) 2011-06-17 2012-12-19 安吉奥斯医药品有限公司 治疗活性组合物和它们的使用方法
EP2771337B1 (en) 2011-09-27 2017-08-02 Novartis AG 3-(pyrimidin-4-yl)-oxazolidin-2-ones as inhibitors of mutant idh
CA2856107C (en) 2011-11-18 2022-10-18 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center 2-hydroxyglutarate as a biomarker for chronic hypoxia
ES2642184T3 (es) 2012-01-05 2017-11-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Péptidos para su uso en el tratamiento y diagnóstico de cánceres positivos a IDH1 R132H
SG10201602862RA (en) 2012-01-06 2016-05-30 Agios Pharmaceuticals Inc Therapeutically Active Compounds And Their Methods Of Use
US9474779B2 (en) 2012-01-19 2016-10-25 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compositions and their methods of use
UY34632A (es) 2012-02-24 2013-05-31 Novartis Ag Compuestos de oxazolidin- 2- ona y usos de los mismos
MX365747B (es) 2012-10-15 2019-06-12 Agios Pharmaceuticals Inc Compuestos derivados de diarilurea de sulfonamida de arilo y sus usos.
KR20150080619A (ko) 2012-11-08 2015-07-09 아지오스 파마슈티컬스 아이엔씨. 치료적 화합물 및 조성물
US9296733B2 (en) 2012-11-12 2016-03-29 Novartis Ag Oxazolidin-2-one-pyrimidine derivative and use thereof for the treatment of conditions, diseases and disorders dependent upon PI3 kinases
US20140193920A1 (en) * 2013-01-10 2014-07-10 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Metabolomics of human biological fluids identify signatures of malignant glioma
JP6387360B2 (ja) 2013-03-14 2018-09-05 ノバルティス アーゲー 変異ｉｄｈの阻害薬としての３−ピリミジン−４−イル−オキサゾリジン−２−オン
EP2978862A4 (en) * 2013-03-26 2016-11-02 Genetag Technology Inc DOUBLE-SINGLE ANTISOND COMPOSITIONS FOR DNA AND RNA DETECTION
US20160113911A1 (en) 2013-06-06 2016-04-28 The General Hospital Corporation Methods and compositions for the treatment of cancer
CN105517996B (zh) * 2013-07-11 2019-03-26 安吉奥斯医药品有限公司 治疗活性化合物及其使用方法
WO2015003355A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compounds and their methods of use
MX2016000336A (es) 2013-07-11 2016-08-08 Agios Pharmaceuticals Inc Compuestos de n,6-bis(aril o heteroaril)-1,3,5-triazin-2,4-diamina como inhibidores de idh2 mutantes para el tratamiento de cancer.
WO2015003360A2 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compounds and their methods of use
US9579324B2 (en) 2013-07-11 2017-02-28 Agios Pharmaceuticals, Inc Therapeutically active compounds and their methods of use
WO2015006591A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. 2,4- or 4,6-diaminopyrimidine compounds as idh2 mutants inhibitors for the treatment of cancer
US20150031627A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Agios Pharmaceuticals, Inc Therapeutically active compounds and their methods of use
US20170007661A1 (en) * 2014-03-14 2017-01-12 Agios Pharmaceuticals, Inc Pharmaceutical compositions of therapeutically active compounds
KR102400737B1 (ko) * 2014-03-14 2022-05-20 아지오스 파마슈티컬스 아이엔씨. 치료적으로 활성인 화합물의 약제학적 조성물
CA2943823C (en) 2014-03-28 2023-10-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center L-2-hydroxyglutarate and stress induced metabolism
EP3666896A1 (en) * 2014-10-10 2020-06-17 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic inhibition of lactate dehydrogenase and agents therefor
EP3307271B1 (en) 2015-06-11 2023-09-13 Agios Pharmaceuticals, Inc. Methods of using pyruvate kinase activators
EP3121166A1 (en) * 2015-07-21 2017-01-25 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Fused imidazoles as midh1 inhibitors
AU2016338557B2 (en) 2015-10-15 2022-05-26 Celgene Corporation Combination therapy for treating malignancies
EP3362065B1 (en) 2015-10-15 2024-04-03 Les Laboratoires Servier Combination therapy comprising ivosidenib, cytarabine and daunorubicin or idarubicin for treating acute myelogenous leukemia
JP2018534288A (ja) 2015-10-15 2018-11-22 アジオス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 悪性腫瘍の治療のための併用療法
EP3362070B1 (en) 2015-10-15 2021-01-27 Celgene Corporation Combination of a mutant isocitrate dehydrogenase 2 inhibitor with azacitidine and its use for treating acute myelogenous leukemia
EA039805B1 (ru) * 2015-11-13 2022-03-15 Аджиос Фармасьютикалз, Инк. Комбинированная терапия для лечения злокачественных опухолей
KR20180088460A (ko) 2015-12-04 2018-08-03 아지오스 파마슈티컬스 아이엔씨. 악성종양의 치료 방법
KR20180114202A (ko) 2016-02-26 2018-10-17 아지오스 파마슈티컬스 아이엔씨. 혈액 악성종양 및 고형 종양의 치료를 위한 idh1 억제제
JP6987798B2 (ja) * 2016-06-22 2022-01-05 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 癌の治療に変異体ｉｄｈ１阻害剤として有用なチアゾール誘導体
US20180042930A1 (en) 2016-08-03 2018-02-15 Celgene Corporation Methods of treatment of malignancies
US11179360B2 (en) 2016-11-02 2021-11-23 University Of Cincinnati Compositions and methods for treating patients suffering from glioma or leukemia
LT3448859T (lt) 2017-03-20 2019-10-25 Forma Therapeutics Inc Pirolpirolo kompozicijos, kaip piruvato kinazės (pkr) aktyvatoriai
WO2018204787A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of treatment of myeloproliferative neoplasm
EP3638245A1 (en) * 2017-06-12 2020-04-22 Agios Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating brain tumors using combination therapy
ES2955045T3 (es) 2017-10-13 2023-11-28 Novo Nordisk Healthcare Ag Métodos y composiciones para inhibir la expresión de ldha
WO2019222551A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Forma Therapeutics, Inc. Solid forms of ((s)-5-((1-(6-chloro-2-oxo-1,2-dihydroquinolin-3-yl)ethyl)amino)-1-methyl-6-oxo-1,6-dihydropyridine-2-carbonitrile
US11013733B2 (en) 2018-05-16 2021-05-25 Forma Therapeutics, Inc. Inhibiting mutant isocitrate dehydrogenase 1 (mlDH-1)
US11013734B2 (en) 2018-05-16 2021-05-25 Forma Therapeutics, Inc. Treating patients harboring an isocitrate dehydrogenase-1 (IDH-1) mutation
US11311527B2 (en) 2018-05-16 2022-04-26 Forma Therapeutics, Inc. Inhibiting mutant isocitrate dehydrogenase 1 (mIDH-1)
US11576906B2 (en) 2018-05-16 2023-02-14 Forma Therapeutics, Inc. Inhibiting mutant IDH-1
US10980788B2 (en) 2018-06-08 2021-04-20 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapy for treating malignancies
EA202190217A1 (ru) 2018-07-06 2021-04-16 Аджиос Фармасьютикалз, Инк. Формы ивосидениба и фармацевтические композиции
US11001588B2 (en) 2018-09-19 2021-05-11 Forma Therapeutics, Inc. Activating pyruvate kinase R and mutants thereof
BR112021005188A2 (pt) 2018-09-19 2021-06-08 Forma Therapeutics, Inc. tratamento de anemia falciforme com um composto de ativação de piruvato cinase r
US20220111013A1 (en) * 2019-01-23 2022-04-14 Universität Heidelberg Compound decreasing the concentration of 2-hydroxy-glutarate
WO2022096486A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-12 Ideogen Ag Methods of diagnosing and/or prognosing a disease in tears
EP3992631A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-04 Ideogen AG Methods of diagnosing and/or prognosing a disease in tear sample
WO2023192565A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Servier Pharmaceuticals Llc Methods of treating enhancing brain tumors using combination therapy

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2390529A (en) 1942-02-03 1945-12-11 Ernst A H Friedheim Hydrazino-1,3,5-triazino derivatives of substituted phenylarsenic compounds
BE754242A (fr) 1970-07-15 1971-02-01 Geigy Ag J R Diamino-s-triazines et dinitro-s-triazines
US3867383A (en) 1971-03-29 1975-02-18 Ciba Geigy Corp Monoanthranilatoanilino-s-triazines
CH606334A5 (zh) 1974-06-21 1978-10-31 Ciba Geigy Ag
DE2928485A1 (de) 1979-07-14 1981-01-29 Bayer Ag Verwendung von harnstoffderivaten als arzneimittel bei der behandlung von fettstoffwechselstoerungen
JPS58186682A (ja) 1982-04-27 1983-10-31 日本化薬株式会社 セルロ−ス又はセルロ−ス含有繊維材料の染色法
DE3512630A1 (de) 1985-04-06 1986-10-23 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zum faerben oder bedrucken von cellulosefasern oder cellulosemischfasern
US5041443A (en) 1989-02-21 1991-08-20 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treating cerebral insufficiency diseases, novel 2-(1-piperazinyl)-4-phenylcycloalkanopyrimidine derivatives, and process for the production thereof
ATE107922T1 (de) 1989-03-03 1994-07-15 Dainippon Pharmaceutical Co 2-(1-piperazinyl)-4-phenylcycloalkanpyridin- derivate, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische zusammensetzungen, die sie enthalten.
WO1993017009A1 (en) 1992-02-28 1993-09-02 Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha s-TRIAZINE DERIVATIVE AND REMEDY FOR ESTROGEN-DEPENDENT DISEASES CONTAINING THE SAME AS ACTIVE INGREDIENT
IL115420A0 (en) 1994-09-26 1995-12-31 Zeneca Ltd Aminoheterocyclic derivatives
IL117580A0 (en) 1995-03-29 1996-07-23 Merck & Co Inc Inhibitors of farnesyl-protein transferase and pharmaceutical compositions containing them
FR2735127B1 (fr) 1995-06-09 1997-08-22 Pf Medicament Nouvelles piperazines heteroaromatiques utiles comme medicaments.
ES2100129B1 (es) 1995-10-11 1998-02-16 Medichem Sa Nuevos compuestos aminopiridinicos policiclicos inhibidores de acetilcolinesterasa, procedimiento para su preparacion y su utilizacion.
AU1608397A (en) 1996-02-02 1997-08-22 Zeneca Limited Heterocyclic compounds useful as pharmaceutical agents
GB9602166D0 (en) 1996-02-02 1996-04-03 Zeneca Ltd Aminoheterocyclic derivatives
US5807876A (en) 1996-04-23 1998-09-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of IMPDH enzyme
JPH09291034A (ja) 1996-02-27 1997-11-11 Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd 縮合ピリジン化合物およびその医薬としての用途
US6262113B1 (en) 1996-03-20 2001-07-17 Smithkline Beecham Corporation IL-8 receptor antagonists
CA2252501A1 (en) 1996-05-20 1997-11-27 Darwin Discovery Limited Quinoline sulfonamides as tnf inhibitors and as pde-iv inhibitors
US5984882A (en) 1996-08-19 1999-11-16 Angiosonics Inc. Methods for prevention and treatment of cancer and other proliferative diseases with ultrasonic energy
EP0945446A4 (en) 1996-11-14 1999-12-08 Nissan Chemical Ind Ltd CYANOETHYLMELAMINE DERIVATIVES AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
US6399358B1 (en) 1997-03-31 2002-06-04 Thomas Jefferson University Human gene encoding human chondroitin 6-sulfotransferase
JPH11158073A (ja) 1997-09-26 1999-06-15 Takeda Chem Ind Ltd アデノシンａ３拮抗剤
US7517880B2 (en) 1997-12-22 2009-04-14 Bayer Pharmaceuticals Corporation Inhibition of p38 kinase using symmetrical and unsymmetrical diphenyl ureas
ATE297383T1 (de) 1997-12-22 2005-06-15 Bayer Pharmaceuticals Corp Hemmung der p38 kinase unter verwendung von symmetrischen und asymmetrischen diphenylharnstoffen
UY25842A1 (es) 1998-12-16 2001-04-30 Smithkline Beecham Corp Antagonistas de receptores de il-8
WO2000075129A1 (en) 1999-06-07 2000-12-14 Shire Biochem Inc. Thiophene integrin inhibitors
EP1212296B9 (en) 1999-08-27 2006-05-10 Sugen, Inc. Phosphate mimics and methods of treatment using phosphatase inhibitors
MX228790B (es) 1999-09-17 2005-06-30 Millennium Pharm Inc Inhibidores del factor xa.
NZ517829A (en) 1999-09-17 2004-12-24 Millennium Pharm Inc Benzamides and related inhibitors of factor Xa
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
WO2001064642A2 (en) 2000-02-29 2001-09-07 Cor Therapeutics, Inc. Benzamides and related inhibitors of factor xa
WO2002008221A2 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Neurogen Corporation Capsaicin receptor ligands
US6525091B2 (en) 2001-03-07 2003-02-25 Telik, Inc. Substituted diarylureas as stimulators for Fas-mediated apoptosis
AU2002256418A1 (en) 2001-04-27 2002-11-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of bace
CA2445653A1 (en) 2001-06-11 2002-12-19 Biovitrum Ab Substituted sulfonamide compounds, process for their use as medicament for the treatment of cns disorders, obesity and type ii diabetes
JP2005500294A (ja) 2001-06-19 2005-01-06 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー ホスホジエステラーゼ７に対するピリミジン阻害剤
JP4344241B2 (ja) 2001-08-17 2009-10-14 チバ ホールディング インコーポレーテッド トリアジン誘導体、およびサンスクリーンとしてのその使用
JP4753336B2 (ja) 2001-09-04 2011-08-24 日本化薬株式会社 新規アリル化合物及びその製法
US6878196B2 (en) 2002-01-15 2005-04-12 Fuji Photo Film Co., Ltd. Ink, ink jet recording method and azo compound
US20040067234A1 (en) * 2002-07-11 2004-04-08 Paz Einat Isocitrate dehydrogenase and uses thereof
EP1546121B1 (en) 2002-07-18 2012-08-29 Janssen Pharmaceutica NV Substituted triazine kinase inhibitors
JP2004107220A (ja) 2002-09-13 2004-04-08 Mitsubishi Pharma Corp ＴＮＦ−α産生抑制剤
AR042052A1 (es) 2002-11-15 2005-06-08 Vertex Pharma Diaminotriazoles utiles como inhibidores de proteinquinasas
WO2004050033A2 (en) 2002-12-02 2004-06-17 Arqule, Inc. Method of treating cancers
AU2003299641C1 (en) 2002-12-16 2016-06-02 Cormorant Pharmaceuticals Ab Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (IL-8)
JP2006515883A (ja) 2003-01-10 2006-06-08 スレッシュオールド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ２−デオキシグルコースによる癌の処置
US7358262B2 (en) 2003-01-29 2008-04-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Identification of genotype-selective anti-tumor agents
WO2004089470A2 (en) 2003-04-11 2004-10-21 Novo Nordisk A/S New amide derivatives and pharmaceutical use thereof
WO2004074438A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Smithkline Beecham Corporation Ccr8 antagonists
WO2004073619A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Smithkline Beecham Corporation Ccr8 antagonists
JP4948173B2 (ja) 2003-10-10 2012-06-06 ニツポネツクス・インコーポレーテツド 過剰増殖性疾患治療用ピリミジン誘導体
JP4099768B2 (ja) 2003-11-10 2008-06-11 富士電機デバイステクノロジー株式会社 電子写真感光体および該電子写真感光体に起因する干渉縞有無の判定方法
US20070196395A1 (en) 2003-12-12 2007-08-23 Mackerell Alexander Immunomodulatory compounds that target and inhibit the py'binding site of tyrosene kinase p56 lck sh2 domain
KR20070007055A (ko) 2003-12-24 2007-01-12 사이오스 인코퍼레이티드 Ｔｇｆ-베타 억제제를 이용한 악성 신경교종의 치료법
GB0412526D0 (en) 2004-06-05 2004-07-14 Leuven K U Res & Dev Type 2 diabetes
CN101083992A (zh) 2004-09-20 2007-12-05 泽农医药公司 抑制人硬脂酰CoA去饱和酶的哒嗪衍生物
EP1796673A2 (en) 2004-09-23 2007-06-20 Reddy US Therapeutics, Inc. Novel pyrimidine compounds, process for their preparation and compositions containing them
WO2006038594A1 (ja) 2004-10-04 2006-04-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Ｎ型カルシウムチャネル阻害薬
US20100160324A1 (en) 2004-12-30 2010-06-24 Astex Therapeutics Limited Pyrazole derivatives as that modulate the activity of cdk, gsk and aurora kinases
KR20070107061A (ko) 2005-01-25 2007-11-06 아스트라제네카 아베 화학적 화합물
WO2006133420A2 (en) * 2005-06-08 2006-12-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Treatment of patients with cancer therapy
GB0513702D0 (en) 2005-07-04 2005-08-10 Sterix Ltd Compound
MX2008002723A (es) 2005-08-26 2008-03-26 Serono Lab Derivados de pirazina y uso como inhibidores de p13k.
US8133900B2 (en) 2005-11-01 2012-03-13 Targegen, Inc. Use of bi-aryl meta-pyrimidine inhibitors of kinases
TW200815426A (en) 2006-06-28 2008-04-01 Astrazeneca Ab New pyridine analogues II 333
JP2010508300A (ja) 2006-10-26 2010-03-18 フライン、ギャリー・エー． アクアポリン修飾因子並びに浮腫および体液平衡異常の治療のためのそれらの使用方法
HUP0600810A3 (en) 2006-10-27 2008-09-29 Richter Gedeon Nyrt New sulfonamide derivatives as bradykinin antagonists, process and intermediates for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US20100234341A1 (en) 2006-12-04 2010-09-16 Marion Lanier Substituted pyrimidines as adenosine receptor antagonists
NZ578180A (en) 2006-12-08 2012-02-24 Millennium Pharm Inc Unit dose formulations and methods of treating thrombosis with an oral factor xa inhibitor
WO2008076883A2 (en) 2006-12-15 2008-06-26 Abraxis Bioscience, Inc. Triazine derivatives and their therapeutical applications
WO2008131547A1 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Prometic Biosciences Inc. 'triazine derivatives, compositions containing such derivatives, and methods of treatment of cancer and autoimmune diseases using such derivatives'
JP2010529193A (ja) 2007-06-11 2010-08-26 ミイカナ セラピューティクス インコーポレイテッド 置換ピラゾール化合物
NZ583450A (en) 2007-07-20 2012-05-25 Nerviano Medical Sciences Srl Substituted indazole derivatives active as kinase inhibitors
TW200906818A (en) 2007-07-31 2009-02-16 Astrazeneca Ab Chemical compounds
CA2702171A1 (en) 2007-10-10 2009-04-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Amide compound
US8642660B2 (en) 2007-12-21 2014-02-04 The University Of Rochester Method for altering the lifespan of eukaryotic organisms
GB0805477D0 (en) 2008-03-26 2008-04-30 Univ Nottingham Pyrimidines triazines and their use as pharmaceutical agents
JP5277685B2 (ja) 2008-03-26 2013-08-28 富士ゼロックス株式会社 電子写真感光体、画像形成装置、プロセスカートリッジ及び画像形成方法
US20090281089A1 (en) 2008-04-11 2009-11-12 Genentech, Inc. Pyridyl inhibitors of hedgehog signalling
CN101575408B (zh) 2008-05-09 2013-10-30 Mca技术有限公司 用作阻燃剂和光稳定剂的聚三嗪基化合物
FR2932483A1 (fr) 2008-06-13 2009-12-18 Cytomics Systems Composes utiles pour le traitement des cancers.
TW201028381A (en) 2008-07-14 2010-08-01 Shionogi & Co Pyridine derivative having ttk inhibition activity
WO2010028179A1 (en) 2008-09-03 2010-03-11 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Heterocyclic compounds as gata modulators
CA2736125C (en) 2008-09-03 2019-04-09 The Johns Hopkins University Genetic alterations in isocitrate dehydrogenase and other genes in malignant glioma
JP2010079130A (ja) 2008-09-29 2010-04-08 Fuji Xerox Co Ltd 電子写真感光体、プロセスカートリッジ、及び画像形成装置
US20100273808A1 (en) 2008-11-21 2010-10-28 Millennium Pharmaceticals, Inc. Lactate salt of 4-[6-methoxy-7-(3-piperidin-1-yl-propoxy)quinazolin-4-yl]piperazine-1-carboxylic acid(4-isopropoxyphenyl)-amide and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of cancer and other diseases or disorders
JP2010181540A (ja) 2009-02-04 2010-08-19 Fuji Xerox Co Ltd 電子写真感光体、プロセスカートリッジ、及び画像形成装置
RU2535217C2 (ru) 2009-02-06 2014-12-10 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Производные аминопиразина и лекарственные средства
ES2740424T3 (es) 2009-03-13 2020-02-05 Agios Pharmaceuticals Inc Métodos y composiciones para trastornos relacionados con la proliferación celular
EP2427441B1 (en) 2009-05-04 2016-12-14 Agios Pharmaceuticals, Inc. Pkm2 activators for use in the treatment of cancer
WO2010130638A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 Evotec Ag Sulfonamide compounds, pharmaceutical compositions and uses thereof
KR101460095B1 (ko) 2009-06-08 2014-11-10 캘리포니아 캐피탈 에쿼티, 엘엘씨 트리아진 유도체와 이들의 치료적 용도
BRPI1011527A2 (pt) 2009-06-09 2016-07-26 California Capital Equity Llc derivados de triazina substituídos com ureidofenil e suas aplicações terapêuticas.
WO2010144404A1 (en) 2009-06-09 2010-12-16 Abraxis Bioscience, Llc Pyridil-triazine inhibitors of hedgehog signaling
SG10201403696UA (en) 2009-06-29 2014-10-30 Agios Pharmaceuticals Inc Therapeutic compounds and compositions
US20120101587A1 (en) 2009-07-10 2012-04-26 Milux Holding Sa Knee joint device and method
CA2773561A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 Phusis Therapeutics Inc. Pharmaceutical compositions and formulations including inhibitors of the pleckstrin homology domain and methods for using same
JP5473851B2 (ja) 2009-09-30 2014-04-16 富士フイルム株式会社 高分子フィルム、位相差フィルム、偏光板及び液晶表示装置
US8652534B2 (en) 2009-10-14 2014-02-18 Berry Pharmaceuticals, LLC Compositions and methods for treatment of mammalian skin
WO2011050211A2 (en) 2009-10-21 2011-04-28 Agios Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for cell-proliferation-related disorders
ES2594402T3 (es) 2009-10-21 2016-12-20 Agios Pharmaceuticals, Inc. Métodos y composiciones para trastornos relacionados con la proliferación celular
SG10201501272SA (en) 2009-10-22 2015-04-29 Fibrotech Therapeutics Pty Ltd Fused ring analogues of anti-fibrotic agents
ES2642109T3 (es) 2009-12-09 2017-11-15 Agios Pharmaceuticals, Inc. Compuestos terapéuticamente activos para su uso en el tratamiento de cáncer caracterizados por tener una mutación de IDH
US20130197106A1 (en) 2010-04-01 2013-08-01 Agios Pharmaceuticals, Inc Methods of identifying a candidate compound
US20130109643A1 (en) 2010-05-10 2013-05-02 The Johns Hopkins University Metabolic inhibitor against tumors having an idh mutation
EP2593425B1 (en) 2010-07-16 2018-10-17 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compositions and their method of use
SG10201710578TA (en) 2010-10-21 2018-02-27 Medivation Technologies Inc Crystalline (8s,9r)-5-fluoro-8-(4-fluorophenyl)-9-(1-methyl-1h-1,2,4-triazol-5-yl)-8,9-dihydro-2h-pyrido[4,3,2-de]phthalazin-3(7h)-one tosylate salt
BR112013013429A2 (pt) 2010-11-29 2017-03-21 Galleon Pharmaceuticals Inc composição, método de prevenção ou tratamento de distúrbio ou doença de controle da respiração, e, método de prevenção de desestabilização ou estabilização do ritmo respiratório
TWI549947B (zh) 2010-12-29 2016-09-21 阿吉歐斯製藥公司 治療化合物及組成物
CN103608016A (zh) 2011-05-03 2014-02-26 安吉奥斯医药品有限公司 丙酮酸激酶激活剂在治疗中的用途
TWI555737B (zh) 2011-05-24 2016-11-01 拜耳知識產權公司 含有硫醯亞胺基團之４－芳基－ｎ－苯基－１，３，５－三氮雜苯－２－胺
CN102827170A (zh) 2011-06-17 2012-12-19 安吉奥斯医药品有限公司 治疗活性组合物和它们的使用方法
CN102659765B (zh) 2011-12-31 2014-09-10 沈阳药科大学 嘧啶及三嗪类化合物的制备方法和应用
SG10201602862RA (en) 2012-01-06 2016-05-30 Agios Pharmaceuticals Inc Therapeutically Active Compounds And Their Methods Of Use
US9474779B2 (en) 2012-01-19 2016-10-25 Agios Pharmaceuticals, Inc. Therapeutically active compositions and their methods of use
JP6228130B2 (ja) 2012-01-19 2017-11-08 アジオス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 治療活性化合物およびそれらの使用方法
EP2634259A1 (en) 2012-03-01 2013-09-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Means and methods for the determination of (D)-2-hydroxyglutarate (D2HG)
IN2014MN01897A (zh) 2012-03-09 2015-07-10 Carna Biosciences Inc
WO2014015422A1 (en) 2012-07-27 2014-01-30 Ontario Institute For Cancer Research Cellulose-based nanoparticles for drug delivery
US9579324B2 (en) 2013-07-11 2017-02-28 Agios Pharmaceuticals, Inc Therapeutically active compounds and their methods of use
US20150031627A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Agios Pharmaceuticals, Inc Therapeutically active compounds and their methods of use
EA034336B1 (ru) 2014-09-19 2020-01-29 Форма Терапьютикс, Инк. Хинолиноновые производные пиридин-2(1h)-она как ингибиторы мутантной изоцитратдегидрогеназы
KR20180088460A (ko) 2015-12-04 2018-08-03 아지오스 파마슈티컬스 아이엔씨. 악성종양의 치료 방법

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