CN108524491A - 羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用 - Google Patents

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宋施豪
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Abstract

本发明公开了羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用。本发明发明人以白色念珠菌为供试对象，筛选高效、低毒、不易产生耐药性的化合物，发现羟基芫花素对白色念珠菌的粘附性、生物膜形成和致病性具有很好的抑制作用。而且，羟基芫花素本身毒性较小，不影响人类细胞的生长；同时不影响白色念珠菌的正常生长，表明羟基芫花素对白色念珠菌菌株的作用并不主要是依靠杀死白色念珠菌，而是通过抑制白色念珠菌的粘附性、生物膜形成、致病性，因此不易产生耐药性。这在新型抗真菌药物的开发，尤其是抗白色念珠菌感染药物的开发方面具有很好的应用前景。

Description

羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用。
背景技术
白色念珠菌(Candida albicans)是在人类中广泛传播的真菌疾病，是一种重要的条件致病真菌，通常会引起急性、亚急性或慢性感染，也是现在医院获得性感染最重要的病原之一。在健康人体黏膜表面，如口腔、肠道，白色念珠菌通常不会引起病害，但在免疫系统受到损害或抑制的病人体内，如化疗病人、器官移植病人或艾滋病人中，会引起严重的系统性感染，其致死率高达40％。
目前在临床上抗真菌药物种类有限，其中唑类药物(氟康唑)应用广泛，氟康唑是通过抑制真菌复制起到抑菌的作用，但是随着抗生素的滥用，耐药性的现象越来越严重。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用。
所述的羟基芫花素的CAS号为20243-59-8，其结构式如下所示：
具体地，所述抗白色念珠菌是指抑制白色念珠菌的粘附性、生物膜形成和致病性(对白色念珠菌的毒力作用)。
所述的抗白色念珠菌药物包括用于预防和/或治疗白色念珠菌感染的药物，以及用于预防和治疗白色念珠菌引起的感染性疾病药物。
本发明具有以下有益效果：
本发明在前期工作中针对性地筛选高效、低毒、不易产生耐药性的化合物。然后以白色念珠菌(Candida albicans)为供试对象，考察了本发明筛选的羟基芫花素对白色念珠菌的粘附性、生物膜形成以及细胞毒性的影响作用，目的是通过检测羟基芫花素对白色念珠菌毒力形成因素的干扰，进一步影响白色念珠菌的侵染作用。结果显示，羟基芫花素对白色念珠菌的粘附性和致病性具有很好的抑制作用。而且，羟基芫花素本身毒性较小，不影响人类细胞的生长；同时不影响白色念珠菌的正常生长，表明羟基芫花素对白色念珠菌菌株的作用并不主要是依靠杀死白色念珠菌，而是通过抑制白色念珠菌的粘附性、致病性，因此不易产生耐药性。这在新型抗真菌药物的开发，尤其是抗白色念珠菌感染药物的开发方面具有很好的应用前景。
因此，羟基芫花素在制备抗白色念珠菌感染的药物中的应用，以及在制备预防和/或治疗白色念珠菌引起的感染性疾病的药物中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
附图说明
图1是羟基芫花素对白色念珠菌在A549细胞致病性方面的影响结果图；其中，图(A)是终浓度为100μM的羟基芫花素对A549细胞的细胞毒性的检测结果图；图(B)是不同浓度的羟基芫花素对白色念珠菌侵染细胞后的检测结果图。
图2是羟基芫花素对白色念珠菌生长速率的影响结果图；其中，DMSO作为对照；数据显示的是3个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差。
图3是羟基芫花素对白色念珠菌粘附性的影响结果图；其中，DMSO、BDSF作为对照；数据显示的是4个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差。
图4是羟基芫花素对白色念珠菌生物膜形成的影响结果图；其中，DMSO作为对照；数据显示的是8个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1羟基芫花素抗菌活性检测
1、试验方法：
(1)白色念珠菌菌株的活化：
将白色念珠菌标准菌株SC5314于LB固体培养基活化(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)，置于30℃培养箱培养过夜。
(2)羟基芫花素对白色念珠菌菌株SC5314细胞毒力的影响：
(a)人非小细胞肺癌细胞系A549细胞的复苏及培养：将冻融的A549细胞转移至含10％(v/v)FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37℃、5％CO2条件下过夜培养。
(b)A549细胞准备：A549细胞在含10％胎牛血清的高糖培养基DMEM中，以1.5×104个/孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％的时候，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。
(c)白色念珠菌准备：挑取新鲜SC5314接种于GMM培养液(6.7g/L YNB，0.2％葡萄糖)中，于30℃、200rpm条件下振荡培养过夜；用细胞维持液(含1％FBS的DMEM)调节至OD600＝1.0，再用细胞维持液稀释10倍(≈108cfu/mL)，得到含菌的细胞维持液。
(d)细胞毒力测定：
a)用DMSO溶解羟基芫花素，制备浓度为2mM的羟基芫花素母液。
b)测定羟基芫花素本身对细胞的毒力作用：将羟基芫花素母液用DMSO稀释到1mM，加入细胞维持液中，羟基芫花素的终浓度为100μM，得到测试液A；同时，设置对照组，即以相同体积的DMSO取代羟基芫花素母液，得到测试液B。按100μL/孔，将测试液A和测试液B分别加入准备好的A549细胞中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养8h，每处理4个重复。
c)测定羟基芫花素和白色念珠菌对细胞的毒力作用：将羟基芫花素母液用DMSO稀释成浓度为1mM、500μM、250μM、125μM的稀释药液，然后将羟基芫花素母液和羟基芫花素稀释液分别与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合，得到测试液C，羟基芫花素在测试液C中的终浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM，测试液C中，DMSO的体积含量是相同的；同时设置只加DMSO(二甲基亚砜)、BDSF(cis-2-dodecenoic acid，顺2-十二碳烯酸，上海有德化工科技有限公司)和FLC(氟康唑)作为对照，其中，以DMSO和含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合，得到测试液D；以BDSF母液(用DMSO溶解得到，浓度为1mM)与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合，得到测试液E；以氟康唑母液(用DMSO溶解得到，浓度为1mM)与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合，得到测试液F。按100μL/孔，将测试液C～F分别加入准备好的A549细胞中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养8h，每处理4个重复。
d)参照Promega公司CytoToxNonRadioactive Cytotoxicity Assay操作方法测定细胞LDH活性，随后用GraphPad Prism 6处理数据。
(3)羟基芫花素对白色念珠菌菌株SC5314生长影响测定：
挑取菌株SC5314单菌落接种于GMM培养液(6.7g/L YNB，0.2％葡萄糖)，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD600，用GMM将菌液稀释至OD600＝0.05。将该菌液与浓度为1mM的羟基芫花素药液按体积比9:1混合，按300μL/孔的量加入到100孔板中，每个处理设置3个重复，同时设置只加DMSO的处理。置于生长曲线测定仪中，30℃，200rpm，每2h测定一次OD600值，2d后观察实验结果，GraphPad Prism 6处理数据。
(4)羟基芫花素对白色念珠菌菌株SC5314粘附性的影响：
(a)A549细胞的复苏及培养：将冻融的A549细胞转移至含10％FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37℃，5％CO2条件下过夜培养。
(b)A549细胞准备：A549细胞在含10％胎牛血清的高糖培养基DMEM中，以0.5×103个/孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％的时候，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。
(c)挑取LB固体平板上的SC5314菌株，接种于GMM培养液(6.7g/L YNB，0.2％葡萄糖)中，30℃，200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD600。随后用细胞维持液(含1％FBS的DMEM)调节将菌液稀释至OD600＝0.5。将羟基芫花素母液用DMSO稀释成浓度为1mM、500μM、250μM、125μM的稀释药液，然后将羟基芫花素母液和羟基芫花素稀释液分别与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合，震荡混匀，得到测试液G，羟基芫花素在测试液G中的终浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM。按100μL/孔加入步骤(b)已培养细胞的96孔板中，每个处理设置4个重复；同时设置只加DMSO和BDSF的处理，其中，以DMSO和含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合，得到测试液H；以BDSF母液(用DMSO溶解得到，浓度为1mM)与含菌的细胞维持液按体积比1:9配比混合，得到测试液I。将96孔板静置于37℃中孵育，1.5h后弃掉培养液，每孔加入100μL浓度为0.1％(w/v)的结晶紫溶液，室温作用45min。将结晶紫弃掉，并用冰ddH2O洗10次，加入100μL浓度为体积百分比75％的乙醇溶液，室温放置30分钟，测定OD590，用GraphPad Prism 6软件处理数据。
(5)羟基芫花素对白色念珠菌菌株SC5314生物膜形成的影响：
挑取LB固体平板上的SC5314菌株，接种于SDA培养液(40g麦芽糖、10g蛋白胨，蒸馏水定容至1L，调pH至6.0±0.2)，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD600。随后用SDA培养液将菌液稀释至OD600＝0.1，得到含菌的SDA培养液。将羟基芫花素母液用DMSO稀释成浓度为1mM、500μM、250μM、125μM的稀释药液，然后将羟基芫花素母液和羟基芫花素稀释液分别与含菌的SDA培养液按体积比1:9配比混合，震荡混匀，得到测试液J，羟基芫花素在测试液J中的终浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM。按100μL/孔加入96孔板中，每个处理设置8个重复，同时设置只加DMSO和只加BDSF(BDSF的终浓度为100μM)的处理。将96孔板静置于37℃中孵育，8h后弃掉培养液，加入100μL 0.1％结晶紫，室温作用45min。将结晶紫弃掉，并用冰ddH2O洗10次，加入100μL 75％乙醇，室温放置30分钟，测定OD590，用GraphPadPrism6软件处理数据。
2、实验结果
(1)羟基芫花素对白色念珠菌菌株SC5314的毒力有一定抑制作用
我们通过检测LDH的释放量来检测细胞的毒性，在检测白色念珠菌的细胞毒性时，我们将加入了DMSO组的LDH释放量作为100％，并由此来规范其他加入羟基芫花素组的LDH释放比例。结果如图1所示，数据显示的是4个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差。
细胞毒力实验结果显示，以DMSO对照，在没有白色念珠菌的条件下，羟基芫花素对细胞没有毒性，如图1(A)所示。
而在加白色念珠菌SC5314的条件下，以DMSO为阳性，BDSF为阴性对照，图1(B)显示羟基芫花素在抑制菌株SC5314对细胞的侵染有一定保护作用，在100μM的浓度时，白色念珠菌的毒力降低到0。
(2)羟基芫花素对白色念珠菌菌株SC5314的生长没有影响
结果如图2所示，以DMSO为对照，羟基芫花素的浓度为100μM时对白色念珠菌菌株SC5314的生长基本没有影响。该结果表明羟基芫花素对白色念珠菌菌株SC5314的作用并不是杀死细菌，因此不易产生耐药性。
(3)羟基芫花素抑制白色念珠菌菌株SC5314的粘附性
结果如图3所示，以DMSO为参照组，将DMSO参照组的粘附性作为100％，BDSF处理组的白色念珠菌粘附性降低了94％，经终浓度为100μM的羟基芫花素处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯上的粘附性降低了58.2％左右。表明羟基芫花素显示出了对白色念珠菌SC5314的粘附性有一定抑制作用。
(4)化合物抑制白色念珠菌菌株SC5314的生物膜形成
如图4所示，以DMSO为参照，经终浓度为100μM羟基芫花素处理后的白色念珠菌的生物膜形成，降低了34.9％左右。羟基芫花素显示出了对白色念珠菌SC5314的生物膜形成有一定抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用，其特征在于：所述的抗白色念珠菌药物是具有抑制白色念珠菌的粘附性、生物膜形成和致病性的药物。
3.根据权利要求1所述的羟基芫花素在制备抗白色念珠菌药物中的应用，其特征在于：所述的抗白色念珠菌药物为用于预防和/或治疗白色念珠菌感染的药物，以及用于预防和治疗白色念珠菌引起的感染性疾病药物中的一种或两种。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TARIK A. MOHAMED ET AL: "Antimicrobial sesquiterpene lactones from Artemisia sieberi", 《JOURNAL OF ASIAN NATURAL PRODUCTS RESEARCH》 *
马鹏凯等: "芫花及其主要黄酮类成分对ＵＧＴｓ活性的影响及其毒性机制初探", 《中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第一次(2016年)学术交流大会》 *

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