CN116419758A - 抗菌组合成分 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用作药物的组合成分，至少包括胶体形式的银、西洋接骨木提取物、报春花和花萼提取物和/或贯叶连翘提取物、狭花天竺葵提取物。所述组合成分优先用于抗病毒、抗细菌和抗真菌的预防和/或治疗。所述组合成分以抗真菌和抗细菌乳霜的形式应用为更佳。

Description

抗菌组合成分
技术领域
本发明涉及一种用作药物的组合成分，至少包括胶体形式的银、西洋接骨木提取物、报春花和花萼提取物和/或贯叶连翘提取物、狭花天竺葵提取物。所述组合成分优先用于抗病毒、抗细菌和抗真菌的预防和/或治疗。所述组合成分以抗真菌和抗细菌乳霜的形式应用为更佳。
本发明涉及抗真菌、抗病毒和抗细菌方面的治疗。
背景技术
银的治疗特性早在古希腊时代就已为人所知：人们知道，在使用银质餐具吃饭的家庭中，感染频率较低。银具有重要的抗菌特性，因为溶液中存在一亿分之一的银元素就足以实现有效的抗菌作用。众所周知，银离子或自由基也是一种活跃的抗菌剂。
为了使银溶于水，有必要使用胶体离子形式(极细的银颗粒在水中的悬浮液)。1920年首次通过水解过程获得——使用两个纯银电极，浸入去矿物质水或蒸馏水中，对其施加电位差。
在1938年抗生素出现之前，由此产生的胶体银被用于治疗各种疾病和感染：事实上，它已被证明对超过650种不同的病原体有效。
胶体银实际上改善了免疫系统功能，因为它作为一种催化剂，使许多细菌、真菌和病毒物种的代谢所需的特定酶失去活性。
这种方法成功的原因是银是一种安全的防腐剂；事实上，当以胶体形式使用时，银被组织吸收的速度非常慢，因此不会引起毒性作用。所以它可以口服，是成人和儿童可以每天服用的制剂之一，即使长期使用也不会出现任何不耐受风险。
胶体银主要作为皮肤科防腐剂，用于治疗某些类型的病变。它还可以作为水净化器和化妆品行业的防腐剂。
然而，胶体银并非对所有真菌、病毒和细菌都有效。
时至今日，尤其从全球新冠疫情以来，更需要一种现有组合成分的替代物，以有效对抗所有现有和未来的病毒、真菌和细菌病原体。
在局部抗真菌和/或抗细菌治疗方面也需要有替代品。
此外，还需要确定新的抗生素组合成分，以治疗抗生素耐药患者。
申请人意外发现将胶体银与几种植物提取物结合起来，可以得到一种用于抗病毒、抗细菌和抗真菌预防和治疗的有效组合物。
发明内容
因此，根据第一方面，本发明涉及一种用作药物的组合成分，所述组合成分包括：
-胶体形式的银；
-西洋接骨木提取物；
-报春花和花萼提取物和/或贯叶连翘提取物；
-天竺葵提取物。
根据本发明所述的胶体离子银是指极细银颗粒在水中的悬浮液。
前述胶体形式的银以大小在0.1至30纳米之间的颗粒为佳。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-每升组合成分中胶体形式的银含量在20mg至250mg之间。
按照惯例，一般认为1mg银相当于1升溶液中的百万分之一，即每升溶液含20mg至250mg银。
西洋接骨木，或称黑接骨木，是忍冬科的一种灌木植物。这种植物的提取物可以取自其花朵或果实，可以是干性、液态和/或酒精的提取物。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-该组合成分中西洋接骨木提取物的重量百分比在0.3至5％之间。
报春花和花萼或报春花是报春花科的多年生草本植物。可以选择在水和/或酒精中通过研磨植物的花和/或花萼获得该提取物。该提取物也可以是干性提取物。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-组合成分中报春花和花萼提取物的重量百分比在1至9％之间。
贯叶连翘或穿孔圣约翰草，更常被称为圣约翰草，是金丝桃科多年生草本植物。该提取物来自于植物或花的顶端，可以选择在水和/或酒精中研磨提取。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-组合成分中贯叶连翘提取物的重量百分比在0.5至11％之间。
狭花天竺葵，或天竺葵，是一种原产于南非的植物。这种植物的提取物可以是取自该植物根部或其他部分的干性、液态和/或酒精提取物的形式。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-组合成分中天竺葵提取物的重量百分比在1至6％之间。
根据一个实施方案，根据本发明使用的所述组合成分包括：
-每升组合成分中胶体形式的银含量在20mg至250mg之间；
-该组合成分中西洋接骨木提取物的重量百分比在0.3至5％之间；
-组合成分中报春花和花萼提取物的重量百分比在1至9％之间，和/
或组合成分中贯叶连翘提取物的重量百分比在0.5至11％之间；
-组合成分中天竺葵提取物的重量百分比在1至6％之间。
根据一个实施方案，根据本发明使用的所述组合成分还包括：
-离子形式的银；
根据本发明所述的离子银是指颗粒溶于水的银，与胶体银相反，该颗粒悬浮于水中。
根据一个实施方案，根据前述实施方案使用的所述组合成分包括：
-每升组合成分中的银总含量在20mg至250mg之间，分为
i.银总重量中胶体形式银的含量在70-99.99％之间；
ii.银总重量中离子形式银的含量在0.01-30％之间。
根据本发明所述的银总量是指包括根据本发明所述的组合成分包含所有的银，无论其形式如何。
根据一个实施方案，使用的所述组合成分包括：
-每升组合成分中的银总含量在20mg至250mg之间，分为
i.银总重量中胶体形式银的含量在70-99.99％之间；
ii.银总重量中离子形式银的含量在0.01-30％之间；
-该组合成分中西洋接骨木提取物的重量百分比在0.3至5％之间；
-组合成分中报春花和花萼提取物的重量百分比在1至9％之间，和/
或组合成分中贯叶连翘提取物的重量百分比在0.5至11％之间；
-组合成分中天竺葵提取物的重量百分比在1至6％之间。
根据一个实施方案，根据本发明使用的所述组合成分还包括：
-紫锥菊提取物，和/或
-蜂胶和/或
-青蒿提取物和/或
-植物蒜提取物。
紫锥菊，是指菊科植物的一个属。提取物采用干性、液态和/或酒精提取物的形式，取自该植物根部、整株植物或气生部分。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-组合成分中紫锥菊提取物的重量百分比在0.01至8％之间。
植物蒜，通常被称为“大蒜”，是一种多年生植物。提取物可采用干性、液态和/或酒精提取物的形式，或陈蒜提取物。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-组合成分中植物蒜提取物的重量百分比在0.01至10％之间。
“蜂胶”是一种从植物树脂和渗出物中提取的产物，可以由植物分泌，也可以由蜜蜂用植物树脂和蜡制成。由于生产蜂胶的植物种类不同，标准化生产的蜂胶以其颜色区分。最好使用黄色、绿色或红色蜂胶。所述蜂胶可以为干性、纯化后、液态和/或酒精提取物的形式出现。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-组合成分中蜂胶的重量百分比在0.01至7％之间
青蒿，或称艾草，是一个由草本植物、灌木和灌木组成的植物种属，具有羽状叶。本发明中优先使用的品种是黄花蒿。这是一种芳香、多分枝草本植物。这种植物的提取物可以来自整株植物或气生部分，可以制成干性、液态和/或酒精的提取物。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-组合成分中青蒿提取物的重量百分比在0.5至3％之间。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括：
-组合成分中紫锥菊提取物的重量百分比在0.01至8％之间，和/或
-组合成分中蜂胶的重量百分比在0.01至7％之间，和/或
-组合成分中青蒿提取物的重量百分比在0.5-3％之间，和/或
-组合成分中植物蒜提取物的重量百分比在0.01至10％之间。
根据本发明使用的所述组合成分最好包括至少另一种皮肤学上和/或药学上可接受的制剂。
根据一个实施方案，根据本发明使用的所述组合成分用于抗病毒、抗细菌和抗真菌预防和/或治疗。
根据一个实施方案，根据本发明使用的所述组合成分用于抗病毒预防和/或治疗。
根据一个实施方案，根据本发明使用的所述组合成分用于抗细菌预防和/或治疗。
根据一个实施方案，根据本发明使用的所述组合成分用于抗真菌预防和/或治疗。
根据一个实施方案，根据本发明使用的所述组合成分用于抗细菌和抗真菌预防和/或治疗。
根据本发明使用的所述组合成分最好适合于口服、静脉注射、皮下注射、鼻腔、眼科、耳道、直肠、阴道、呼吸道或皮肤施用。
口服途径采取片剂、糖浆、溶液或可饮用悬浮液、胶囊的形式为更佳，
静脉注射采用溶液形式为更佳。
皮下给药采用溶液形式为更佳。
皮肤施用采取软膏、霜、贴片或凝胶形式为更佳。
通过呼吸道或鼻腔给药为佳。
根据本发明使用的所述组合成分最好通过呼吸或鼻腔给药，其形式为滴鼻剂、喷鼻剂、鼻粉、气雾剂，例如压缩气体气雾剂和/或鼻腔喷雾剂，或雾化器。
如果药物组合成分适合通过鼻腔或呼吸道给药，经靶向支气管肺或鼻窦的效果更佳。
根据本发明使用的所述组合成分最好通过气雾剂进入鼻腔给药。
根据本发明所述的组合成分可以给患者每天使用，一天一次，一天两次，一天三次或一天多次均可。本发明所述的组合成分最好每天给患者使用两次，每隔12小时一次。
根据本发明的实施方案，所述组合成分按重量百分比
包括：
-医药级纯化水：qsp
-银总量20mg，20％为离子银，80％为胶体
银，平均粒径为0.8nm；
-0.9％西洋接骨木提取物；
-5％贯叶连翘提取物；
-1.5％干天竺葵提取物；
-3％干紫锥菊提取物；
-4％纯化蜂胶提取物。
根据本发明的实施方案，所述组合成分按重量百分比包括：
-医药级纯化水：qsp
-银总量20mg，20％为离子银，80％为胶体银，平均粒径为0.8nm；
-0.9％西洋接骨木提取物；
-5％干报春花和花萼提取物；
-5％贯叶连翘提取物；
-1.5％干天竺葵提取物；
-3％干紫锥菊提取物；
-4％纯化蜂胶提取物。
根据本发明使用的组合成分采取局部应用的乳膏形式为更佳。
根据一个实施方案，所述局部应用药膏是抗真菌药膏。
根据一个实施方案，所述局部应用药膏是抗细菌药膏。
所述局部应用药膏是抗真菌和抗菌药膏为更佳。
根据本发明使用的组合成分，采用局部应用抗真菌和/或抗菌乳膏形式，可以每天使用，每天一次、每天两次、每天三次或更多次对患者进行局部应用。本发明所述的组合成分最好每天给患者使用两次，每隔12小时一次。
根据另一个实施方案，所述组合成分被用作抗生素。
所述组合成分作为抗生素用于治疗抗生素耐药患者为佳。
抗生素耐药性是指病原体对抗生素产生耐药性的现象。这些生物体进化并发展出防御机制，阻止抗生素治疗发挥作用。使治疗变得无效。
作为抗生素使用的所述组合成分最好用于口服、静脉注射、皮下注射、鼻腔、眼科、耳道、直肠、阴道、呼吸道或皮肤施用。
口服途径采取片剂、糖浆、溶液或可饮用悬浮液、胶囊的形式为更佳，
静脉注射采用溶液形式为更佳。
皮下给药采用溶液形式为更佳。
皮肤施用采取软膏、霜、贴片或凝胶形式为更佳。
根据第二方面，本发明涉及一种组合成分，包括：
-胶体形式的银；
-西洋接骨木提取物；
-报春花和花萼提取物和/或贯叶连翘提取物；
-天竺葵提取物。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-每升组合成分中胶体形式的银含量在20mg至250mg之间。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-该组合成分中西洋接骨木提取物的重量百分比在0.3至5％之间。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-组合成分中报春花和花萼提取物的重量百分比在1至9％之间。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-组合成分中贯叶连翘提取物的重量百分比在0.5至11％之间。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-组合成分中天竺葵提取物的重量百分比在1至6％之间。
根据一个实施方案，所述组合成分包括：
-每升组合成分中胶体形式的银含量在20mg至250mg之间；
-该组合成分中西洋接骨木提取物的重量百分比在0.3至5％之间；
-组合成分中报春花和花萼提取物的重量百分比在1至9％之间，和/或组合成分中贯叶连翘提取物的重量百分比在0.5至11％之间；
-组合成分中天竺葵提取物的重量百分比在1至6％之间。
根据一个实施方案，根据本发明所述的组合成分还包括：
-离子形式的银；
根据一个实施方案，根据前述实施方案所述组合成分包括：
-每升组合成分中的银总含量在20mg至250mg之间，分为i.银总重量中胶体形式银的含量在70-99.99％之间；
ii.银总重量中离子形式银的含量在0.01-30％之间。
根据一个实施方案，所述组合成分包括：
-每升组合成分中的银总含量在20mg至250mg之间，分为i.银总重量中胶体形式银的含量在70-99.99％之间；
ii.银总重量中离子形式银的含量在0.01-30％之间；
-该组合成分中西洋接骨木提取物的重量百分比在0.3至5％之间；
-组合成分中报春花和花萼提取物的重量百分比在1至9％之间，和/或组合成分中贯叶连翘提取物的重量百分比在0.5至11％之间；
-组合成分中天竺葵提取物的重量百分比在1至6％之间。
根据一个实施方案，根据本发明所述的组合成分还包括：
-紫锥菊提取物，和/或
-蜂胶和/或
-青蒿提取物和/或
-植物蒜提取物。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-组合成分中紫锥菊提取物的重量百分比在0.01至8％之间。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-组合成分中植物蒜提取物的重量百分比在0.01至10％之间。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-组合成分中蜂胶的重量百分比在0.01至7％之间根据本发明所述组合成分最好包括：
-组合成分中青蒿提取物的重量百分比在0.5至3％之间。
根据本发明所述组合成分最好包括：
-组合成分中紫锥菊提取物的重量百分比在0.01至8％之间，和/或-组合成分中蜂胶的重量百分比在0.01至7％之间，和/或-组合成分中青蒿提取物的重量百分比在0.5-3％之间，和/或-组合成分中植物蒜提取物的重量百分比在0.01至10％之间。
根据本发明的实施方案，所述组合成分按重量百分比包括：
-医药级纯化水：qsp
-银总量20mg，20％为离子银，80％为胶体银，平均粒径为0.8nm；-0.9％西洋接骨木提取物；
-5％贯叶连翘提取物；
-1.5％干天竺葵提取物；
-3％干紫锥菊提取物；
-4％纯化蜂胶提取物。
根据本发明的实施方案，所述组合成分按重量百分比包括：
-医药级纯化水：qsp
-银总量20mg，20％为离子银，80％为胶体银，平均粒径为0.8nm；
-0.9％西洋接骨木提取物；
-5％干报春花和花萼提取物；
-5％贯叶连翘提取物；
-1.5％干天竺葵提取物；
-3％干紫锥菊提取物；
-4％纯化蜂胶提取物。
根据第三方面，本发明涉及使用根据本发明第二方面所述的组合成分进行表面消毒。
表面消毒的意思是将根据本发明的组合成分应用于惰性表面，以便在使用该组合成分的表面获得抗真菌和/或抗病毒和/或抗细菌的效果。
使用这种组合成分消毒的表面通常包括所有可能需要清洁和消毒表面或物体或器具的地方，例如食品工业、商店、餐馆、医疗环境甚至私人住宅。
根据本发明，优先考虑存在于医疗环境的表面，例如在医疗机构、医院、实验室、兽医机构。
存在于医疗环境的表面包括地板、墙壁、工作台和医疗仪器。
示例：
示例1：组合成分示例：
每100mL组合成分包括：
-银，总量20mg，20％为离子银，80％为胶体银，平均粒径为0.8nm。
-0.9％西洋接骨木提取物
-5％干报春花和花萼提取物和/或贯叶连翘提取物
-1.5％干天竺葵提取物。
-3％干紫锥菊提取物
-4％纯化蜂胶提取物。
示例2：示例1组合成分的抗细菌活性。
通过监测接种试验菌株并与示例1的组合成分接触后的可培养金黄色葡萄球菌的体外密度来研究抗菌活性。
以CFU/ml表示的密度分别在1、3和24小时内测量，用于杀菌效果表征。
结果表明，该组合成分具有杀菌作用。
示例3：示例1组合成分的抗病毒效果。
示例1的组合成分在完全分化的人类气道上皮细胞培养中测试对HRV-A16(一种导致感冒的鼻病毒)的潜在活性。感染前一小时内先应用该组合成分，并进行4小时的复制。用配方进行3个漂洗步骤。收集剩余部分，在细胞裂解后检测RNA。24小时后进行同样的收集步骤，并进行同样的检测步骤。百分比表明病毒RNA的变化，导致对HRV-A16复制的百分比抑制，从而达到抗病毒的功效。根据示例1的组合成分针对芦平曲韦(一种已知的抗病毒化合物，有几乎完全的缓解作用)进行测试。根据示例1的组合成分取得的结果更优。
示例4：根据示例1组合成分的抗真菌活性：
通过对浅表霉菌病患者的角质层进行分离和鉴定，得到柱顶孢霉的菌株。在SDA培养基上预培养的真菌悬浮在含有0.1％(w/v)吐温80的无菌盐水中，用纱布过滤悬浮液以收集分节孢子。将其悬浮在含有0.1％(w/v)吐温80的无菌生理盐水中，然后以2x104个细胞/ml的比例加入含有20％阿拉尔蓝的培养基中，得到真菌接种物溶液。
使用示例1的组合成分，以及卢立康唑。
测试方法
最小抑制浓度(MIC)通过微量肉汤稀释法测定。即：RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich)用pH7.0的0.165M吗啉丙磺酸(MOPS，WakoPure ChemicalIndustries,Ltd.)缓冲，并加入既定数量示例1的组合成分的溶液或卢利康唑，制备0.00098-4μg/mL范围内的两倍稀释组。在96孔微孔板中加入100μl，然后加入真菌接种液(100μl，要加入的真菌最终浓度：1.0×104个细胞/ml)，混合物在35℃下生长。事先在培养基中加入阿拉巴马蓝试剂(加入的最终浓度：10％)，在无药生长对照组的阿拉尔蓝试剂由蓝变红的时候，停止培养并测量吸光度(基于590纳米作为参考的570纳米微分光密度)。示例1的组合成分或卢利康唑对生长对照组中真菌生长的抑制率为80％或以上的最低浓度作为MIC。在测量的10个菌株中，确定了9个菌株(90％)的MIC(CMI90)浓度。
测量方法的参考文件：TakakoShinoda等：日本医学真菌学会临床实验室标准委员会提出的意见(1995-1997)，Methodforantifungal susceptibilitytestingoffilamentousfungus,MedicalMycologyJournal,40:239-257,1999.临床实验室标准研究所/国家临床实验室标准委员会。用肉汤稀释法对丝状真菌进行抗真菌药敏试验的参考方法。核准标准M38-A2。韦恩，宾夕法尼亚州：国家临床实验室标准委员会，2008年。
结果
示例1组合成分的MIC高于卢利康唑，显示出特别强的抗真菌活性。
示例5：体内抗病毒、抗菌、抗真菌药效试验
两组各20名患者，患有病毒、真菌和/或细菌感染，用示例1所述的组合成分或生理盐水(PLACEBO)治疗。治疗包括每天两次喷洒示例1的组合成分和PLACEBO。治疗持续两个星期。通过与拭子样本有关的症状总分来评估治疗的有效性。在治疗开始和结束时用Student的t检验评分，并用同样的统计方法来分配疗效分数。
结果显示，示例1中的组合成分比生理盐水更有效。
示例6：天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘提取物与胶体银结合的体外抗菌活性研究方案：
本研究的目的是测试和评估狭花天竺葵、贯叶连翘和西洋接骨木果实的提取物结合胶体银的组合物对革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物的抗菌活性，这些微生物是导致人类和动物难以治疗的感染的最常见原因之一。
材料和方法
植物提取物：测试了非洲天竺葵(狭花天竺葵)、圣约翰草(贯叶连翘)和黑接骨木(西洋接骨木)提取物在浓度为30ppm的胶体银(AgNP)中的抗菌效果。
制备AgNP中的植物组合：在80ml的30ppm胶体银中加入：2克非洲天竺葵提取物(10x200mg胶囊)；2克黑接骨木提取物(5ml浓缩糖浆)；20ml圣约翰草液态提取物-0.4克(1克干花在50ml水中煮沸3分钟并浸泡30分钟。)
对照组广谱抗生素甲砜霉素(Nikovet-Sofia)被用作阳性对照组，待测微生物对其无抵抗。
微生物测试了7个致病菌株的纯培养物：大肠杆菌ATCC-8739(NBIMCC3397)，肠道沙门氏菌ATCC1304(NBIMCC8691)，金黄色葡萄球菌ATCC-6538(NBIMCC3359)，产气荚膜梭菌ATCC13124(NBIMCC8615)和白色念珠菌ATCC10231(NBIMCC74)。另外两种(铜绿假单胞菌和化脓性链球菌)由索非亚林业大学兽医系大学诊所微生物实验室的狗的炎症性皮肤分泌物中分离出来。
营养介质使用了MuellerHinton琼脂和肉汤(BULBIONCIPD-Sofia)，哥伦比亚血琼脂(BiolabZrt.H-1141,BudapestOv.Utra43)，以及选择性培养基：Endo琼脂(Antisel-SharlauChemieSA，西班牙)用于大肠杆菌和肠道菌，溴棕三甲铵琼脂(BiolabZrt.H-1141,BudapestOv.Utr.)用于铜绿假单胞菌，PerfringensTSC琼脂(MkBTestas,SlovakRepublic)以及Zeissler琼脂(BULBIONCIPD-Sofia)用于产气荚膜梭菌，沙氏葡萄糖琼脂加氯霉素(Antisel-SharlauChemieSA,Spain)用于白色念珠菌。
将微生物在35-37℃下培养18-24小时和72小时，对于产气荚膜梭菌，在厌氧条件下培养，对于其他微生物物种在好氧条件下培养。在一个罐子里使用带有钯-H2+CO2催化剂的AnaerobPack系统(BULBIONCIPD-Sofia)来创造厌氧条件。使用IndicStrip指示剂(BULBIONCIPD-Sofia)来证明是否达到厌氧标准。
通过Bauer等(1966年)的经典琼脂扩散法并依据国家临床实验室标准委员会(NCCLS)M2-A3(1997，1999)对物质进行初步研究。试验微生物的悬浮液在指数生长期接种，剂量为2.106细胞/ml，体积为0.1ml，在直径为9厘米的培养皿中，对产气荚膜梭菌用Zeissler琼脂，对其他微生物用Mueller-Hinton琼脂，pH为7.2-7.4，层厚为4mm。将胶态银植物提取物和对照组抗生素以0.1ml的增量施用于琼脂中直径为9mm的孔中。0.1ml植物提取物中含有2mg的狭花天竺葵，2mg的西洋接骨木，0.4mg的贯叶连翘和24ppm的AgNP，以及甲砜霉素在0.1ml(根据需要)中含有30μg。在室温下培养3-4小时进行扩散后，将培养物在35-37℃下培养18-24小时和72小时。读取结果的方法是用透明的尺子在平板底部的外侧测量抑制区的直径，单位是毫米，包括孔的直径(精确到1mm)。根据Bauer-Kirby系统的三个步骤，AgNP的植物提取物在>12mm的区域有抑制作用，而甲砜霉素在>17mm的区域有抑制作用。待测微生物的敏感性与非抗生素制剂如磺胺类药物一样，即：抗性(R)-直径小于12mm的区域，中度敏感(I)-在13至16mm的区域，敏感(S)在>17mm的区域。对于甲砜霉素，相应的限制如下：R<12mm，I-13-17mm，S->18mm(NCCLS、1997,1999)。
根据Ericsson和Sherris(1971年)和NCCLS(1999年)的描述，在Zeissler琼脂中对产气荚膜杆菌和Mueller-Hinton琼脂中对其他微生物采用双倍连续稀释法测定最低抑制浓度(MIC)。细菌悬浮液以106细胞/ml的剂量施用。测试的植物提取物组合，包括狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘，以及对照的抗生素，以不同的最终浓度(每毫升琼脂增加一倍)给药。在35-37℃下培养18-24小时后，测定出现的菌落数量。以数学方式计算出ICD50，其依据是用相应稀释度的试验化合物在琼脂上抑制的菌落数量与在不含植物提取物或抗生素的对照组上的菌落相比。生长抑制范围(D)的定义为无明显生长的浓度。
测定AgNP中植物提取物组合的抗菌作用时间。每毫升组合含有20mg的狭花天竺葵，20mg的西洋接骨木和4mg的贯叶连翘，30ppm的AgNP。
-将浓度为105个细胞/ml的每种测试微生物菌株的悬浮液以1ml的量加入到9ml的AgNP中的植物提取物组合中，达到最终浓度104个细胞/ml。
-将浓度为107个细胞/ml的每种测试微生物菌株的悬浮液以1ml的量加入到9ml的AgNP中的植物提取物组合中，达到最终浓度106个细胞/ml。
-应用了以下对照组：无菌蒸馏水(不含植物提取物和AgNP)，其中每个研究的微生物菌株含量相同，以及植物提取物和30ppm的AgNP，
不含微生物。
在Vortex仪器(Heidolph-Labimex，保加利亚)上均质化1分钟后，将微生物暴露于AgNP中的植物提取物的不同时间间隔(1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、2小时和24小时)，在37℃下将每个样品在Zeissler琼脂中培养，在好氧和厌氧条件下生长24-48小时，对产气荚膜梭菌进行Zeissler琼脂培养，对其他微生物进行Mueller-Hinton琼脂培养。培养后，报告试验细菌的生长情况，并确定形成的菌落数量。
所有实验都进行三次。
依照经典的Student和Fisher方法对结果进行统计学处理。
结果
在采用圆盘扩散法实施的研究中，所测试的植物组合狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘在30ppm的AgNPs中具有非常好的抑制作用(抑制区直径在18.3+3.3和28.7+3.1mm之间)。表1中列出了结果汇总。
与革兰氏阳性微生物相比，所研究的革兰氏阴性细菌显示出更高的敏感性(P>0.05，Student的t检验)。这种方法对产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌的敏感性最低，而对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的敏感性最高。所有测试的微生物都对作为阳性对照的甲砜霉素表现出高度敏感性，即使是白色念珠菌。然而，所研究的微生物抑制区的直径在抗生素和与胶体银的组合测试之间的差异没有统计学意义(P>0.05，Student的t检验)。
[表1]：在琼脂扩散法中，待测植物提取物狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘与30ppm的AgNP对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000151
然而，当确定所测试的植物提取物与所用菌株的最小抑制浓度时，革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物之间的敏感性表现出很大差异，并且具有显著性(P>0.001，Student的t检验)。表2中列出了结果。与革兰氏阳性细菌和白色念珠菌相比(狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘的MIC50分别为10.0+0.0,10.0+0.0和100.0+0,0)，较低浓度的植物提取物(狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘的MIC50分别为5.0+0.0、5.0+0.0和50.0+0.0)能完全抑制革兰氏阴性细菌的生长。在这种方法中，白色念珠菌真菌对测试的植物提取物组合的敏感性与革兰氏阳性细菌的敏感性没有区别。
[表2]：在水中测试的植物提取物组合对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的最小抑制浓度
Figure BDA0004209578700000161
Figure BDA0004209578700000171
MIC50-50％的生长抑制；D-完全生长抑制区域；P.-
狭花天竺葵；S.-西洋接骨木；H.-贯叶连翘；甲砜霉素
为确定所测试的革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物对AgNP中的植物组合的敏感性而进行的研究结果详见表3，通过悬浮法在最终浓度为106个细胞/ml时进行检测。
数据显示，AgNP中的植物组合在24小时内灭活了所有测试的微生物菌株。所有研究的革兰氏阴性菌株显示出尤其高的敏感性。它们在1至15分钟内死亡。在革兰氏阳性微生物中，产气荚膜梭菌细胞的存活时间最短——最多60分钟，化脓性链球菌也是如此。其他的(金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)，单个细胞保持活性的时间超过2小时。
[表3]：在水中测试的植物提取物组合对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的最小抑制浓度
Figure BDA0004209578700000172
Figure BDA0004209578700000181
[表4]：狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘的测试植物提取物与30ppm的AgNP对密度为104个细胞/ml的悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000182
对于所研究的革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物，当以104个细胞/ml的最终浓度施用时，所测试胶体银中的狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘组合表现出明显更快的杀菌效果。表4中列出了汇总数据。
得到的结果显示，在这种较低密度的悬浮液中，存在植物组合时，革兰氏阴性菌在1分钟内死亡。在革兰氏阳性菌种中，产气荚膜梭菌(最多15分钟)和化脓性链球菌(最多30分钟)存活的时间最短。白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的单个细胞分别在1小时和2小时内保持活性。
目前对狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘在30ppm的AgNP中组合的抗菌活性研究表明，来自不同组别的研究微生物具有显著敏感性，这在革兰氏阴性细菌中尤其高，包括铜绿假单胞菌--一种会对化学因素迅速形成抗性的菌种。还应强调的是，通过所有研究方法测定的结果中，严格厌氧产气荚膜梭菌的敏感性特别高。
这些结果证明了这种组合可成功地用作防腐剂，以及用于此类细菌感染的局部治疗。该组合的抗真菌作用也很显著。
结论：
1.在琼脂扩散法中，狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘在30ppm的AgNP中的组合对所有测试微生物显示出非常好的抑制作用(抑制区直径在18.3+3.3和28.7+3.1mm之间)。革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌和铜绿假单胞菌，显示出较高的敏感性，而产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌则较低。
2.非常低浓度的植物提取物组合应用可抑制所测试的微生物。狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘对革兰氏阴性细菌的MIC50分别为5.0+0.0、5.0+0.0和50.0+0.0。对于革兰氏阳性细菌和白色念珠菌，狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘的MIC50分别为10.0+0.0、10.0+0.0和100.0+0.0。
3.在悬浮液研究中，发现AgNP中的植物组合在最终浓度为106个细胞/ml时，24小时内所有测试的细菌菌株均丧失活性。革兰氏阴性细菌菌株显示出特别高的敏感性(在1-15分钟内死亡)。在革兰氏阳性微生物中，产气荚膜梭菌细胞的存活时间最短——最多60分钟，化脓性链球菌也是如此。金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的单个细胞保持活性超过2小时。
4.对于所研究的微生物，当以104个细胞/ml的最终浓度施用时，所测试胶体银中的狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘组合表现出明显更快的杀菌效果。革兰氏阴性细菌在1分钟内死亡。在革兰氏阳性菌种中，产气荚膜梭菌(最多15分钟)和化脓性链球菌(最多30分钟)存活的时间最短。白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的单个细胞分别在1小时和2小时内保持活性。
5.获得的结果表明，这种植物组合与AgNP对于防腐用途，以及针对细菌和真菌感染的局部治疗有效。
示例7：天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘提取物与胶体银结合的体外抗菌活性补充研究方案：
这项实验的目的是研究评估以下组合提取物的体外抗菌活性——非洲天竺葵(狭花天竺葵)和黑接骨木(西洋接骨木)，圣约翰草(贯叶连翘)和黑接骨木(西洋接骨木)以及非洲天竺葵(狭花天竺葵)和圣约翰草(贯叶连翘)作为胶体纳米银形式的液态提取物。)和非洲天竺葵(狭花天竺葵)圣约翰草(贯叶连翘)作为胶体纳米银形式和液态提取物对革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物的作用，这类微生物是人类和动物中难以治疗的感染的最常见原因之一。
材料和方法
植物提取物。检测了非洲天竺葵(狭花天竺葵)、圣约翰草(贯叶连翘)和黑接骨木(西洋接骨木)液态提取物的抗菌效果。相同的提取物与浓度为30ppm的胶体银纳米粒子(AgNP)一起进行了检测。
对照组广谱抗生素甲砜霉素(Nikovet-Sofia)被用作阳性对照组，待测微生物对其无抵抗。
微生物测试了7个致病菌株的纯培养物。其中五个是保加利亚国家工业微生物和细胞培养库(NBIMCC)的参照：大肠杆菌ATCC-8739(NBIMCC3397)，肠道沙门氏菌ATCC1304(NBIMCC8691)，金黄色葡萄球菌ATCC-6538(NBIMCC3359)，产气荚膜梭菌ATCC13124(NBIMCC8615)和白色念珠菌ATCC10231(NBIMCC74)。另外两种(铜绿假单胞菌和化脓性链球菌)由索非亚林业大学兽医系大学诊所微生物实验室的狗的炎症性皮肤分泌物中分离出来。
营养介质使用了MuellerHinton琼脂和肉汤(BULBIONCIPD-Sofia)，哥伦比亚血琼脂(BiolabZrt.H-1141,BudapestOv.Utra43)，以及选择性培养基：Endo琼脂(Antisel-SharlauChemieSA，西班牙)用于大肠杆菌和肠道菌，溴棕三甲铵琼脂(BiolabZrt.H-1141,BudapestOv.Utr.)用于铜绿假单胞菌，PerfringensTSC琼脂(MkBTestas,Slovak)以及Zeissler琼脂(BULBIONCIPD-Sofia)用于产气荚膜梭菌，沙氏葡萄糖琼脂加氯霉素(Antisel-SharlauChemieSA,Spain)用于白色念珠菌。
将微生物在35-37℃下培养18-24小时和72小时，对于产气荚膜梭菌，在厌氧条件下培养，对于其他微生物物种在好氧条件下培养。使用罐装带有钯-H2+CO2催化剂的AnaerobPack系统(BULBIONCIPD-Sofia)创造厌氧条件。使用Strip指示剂(BULBIONCIPD-Sofia)来证明是否达到厌氧标准。
通过Bauer等(1966年)的经典琼脂扩散法
对物质进行初步研究。并依据国家临床实验室标准委员会(NCCLS)M2-A3(1997，1999)对物质进行初步研究。试验微生物的悬浮液在指数生长期接种，剂量为2106细胞/ml，体积为0.1ml，在直径为9厘米的培养皿中，对产气荚膜梭菌用Zeissler琼脂，对其他微生物用Mueller-Hinton琼脂，pH为7.2-7.4，层厚为4mm。将胶态纳米银和水中的植物提取物以及对照组抗生素以0.1ml的增量施用于琼脂中9mm的孔中。单独和组合的植物提取物分别含有每0.1ml含24ppm的AgNP或水，2mg的狭花天竺葵、2mg的西洋接骨木、0.4mg的贯叶连翘，以及0.1ml中含-30μg甲砜霉素(根据要求)。在室温下培养3-4小时进行扩散后，将培养物在35-37℃下培养18-24小时和72小时。读取结果的方法是用透明的尺子在平板底部的外侧测量抑制区的直径，单位是毫米，包括孔的直径(精确到1mm)。根据Bauer-Kirby系统的三个步骤，AgNP的植物提取物在>12mm的区域有抑制作用，而甲砜霉素在>17mm的区域有抑制作用。待测微生物的敏感性与非抗生素制剂如磺胺类药物一样，即：抗性(R)-直径小于12mm的区域，中度敏感(I)-包括13至16mm的区域，敏感(S)在>17mm的区域。对于甲砜霉素，相应的限值如下：R<12mm,I-13-17mmetS->18mm(NCCLS,1997,1999)。
根据Ericsson和Sherris(1971年)和NCCLS(1999年)的描述，在Zeissler琼脂中对产气荚膜杆菌和Mueller-Hinton琼脂中对其他微生物采用双倍连续稀释法测定最低抑制浓度(MIC)。细菌悬浮液以106细胞/ml的剂量施用。测试的植物提取物包括单独或组合的狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘，在水中或与AgNP一起检测，以及对照的抗生素，以不同的最终浓度(每毫升琼脂增加一倍)给药。在35-37℃下培养18-24小时后，测定出现的菌落数量。以数学方式计算出MIC50，其依据是用相应稀释度的试验化合物在琼脂上抑制的菌落数量与在不含植物提取物或抗生素的对照组上的菌落相比。生长抑制范围(D)的定义为无明显生长的浓度。
测定植物水提物和含胶体纳米银的液态提物的抗菌作用时间。每毫升提取物中分别含有20mg的狭花天竺葵、20mg的西洋接骨木和4mg的贯叶连翘，当加入AgNP时，其最终浓度为24ppm。
-将浓度为105个细胞/ml的每种测试微生物菌株的悬浮液以1ml的量加入到9ml的水中，以及9ml每种植物单独的液态提取物中，达到最终浓度104个细胞/ml。同样也对单独和含有AgNP的提取物进行了分析。
-将浓度为107个细胞/ml的每种测试微生物菌株的悬浮液以1ml的量加入到9ml的组合植物提取物中，以及9ml每种植物单独的提取物中，达到最终浓度106个细胞/ml。同样也对单独和含有AgNP的提取物进行了分析。
-应用了以下对照组：无菌蒸馏水(不含植物提取物和AgNP)，其中每个研究的微生物菌株含量相同，以及植物提取物和30ppm的AgNP，
不含微生物。
在Vortex仪器(Heidolph-Labimex，保加利亚)上均质化1分钟后，将微生物暴露于待测植物提取物的不同时间间隔(1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、2小时和24小时)，在37℃下将每个样品在Zeissler琼脂中培养，在好氧和厌氧条件下生长24-48小时，对产气荚膜梭菌进行Zeissler琼脂培养，对其他微生物进行Mueller-Hinton琼脂培养。培养后，报告试验细菌的生长情况，并确定形成的菌落数量。
所有实验都进行三次。
依照经典的Student和Fisher方法对结果进行统计学处理。
结果
在琼脂圆盘扩散法研究中，所有测试植物的提取物与AgNP(抑制区直径在16.0+0.6和24.3+1.3mm之间)以及它们之间的组合对所有测试微生物都有很好的抑制作用(抑制区在18.3+3.3和28.7+3.1mm之间)。表5中列出总结数据。三种植物的提取物与AgNP结合使用的效果要高于单种提取物分别与AgNP使用的效果。单种植物的提取物和它们的组合在抑制区的平均直径(无微生物生长)的差异不显著(P>0.05)。
[表5]：在琼脂凝胶扩散法中，植物提取物(狭花天竺葵和西洋接骨木；西洋接骨木和贯叶连翘；贯叶连翘和狭花天竺葵)结合AgNP对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌作用。
Figure BDA0004209578700000231
所有测试植物的水提取物以及它们的组合(抑制区直径在16.0+0.6和26.0+3.7mm之间)也对所有在圆盘扩散法研究中待测微生物显示出高抑制作用。表6中列出了结果。三种植物的提取物结合使用的效果要高于单种提取物的效果。单种植物的提取物和它们的组合在非生长区的平均直径差异不显著(P>0.05)。
[表6]：在琼脂凝胶扩散法中，植物提取物(狭花天竺葵和西洋接骨木；西洋接骨木和贯叶连翘；贯叶连翘和狭花天竺葵)在水中对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000241
Figure BDA0004209578700000251
与革兰氏阳性微生物相比，所测试的革兰氏阴性细菌对所有测试的植物以及这些植物的组合表现出略高的敏感性(P>0.05)。在这种方法中，大肠杆菌和铜绿假单胞菌的灵敏度最高。白色念珠菌真菌也对所有研究的植物表现出敏感性。所有测试的微生物都对作为阳性对照的甲砜霉素表现出高度敏感性。所有菌株在所研究的抗生素和提取物中抑制区直径的差异具有统计学意义(P<0.05)。
测定的最小抑制浓度(MIC)结果列于表7。它们与琼脂凝胶扩散法的结果相符。所研究的三种植物提取物显示出显著的抗菌活性。狭花天竺葵和西洋接骨木的效果相似。它们对革兰氏阴性细菌的MIC50很低-10mg/ml，而对革兰氏阳性微生物为20mg/ml。较高浓度的贯叶连翘抑制了所研究的微生物菌株生长——对革兰氏阴性菌株为50mg/ml，对革兰氏阳性菌株为100mg/ml。
当应用植物组合时，提取物显示出协同活性。在低两倍的浓度下获得相同的抗菌效果。狭花天竺葵和西洋接骨木的MIC50，单独测试对比组合测试的差异显著(P<0.01)，组合使用效果更佳。
[表7]：所测试的植物提取物(狭花天竺葵和西洋接骨木；西洋接骨木和贯叶连翘；贯叶连翘和狭花天竺葵)在水中对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的最小抑制浓度
Figure BDA0004209578700000252
/>
Figure BDA0004209578700000261
MIC50-50％的生长抑制；D-总生长抑制区域
悬浮法研究的数据显示，测试的水基植物提取物联合应用，表现出明显的抗菌活性(表8)。当植物组合含有AgNP时，杀菌效果比不含银时更快。如表中数据所示，当以106个细胞/ml的密度悬浮时，所研究的革兰氏阴性菌迅速死亡——大肠杆菌(有银)1分钟，无银时最多5分钟，铜绿假单胞菌分别为15-30分钟，而肠杆菌则在30分钟内。
植物提取物的组合也灭活了在106个细胞/ml的悬浮液中研究的革兰氏阳性微生物，但时间更长——产气荚膜梭菌30-60分钟，化脓性链球菌至少1小时，白色念珠菌至少2小时，金黄色葡萄球菌超过2小时。在不含银的水提取物中，所有组别的测试微生物减少的速度比植物组合含有胶体纳米银时慢。
[表8]：在琼脂凝胶扩散法中，植物提取物(狭花天竺葵和西洋接骨木)(西洋接骨木和狭花天竺葵)结合AgNP或在水中，密度为106个细胞/ml的悬浮液，对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果。
Figure BDA0004209578700000271
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
在密度为104个细胞/ml的悬浮液中，待测微生物对组合应用的待测植物提取物表现出更高的敏感性。在所研究方法的作用下，它们的数量减少得更快。当植物组合含有AgNP时，杀菌效果比不含银时更快。表9中列出了这项研究的结果。在这个实验装置中，所测试的革兰氏阴性细菌在更短时间内死亡。在有纳米银的情况下为1分钟，而没有纳米银的情况下为5分钟。
[表9]：狭花天竺葵和西洋接骨木提取物与AgNP和在水中对密度为104个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000281
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
植物提取物的组合也灭活了在104个细胞/ml的悬浮液中研究的革兰氏阳性微生物，但时间更长——产气荚膜梭菌30分钟，其他细菌种类和白色念珠菌超过2小时。从表中的数据可以看出，在不含银的水提取物中，所有组别的测试微生物减少的速度比植物组合含有胶体纳米银时慢。
表10列出了非洲天竺葵(狭花天竺葵)和贯叶连翘提取物在悬浮法中的研究结果。这种植物的提取物显示出明显的抗菌活性，并随着胶体纳米银的加入而增加。在悬浮液中研究的密度为106个细胞/ml的革兰氏阴性细菌在相对较短的时间内死亡-大肠杆菌和肠炎杆菌在有纳米银的情况下最多5分钟，在没有银的情况下最多15分钟，而铜绿假单胞菌-在有银的情况下15分钟，在没有纳米银的情况下约30分钟。狭花天竺葵和贯叶连翘的提取物可以灭活所研究的革兰氏阳性微生物，但时间超过两小时。
[表10]：狭花天竺葵和贯叶连翘提取物与AgNP和在水中对密度为106个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果。
Figure BDA0004209578700000291
Figure BDA0004209578700000301
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
表11显示了黑接骨木(西洋接骨木)和贯叶连翘提取物以及贯叶连翘和狭花天竺葵提取物悬浮法试验的结果。在密度为106个细胞/ml的悬浮液中测试的所有革兰氏阴性细菌在15至30分钟内死亡，但当提取物含有纳米银时，其死亡速度更快。这些提取物也灭活了所研究的革兰氏阳性微生物，但时间更长-超过两小时。在有含银提取物的情况下，与水提取物相比，所有组别的测试微生物减少更快。
[表11]：西洋接骨木和贯叶连翘提取物与30ppm的AgNP在水中对密度为106个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果。
Figure BDA0004209578700000302
Figure BDA0004209578700000311
Ag-含30ppm的AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
[表12]：贯叶连翘和狭花天竺葵提取物与30ppm的AgNP对密度为104个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000312
Ag-含30ppm的AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
在密度为104细胞/ml的悬浮液中(表12)，在提取物的影响下，所有被检查的革兰氏阴性细菌在较短的时间内——15分钟内死亡。与悬浮在106个细胞/ml的浓度时相比，测试的革兰氏阳性微生物数量下降更快，但产气荚膜梭菌的单细胞在60分钟以上仍有活性，而而其他菌种在有提取物的情况下存活超过2小时。在提取物中含有AgNP的情况下，所有微生物菌株减少得更快。
结论：
非洲天竺葵(狭花天竺葵)和黑接骨木(西洋接骨木)，圣约翰草(贯叶连翘)和黑接骨木(西洋接骨木)以及非洲天竺葵(狭花天竺葵)和圣约翰草(贯叶连翘)已在体外显示出显著的抗菌活性。所研究的组合对革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物有协同作用。提取物中加入胶体纳米银以及提取物组合增加抗菌活性。这种提取物组合与30ppm的AgNP结合可能是一种可靠的抗菌剂，特别是对革兰氏阴性菌有明显的效果，这是人类和动物难以治疗的感染的最常见原因之一。在革兰氏阳性微生物中，专性厌氧菌C.perfringens和卵圆形白色念珠菌更易受影响。
参考文献：
-Bauer,A.W.,W.M.Kirby,J.C.Cherris,M.Truck.Antibioticsusceptibilitytestingbyastandardizedsinglediskmethod.TheAm.J.ofClin.Pathol.,1966,45,4,493–496.
-Ericsson,H.M.,J.S.Sherris.Antibioticsensitivitytesting.ActaPath.Microb.Scand.Suppl.,1971,217,3–86.
-NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards:PerformanceStandardsforAntimicrobialDiskSusceptibilityTests.6-thed.ApprovedStandard.NCCLSDocumentM2–A6,Vol.17,No1,1997.
-NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards:PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting:NinthsInformationalSupplement.NCCLSDocumentM100–S9,Vol.18,No1,1999.
示例8：进一步研究非洲天竺葵、黑接骨木和圣约翰草提取物在胶体纳米银中体外抗菌活性的方案：
本研究的目的是评估天竺葵浆果、贯叶连翘和西洋接骨木提取物的体外抗菌活性，这些提取物以胶体纳米银形式和水提取物的形式单独或相互组合，对革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物进行抗菌作用，这些微生物是人类和动物难以治疗的感染的最常见原因。
材料和方法
植物提取物。检测了非洲天竺葵(狭花天竺葵)、圣约翰草(贯叶连翘)和黑接骨木(西洋接骨木)液态提取物的抗菌效果。相同的提取物与浓度为30ppm的胶体银纳米粒子(AgNP)一起进行了检测。
对照组广谱抗生素甲砜霉素(Nikovet-Sofia)被用作阳性对照组，待测微生物对其无抵抗。
微生物测试了7个致病菌株的纯培养物。其中五个是保加利亚国家工业微生物和细胞培养库(NBIMCC)的参照：大肠杆菌ATCC-8739(NBIMCC3397)，肠道沙门氏菌ATCC1304(NBIMCC8691)，金黄色葡萄球菌ATCC-6538(NBIMCC3359)，产气荚膜梭菌ATCC13124(NBIMCC8615)和白色念珠菌ATCC10231(NBIMCC74)。另外两种(铜绿假单胞菌和化脓性链球菌)由索非亚林业大学兽医系大学诊所微生物实验室的狗的炎症性皮肤分泌物中分离出来。
营养介质使用了MuellerHinton琼脂和肉汤(BULBIONCIPD-Sofia)，哥伦比亚血琼脂(BiolabZrt.H-1141,BudapestOv.Utra43)，以及选择性培养基：Endo琼脂(Antisel-SharlauChemieSA，西班牙)用于大肠杆菌和肠道菌，溴棕三甲铵琼脂(BiolabZrt.H-1141,BudapestOv.Utr.)用于铜绿假单胞菌，PerfringensTSC琼脂(MkBTestas,Slovak)以及Zeissler琼脂(BULBIONCIPD-Sofia)用于产气荚膜梭菌，沙氏葡萄糖琼脂加氯霉素(Antisel-SharlauChemieSA,Spain)用于白色念珠菌。
将微生物在35-37℃下培养18-24小时和72小时，对于产气荚膜梭菌，在厌氧条件下培养，对于其他微生物物种在好氧条件下培养。使用罐装带有钯-H2+CO2催化剂的AnaerobPack系统(BULBIONCIPD-Sofia)创造厌氧条件。使用Strip指示剂(BULBIONCIPD-Sofia)来证明是否达到厌氧标准。
通过Bauer等(1966年)的经典琼脂扩散法对物质进行初步研究。并依据国家临床实验室标准委员会(NCCLS)M2-A3(1997，1999)对物质进行初步研究。试验微生物的悬浮液在指数生长期接种，剂量为2106细胞/ml，体积为0.1ml，在直径为9厘米的培养皿中，对产气荚膜梭菌用Zeissler琼脂，对其他微生物用Mueller-Hinton琼脂，pH为7.2-7.4，层厚为4mm。将胶态纳米银和水中的植物提取物以及对照组抗生素以0.1ml的增量施用于琼脂中9mm的孔中。单独和组合的植物提取物分别含有每0.1ml含24ppm的AgNP或水，2mg的狭花天竺葵、2mg的西洋接骨木、0.4mg的贯叶连翘，以及0.1ml中含-30μg甲砜霉素(根据要求)。在室温下培养3-4小时进行扩散后，将培养物在35-37℃下培养18-24小时和72小时。读取结果的方法是用透明的尺子在平板底部的外侧测量抑制区的直径，单位是毫米，包括孔的直径(精确到1mm)。根据Bauer-Kirby系统的三个步骤，AgNP的植物提取物在>12mm的区域有抑制作用，而甲砜霉素在>17mm的区域有抑制作用。待测微生物的敏感性与非抗生素制剂如磺胺类药物一样，即：抗性(R)-直径小于12mm的区域，中度敏感(I)-包括13至16mm的区域，敏感(S)在>17mm的区域。对于甲砜霉素，相应的限值如下：R<12mm,I-13-17mmetS->18mm(NCCLS,1997,1999)。
根据Ericsson和Sherris(1971年)和NCCLS(1999年)的描述，在Zeissler琼脂中对产气荚膜杆菌和Mueller-Hinton琼脂中对其他微生物采用双倍连续稀释法测定最低抑制浓度(MIC)。细菌悬浮液以106细胞/ml的剂量施用。测试的植物提取物包括单独或组合的狭花天竺葵、西洋接骨木和贯叶连翘，在水中或与AgNP一起检测，以及对照的抗生素，以不同的最终浓度(每毫升琼脂增加一倍)给药。在35-37℃下培养18-24小时后，测定出现的菌落数量。以数学方式计算出MIC50，其依据是用相应稀释度的试验化合物在琼脂上抑制的菌落数量与在不含植物提取物或抗生素的对照组上的菌落相比。生长抑制范围(D)的定义为无明显生长的浓度。
测定植物水提物和含胶体纳米银的液态提物的抗菌作用时间。每毫升提取物中分别含有20mg的狭花天竺葵、20mg的西洋接骨木和4mg的贯叶连翘，当加入AgNP时，其最终浓度为24ppm。
-将浓度为105个细胞/ml的每种测试微生物菌株的悬浮液以1ml的量加入到9ml的水中，以及9ml每种植物单独的液态提取物中，达到最终浓度104个细胞/ml。同样也对单独和含有AgNP的提取物进行了分析。
-将浓度为107个细胞/ml的每种测试微生物菌株的悬浮液以1ml的量加入到9ml的组合植物提取物中，以及9ml每种植物单独的提取物中，达到最终浓度106个细胞/ml。同样也对单独和含有AgNP的提取物进行了分析。
-应用了以下对照组：无菌蒸馏水(不含植物提取物和AgNP)，其中每个研究的微生物菌株含量相同，以及植物提取物和30ppm的AgNP，不含微生物。
在Vortex仪器(Heidolph-Labimex，保加利亚)上均质化1分钟后，将微生物暴露于待测植物提取物的不同时间间隔(1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、2小时和24小时)，在37℃下将每个样品在Zeissler琼脂中培养，在好氧和厌氧条件下生长24-48小时，对产气荚膜梭菌进行Zeissler琼脂培养，对其他微生物进行Mueller-Hinton琼脂培养。培养后，报告试验细菌的生长情况，并确定形成的菌落数量。
所有实验都进行三次。
依照经典的Student和Fisher方法对结果进行统计学处理。
结果
在琼脂圆盘扩散法研究中，所有测试植物的提取物与AgNP(抑制区直径在16.0+0.6和24.3+1.3mm之间)以及它们之间的组合对所有测试微生物都有很好的抑制作用(抑制区在18.3+3.3和28.7+3.1mm之间)。表13中列出总结数据。三种植物的提取物与AgNP结合使用的效果要高于单种提取物分别与AgNP使用的效果。单种植物的提取物和它们的组合在抑制区的平均直径(无微生物生长)的差异不显著(P>0.05)。
[表13]：在琼脂凝胶扩散法中，单种植物提取物或组合与AgNP结合使用，对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果。
Figure BDA0004209578700000351
/>
Figure BDA0004209578700000361
所有测试植物的水提取物以及它们的组合(抑制区直径在16.0+0.6和26.0+3.7mm之间)也对所有在圆盘扩散法研究中待测微生物显示出高抑制作用。表14中列出了结果。三种植物的提取物结合使用的效果要高于单种提取物的效果。单种植物的提取物和它们的组合在非生长区的平均直径差异不显著(P>0.05)。
[表14]：在琼脂凝胶扩散法中，单种植物提取物或组合与AgNP结合使用，对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果。
Figure BDA0004209578700000362
/>
Figure BDA0004209578700000371
与革兰氏阳性微生物相比，被测试的革兰氏阴性细菌对所有测试的草药以及这些草药的组合表现出轻微高敏感性(P>0.05)。在这种方法中，大肠杆菌和铜绿假单胞菌的灵敏度最高。白色念珠菌真菌也对所有研究的草药表现出敏感性。所有测试的微生物都对作为阳性对照的甲砜霉素表现出高度敏感性。所有菌株在所研究的抗生素和提取物中抑制区直径的差异具有统计学意义(P<0.05)。
测定的最小抑制浓度(MIC)结果列于表15。它们与琼脂凝胶扩散法的结果相符。所研究的三种草药提取物显示出显著的抗菌活性。狭花天竺葵和西洋接骨木的效果相似。它们对革兰氏阴性细菌的MIC50很低-10mg/ml，而对革兰氏阳性微生物为20mg/ml。较高浓度的贯叶连翘抑制了所研究的微生物菌株生长——对革兰氏阴性菌株为50mg/ml，对革兰氏阳性菌株为100mg/ml。
[表15]：在水中测试的植物提取物对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的最小抑制浓度。
Figure BDA0004209578700000381
MIC50-50％的生长抑制；D-总生长抑制区域
当应用植物组合时，提取物显示出协同活性。在低两倍的浓度下获得相同的抗菌效果。狭花天竺葵和西洋接骨木的MIC50，单独测试对比组合测试的差异显著(P<0.01)，组合使用效果更佳(数据列于前述方案的表2)。
悬浮法研究的数据显示，测试的水基植物提取物联合应用，表现出明显的抗菌活性(表16)。当植物组合含有AgNP时，杀菌效果比不含银时更快。如表中数据所示，当以106个细胞/ml的密度悬浮时，所研究的革兰氏阴性菌迅速死亡——大肠杆菌(有银)1分钟，无银时最多5分钟，铜绿假单胞菌分别为15-30分钟，而肠杆菌则在30分钟内。植物提取物组合也能在密度为106个细胞/ml的悬浮液中灭活所研究的革兰氏阳性微生物，但时间更长——产气荚膜梭菌为1小时，金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、化脓性链球菌和白色念珠菌为超过两小时。在不含银的水提取物中，所有组别的测试微生物减少的速度比植物组合含有胶体纳米银时慢。
[表16]：在琼脂凝胶扩散法中，植物提取物组合与AgNP在水中对密度为106个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000391
Figure BDA0004209578700000401
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
在密度为104个细胞/ml的悬浮液中，受试微生物对联合应用的受试植物提取物表现出更高的敏感性。在所研究方法的作用下，它们的数量减少得更快。当植物组合含有AgNP时，杀菌效果比不含银时更快。这项研究的结果列于表17。在这个实验装置中，所测试的革兰氏阴性细菌在更短时间内死亡。在有纳米银的情况下-1分钟，没有纳米银的情况下-5分钟。植物提取物的组合也灭活了悬浮液中密度为104个细胞/ml的革兰氏阳性微生物，但时间更长--厌氧菌产气荚膜梭菌为30分钟，其他细菌种类和卵圆形白色念珠菌为2小时以上。从表中的数据可以看出，在不含银的水提取物中，所有组别的测试微生物减少的速度比植物组合含有胶体纳米银时慢。
[表17]：茜草提取物与AgNP和在水中的抗菌效果
悬浮液中对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物，密度为104细胞/ml
Figure BDA0004209578700000402
Figure BDA0004209578700000411
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
非洲天竺葵(狭花天竺葵)提取物在悬浮法中的研究结果列于表18和19。这种植物的提取物显示出显著的抗菌活性，随着胶体纳米银的加入，这种活性会增加。在悬浮液中研究的密度为106个细胞/ml的革兰氏阴性细菌在相对较短的时间内死亡--大肠杆菌在有纳米银的情况下最多5分钟，在没有银的情况下最多15分钟；而肠炎杆菌和铜绿假单胞菌--在有银的情况下15分钟，在没有纳米银的情况下30分钟。狭花天竺葵提取物对所研究的革兰氏阳性微生物都有灭活作用，但时间较长--产气荚膜梭菌超过一小时，其他细菌种类和白色念珠菌则超过两小时。
[表18]：茜草提取物与AgNP和水的抗菌效果
在密度为106个细胞/ml的悬浮液中，对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的作用。
Figure BDA0004209578700000412
Figure BDA0004209578700000421
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
[表19]：狭花天竺葵提取物与AgNP和在水中对密度为个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000422
Figure BDA0004209578700000431
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
在狭花天竺葵提取物的影响下，以104个细胞/ml的密度悬浮时(表19)，革兰氏阴性细菌在较短的时间内死亡--大肠杆菌在5分钟内死亡，而肠道菌和铜绿假单胞菌--在纳米银的存在下不到5分钟内死亡，在没有银的情况下最多15分钟。与高密度悬浮液相比，革兰氏阳性微生物的数量下降得更快，但当存在这种提取物时，产气荚膜梭菌的单细胞保持活性超过30分钟，而其他菌种保持活性超过2小时。
表20和21显示了黑接骨木(西洋接骨木)浆果提取物悬浮法的测试结果。在密度为106细胞/ml的悬浮液中测试的所有革兰氏阴性菌都在30分钟内死亡，但当提取物含有纳米银时，速度要快很多。在密度为106个细胞/ml的悬浮液中，西洋接骨木浆果提取物同样使所研究的革兰氏阳性微生物失去活性，但时间较长，产气荚膜梭菌为2小时，其他细菌种类和椭圆白色念珠菌为2小时以上(表20)。以含银的西洋接骨木浆果提取物为例，与水提取物相比，所有组别的测试微生物减少更快。
[表20]：西洋接骨木提取物与30ppm的AgNP和水中对密度为106个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果。
Figure BDA0004209578700000432
Figure BDA0004209578700000441
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
在西洋接骨木浆果提取物的影响下，以104细胞/ml的密度悬浮时(表21)，革兰氏阴性细菌在较短的时间内死亡——达15分钟。革兰氏阳性微生物的数量比以106个细胞/ml的浓度悬浮时减少得更快，但在这种提取物的影响下，产气荚膜梭菌的单个细胞仍能保持活性30分钟以上，其他的菌种则超过2小时。提取物中存在纳米银使微生物细胞减少更快。
[表21]：西洋接骨木提取物与30ppm的AgNP水中对密度为104个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果。
Figure BDA0004209578700000442
Figure BDA0004209578700000451
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
圣约翰草(贯叶连翘)黄色提取物对微生物悬浮液的测试结果见表22和23。这种提取物也显示出显著的抗菌活性，特别是在有胶体纳米银的情况下。所研究的革兰氏阴性细菌在很短的时间内死亡——在有银的情况下15分钟，在没有银的情况下稍慢一些。在密度为106个细胞/ml的悬浮液中，贯叶连翘提取物使所研究的革兰氏阳性微生物失去活性，但时间较长，产气荚膜梭菌为2小时，其他细菌种类和白色念珠菌为2小时以上。提取物中存在纳米银使所有类型的微生物细胞减少都更快。
[表22]：西洋接骨木提取物与30ppm的AgNP和在水中对密度为106个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000452
Figure BDA0004209578700000461
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
[表23]：西洋接骨木提取物与30ppm的AgNP和在水中对密度为104个细胞/ml悬浮液中革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的抗菌效果
Figure BDA0004209578700000462
Figure BDA0004209578700000471
Ag-含AgNP的植物提取物组合；W-在水中的植物提取物组合。
在密度为104细胞/ml的悬浮液中，在贯叶连翘的影响下，所有被检查的革兰氏阴性细菌在较短的时间内——15分钟内死亡。当存在贯叶连翘提取物时，与悬浮在106个细胞/ml的浓度时相比，测试的革兰氏阳性微生物数量下降更快，但化脓性链球菌和产气荚膜梭菌的单细胞60分钟以上仍有活性，而其他菌种保持活性超过2小时。在提取物中含有AgNP的情况下，所有微生物菌株减少得更快。
结论：
待测狭花天竺葵、贯叶连翘和西洋接骨木浆果提取物在试管内单独和组合使用时都显示出明显的抗微生物活性。所研究的三种提取物组合对革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物有协同作用。提取物中加入胶体纳米银以及提取物组合增加抗菌活性。这种提取物组合与30ppm的AgNP结合可能是一种可靠的抗菌剂，特别是对革兰氏阴性菌有明显的效果，这是人类和动物难以治疗的感染的最常见原因之一。在革兰氏阳性微生物中，专性厌氧菌C.perfringens和卵圆形白色念珠菌更易受影响。

Claims (15)

1.作为药物使用的组合成分，其中包括：
-胶体形式的银；
-西洋接骨木提取物；
-报春花和花萼提取物和/或贯叶连翘提取物；
-天竺葵提取物。
2.根据前述权利要求作为药物使用的组合成分，所述胶体形式的银颗粒特征为大小在0.1至30纳米之间。
3.根据任一前述权利要求使用的组合成分，包括：
-每升组合成分中胶体形式的银含量在20mg至250mg之间；
-组合成分中西洋接骨木提取物的重量百分比在0.3至5％之间；
-组合成分中报春花和花萼提取物的重量百分比在1至9％之间，和/或组合成分中贯叶连翘提取物的重量百分比在0.5至11％之间；
-组合成分中天竺葵提取物的重量百分比在1至6％之间。
4.根据权利要求1和2使用的组合成分，此外还包括：
-离子形式的银；
5.根据前述权利要求作为药物使用的组合成分，包括：
-每升组合成分中的银总含量在20mg至250mg之间，具体分为
i.银总重量中胶体形式银的含量在70-99.99％之间；
ii.银总重量中离子形式银的含量在0.01-30％之间。
-组合成分中西洋接骨木提取物的重量百分比在0.3至5％之间；
-组合成分中报春花和花萼提取物的重量百分比在1至9％
之间，和/或组合成分中贯叶连翘提取物的重量百分比在0.5至11％之间；
-组合成分中天竺葵提取物的重量百分比在1至6％之间。
6.根据任一前述权利要求使用的组合成分，还包括：
-紫锥菊提取物，和/或
-蜂胶和/或
-青蒿提取物和/或
-植物蒜提取物。
7.根据前述权利要求使用的组合成分，包括：
-组合成分中紫锥菊提取物的重量百分比在0.01至8％之间，和/或
-组合成分中蜂胶的重量百分比在0.01至7％之间，和/或
-组合成分中青蒿提取物的重量百分比在0.5至3％之间，和/或
-组合成分中植物蒜提取物的重量百分比在0.01至10％之间。
8.根据任一前述权利要求使用的组合成分，特征为其形式适合于口服、静脉注射、皮下注射、鼻腔、眼科、耳道、直肠、阴道、呼吸道或皮肤施用。
9.根据前述权利要求使用的组合成分，特征为适合于以软膏、乳剂、贴片或凝胶形式适用于皮肤。
10.根据任一前述权利要求使用的组合成分，用于抗病毒、抗细菌和抗真菌预防和/或治疗。
11.根据权利要求9使用的组合成分，通过乳膏形式应用于皮肤，用于抗真菌预防和/或治疗。
12.根据权利要求9使用的组合成分，通过乳膏形式应用于皮肤，用于抗细菌预防和/或治疗。
13.根据权利要求9使用的组合成分，通过乳膏形式应用于皮肤，用于抗真菌和抗细菌预防和/或治疗。
14.根据权利要求1-9中任一项使用的组合成分，用于作为抗生素使用。
15.根据前述权利要求使用的组合成分，用于抗生素耐药患者。
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