CN108504130A - 一种花菁类荧光染料及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花菁类荧光染料，其结构式为Ⅰ和Ⅱ中的一种：本发明提供的这种花菁类荧光染料的激发波长和荧光发射波长均达到了近红外区，且斯托克斯位移均大于60nm；其在活体成像的应用中生物体环境的背景荧光和染料的自猝灭及自吸收效应显著降低，提高了信噪比，从而提高了灵敏度；本发明中荧光染料的合成方法简单，原料易获取，产率高；将本发明的荧光染料在细胞成像和小动物活体成像效果好，光稳定性高。

Description

一种花菁类荧光染料及其合成方法
技术领域
本发明属于有机荧光染料与应用技术领域，具体涉及一种花菁类荧光染料及其合成方法。
背景技术
荧光成像技术是目前发展极为迅速的一种光学成像技术，在化学、生物学、环境科学以及临床医学等多个领域都具有广泛的应用前景。目前，荧光成像技术受制于大部分荧光分子的发射波长位于可见光区，极易受到生物体内的内源荧光干扰，且也因为激发与发射波长较短而难以深入组织，目前具有近红外区发射波长的荧光染料较少，因此，开发具有近红外区激发与发射的荧光染料对于荧光成像技术的发展是十分有必要的。
具有大斯托克斯位移的荧光染料，其激发光谱和荧光发射光谱的分离程度高，在荧光成像时能避免激发光源的干扰，提高了信噪比，从而能够实现高灵敏度的生物成像。
花菁类和半花菁类染料是一种性能比较优良的染料，已在分子探针、荧光成像、生物传感等领域广泛应用。目前文献报道的大部分花菁类和半花菁类的荧光染料的吸收波长和发射波长较短，斯托克斯位移小，荧光自猝灭效应强，难以实现细胞内或生物体内的高灵敏度荧光分析和成像。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有大斯托克斯位移和近红外发射波长的花菁类荧光染料及其合成方法。
本发明这种花菁类荧光染料，其结构式为Ⅰ和Ⅱ中的一种：
其中：x为O,S,NR2,CMe2；n的值为1，2，3；R1为H、C1-8烃基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基；R2为H、C1-20烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基。
所述的花菁类荧光染料的中间体5(6,11-二取代-4-甲基-2-苯基-6,6a,7,8,9,10,10a,11-八氢吡喃酮[2,3-b]吩嗪-1-鎓无机酸盐)的合成路线如下：
包括以下步骤：
将4-甲氧基邻苯二胺和1,2-环己二酮溶解于乙醇中，60℃反应2～4h后浓缩并用柱色谱分离，得到淡黄色固体化合物3(7-甲氧基-1,2,3,4-四氢吩嗪)；将化合物3与硼氢化钠溶于甲苯中，在冰浴环境下滴加有机酸，滴加完毕后，在冰浴中搅拌0.5～2h，随后在110℃，继续反应6～24h；反应完成后，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，有机相浓缩并用柱色谱分离，得到棕黄色粘稠状化合物4(5,10-二取代-7-甲氧基-1,2,3,4,4a,5,10,10a-八氢吩嗪)；将化合物4与1-苯基-1,3-丁二酮溶于甲基磺酸中，在90～110℃下搅拌反应4～8h，反应结束后，将反应液倒入冰水中，边搅拌边加入无机酸以析出固体，过滤后得到的固体经柱色谱进一步提纯得到红黑色固体中间体5(6,11-二取代-4-甲基-2-苯基-6,6a,7,8,9,10,10a,11-八氢吡喃酮[2,3-b]吩嗪-1-鎓无机酸盐)。
其中：所有化合物的结构式如合成路线中所示；4-甲氧基邻苯二胺和1,2-环己二酮摩尔比为1:(0.8～1.5)；4-甲氧基邻苯二胺与乙醇的摩尔体积比为3:(12～25)mol/L；化合物3和硼氢化钠的摩尔比为1:(5～12)；化合物3和有机酸的摩尔体积比5:(8～12)mol/L，化合物3与甲苯的摩尔体积比为1:(25～30)mol/L；有机酸具有R2-COOH结构，其中R2为H、C1-20烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基中的一种；化合物4和1-苯基-1,3-丁二酮摩尔比1:(1～2)；化合物4和甲基磺酸的摩尔体积比为1:(10～25)mol/L；所述的无机酸为硫酸、甲基磺酸、高氯酸、对甲苯磺酸中的一种；所述的柱色谱所用固定相为100-200目的硅胶；化合物3与化合物4的分离提纯所用柱色谱的流动相为石油醚-二氯甲烷混合溶液，体积比为(1～30):1；化合物5的分离提纯所用柱色谱的流动相为二氯甲烷-乙醇混合溶液，体积比为(50～200):1。
所述的花菁类荧光染料的中间体8((1E,2E)-4-((E)-1-取代基吲哚啉衍生物-2-亚甲基)-N-苯基-2-丙烯基-1-亚胺)和中间体9((E)-2-氯-3-(2-((E)-1-甲基吲哚啉衍生物-2-亚甲基)亚乙基)环己烯-1-烯-1-甲醛)的合成路线如下：
包括以下步骤：
(1)化合物7的合成：
取化合物6(2-甲基-3H-吲哚衍生物)和有机碘试剂溶于无水乙腈中，回流搅拌反应3～6h；反应完毕后冷却，析出的粉红色固体经抽滤、洗涤和干燥后得到化合物7(1-取代-2-甲基-3H-吲哚衍生物碘盐)；
(2)中间体8的合成：
将步骤(1)中的化合物7与缩合剂丙二醛二苯胺盐酸盐溶于正丁醇-甲苯混合溶液中，110℃下回流反应2～4h；反应完成后，溶液浓缩后经柱色谱分离得到中间体8((1E,2E)-4-((E)-1-取代基吲哚啉衍生物-2-亚甲基)-N-苯基-2-丙烯基-1-亚胺)；
(3)中间体9的合成：
将步骤(1)中的化合物7与缩合剂2-氯-1-甲酰-3-羟基亚甲基环己烯溶于正丁醇-甲苯混合溶液中，110℃下回流反应2～4h；反应完成后，溶液浓缩后经柱色谱分离得到中间体9((E)-2-氯-3-(2-((E)-1-甲基吲哚啉衍生物-2-亚甲基)亚乙基)环己烯-1-烯-1-甲醛)。
其中，所有化合物的结构式如合成路线中所示；所述步骤(1)中，有机碘试剂具有I-R1的结构特征，R1为H、C1-8烃基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基中的一种，化合物6与有机碘试剂的摩尔比为1:(1～2)，化合物6与乙腈的摩尔体积比为1:(1～2)mol/L；步骤(2)和步骤(3)中，化合物7与缩合剂的摩尔比为1:(1.2～2)；正丁醇-甲苯混合溶液的体积比为(0.3～0.5):(0.7～0.5)；化合物7与正丁醇-甲苯混合溶液的摩尔体积比为1:(4～10)mol/L；所述的柱色谱所用固定相为100-200目的硅胶，流动相为二氯甲烷-乙醇混合溶液，体积比为(25～200):1。
所述的n＝1的Ⅰ式花菁类荧光染料的合成路线：
包括以下步骤：将化合物10((E)-2-(1-取代-3-取代基吲哚啉-2-亚甲基)乙醛)和无水乙酸钠溶解于乙酸酐中，边搅拌边滴加中间体5，25～40℃下反应0.75～1h，反应结束后，加入饱和碳酸钠溶液中和并用二氯甲烷萃取，有机相浓缩后经柱色谱分离得到黑色固体，即为n＝1的Ⅰ式花菁类荧光染料；
所述的化合物10、乙酸钠和中间体5的摩尔比为1:(5～10):(0.75～1.5)；化合物10与乙酸酐的摩尔体积比为1:(30～40)mol/L；所述的无机酸为硫酸、甲基磺酸、高氯酸、对甲苯磺酸中的一种；所述柱色谱所用固定相为硅胶；荧光染料的分离提纯所用柱色谱流动相为二氯甲烷-乙醇混合液，二氯甲烷与乙醇的体积比为(20～200):1；所有化合物的结构式如合成路线中所示。
所述的n＝2的Ⅰ式花菁类荧光染料的合成路线如下：
包括以下步骤：
将无水乙酸钠与中间体8溶于乙酸酐中，边搅拌边滴加中间体5，25～40℃下反应0.75～1h，反应结束后，加入饱和碳酸钠溶液中和并用二氯甲烷萃取，有机相浓缩后经柱色谱分离得到黑色固体，即为n＝2的Ⅰ式花菁类荧光染料；
所述的中间体8、乙酸钠和中间体5的摩尔比为1:(5～10):(0.75～1.5)；中间体8与乙酸酐的摩尔体积比为1:(3～5)mol/L；所述的无机酸为硫酸、甲基磺酸、高氯酸、对甲苯磺酸中的一种；所述柱色谱所用固定相为硅胶；荧光染料的分离提纯所用柱色谱流动相为二氯甲烷-乙醇混合液，二氯甲烷与乙醇的体积比为(20～200):1；所有化合物的结构式如合成路线中所示。
所述的Ⅱ式花菁类荧光染料的合成路线如下：
包括以下步骤：
将无水乙酸钠与中间体9溶于乙酸酐中，边搅拌边滴加中间体5，25～40℃下反应0.75～1h，反应结束后，加入饱和碳酸钠溶液中和并用二氯甲烷萃取，有机相浓缩后经柱色谱分离得到黑色固体，即为Ⅱ式花菁类荧光染料。
所述的中间体9、乙酸钠和中间体5的摩尔比为1:(5～10):(0.75～1.5)；中间体9与乙酸酐的摩尔体积比为1:(3～5)mol/L；所述的无机酸为硫酸、甲基磺酸、高氯酸、对甲苯磺酸中的一种；所述柱色谱所用固定相为硅胶；荧光染料分离提纯所用柱色谱流动相为二氯甲烷-乙醇混合溶液，体积比为(20～200):1；所有化合物的结构式如合成路线中所示。
所述花菁类荧光染料在活体成像中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的这种花菁类荧光染料的激发波长和荧光发射波长均达到了近红外区，且斯托克斯位移均大于60nm；其在活体成像的应用中生物体环境的背景荧光和染料的自猝灭及自吸收效应显著降低，提高了信噪比，从而提高了灵敏度；本发明中荧光染料的合成方法简单，原料易获取，产率高；将本发明的荧光染料在细胞成像和小动物活体成像效果好，光稳定性高。
说明书附图
图1实施例1所制备的n＝1的I式花菁类近红外荧光染料的高分辨质谱图；
图2实施例2所制备的n＝2的I式花菁类近红外荧光染料的高分辨质谱图；
图3实施例3所制备的II式花菁类近红外荧光染料的质谱图；
图4DQF-692在溶液中的紫外可见吸收光谱与荧光发射光谱；
图5DQF-692在细胞中的共聚焦成像图及其与Cy3的光稳定性的比较；a)DQF-692细胞染色图；b)Cy3细胞染色图；c)DQF-692和Cy3荧光信号强度图。
具体实施方式
实施例1：n＝1的I式花菁类荧光染料(DQF-692)的合成
(1)化合物4(5,10-二乙基-7-甲氧基-1,2,3,4,4a,5,10,10a-八氢吩嗪)的合成
称取4-甲氧基邻苯二胺(1.3g，12.0mmol)和1,2-环己二酮(1.1g，10.0mmol)并将二者溶于60mL乙醇中，60℃下搅拌2h后经硅胶柱色谱分离提纯(洗脱剂为石油醚和二氯甲烷，体积比为1:1)，得到淡黄色固体化合物3(7-甲氧基-1,2,3,4-四氢吩嗪)；取化合物3(0.9g，5.0mmol)溶解在150mL无水甲苯中，在冰浴环境下加入硼氢化钠(1.9g，50.0mmol)，搅拌15min，后将10mL冰乙酸缓慢滴加1h至反应液中，待冰乙酸滴完后，维持冰浴反应30min，随后将反应液加热至110℃，回流反应6h，待反应完毕后，缓慢加入200mL水淬灭多余的硼氢化钠，有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤并用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱色谱分离提纯(洗脱剂为石油醚和二氯甲烷，体积比为1:1)，得到棕黄色粘稠液体化合物4(5,10-二乙基-7-甲氧基-1,2,3,4,4a,5,10,10a-八氢吩嗪)。
(2)中间体5(6,11-二乙基-4-甲基-2-苯基-6,6a,7,8,9,10,10a,11-八氢吡喃酮[2,3-b]吩嗪-1-鎓高氯酸盐)的合成
化合物4(5,10-二乙基-7-甲氧基-1,2,3,4,4a,5,10,10a-八氢吩嗪)(54.8mg，0.2mmol)与1-苯基-1,3-丁二酮(48.6mg，0.3mmol)溶于4mL甲基磺酸，在90℃下搅拌4h，反应停止后，将反应液倒入碎冰中，边搅拌边缓慢加入1mL高氯酸以析出固体，抽滤并用20mL石油醚洗涤3次，固体经硅胶柱色谱分离提纯(洗脱剂：二氯甲烷:乙醇＝200:1，v/v)，得到黑红色固体中间体5(6,11-二乙基-4-甲基-2-苯基-6,6a,7,8,9,10,10a,11-八氢吡喃酮[2,3-b]吩嗪-1-鎓高氯酸盐)。
(3)荧光染料DQF-692的合成
将化合物10((E)-2-(1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚甲基)乙醛)(45.0mg，0.22mmol)和无水乙酸钠(135.3mg，1.65mmol)溶于8mL乙酸酐中，边搅拌边滴加中间体5(97.0mg，0.2mmol)，然后在40℃下反应1h，反应完毕后向反应液中缓慢加入30mL饱和碳酸钠溶液中和并用40mL二氯甲烷萃取3次，有机相浓缩后经硅胶柱色谱分离提纯(二氯甲烷:乙醇＝75:1，v/v)得到黑色固体DQF-692，将其进行质谱(图1)和核磁表征。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(t,J＝13.2Hz,1H),7.99(d,J＝7.1Hz,2H),7.57(t,J＝8.0Hz,3H),7.37(s,1H),7.33(t,J＝7.6Hz,2H),7.22–7.10(m,3H),7.01(d,J＝7.5Hz,1H),6.62(d,J＝6.7Hz,2H),3.99(dd,J＝15.1,7.0Hz,1H),3.64(s,4H),3.54(s,1H),3.45(dd,J＝26.1,11.0Hz,3H),2.06(d,J＝23.4Hz,1H),1.79(s,2H),1.74(s,6H),1.66(s,3H),1.50(s,2H),1.32–1.22(m,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.3,155.6,151.4,146.3,143.4,142.9,142.4,139.2,134.9,130.8,130.3,128.3,127.5,125.0,122.7,120.9,113.0,112.8,108.5,102.0,100.4,94.6,51.1,47.2,42.7,40.0,30.6,27.8,26.7,26.3,25.9,21.6,20.1,13.1,10.8,8.5.HRMS(ESI):[C39H44N3O]+,found 570.3481,calculated 570.3479.
实施例2：n＝2的I式花菁类荧光染料(DQF-780)的合成
(1)中间体8((1E,2E)-4-((E)-1,3,3三甲基吲哚啉-2-亚甲基)-N-苯基-2-丙烯基-1-亚胺)的合成
取化合物6(2,3,3-三甲基-3H-吲哚)(1.6g,10mmol)和碘甲烷(2.8g,20mmol)溶于20mL无水乙腈中，回流搅拌反应6h；反应完毕后冷却，析出的粉红色固体经抽滤、洗涤和干燥后得到化合物7(1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘盐)；将化合物7(1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘盐)(2.1g,7mmol)与缩合剂丙二醛二苯胺盐酸盐(2.6g,10mmol)溶于30mL正丁醇-甲苯混合溶液中，110℃下回流反应4h；反应完成后，溶液浓缩后经柱色谱分离(二氯甲烷:乙醇＝100:1，v/v)得到中间体8((1E,2E)-4-((E)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚甲基)-N-苯基-2-丙烯基-1-亚胺)。
(2)荧光染料DQF-780的合成
将无水乙酸钠(2.0g,25mmol)与中间体8((1E,2E)-4-((E)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚甲基)-N-苯基-2-丙烯基-1-亚胺)(1.5g,5mmol)溶于20mL乙酸酐中，边搅拌边滴加实施例1中所制备的中间体5(6,11-二乙基-4-甲基-2-苯基-6,6a,7,8,9,10,10a,11-八氢吡喃酮[2,3-b]吩嗪-1-鎓高氯酸盐)(2.4g,5mmol)，常温下反应1h，反应结束后，加入40mL饱和碳酸钠溶液中和并用100mL二氯甲烷萃取三次，有机相浓缩后经柱色谱分离(二氯甲烷:乙醇＝150:1，v/v)得到黑色固体，即为n＝2的Ⅰ式花菁类荧光染料，将其进行质谱(图2)和核磁表征。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(d,J＝6.0Hz,2H),7.90(s,1H),7.75(s,1H),7.56(d,J＝6.8Hz,3H),7.50(d,J＝6.5Hz,1H),7.38(s,1H),7.07(s,1H),6.96–6.83(m,2H),6.81(s,1H),6.67(s,1H),6.62(s,1H),5.89(s,1H),3.81–3.54(m,4H),3.45(s,5H),2.03(1H),1.81(2H),1.70–1.66(m,9H),1.52(2H),1.32–1.25(6H).HRMS(ESI):calcd for[C41H46N3O]+596.3635,found 596.3480.
实施例3：II式花菁染料(DQF-Cy7)的合成
(1)中间体9((E)-2-氯-3-(2-((E)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚甲基)亚乙基)环己烯-1-烯-1-甲醛)的合成
将实施例2中制备的化合物7(1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘盐)(3.0g,10mmol)与缩合剂2-氯-1-甲酰-3-羟基亚甲基环己烯(3.4g,20mmol)溶于30mL正丁醇-甲苯混合溶液中，110℃下回流反应2h；反应完成后，溶液浓缩后经柱色谱分离(二氯甲烷:乙醇＝100:1，v/v)得到中间体9((E)-2-氯-3-(2-((E)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚甲基)亚乙基)环己烯-1-烯-1-甲醛)。
(2)荧光染料DQF-Cy7的合成
将无水乙酸钠(2.0g,25mmol)与中间体9((E)-2-氯-3-(2-((E)-1,3,3-三甲基吲哚啉-2-亚甲基)亚乙基)环己烯-1-烯-1-甲醛)(1.6g,5mmol)溶于20mL乙酸酐中，边搅拌边滴加实施例1中所制备的中间体5(6,11-二乙基-4-甲基-2-苯基-6,6a,7,8,9,10,10a,11-八氢吡喃酮[2,3-b]吩嗪-1-鎓高氯酸盐)(3.6g,7.5mmol)，常温下反应1h，反应结束后，加入40mL饱和碳酸钠溶液中和并用100mL二氯甲烷萃取，有机相浓缩后经柱色谱分离(二氯甲烷:乙醇＝150:1，v/v)得到黑色固体，即为n＝2的Ⅰ式花菁类荧光染料DQF-Cy7，将其进行质谱表征(图3)。
实施例4：实施例1中制备的n＝1的I式花菁染料的光谱表征
实施例1中制备的DQF-692的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱(紫外可见吸收光谱的测定仪器为岛津UV-1800紫外可见分光光度计，荧光发射光谱的测定仪器为日立F-4600荧光光度计)。
将实施例1中制备的荧光染料DQF-692溶于无水乙醇中，配制成浓度为4μM的溶液，测定其紫外可见吸收光谱，得到该染料最大吸收峰值位于692nm处；以最大吸收波长作为激发波长，测定荧光发射光谱，得到该染料的荧光发射峰值位于752nm处(图2)，其斯托克斯位移为60nm。
实施例5：实施例1中制备的n＝1的I式花菁染料的细胞染色实验
将DQF-692溶于PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4)中配制浓度为成5μM的溶液，与HepG2细胞共孵育15min后进行共聚焦荧光成像，并与Cy3染料的光稳定性进行对比，其结果如图5所示，DQF-692的荧光成像效果(图5a)与Cy3染料(图5b)相比，DQF-692具有更好的细胞成像效果，并且光稳定性显著优于Cy3染料(图5c)。

Claims (10)

1.一种花菁类荧光染料，其结构式为Ⅰ和Ⅱ中的一种：
其中：x为O,S,NR2,CMe2；n的值为1，2，3；R1为H、C1-8烃基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基；R2为H、C1-20烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基。
2.根据权利要求1所述的花菁类荧光染料的中间体5的合成路线如下：
具体包括以下步骤：
将4-甲氧基邻苯二胺和1,2-环己二酮溶解于乙醇中，60℃反应2～4h后浓缩并用柱色谱分离，得到淡黄色固体化合物3，化合物3为7-甲氧基-1,2,3,4-四氢吩嗪；将化合物3与硼氢化钠溶于甲苯中，在冰浴环境下滴加有机酸，滴加完毕后，在冰浴中搅拌0.5～1h，随后在110℃下，继续反应6～24h；反应完成后，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，有机相浓缩并用柱色谱分离，得到棕黄色粘稠状化合物4，化合物4为5,10-二取代-7-甲氧基-1,2,3,4,4a,5,10,10a-八氢吩嗪；将化合物4与1-苯基-1,3-丁二酮溶于甲基磺酸中，在90～110℃下搅拌反应4～8h，反应结束后，将反应液倒入冰水中，边搅拌边加入无机酸以析出固体，过滤后得到的固体经柱色谱进一步提纯得到红黑色固体中间体5，中间体5为6,11-二取代-4-甲基-2-苯基-6,6a,7,8,9,10,10a,11-八氢吡喃酮[2,3-b]吩嗪-1-鎓无机酸盐；
其中：4-甲氧基邻苯二胺和1,2-环己二酮摩尔比为1:(0.8～1.5)；4-甲氧基邻苯二胺与乙醇的摩尔体积比为3:(12～25)mol/L；化合物3和硼氢化钠的摩尔比为1:(5～12)；化合物3和有机酸的摩尔体积比5:(8～12)mol/L，化合物3与甲苯的摩尔体积比为1:(25～30)mol/L；有机酸具有R2-COOH结构，其中R2为H、C1-20烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基中的一种；化合物4和1-苯基-1,3-丁二酮摩尔比1:(1～2)；化合物4和甲基磺酸的摩尔体积比为1:(10～25)mol/L；所述的无机酸为硫酸、甲基磺酸、高氯酸、对甲苯磺酸中的一种；所述的柱色谱所用固定相为100-200目的硅胶；化合物3与化合物4的分离提纯所用柱色谱的流动相为石油醚-二氯甲烷混合溶液，体积比为(1～30):1；化合物5的分离提纯所用柱色谱的流动相为二氯甲烷-乙醇混合溶液，体积比为(50～200):1。
3.根据权利要求1所述的花菁类荧光染料的中间体8和中间体9的合成路线如下：
包括以下步骤：
(1)化合物7的合成：
取化合物6和有机碘试剂溶于无水乙腈中，回流搅拌反应3～6h；反应完毕后冷却,析出的粉红色固体经抽滤、洗涤和干燥后得到化合物7，化合物7为1-取代-2-甲基-3H-吲哚衍生物碘盐；
(2)中间体8的合成：
将步骤(1)中的化合物7与缩合剂丙二醛二苯胺盐酸盐溶于正丁醇-甲苯混合溶液中，110℃下回流反应2～4h；反应完成后，溶液浓缩后经柱色谱分离得到中间体8，中间体8为(1E,2E)-4-((E)-1-取代基吲哚啉衍生物-2-亚甲基)-N-苯基-2-丙烯基-1-亚胺；
(3)中间体9的合成：
将步骤(1)中的化合物7与缩合剂2-氯-1-甲酰-3-羟基亚甲基环己烯溶于正丁醇-甲苯混合溶液中，110℃下回流反应2～4h；反应完成后，溶液浓缩后经柱色谱分离得到中间体9，中间体9为(E)-2-氯-3-(2-((E)-1-甲基吲哚啉衍生物-2-亚甲基)亚乙基)环己烯-1-烯-1-甲醛。
其中，所述步骤(1)中，有机碘试剂具有I-R1的结构特征，R1为H、C1-8烃基、取代烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基中的一种，化合物6与有机碘试剂的摩尔比为1:(1～2)，化合物6与乙腈的摩尔体积比为1:(1～2)mol/L；步骤(2)和步骤(3)中，化合物7与缩合剂的摩尔比为1:(1.2～2)；正丁醇-甲苯混合溶液的体积比为(0.3～0.5):(0.7～0.5)；化合物7与正丁醇-甲苯混合溶液的摩尔体积比为1:(4～10)mol/L；所述的柱色谱所用固定相为100-200目的硅胶，流动相为二氯甲烷-乙醇混合溶液，体积比为(25～200):1。
4.根据权利要求1或2所述的n＝1的Ⅰ式花菁类荧光染料的合成路线如下：
包括以下步骤：将化合物10和无水乙酸钠溶解于乙酸酐中，边搅拌边滴加中间体5，25～40℃下反应0.75～1h，反应结束后，加入饱和碳酸钠溶液中和并用二氯甲烷萃取，有机相浓缩后经柱色谱分离得到黑色固体，即为n＝1的Ⅰ式花菁类荧光染料；
5.根据权利要求4所述的n＝1的Ⅰ式花菁类荧光染料的合成方法，其特征在于，所述的化合物10为(E)-2-(1-取代-3-取代基吲哚啉-2-亚甲基)乙醛，化合物10、乙酸钠和中间体5的摩尔比为1:(5～10):(0.75～1.5)；化合物10与乙酸酐的摩尔体积比为1:(30～40)mol/L；所述的无机酸为硫酸、甲基磺酸、高氯酸、对甲苯磺酸中的一种；所述柱色谱所用固定相为硅胶；荧光染料的分离提纯所用柱色谱流动相为二氯甲烷-乙醇混合液，二氯甲烷与乙醇的体积比为(20～200):1。
6.根据权利要求1或3所述的n＝2的Ⅰ式花菁类荧光染料的合成路线如下：
包括以下步骤：
将无水乙酸钠与中间体8溶于乙酸酐中，边搅拌边滴加中间体5，25～40℃下反应0.75～1h，反应结束后，加入饱和碳酸钠溶液中和并用二氯甲烷萃取，有机相浓缩后经柱色谱分离得到黑色固体，即为n＝2的Ⅰ式花菁类荧光染料。
7.根据权利要求6所述的n＝2的Ⅰ式花菁类荧光染料的合成方法，其特征在于，所述的中间体8、乙酸钠和中间体5的摩尔比为1:(5～10):(0.75～1.5)；中间体8与乙酸酐的摩尔体积比为1:(3～5)mol/L；所述的无机酸为硫酸、甲基磺酸、高氯酸、对甲苯磺酸中的一种；所述柱色谱所用固定相为硅胶；荧光染料的分离提纯所用柱色谱流动相为二氯甲烷-乙醇混合液，二氯甲烷与乙醇的体积比为(20～200):1。
8.根据权利要求1或3所述的Ⅱ式花菁类荧光染料的合成路线如下：
包括以下步骤：
将无水乙酸钠与中间体9溶于乙酸酐中，边搅拌边滴加中间体5，25～40℃下反应0.75～1h，反应结束后，加入饱和碳酸钠溶液中和并用二氯甲烷萃取，有机相浓缩后经柱色谱分离得到黑色固体，即为Ⅱ式花菁类荧光染料。
9.根据权利要求8所述的所述的Ⅱ式花菁类荧光染料的合成方法，其特征在于，所述中间体9、乙酸钠和中间体5的摩尔比为1:(5～10):(0.75～1.5)；中间体9与乙酸酐的摩尔体积比为1:(3～5)mol/L；所述的无机酸为硫酸、甲基磺酸、高氯酸、对甲苯磺酸中的一种；所述柱色谱所用固定相为硅胶；荧光染料分离提纯所用柱色谱流动相为二氯甲烷-乙醇混合溶液，体积比为(20～200):1。
10.根据权利要求1所述花菁类荧光染料在活体成像中的应用。
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