CN108498655B - 一种用于清热解毒的蓝金口服液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于清热解毒的蓝金口服液及其制备方法，蓝金口服液是由以下药材制成：板蓝根170‑190g、金银花140‑160g、荆芥90‑110g、连翘110‑130g、柴胡90‑110g、射干110‑130g、甘草25‑35g。其功能为清热解毒，疏风透表。主治外感温邪疫毒，邪在卫表。蓝金口服液有较好的体内外抗菌抗病毒作用和显著的抗炎、镇痛、解热、发汗作用。

Description

一种用于清热解毒的蓝金口服液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于清热解毒的蓝金口服液及其制备方法，属于清热解毒的中药制剂。
背景技术
上呼吸道感染(Upper Respiratory Tract Infection,URTI)俗称普通感冒，临床一般统称为上感，是指自鼻腔至喉部之间的急性炎症的总称，是最常见的呼吸系统疾病。本病归属于中医外感病范畴，按证候可分为两类六证候，两类即实证和虚体感冒两大类，六大主要证候则是风寒证、风热证、风燥证、暑湿证、气虚证、气阴两虚证，其中前四种证属于实证感冒，而后两种证型划归于虚体感冒。上感90％左右由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。该病四季、任何年龄均可发病，主要通过含有病毒的飞沫、雾滴或经污染的用具进行传播。我国感冒的年发病率为80％，其中75％的人1年至少患1次感冒，中国的年均患感冒的人数高达10亿。一般人群中，成人每年可有1-3次感冒，小儿则发病次数更多，尚未发现一个人终生不感冒患者。我国多次的死因调查结果表明，呼吸系统疾病在城市的死亡病因中占第4位，在农村则居第1位，由此可见，呼吸系统疾病对人类健康的危害依然严重，其防治任务依然艰巨,因此防治上呼吸道感染，降低发病率及病死率都有着重要的现实意义。
目前西药治疗急性上呼吸道感染缺乏特异性，针对病毒性的上呼吸道感染尚无特效药，而针对上呼吸道感染继发的细菌性感染，通常以有相应的抗菌素治疗及对症处理。但抗生素及抗病毒药物在应用时均存在一定的副作用，且药物滥用使细菌和病毒株的耐药性问题日益严重。因此，快速而有效的中医辨证用药治疗成为热点。
发明内容
本发明的目的是，提供一种具有清热解毒，疏风透表功能，主治外感温邪疫毒，邪在卫表的纯中药制剂及其制备方法，该中药制剂的疗效确切，药物储存稳定性好。
本发明的技术方案是，提供一种用于清热解毒的蓝金口服液，蓝金口服液是由以下药材制成：板蓝根170-190g、金银花140-160g、荆芥90-110g、连翘110-130g、柴胡90-110g、射干110-130g、甘草25-35g。
优选地，蓝金口服液是由以下药材制成：板蓝根180g、金银花150g、荆芥100g、连翘120g、柴胡100g、射干120g、甘草30g。
优选地，蓝金口服液中腺苷(以C10H13N5O4计)含量不少于0.40mg/10mL；绿原酸(以C16H18O9计)含量不少于8.00mg/10mL。
本发明还提供所述蓝金口服液的制备方法，取荆芥、金银花、连翘、柴胡，加水浸泡后，蒸馏提取，收集芳香水，并将药液滤过，得到第一药渣和第一提取液，药渣加入板蓝根、射干、甘草，加水煎煮，滤过，得到第二药渣和第二提取液，第一提取液和第二提取液合并，浓缩得到相对密度1.05-1.10的浓缩液，浓缩液与芳香水合并，得到蓝金口服液。
优选地，第二药渣加水煎煮，得到第三提取液，将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并再浓缩。
优选地，在蓝金口服液中加入甜味剂和防腐剂，甜味剂为蔗糖和/或甜菊苷，防腐剂为苯甲酸钠。
优选地，其特征在于：将浓缩液在5-10℃下静置10-30小时后离心，得到的第一上清液；第一上清液中加入浓度为1-2％(W/V)的壳聚糖溶液70-90g，搅拌均匀，调节pH值至4.0-6.0，在5-10℃下静置10-30小时，离心，得到第二上清液；将第二上清液浓缩至密度为1.05-1.10后，再加入乙醇，使乙醇的体积百分含量达到28-35％，搅拌均匀，在5-10℃下静置35-60小时，离心，得到第三上清液，第三上清液浓缩除去乙醇，再与芳香水合并，得到蓝金口服液。
优选地，所述第三上清液浓缩除去乙醇后，加入甜味剂和防腐剂，加水至500mL，加热至沸腾，使甜味剂和防腐剂全部溶解，自然冷却后在5-10℃下静置60-90小时，离心，得到第四上清液，第四上清液中加入芳香水，加水至1000mL，搅拌均匀，0.8μm微孔滤膜滤过，得到蓝金口服液。
优选地，该方法制备得到的蓝金口服液中，每毫升蓝金口服液含生药0.7-0.9g。
优选地，蓝金口服液的具体制备方法为：以上七味，取荆芥、金银花、连翘、柴胡，加水12倍量浸泡2小时，加热收集芳香水约400mL，另器保存，药液滤过，药渣加入板蓝根、射干、甘草三味，加水9倍量，煎煮2小时，滤过，药渣加水8倍量，煎煮1.5小时，滤过，合并三次滤液，浓缩至相对密度为1.05，放冷，5～10℃冷藏24小时，离心，取上清液，加1.5％(W/V)壳聚糖溶液80g，搅匀，调节pH值至4.0～6.0，5～10℃冷藏12小时，离心，取上清液，浓缩至相对密度为1.05～1.10，加乙醇使含醇量达30％(V/V)，搅匀，5～10℃冷藏48小时，离心，取上清液，回收乙醇并浓缩至无醇味，加蔗糖100g、甜菊苷1g和苯甲酸钠2g，加水约至500ml，加热至沸使全部溶解，放冷，5～10℃冷藏72小时，离心，取上清液，加入芳香水，搅匀，加水至1000mL，搅匀，0.8μm微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，即得。
本方由板蓝根180克、金银花150克、连翘120克、柴胡100克、荆芥100克、射干120克、甘草30克，制成每毫升含生药0.8g的口服液，每次10ml，每天3次。以大剂量板蓝根清解疫毒为君，其有擅“治天行热毒”之功(《日华子本草》)，且有“辟疫”之效(《本草便读》)，既可解疫毒于卫表，又可防疫毒以内犯。配银花、连翘，其意有三：一则银翘可清热解毒，可增板蓝根之效；二则银翘具透达之性，使邪毒外宣；三则银翘芳香，亦可辟秽而防邪毒内侵，故为臣药。《重庆堂随笔》谓银花“清络中风火湿热，解温疫秽恶浊邪”。用柴胡、荆芥为佐，开肌腠以祛邪外出，透疫毒以泄邪热；二药相伍，有发汗退热之良效，即所谓“体若燔炭，汗出而散”之意；再以射干利咽候、解热毒、消肿止痛，亦为佐药。其中银花、柴胡、荆芥配伍，长于发表退热；连翘与射干相配，长于解毒消肿。甘草为使，调和诸药。以上各药相合，于清热解毒之中透表泄热，发汗祛邪之中解毒消肿，对温疫邪毒侵犯人体，发热较甚，邪在卫表者，诚常对证之剂。
中药口服液是近几十年来中药剂型的演化产物，是在中药汤剂的基础上发展起来的新剂型。其保持了原有汤剂的固有特色，且具有发挥疗效快，作用明显，服用携带方便，保存性能良好等优点。它克服了中药汤剂用量大，携带不方便，不能久贮，无法商品化生产等缺点，与固体制剂相比，分散度大，易吸收，生物利用度高，奏效快；安瓿瓶装，剂量准确，密封程度好，可采用灭菌措施，避免了在储运过程中可能出现的再次污染，有利于保存。故本品采用口服液剂型。
同类药物对比
对现在国内目前市场上的与本品主治病症(风热表证)相近品种的使用现状进行了比较分析。
(1)与疏风解毒胶囊比较：该方亦有疏风清热、解毒利咽之效，亦可用于上呼吸道感染而属风热证者，有虎杖、连翘、板蓝根、败酱草、马鞭草等清热解毒药，其解毒之功有余而透邪之力不足，蓝金口服液则能把解毒清热与透邪外出有机结合在一起，更符合中医治外感病“发汗透邪”的理论特色。
(2)与金莲清热泡腾片比较，该方配石膏、知母、地黄、玄参等，有清热凉血滋阴之功，无外透祛邪之效，似不符合外感风热表证的治法特征。
(3)与感冒灵颗粒比较：该方既有中草药成分如岗梅，野菊三叉苦等，又有化学药物如对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏，是中药加西药的处方，蓝金口服液则是纯中药制剂。
(4)与抗感口服液比较：该方由11味中药组成，清热解毒作用较强，透邪外出之力则弱，适应风热外感热毒偏重者。其处方苦寒药较多(黄芩、栀子、茵陈、贯众、大青叶等)，难免有遏制“表邪外解”之弊。
(5)与连花清瘟胶囊比较：该方由13味药组成，既运用银花、连翘、板蓝根、鱼腥草等清热解毒，又配麻杏甘石汤，着意宣肺清热，还配有大黄泻下清上，导热下引，故其治肺热炽盛的上感为优。蓝金口服液则以治风热外感的肺卫表证的上感为主，两方各有侧重。
(6)与清热解毒颗粒比较：该药含水牛角、石膏、黄连、地黄、知母、玄参等清热解毒凉血之品，故只宜于上呼吸道感染，邪入营血之证，其透邪外达之力较弱。
(7)与双黄连口服液、蒲地蓝消炎口服液比较：此二药处方着重于清热解毒，配伍中均忽视了风热外感在治法上仍需“外透”解表的基本规律。
由上可知，蓝金口服液与上述品种相较，其组方特点是：一则配伍严谨，清热解毒而无凉遏表邪之弊，透邪解表而无助长风邪热毒之虞；二则蓝金口服液治外感病，邪在卫表之风热表证，不是一味清热解毒，不是苦寒直折，而是坚持“透”邪外出，完全符合“其在皮者，汗而发之”的理论宗旨。三则本方选药组方突出了中医药的特色。
可行性分析
(1)蓝金口服液处方充分体现了中医药特色，符合中医药的基本理论。对外感风热表证，疏散风热以透邪外出，是治法的核心要素。蓝金口服液处方在合理运用板蓝根、银花、连翘、射干清热解毒的同时，又配柴胡、荆芥解表以透邪外出。药虽平凡无奇，却体现了治法的精髓，这也是蓝金口服液有别于诸多治上感药物的特色所在。蓝金口服液组方精炼(7味药)，配伍严谨，功能主治明确，针对性强。
(2)蓝金口服液有良好的抗病毒、抗炎、抗菌、解热镇痛等作用。研究表明：蓝金口服液体外实验中抗菌谱较广，对金色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌等均有抑制作用；呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒等有较好体外抑制效应；并有良好的抗炎、解热镇痛等作用。根据国家《药品注册管理方法》中药6类新药关于现代中药复方制剂的技术要求，对该制剂进行了以下几个方面的药效学研究：①体外抗菌作用；②对小鼠的体内抗菌保护作用；③对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响；④对小鼠醋酸扭体的影响；⑤对小鼠热板通阀的影响；⑥对二甲苯致小鼠耳廓的影响；⑦对酵母所致大鼠发热的影响；⑧对大鼠脚趾汗液分泌的影响，实验结果表明，蓝金口服液对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌)的抑制作用明显优于革兰阴性菌(大肠埃希杆菌)以及真菌白假丝酵母菌；对流感病毒100TCID50引起的MDCK细胞病变及血凝现象有明显的抑制作用；还能延长金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及溶血性链球菌感染小鼠的存活时间；高剂量(12.5g生药/kg)可以显著降低醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加，中(4.32g生药/kg)、高剂量能明显减少小鼠扭体次数；高剂量可以增加大鼠足趾出汗点数量；中、高剂量可以降低动物在6h的体温升高的程度。以上实验研究体现了蓝金口服液的药效学与功能主治基本一致，提示蓝金口服液具有清热解毒，疏风透表的作用。
(3)蓝金口服液有较好的市场前景。尽管市售上呼吸道感染的药不少，但多偏于清热解毒，只适宜于上感热毒炽盛之证。而流行病学研究表明，上感属于风热表证居多，蓝金口服液的特点是把清热解毒与疏风透邪相结合，适应面更广，对风热表证更具针对性。
(4)蓝金口服液处方中药物来源明确，安全有效，无明显毒副反应。单次给药毒性实验表明，小鼠按40mL/kg灌胃给予最大浓度3.22g生药/mL(相当于128.8g生药/kg)的蓝金口服液，当日1次，动物未见明显急性毒性反应，按公斤体重计算相当于成人临床一日拟用量161倍。大鼠长期毒性试验结果表明，大鼠按15mL/kg灌胃给予12.3、24.6、49.1g生药/kg的蓝金口服液，连续给药26周，停药观察4周，未见明显毒性反应剂量(NOAEL)为49.1g生药/kg。蓝金口服液主要药效起效剂量为临床等效剂量(小鼠：6.2g生药/kg、大鼠：4.32g生药/kg)，且在等效剂量的1.0-2.0倍范围内均有效。综合药效学及毒性试验分析，蓝金口服液具有显著的清热解毒，疏风透表功效，并对外感温邪疫毒，邪在卫表具有显著治疗作用，且在治疗剂量范围内具有较大的安全性。
鉴于上述分析，蓝金口服液治疗上呼吸道感染中医辩证属风热者，是完全可行的。
荆芥挥发油类成分具有明显的抗炎抗病毒活性,为其主要活性成分,与处方中其它适合水煎药材一起水煎易造成挥发油成分损失,因此进行水煎之前需对荆芥挥发油先进行水蒸汽提取。
同时,处方中金银花、连翘、柴胡中也含有部分挥发油类成分，也需考虑将此三味药材进行挥发油提取，因此拟设计单独提取荆芥挥发油及其与金银花、连翘、柴胡合并提取挥发油两种工艺，并利用干酵母致热大鼠解热模型进行活性筛选。
预试验过程中发现，药材经提取后，浸膏得率较高(>20％)，不利于后续制剂，因此考虑对样品进行醇沉精制，由于醇沉对经水回流提取所得样品成份影响较大，拟设计不同浓度醇沉结合活性测试以获取最佳的除杂效果。
本发明的有益效果是，蓝金口服液是由中医汉方提取有效成分制成的，经过细胞实验，动物实验结合老中医按照君臣佐使确定最终处方研制出来的一种有效的中药制剂。口服液剂型保持了原有汤剂的固有特色，且具有发挥疗效快，作用明显，服用携带方便，保存性能良好，克服了中药汤剂用量大，携带不方便，不能久贮，无法商品化生产等缺点，与固体制剂相比，分散度大，易吸收，生物利用度高，奏效快；安瓿瓶装，剂量准确，密封程度好，可采用灭菌措施，避免了在储运过程中可能出现的再次污染，有利于保存，故选用口服溶液剂。经考查，工艺稳定，质量可控，能保证产品质量。
具体实施方式
实施例
【处方】金银花150g、连翘120g、柴胡100g、荆芥100g、板蓝根180g、射干120g、甘草30g
【制法】以上七味，取荆芥、金银花、连翘、柴胡，加水12倍量浸泡2小时，加热收集芳香水约400mL，另器保存，药液滤过，药渣加入其余板蓝根等三味，加水9倍量，煎煮2小时，滤过，药渣加水8倍量，煎煮1.5小时，滤过，合并三次滤液，浓缩至相对密度为1.05(60～70℃)，放冷，冷藏(5～10℃)24小时，离心，取上清液，加1.5％壳聚糖溶液80g，搅匀，调节pH值至4.0～6.0，冷藏(5～10℃)12小时，离心，取上清液，浓缩至相对密度为1.05～1.10(25℃)，加乙醇使含醇量达30％，搅匀，冷藏(5～10℃)48小时，离心，取上清液，回收乙醇并浓缩至无醇味，加蔗糖100g、甜菊苷1g和苯甲酸钠2g，加水约至500ml，加热至沸使全部溶解，放冷，冷藏(5～10℃)72小时，离心，取上清液，加入芳香水，搅匀，加水至1000mL，搅匀，0.8μm微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，即得。
质量分析评价
药材薄层鉴别：蓝金抗病毒口服液是由板蓝根，金银花，连翘，甘草，荆芥，柴胡，射干共七味药材制成的口服液剂。参考《中国药典》2015年版第一部中对该七味药材的相关规定进行质量研究。对该七味药材照药典进行薄层鉴别，均符合规定。
腺苷、绿原酸含量测定：处方中板蓝根为君药，含有腺苷和绿原酸主要有效成分，故选取其作为质量控制指标。研究者用HPLC法测定腺苷、绿原酸的含量进行了方法学考察，建立了HPLC测定腺苷、绿原酸含量的高效液相色谱测定方法，根据三批中试放大产品含量测定(结果见表)，最终确定本品腺苷(以C10H13N5O4计)含量不得少于0.40mg/支；绿原酸(以C15H1809计)含量不得少于8.00mg/支。
提取工艺和制剂工艺研究
药材前处理
板蓝根由嘉禾县药材公司提供，金银花和荆芥由益阳药材公司提供，柴胡，连翘，射干及甘草均由亳州毕生药材公司提供，均为药材饮片。经鉴定，均符合中国药典2015年版一部各药味项下的规定。
药材提取方法选择及依据
金银花含绿原酸，异绿原酸，白果酸，β-谷甾醇及其D-葡萄糖苷、豆甾醇及其D-葡萄糖苷、木犀草素等。其煎剂对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌等致病菌有一定的抑制作用，对肺炎球菌、脑膜炎双球菌、绿脓杆菌、结核杆菌亦有效。金银花可诱导产生干扰素物质，对人的γ-球蛋白的Cu2+的热变性有抑制作用；其煎剂可促进白细胞的吞噬功能，宜水提。
连翘具有抗病原微生物、抗炎、解热作用，其水煎剂有明显的抗菌作用，宜水提。
柴胡水提取物能抑制流感菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、等常见的的致病菌有较强的抑制作用，在体内试验也能降低感染致病菌如金葡菌小鼠的死亡率。该制剂还能明显病毒引起小鼠肺部病变，并能降低感染致死量流感病毒小鼠的死亡率，宜水提。
板蓝根含靛蓝、靛玉红、黒芥子苷、精氨酸、谷氨酸等多种氨基酸，其水煎剂具有抗细菌、病毒作用及免疫调节作用，在体外能抑制多种细菌生，如金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、甲型链球菌、流感杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌及钩端螺旋体等，宜水提。
射干具有抗炎、解热、抗病原微生物作用。灌服能抑制大鼠体温升高，还能抑制某些病毒的生长，宜水提。
甘草的水浸膏具有明显的抗炎、镇痛作用宜水提。
荆芥味平，性温，无毒，清香气浓。荆芥为发汗，解热药，是中华常用草药之一，能镇痰、祛风、凉血。治流行感冒，头疼寒热发汗，呕吐。主要活性成分为挥发油类，宜通过水蒸汽蒸馏获得芳香性物质。
因此，本品确定提取思路为对含挥发油类成分进行水蒸汽蒸馏,然后与其它药物进行水回流提取。
活性导向提取工艺筛选
样品制备依据
荆芥挥发油类成分具有明显的抗炎抗病毒活性,为其主要活性成分,与处方中其它适合水煎药材一起水煎易造成挥发油成分损失,因此进行水煎之前需对荆芥挥发油先进行水蒸汽提取。
同时,处方中金银花、连翘、柴胡中也含有部分挥发油类成分,也需考虑将此三味药材进行挥发油提取,因此拟设计单独提取荆芥挥发油及其与金银花、连翘、柴胡合并提取挥发油两种工艺,并利用干酵母致热大鼠解热模型进行活性筛选。
预试验过程中发现，药材经提取后，浸膏得率较高(>20％)，不利于后续制剂，因此考虑对样品进行醇沉精制，由于醇沉对经水回流提取所得样品成份影响较大，拟设计不同浓度醇沉结合活性测试以获取最佳的除杂效果。
药材吸水量考察
由于处方中金银花、荆芥等蓬松药材浮于水面，不利于提取，经浸泡2小后发现药材基本没入水面，故提取加热前先对药材进行浸泡2小时。
取一个处方量药材，浸泡半小时，加8量水提取2小时，滤过，滤液冷却测量其体积。得提取液5.87L，提示药材吸水约为2倍药材量。
药材提取次数考察
取一个处方量药材，浸泡半小时，加8、6、6倍量水提取三次，第一次2小时，后三次分别为1.5小时，取每次提取液的1/10分别浓缩至干，真空干燥，称重。
表1不同提取次数提取物重量
Figure GDA0002819696740000081
结果显示，从干膏得率判断经两次提取药材基本提取完全。
样品制备
A单独提取荆芥芳香水工艺
取1个处方量药材，取荆芥100g，加10倍量蒸馏水1L，用蒸馏法提取约400mL芳香水，备用。药渣中再加入处方量其它药材金银花150g、连翘120g、柴胡100g、板蓝根180g、射干120g、甘草30g，补加水至总药材的8倍量,加热回流提取2小时,滤过；第二次加4.8L提取1.5小时,过滤，合并滤液，滤过，取四份药液，每份为总体积的1/5(即1/5个处方量)滤液浓缩至相对密度1.05～1.10的清膏(60℃测)，离心分离,依次加醇至0％,30％,50％,70％离心,取上清液,浓缩或浓缩至无醇味,加入相当量芳香水,制得样品样GY-1、GY-2、GY-3、GY-4。药渣再用10倍量70％乙醇提取1.5小时，回收溶剂，浓缩，加水定容过滤，制得样品样GY-5。
B荆芥与金银花、连翘、柴胡合并提取芳香水工艺
取金银花150g、连翘120g、柴胡100g、荆芥100g，加蒸馏水10倍量，用蒸馏法提取约400mL芳香水，备用；在上述药渣中再加入处方量其它药材(板蓝根180g、射干120g、甘草30g)，补加水至总药材的8倍量,加热回流提取2小时,滤过；第二次加6倍量水提取1.5小时,过滤，合并滤液，滤过，取四份药液，每份为总体积的1/5(即1/5个处方量)滤液浓缩至相对密度1.05～1.10的清膏(60℃测)，离心分离,依次加醇至0％,30％,50％,70％离心,取上清液,浓缩或浓缩至无醇味,加入相当量芳香水,加水调整体积到200ml,制得样品GY-6、GY-7、GY-8、GY-9。
活性试验
A分组、给药
试验大鼠于检疫结束后测肛温2次，选取体温体温波动小于0.5℃的健康SD大鼠110只，雌雄各半，体重180.1～219.4g，按性别、体重随机分为5组，每组10只，分别为模型对照组、阿司匹林组(5.4mL/kg)、GY-01、02、03、04、05、06、07、08、09组。每日给药前将阿司匹林片(研磨成粉末)及GY用蒸馏水按剂量配制成相应浓度，现配现用。各组大鼠按10mL/kg灌胃给予相应浓度药液，1次/日，连续7天，模型对照组灌胃给予等体积蒸馏水。
B检测指标
各组大鼠于给药第5、6天分别测定肛温一次使之适应。于末次给药前动物禁食不禁水12h，造模前测定基础肛温值，测定后各鼠背部皮下注射20％干酵母-生理盐水悬液10mL/kg，于造模后4h按组别灌胃给予对应药物或蒸馏水，检测造模后1、2、4、5、6、8、10h各测肛温，并计算体温波动值△t＝基础体温-造模后体温。
C试验结果
如表1所示，各组大鼠造模前体温无明显差异，与模型对照组比较，GY-07组大鼠造模后5h体温波动值显著减小(P<0.05)；GY-01、GY-02、GY-03、GY-04、GY-06、GY-07、GY-08、GY-09组大鼠造模后6h体温波动值显著减小(P<0.01)；GY-01、GY-02、GY-03、GY-06、GY-07、GY-08组大鼠造模后8h及10h体温波动值显著减小(P<0.05或P<0.01)；
表2不同工艺样品对大鼠干酵母所致体温升高的影响
Figure GDA0002819696740000101
Figure GDA0002819696740000102
结果显示，GY-01、GY-02、GY-03、GY-04、GY-06、GY-07、GY-08、GY-09均能显著降低干酵母所致大鼠体温，其中GY-07持续起效时间最早，体温波动值最小，效果最优。
鉴于上述试验结果，药材提取的初步工艺为：金银花150g、连翘120g、柴胡100g、荆芥100g，加蒸馏水10倍量，用蒸馏法提取约400mL芳香水，备用；在上述药渣中再加入处方量其它药材(板蓝根180g、射干120g、甘草30g)，补加水至总药材的8倍量，加热回流提取2小时，滤过；第二次加6倍量提取1.5小时，然后回收水液后再经30％醇沉精制。
提取工艺参数优化
提取溶剂体积考察
为了考察提取工艺，试验以加水倍量为考察因素，以干膏的重量为考察指标进行单因素考察实验。
实验方法：按单因素考察提取水的用量，取1/10处方量药材，煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩,干燥，称干膏重。实验结果如下表。
表3水提工艺单因素考察试验结果表
Figure GDA0002819696740000111
结果表明：加水10、8倍量比加水8、6倍得的干膏量有一定的增加，但二者之间无显著差异。为了缩短工时、节约能耗，选择方案2，即取药材经浸泡0.5小时后，加水煎煮二次，第一次加8倍量水煎煮2小时，第二次加6倍量水煎煮1.5小时。
芳香水提取工艺考察
活性导向工艺筛选试验表明荆芥、金银花、连翘、柴胡合并提取芳香水后再与其它药味合煎疗效较佳，与处方所有药材合并水煎提取芳香水工序稍显复杂，拟对处方药材同时投料提取芳香水与仅含挥发油类药材后先投料提取芳香水两种工艺进行考察。
由于本品制剂为口服液剂型，1个处方量药材拟制成体积为1L口服液，如果芳香水体积过大，会影响后续与其它药味合煎提取液的浓缩体积，因此需对芳香水的体积进行考察。
A所有处方药材同时投料提取芳香水
实验内容：取1个处方药材，加10倍量水，采用蒸馏法提芳香水，每100ml为一个馏分，共收集8个馏分，每个馏分用乙醚萃取，以右旋薄荷酮为对照品，进行薄层层析。
薄层结果显示，右旋薄荷酮比较分散，在第七个馏分中还检测到有右旋薄荷酮。因此该法提取所得芳香水体积过大，不利于后续制剂。
B仅荆芥、金银花、连翘、柴胡合并投料提取芳香水
实验方法：取一个处方量荆芥、金银花、连翘、柴胡药材，加10倍量水，采用蒸馏法提芳香水，每100ml为一个馏分，共收集8个馏分，每个馏分用乙醚萃取，以右旋薄荷酮为对照品，进行薄层层析。
薄层结果显示，右旋薄荷酮主要集中在第一、二个馏分，到第五个馏分，基本上没有右旋薄荷酮，故确定提取体积为400ml，即4倍药材量。
水沉工艺考察
处方中药材经活性筛查及文献调研证实，主要为水溶性成分，提取液经浓缩冷却能使弱极性成分沉降析出，可过滤除去，考察浓缩相关参数，主要考察提取浓缩液的体积(相对密度)。
实验方法：取金银花、连翘、柴胡、荆芥一个处方量药材，加10倍量水，提取400ml芳香水，再加入一个处方量板蓝根、射干、甘草，加水至约8倍药材量，提取2小时，滤过；药渣加6倍量水，提取1.5小时，滤过，合并滤液，于65℃减压浓缩至不同体积，冰箱中冷藏(5～10℃)12小时，离心(2500r/min，20min)，上清液备用，取离心后的沉淀，干燥，考察沉淀重量，反应水沉工艺最佳相对密度及体积，结果见表4。
表4提取液浓缩的相对密度考察结果
Figure GDA0002819696740000121
验证：将上述1、2、3药材浓缩液，离心(2500r/min，20min)，上清液直接加纯化水，稀释至300mL,测定相对密度均为1.06左右。冰箱中冷藏(5～10℃)12小时，离心(2500r/min，20min)，上清液备用，取离心后的沉淀，干燥，考察沉淀重量与相对密度，结果见表5。
表5提取液浓缩的相对密度考察结果
Figure GDA0002819696740000122
备注：两表中的1和5、2和6、3和7均为同一样品，不同相对密度。
结果显示，浓缩液相对密度较大时，沉淀与溶液很难分离，达不到水沉的效果；浓缩液相对密度较小时(约1.05)析出的沉淀量多，能除去水不溶性成分，增加成品的澄明度，暂定提取水液浓缩相对密度控制在1.05左右(60℃)。
样品澄清度研究
初步研究中发现,提取液经浓缩水沉,醇沉后所制备样品澄清度不佳，故考虑对水沉液进行壳聚糖沉降,考察壳聚糖对样品澄清度的影响。
壳聚糖用量考察
实验方法：取1个处方量药材，按12.3.6确定工艺进行提取、浓缩至相对密度为1.05(约1200ml)，平均分成四份，加入不同体积的壳聚糖溶液(1.5％的0.5％的HAC溶液)，搅拌30分钟，用10％氢氧化钠调节溶液pH值一致至5.0，各取100ml置100ml量筒中，冰箱中冷藏(5～10℃)24小时，于1、3、6、12、24小时观测沉淀体积。
表6壳聚糖用量考察
Figure GDA0002819696740000131
结果表明，1/4个处方药液加入20ml壳聚糖溶液，絮凝效果较佳，即一个处方加80ml1.5％的壳聚糖溶液能使药液达到澄清效果。
提取液浓缩浓度考察
提取液经壳聚糖沉降后，一个处方提取药液体积达到1250ml左右，加上400ml芳香水，比处方设计的1000ml药液体积大很多，因此需对壳聚糖沉降后药液进行浓缩，为保证后续制剂，拟将该药液浓缩至400ml左右。
按前述最佳工艺条件，制备1个处方经壳聚糖沉降后离心后药液，取三份(每份1/4个处方量)，分别浓缩至处方量60、80、100ml，观察溶液状态。
实验结果：浓缩后，圆底烧瓶壁上有少量固体，加热易溶解，放置，离心(2500r/min，20min)，均无明显沉淀产生，因此暂定每个处方提取液浓缩至350-400ml。
制剂工艺初步考察
取浓缩液(1/4个处方浓缩到100ml)，加入10ml糖浆，加入100ml芳香水，加水调整体积到250ml，0.8μm微孔滤膜过滤。
实验结果：混合液0.8μm直接用微孔滤膜过滤，过滤困难。离心(2500r/min，20min)、滤纸抽滤，过滤均比较容易，续滤液再用0.8μm微孔滤膜过滤，比较困难，且放置一段时间(48h)有沉淀产生。
醇沉对药液澄清度的影响
制剂工艺初步研究表明，样品澄清度还是不佳。活性筛选过程发现，药液经低浓度醇沉活性没有减弱，且在该样品制备过程发现，醇沉有部分沉淀析出。因此拟对提取药液进行低浓度醇沉考察。
取前述剩余三份药液合并，浓缩体积至300ml，均分成三份，分别加入醇至20、30、40％(V/V，％)，搅拌均匀，冰箱中冷藏(5～10℃)静置，分别与3、6、12小时观察，12小时后取出，离心出沉淀、干燥、称量。清液回收乙醇至无醇味，分别加入10ml糖浆、100ml芳香水，加水调整体积到250ml，0.8μm微孔滤膜过滤，观察过滤效果，过滤后样品置冰箱中冷藏48小时(5～10℃)观察澄清情况。
表7醇沉的浓度考察结果
Figure GDA0002819696740000141
结果显示，样品经30％醇沉能除掉部分大极性杂质，有助制剂澄清。
提取精制工艺验证
取三个处方药材，分别按下述工艺进行样品制备。
取金银花150g、连翘120g、柴胡100g、荆芥100g，加蒸馏水4.7L，用蒸馏法提取约400mL芳香水，保存备用；在上述药渣中再加入处方量其它药材(板蓝根180g、射干120g、甘草30g)，加热回流提取两次，第一次在提完芳香水的药液中加水2.1L，提取2小时；第二次加4.8L提取1.5小时，滤过，合并两次提取液，减压浓缩至相对密度1.05的浓缩液(60℃)。取浓缩液冷却至室温，然后冷藏(5～10℃)12小时，离心(2500r/min，20min)，取上清液加入1.5％(W/V)的壳聚糖溶液80ml，搅拌均匀，用10％氢氧化钠调节溶液pH值至5.0，继续搅拌30分钟，冷藏(5～10℃)24小时，离心(2500r/min，20min)，上清液浓缩至350～400mL，加乙醇至30％(V/V，％)醇沉，冷藏(5～10℃)12小时，离心(2500r/min，20min)，取上清液浓缩，浓缩至无醇味，得药液。
各取1/4个处方药液中加入1/4个处方量芳香水，10ml单糖浆，加水至250ml，搅拌均匀，冷藏(5～10℃)48小时，观察样品性状。
结果显示，样品均一，澄清度好，未见明显沉淀。
制剂工艺研究
本品为中药复方合剂，拟制成口服液剂型，前述工艺研究已基本能达到相关要求，主要对单糖浆、防腐剂用量进行考察。
单糖浆用量考察
由于本品有苦涩味，为掩盖苦涩口感，拟加入单糖浆用于调味。
取工艺验证制备的芳香水与提取处理样品(每个实验取1/4处方量)，按下表进行试验，比较口感。
表8单糖浆用量考察
Figure GDA0002819696740000151
经实验，认为1/4处方加12.5ml即每个处方加50ml单糖浆口感较佳。
防腐剂用量初步考察
本品为多味药材提取制备的合剂，且加入了单糖浆，宜加适量防腐剂，拟使用苯甲酸钠作为防腐剂并对其用量进行初步考察。
取“单糖浆用量考察”项下3号样四份，各50ml，依次加入0、50、75、100mg苯甲酸钠，搅拌均匀，于具塞玻璃瓶中室温(25℃)放置，观察样品状态。
表9单糖浆用量考察
Figure GDA0002819696740000161
初步结果显示，防腐剂用量以0.15％为宜。
小试样品制备
为考察优选工艺的稳定性，在实验室进行小试样品制备。取3个处方量药材，按下述工艺进行试验。
取金银花150g、连翘120g、柴胡100g、荆芥100g于10L圆底烧瓶中，加4.7L蒸馏水，电热套加热，用蒸馏法提取约400mL芳香水，保存备用；在药渣中再加入板蓝根180g、射干120g、甘草30g，加水2.1L，加热回流提取，提取2小时，滤过；药渣加4.8L水进行第二次提取，提取1.5小时，滤过,合并两次提取液，减压浓缩至相对密度1.05的浓缩液(60℃)。取浓缩液冷却至室温，然后冷藏(5～10℃)12小时，离心(2500r/min，20min)，取上清液加入1.5％(W/V)的壳聚糖溶液80ml，搅拌均匀，用10％氢氧化钠调节溶液pH值至5.0，继续搅拌30分钟，冷藏(5～10℃)24小时，离心(2500r/min，20min)，上清液浓缩至350～400mL，加乙醇至30％(V/V，％)沉降，冷藏(5～10℃)12小时，离心(2500r/min，20min)，取上清液浓缩，浓缩至无醇味，加入芳香水、50ml单糖浆，1.5g苯甲酸钠，充分搅拌混匀，精滤(0.8μm微孔滤膜)即得。
结果显示，三批样品(批号：20150604，20150908，20151021)性状基本一致，为棕褐色液体，且经放置状态稳定，未见澄清度良好。
制法：经过比对分析研究，最终确定蓝金口服液的提取纯化工艺为：以上七味，取荆芥、金银花、连翘、柴胡，加水12倍量浸泡2小时，加热收集芳香水约400mL，另器保存，药液滤过，药渣加入其余板蓝根等三味，加水9倍量，煎煮2小时，滤过，药渣加水8倍量，煎煮1.5小时，滤过，合并三次滤液，浓缩至相对密度为1.05(60～70℃)，放冷，冷藏(5～10℃)24小时，离心，取上清液，加1.5％壳聚糖溶液80g，搅匀，调节pH值至4.0～6.0，冷藏(5～10℃)12小时，离心，取上清液，浓缩至相对密度为1.05～1.10(25℃)，加乙醇使含醇量达30％，搅匀，冷藏(5～10℃)48小时，离心，取上清液，回收乙醇并浓缩至无醇味，加蔗糖100g、甜菊苷1g和苯甲酸钠2g，加水约至500ml，加热至沸使全部溶解，放冷，冷藏(5～10℃)72小时，离心，取上清液，加入芳香水，搅匀，加水至1000mL，搅匀，0.8μm微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，即得。
制剂工艺综合分析与评价：根据处方药物组成及其各药味的药性和化学成分特征，以大鼠干酵母所致体温升高模型考察9种不同提取纯化工艺，最终确定蓝金口服液的提取纯化工艺为：以上七味，取荆芥、金银花、连翘、柴胡，加水12倍量浸泡2小时，加热收集芳香水约400mL，另器保存，药液滤过，药渣加入其余板蓝根等三味，加水9倍量，煎煮2小时，滤过，药渣加水8倍量，煎煮1.5小时，滤过，合并三次滤液，浓缩至相对密度为1.05(60～70℃)，放冷，冷藏(5～10℃)24小时，离心，取上清液，加1.5％壳聚糖溶液80g，搅匀，调节pH值至4.0～6.0，冷藏(5～10℃)12小时，离心，取上清液，浓缩至相对密度为1.05～1.10(25℃)，加乙醇使含醇量达30％，搅匀，冷藏(5～10℃)48小时，离心，取上清液，回收乙醇并浓缩至无醇味，加蔗糖100g、甜菊苷1g和苯甲酸钠2g，加水约至500ml，加热至沸使全部溶解，放冷，冷藏(5～10℃)72小时，离心，取上清液，加入芳香水，搅匀，加水至1000mL，搅匀，0.8μm微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，即得。按照这个工艺中试放大3批样品供药效和毒理学评价。三批中试样品批号分别为：20150604，20150908，20151021。其外观、装量以及微生物限度均符合相关规定。在提取纯化工艺研究过程中，采用大鼠干酵母所致体温升高模型，重点考察了提取纯化工艺的科学性和可操作性，为复方中药的制法提供了一定的实验依据。
口服溶液剂的一般检查：根据《中国药典》2015年版第四部通则0123口服溶液剂项下规定，对其进行了装量、pH值、微生物限度等进行了检查，均符合相关规定。
质量研究综合分析与评价：研究结果表明，本品种所确定的药材鉴别、主要成分含量测定及其含量限度和口服液项下检查项目均符合规定。
药理毒理作用
有效性分析及评价
蓝金口服液功能主治为：功能：清热解毒，疏风透表。主治：外感温邪疫毒，邪在卫表。证见发热较甚，微恶风寒，头身痛而无汗，或有微汗，咽痛口干，或颐肿，舌苔薄白或薄黄，脉浮数等。可用于流行性感冒，流行性腮腺炎，急性咽炎，扁桃体炎等而有上述见症者。
药效学试验根据其功能主治进行设计，分别观察蓝金口服液体外抑菌、蓝金口服液体外抗病毒作用、对小鼠体内细菌感染的保护作用、对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响、对小鼠醋酸致扭体反应的影响、小鼠热板痛阈的影响、对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响、对酵母所致大鼠发热的影响、大鼠足趾汗液分泌的影响，综合评价了蓝金口服液清热解毒、疏风透表的功能及对外感温邪疫毒的治疗作用。
蓝金口服液体外抗菌作用
分别采用试管稀释法和打孔法检测蓝金口服液对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希杆菌、真菌白假丝酵母菌的最小抑菌浓度MIC以及对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希杆菌、真菌白假丝酵母菌的抑菌圈直径。
蓝金口服液体外抗病毒作用
采用细胞病变效应法(CPE法)确定不同病毒对细胞的半数致细胞病变量(TCID50)：呼吸道合胞病毒(RSV)对Hep-2细胞的半数病毒感染量(TCID50)为10－6.47/0.1mL；甲型流感病毒(A/PR/8/34)对MDCK细胞的半数病毒感染量(TCID50)为10－7.00/0.1mL。
分别测量蓝金口服液对Hep-2细胞、MDCK细胞的细胞毒性(TC)，选用Hep-2细胞、MDCK细胞分别接种100TCID50的RSV或A/PR/8/34病毒液50ul/孔，然后分别加入低于TC50浓度蓝金口服液每日倒置微镜下观察细胞病变，当病毒对照组细胞病变为++++时记录实验结果。细胞病变按六级标准判断，并按Reed-Muench计算50％有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。
蓝金口服液对小鼠体内细菌感染的保护作用
采用ICR，雌雄各半，小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌或溶血性链球菌0.6mL/只，注射前各组小鼠按20nL/kg灌胃给予5个剂量(3.1、6.2、12.5、25.0、50.0g生药/kg)的蓝金口服液进行预防，注射细菌后继续灌胃给药4天，自注射后连续观察7天，记录各组小鼠死亡情况。
蓝金口服液对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响
采用ICR小鼠，雌雄各半，分别灌胃给予低、中、高剂量(3.1、6.2、12.5g生药/kg)的蓝金口服液、阿司匹林组，每日1次，连续7天，空白对照组灌胃给予等体积蒸馏水。末次给药后30min，各组动物尾静脉注射1％伊文思蓝，腹腔注射0.7％冰醋酸，15min后处死动物，收集腹腔洗液，测OD590nm值，以OD590nm值大小表示腹腔毛细血管通透性。
蓝金口服液对小鼠醋酸致扭体反应的影响
采用ICR小鼠，雌雄各半，分别灌胃给予低、中、高剂量(3.1、6.2、12.5g生药/kg)的蓝金口服液、阿司匹林组，每日1次，连续7天，空白对照组灌胃给予等体积蒸馏水。于末次给药后30min，各组动物腹腔注射0.7％冰醋酸0.2mL/只，观察注射冰醋酸后15min内各组小鼠扭体反应次数及潜伏期。
蓝金口服液对小鼠热板痛阈的影响
采用ICR小鼠，分别灌胃给予低、中、高剂量(3.1、6.2、12.5g生药/kg)的蓝金口服液、阿司匹林组，每日1次，连续7天，空白对照组灌胃给予等体积蒸馏水。于末次给药后15min、30min、60min、120min测定各组小鼠的痛阈值。
蓝金口服液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
采用ICR小鼠，分别灌胃给予低、中、高剂量(3.1、6.2、12.5g生药/kg)的蓝金口服液、阿司匹林组，每日1次，连续7天，空白对照组灌胃给予等体积蒸馏水。于末次给药后1h，每鼠右耳内侧外侧涂二甲苯50uL/只致炎，左耳不涂为正常而对照。30分钟后称量左右耳重量，并计算肿胀度＝左耳重-右耳重。
蓝金口服液对酵母所致大鼠发热的影响
SD大鼠，雌雄各半，分别灌胃给予低、中、高剂量(2.16、4.32、8.64g生药/kg)的蓝金口服液，每日1次，连续7天，空白对照组灌胃给予等体积蒸馏水。末次给药前于大鼠背部皮下注射20％酵母-NS溶液10mL/kg造模，造模后4h给药。于造模前和造模后的1、2、4、5、6、8、10h测量大鼠肛温并做体温变化曲线。
实验结果表明：(1)蓝金口服液对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌)的抑制作用明显优于革蓝阴性菌(大肠埃希杆菌)以及真菌白假丝酵母菌；(2)蓝金口服液RSV抑制作用EC50＝22.25mg/mL，TI＝3.62；蓝金口服液32.51mg/mL对流感病毒100TCID50引起的MDCK细胞病变及血凝现象有明显的抑制作用；(3)蓝金口服液能够延长金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及溶血性链球菌感染小鼠的存活时间，提高其存活率，提示蓝金口服液对上述三种细菌感染小鼠具有一定的保护作用；(4)；蓝金口服液高剂量(12.5g生药/kg)可以显著降低醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加(5)蓝金口服液中、高剂量能明显减少小鼠扭体次数；(6)蓝金口服液高剂量(12.5g生药/kg)可以显著降低二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的程度；(7)给药30min后，蓝金口服液高剂量组(12.5g生药/kg)小鼠痛阈值显著增加；(8)蓝金口服液中、高剂量(4.32、8.64g生药/kg)可以增加大鼠足趾出汗点数量。(9)蓝金口服液中剂量(4.32g生药/kg)可以降低动物在6h的体温升高的程度，给予蓝金口服液高剂量(8.64g生药/kg)可以降低动物在6、8h体温升高的程度。
蓝金口服液大鼠足趾汗液分泌的影响
SD大鼠，雌雄各半，分别灌胃给予低、中、高剂量(2.16、4.32、8.64g生药/kg)的蓝金口服液，每日1次，连续7天，空白对照组灌胃给予等体积蒸馏水。末次给药后30min，用75％酒精将大鼠右足跖擦拭干净后涂上和田-高垣氏A液，待充分干燥后，再薄薄涂上和田-高垣氏B液，20min后，用放大镜观察计数足跖部的深紫色着色点(汗点)。
综上所述，蓝金口服液的主要药效学实验的起效剂量与临床等效剂量基本一致(小鼠：6.2g生药/kg、大鼠：4.32g生药/kg)，且在等效剂量1.0倍至2.0倍之间均有效。药效学试验结果与功能主治基本一致，提示蓝金口服液具有清热解毒，疏风透表的作用，为其临床研究提供了可靠的实验依据。
安全性分析及评价
小鼠单次给药毒性试验
小鼠按最大给药体积40mL/kg，灌胃给予最大浓度3.22g生药/mL(相当于128.8g生药/kg)的蓝金口服液，当日1次，给药后小鼠未见异常，给药后14天的观察期内小鼠体重、自主活等均未见明显异常。观察期结束后麻醉安乐死所有动物，大体解剖后肉眼观察，各脏器均未见明显异常。在本试验条件下，小鼠经口灌服蓝金口服液128.8g生药/kg(最大浓度3.22g生药/mL)，最大体积40mL/kg，当日1次，未见明显毒性反应及死亡，按公斤体重计相当于成人(70kg)临床一日拟用量的161倍。
大鼠重复给药毒性试验
大鼠按15mL/kg灌胃给予低、中、高剂量(16.2、32.2、48.3g生药/kg)的蓝金口服液，连续给药4周，停药观察4周，低、中、高剂量按公斤体重折算分别相当于成人临床拟用量的23.3、46.7、70.0倍。与空白对照组比较，蓝金口服液低、中、高剂量在给药4个月及停药4周期间，大鼠一般状况、摄食量、摄水量、体重增长、尿液、血液学、血浆生化指标、骨髓检查、系统解剖肉眼观察及镜下组织形态学观察均未见与供试品相关的毒性反应。主要脏器系数：给药末期低、中、高剂量组动物肝脏脏器系数与对照组比较出现统计学意义的升高，停药4周恢复期正常。肝脏器系数的增加为可逆的变化，相关联血液生化指标和相应组别组织病理学检查结果未见异常，以上差异不考虑与药物毒性有关。结果表明，在本试验条件下，SD大鼠经口灌服蓝金口服液1个月，未见明显毒性反应剂量(NOAEL)为48.3g生药/kg(相当于人临床拟用剂量的70.0倍)。
药理毒理综合分析及评价
药效学试验结果表明，(1)蓝金口服液对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌)的抑制作用明显优于革蓝阴性菌(大肠杆菌)以及真菌白假丝酵母菌；(2)蓝金口服液RSV抑制作用EC50＝22.25mg/mL，SI＝3.62；蓝金口服液32.51mg/mL对流感病毒100TCID50引起的MDCK细胞病变及血凝现象有明显的抑制作用；(3)蓝金口服液能够延长金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及溶血性链球菌感染小鼠的存活时间，提高其存活率；(4)蓝金口服液高剂量(12.5g生药/kg)可以显著降低醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加。；(5)蓝金口服液中、高剂量能明显减少醋酸致小鼠扭体反应次数；(6)蓝金口服液高剂量(12.5g生药/kg)可以显著降低二甲苯所致小鼠耳廓肿胀度；(7)蓝金口服液高剂量组(12.5g生药/kg)能显著增加小鼠痛阈值；(8)蓝金口服液中、高剂量(4.32、8.64g生药/kg)可以显著增加大鼠足趾出汗点数量。(9)蓝金口服液中剂量(4.32g生药/kg)可以显著降低动物在6h的体温升高的程度，高剂量(8.64g生药/kg)可以降低动物在6、8h体温升高的程度。
单次给药毒性试验表明，小鼠按40mL/kg灌胃给予最大浓度3.22g生药/mL(相当于128.8g生药/kg)的蓝金口服液，当日1次，动物未见明显急性毒性反应，按公斤体重计算相当于成人临床一日拟用量161倍。
大鼠长期毒性试验结果表明，大鼠按15mL/kg灌胃给予12.3、24.6、49.1g生药/kg的蓝金口服液，连续给药26周，停药观察4周，未见明显毒性反应剂量(NOAEL)为49.1g生药/kg。
综上所述，蓝金口服液主要药效学起效剂量为临床等效剂量(小鼠：6.2g生药/kg、大鼠：4.32g生药/kg)，且在等效剂量的1.0～2.0倍范围内均有效。大鼠单次给药毒性试验最大给药量(当日累积剂量161g生药/kg)约相当于小鼠等效剂量(6.2g生药/kg)的21.0倍，大鼠重复给药毒性试验NOAEL(48.3g生药/kg)约为大鼠等效剂量(4.32g生药/kg)的11.2倍。综合药效学及毒性试验分析，蓝金口服液具有显著的清热解毒，疏风透表功效，并对外感温邪疫毒，邪在卫表具有显著治疗作用，且在治疗剂量范围内具有较大的安全性。
综合分析与评价
1、蓝金口服液处方在合理运用板蓝根、银花、连翘、射干清热解毒的同时，又配柴胡、荆芥解表以透邪外出。药虽平凡无奇，却体现了治法的精髓，这也是蓝金口服液有别于诸多治上感药物的特色所在。蓝金口服液组方精炼(7味药)，配伍严谨，功能主治明确，针对性强。蓝金口服液处方充分体现了中医药特色，符合中医药的基本理论。
2、根据处方的功能主治，采用水蒸汽蒸馏法收集挥发性成分，以增强其透风解表之功效；采用大鼠干酵母所致体温升高模型，重点考察了提取纯化工艺的科学性和可操作性，为复方中药的制法提供了一定的实验依据；采用冷藏离心除杂和醇沉离心除杂二次除杂工艺，保持了液体制剂的澄明度且在储存过程中沉淀物析出少；以蔗糖为矫味剂，苯甲酸钠为防腐剂，经过3批中试放大样品的药效和毒理学评价，其解热镇痛药效作用明显，安全指数较高；三批中试样品外观、装量以及微生物限度检查均符合相关规定。
3、质量标准研究结果表明，本品种所确定的药材鉴别方法、主要成分含量测定及含量限度和口服液项下检查项目均符合规定，建立处方中全部七味药材进行定性鉴别方法，重点研究并建立了处方中二味君药主要活性成分的HPLC测定方法，为药物质量控制、安全有效提供了保障。
4、经加速实验和长期稳定性实验(18个月)研究表明，确定该制剂有效期为2年，18个月长期稳定性实验表明蓝金口服液的外观、沉淀物和主要成分含量均符合2015版《中国药典》相关要求。
5、药效学研究表明：蓝金口服液具有明显的体外、体内抗菌抗病毒作用，同时具有显著的抗炎、镇痛、解热、发汗的作用。
6、单次、多次给药毒性试验表明蓝金口服液在治疗剂量范围内具有较大的安全性。
综上所述蓝金口服液立题依据充分，处方论证正确；剂型选择合理，制剂工艺技术路线清晰、操作性强，三批放大中试产品在2年有效期内稳定，主要成分含量变化不明显；制定了合理、可行的定性定量质量标准；蓝金口服液有较好的体内外抗菌抗病毒作用和显著的抗炎、镇痛、解热、发汗作用；蓝金口服液为一种值得开发且具有很好市场前景的中药六类新药。

Claims (6)

1.一种用于清热解毒的蓝金口服液，其特征在于：蓝金口服液是由以下药材制成：板蓝根170-190g、金银花140-160g、荆芥90-110g、连翘110-130g、柴胡90-110g、射干110-130g、甘草25-35g;
蓝金口服液的具体制备方法为：取荆芥、金银花、连翘、柴胡，加水12倍量浸泡2小时，加热收集芳香水400mL，另器保存，药液滤过，药渣加入板蓝根、射干、甘草三味，加水9倍量，煎煮2小时，滤过，药渣加水8倍量，煎煮1 .5小时，滤过，合并三次滤液，浓缩至相对密度为1.05，放冷，5～10℃冷藏24小时，离心，取上清液，加1.5％W/V的壳聚糖溶液80g，搅匀，调节pH值至4.0～6.0，5～10℃冷藏12小时，离心，取上清液，浓缩至相对密度为1.05～1.10，加乙醇使含醇量达30％V/V，搅匀，5～10℃冷藏48小时，离心，取上清液，回收乙醇并浓缩至无醇味，加蔗糖100g、甜菊苷1g和苯甲酸钠2g，加水至500ml，加热至沸使全部溶解，放冷，5～10℃冷藏72小时，离心，取上清液，加入芳香水，搅匀，加水至1000mL，搅匀，0.8μm微孔滤膜滤过，灌装，灭菌，即得。
2.如权利要求1所述的蓝金口服液，其特征在于：蓝金口服液是由以下药材制成：板蓝根180g、金银花150g、荆芥100g、连翘120g、柴胡100g、射干120g、甘草30g。
3.如权利要求1所述的蓝金口服液，其特征在于：蓝金口服液中腺苷，以C10H13N5O4计，含量不少于0.40mg/10mL；绿原酸，以C16H18O9计，含量不少于8.00mg/10mL。
4.如权利要求1所述的蓝金口服液，其特征在于：将浓缩液在5-10℃下静置10-30小时后离心，得到的第一上清液；第一上清液中加入浓度为1-2％W/V的壳聚糖溶液70-90g，搅拌均匀，调节pH值至4.0-6.0，在5-10℃下静置10-30小时，离心，得到第二上清液；将第二上清液浓缩至密度为1.05-1.10后，再加入乙醇，使乙醇的体积百分含量达到28-35％，搅拌均匀，在5-10℃下静置35-60小时，离心，得到第三上清液，第三上清液浓缩除去乙醇，再与芳香水合并，得到蓝金口服液。
5.如权利要求4所述的蓝金口服液，其特征在于：所述第三上清液浓缩除去乙醇后，加入甜味剂和防腐剂，加水至500mL，加热至沸腾，使甜味剂和防腐剂全部溶解，自然冷却后在5-10℃下静置60-90小时，离心，得到第四上清液，第四上清液中加入芳香水，加水至1000mL，搅拌均匀，0.8μm微孔滤膜滤过，得到蓝金口服液。
6.如权利要求1所述的蓝金口服液，其特征在于：该方法制备得到的蓝金口服液中，每毫升蓝金口服液含生药0.7-0.9g。
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