CN108474763A - 用于检测浅表体液中的循环细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种借助于基于高频的设备测量浅表体液中的循环细胞的方法。该方法可用于检测个体的液体中的循环细胞，而无需提取个体的样品，可用作诊断工具并用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的个体的治疗的有效性。

Description

用于检测浅表体液中的循环细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种借助于基于高频的设备测量浅表体液中的循环细胞的方法。该方法可用于检测个体的液体中的循环细胞，而无需提取个体的样品，可用作诊断工具并用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的个体的治疗的有效性。特别地，该方法用于通过脑脊液中的循环细胞的检测的脑膜感染和/或炎症的诊断。
背景技术
专利申请RU2093833涉及一种通过神经超声波检查法(neurosonography)预测婴儿和幼儿的大脑和脊髓中的病理变化的方法。为了实现所述神经超声波检查法，至少将超声传感器放置在婴儿的脊柱或囟门中的缺损骨中。该传感器以以下频率之一操作：3.5,5.0,7.5MHz。特别地，RU2093833描述的方法包括扫描脑脊液以及确定蛋白质水平。当蛋白质水平增加时，脑脊液的粘度变化。由于这种液体变化，脑脊液中的蛋白质水平可被检测。当CSF中的蛋白质含量高于0.8g/L时，指示脑膜炎或脑炎的病理性改变。由于增加的蛋白质水平作为感染或炎症的指示，该方法是基于CSF的密度/粘度改变；这对于脑膜炎而言是低敏脑脊液(CSF)参数。此外，这种方法需要对身体进行一些介入性操作才能获得准确的测量值。
专利申请RU2189782公开了一种用于预测早龄儿童中的细菌性化脓性脑膜炎的发展的方法。特别地，该方法分析在疾病的第一周内取得的患者的神经超声图像的参数。这些图像是在脑半球之间的裂隙中取得的，以获得用于预测神经损伤的大脑的回波和回波结构。该方法借助于评估后期疾病中发生的结构变化来预测化脓性脑膜炎。因此，当CSF尚未化脓时，并且作为最常用于跟踪患者对治疗的反应的参数的精确的CSF细胞性也未变化时，该方法不允许早期脑膜感染诊断。
国际专利申请WO2006055449涉及一种用于超声波测量悬浮液中各种粒子或细胞的性质的系统和方法。那些性质例如是粒子的速度、浓度和/或大小。为了测量这些性质，将声能引入病灶区并使用窄带询问信号。声能可能导致液体或悬浮液的移动或流动。声流可以在不存在速度的任何其他来源的情况下允许多普勒效应测量。该专利申请还描述了使用超声波后向散射来表征悬浮液的浓度、粒度和粘度。此外，这种超声波后向散射时域信号可以通过快速傅立叶变换(“FFT”)算法转换为高分辨率的窄带功率谱，其形状提供关于粒子悬浮液的信息。该专利主张一种操纵至少10个周期的超声波单频猝发音的方法。此类长信号降低了系统分辨个体细胞的能力，对浓度测量值进行后向散射的信号至背景或参考信号的归一化/表征化。在体内进行这种归一化对于每个患者而言都是不切实际的，因为每个患者的皮肤的不同衰减(attenuation)使得在体外或从其他患者获得的在先参考值是无效的。
国际专利申请WO2009052481公开了一种光学相干断层扫描细胞检测系统。特别地，该发明的目的是使用磁动光学多普勒断层扫描(MMODT)、光学相干断层扫描(OCT)或超声对血流进行成像。这些方法中的至少一种涉及患者的身体以及悬浮在血浆中的红血细胞，并将超声波能量散射回将经后向散射的超声波能量转换为电信号的接收器/换能器，电信号以某种已知的方式被处理以确定流体的存在和流速的估计。然而，这种方法需要对于后向散射信号变化是敏感的高浓度的红血细胞。对于如此高浓度的细胞，通常需要5-10MHz范围内的超声频率。
因此，希望得到不遭受一个或多个上述缺点的方法和过程。
发明内容
实现一些疾病的早期诊断的关键在于个体细胞的检测，以在低浓度范围(1-1000个细胞/μL)下获得体内的细胞浓度的有效测量。如示例中所示，借助于使用高频超声和短持续时间的声脉冲序列对非常低的浓度的细胞进行检测，本文公开的方法提供了针对上述缺点的解决方案。
因此，在一个方面，本发明涉及用于检测和量化浅表体液中的循环细胞的非介入性方法，在下文中，本发明的第一方法包括：
a)将基于超声的设备放置在受试者的皮肤上以用于获得皮肤下的浅表体液的超声数据；
b)通过提供关于细胞及其在液体中的浓度的信息的数据处理系统分析步骤a)中获得的超声数据；以及
c)将步骤b)中获得的信息与个体中循环细胞的存在和量相关联，
其中基于超声的设备以在10-50MHz的范围中的中心频率和50-1000ns之间的脉冲持续时间以及30和150μm之间的波长操作。
在本发明的上下文中，术语“非介入性”是指个体中的皮肤不是为了提取样品而被破坏的过程。因此，本发明的非介入性的第一方法同时是无痛的，即它是一种不引起生理疼痛的过程。
本发明的第一方法用于检测浅表体液中的循环细胞。流经人体中的液体的任何细胞都被认为是“循环细胞”，并可通过本方法检测。在一个特定的实施例中，循环细胞是白血细胞、红血细胞或癌细胞。
术语“浅表体液”是指人体的在足够接近皮肤处流动的液体，使得通过所述范围(10-50MHz)内的高频超声波到达该液体。其可包括不深于50mm、优选20mm的体液。在一个具体实施例中，浅表体液选自由脑脊液(CSF)、血液、尿液、胸膜液、滑液和心包液组成的群组。
本方法尤其适用于测量婴儿的脑脊液中的循环细胞，而无需进行腰椎穿刺。如本领域技术人员所知，囟门是婴儿头部上的柔软点，其在出生时使头骨的骨板弯曲，从而允许儿童的头部穿过产道。颅骨的骨化导致前囟门在9至24个月前闭合。因此，在囟门闭合之前，围绕大脑的CSF是可接近的，允许医生使用本发明的方法测量循环细胞，其浓度可以指示中枢神经系统中的感染或炎症，例如脑膜炎或脑炎。
本发明的第一方法的其他优点不仅在于可以检测或测量浅表体液的循环细胞，还可以评估细胞的其他性质，例如大小、变异性、浓度等，以及液体的性质，例如可以提供关于液体中蛋白质浓度的信息并且指示疾病的粘度。
本发明的第一方法的第一步骤，即步骤a)，包括将基于超声的设备放置在受试者的皮肤上以获得皮肤下的液体的超声数据。
任何基于超声的设备可用于实施本发明。设备的非限制性示例包括来自TabernaPro-Medicum(DUB皮肤扫描仪33或33MHz)的便携式皮肤科超声设备(系统、探针和膝上型计算机)，来自VisualSonics(Vevo 2100和用于Vevo 770的换能器)的临床前期的成像系统(专利US7255678)和来自ArcScan的眼科探针(专利申请US2013237826)。
在特定的实施例中，本发明的方法的基于超声的设备包括换能器。如本领域技术人员所理解的，换能器是将一种形式的能量转换成另一种形式的能量的设备，即超声换能器将诸如压力的物理量变化转换为电信号，或者反之亦然。
通常将凝胶放置在换能器和皮肤之间，实现换能器和皮肤之间更好的声阻抗匹配，从而减少在信号的发送和接收期间的信号损失。为获得最佳信号，超声的焦点需要在目标区域内。通常，该焦点距离探针表面可以在1-30mm之间，优选20mm。
换能器可以包括单个聚焦元件，例如谐振平坦压电陶瓷晶体和凹面聚焦透镜。可以使用其他换能器，例如具有成形压电元件以产生焦点的换能器。获得短脉冲的但不是非常强烈的共振可用来使发送的信号和接收灵敏度最大化。换能器可具有不同的直径(通常在4-10mm之间)和焦距(通常在5-15mm之间)。可以使用具有任何直径和焦距的任何其他合适的换能器。与皮肤声学接触的单个换能器可以既发射询问信号又接收后向散射的信号。
也可以使用一组换能器或阵列。在这种情况下，可以通过使用几何聚焦元件、电子聚焦(通过对每个换能器的发射设置适当的延迟)、合成聚焦(通过对获得的信号进行后处理)或其中一些或全部的组合来获得信号聚焦。可以使用可在液体中产生足够大的超声波压力信号的任何其他类型的换能器。
在特定的实施例中，由基于超声的设备或换能器发射的信号以20MHz的中心频率和500ns的脉冲持续时间以及75μm的波长操作。
一旦换能器发射声脉冲通过皮肤，来自组织层接触面以及液体中的细胞的反射信号或超声数据被换能器接收并记录(我们也将这些信号称为接触面信号和散射)。
接下来，换能器接收在步骤b)中处理的超声数据。在特定的实施例中，在步骤a)中获得的超声数据是(i)A线数据的采集和/或(ii)B模式或C模式类型的2D数据或3D数据的形式。A线数据是指在一维中并保持换能器位置固定而获得的超声波数据；B模式和C模式分别指依据角度和换能器位置(在移动系统中)获得的2D或3D数据表示。可以通过移动单个元件换能器，或通过使用固定或移动的换能器阵列(线性或2D阵列)获得2D和3D数据。
在第二步骤，步骤b)中，本发明的第一方法包括通过提供关于细胞和/或液体性质的信息的数据处理系统对在步骤a)中获得的超声数据进行分析。
在本发明中，“数据处理系统”表示电子技术和算法的组合，用以分析超声数据并提供细胞类型和浓度信息以及诸如密度或粘度的细胞的液体整体性质。在特定的实施例中，数据处理系统包括算法。
在本发明的上下文中，术语“分析”、“处理”、“估算”、“计算”、“确定”、“得出”等是等同的并且是指处理器、计算机或计算机系统或类似的电子或硬件计算设备的动作和/或过程，其将表示为计算机系统的寄存器和/或存储器中的物理(例如电子)量的数据操纵和/或转换为类似地表示为计算机系统的存储器、寄存器或其他信息存储、传输或显示服务中物理量的其他数据。
本文呈现的过程和显示并不固有地涉及任何特定的计算机、测量设备、电子设备或其他装置。从下面的描述中可以看出各种这些系统的理想结构。另外，不参照任何特定的编程语言、机器代码等对本发明的实施例进行描述。应理解，可以使用各种编程语言、数学工具、电子测量工具、机器代码等实现本文所述的本发明的教导。本发明的实施例可以被包括在诸如具有指令存储其上或者具有与效果对应的文件或数据存储其上的硬盘、CD、DVD、“便携磁盘(disc on key)”、存储棒或其他存储单元的介质或物品中，当执行该指令时实施本发明的实施例。
换能器发射的波从物体被后向散射，该物体与悬浮物体的介质相比具有声阻抗对比(acoustic impedance contrast)。该声阻抗比差(acoustic contrast)例如可能是由于粒子的密度或可压缩性或其二者与液体的密度或可压缩性或其二者的不同所致。这些差异可能会导致声阻抗(粒子或液体密度和声波速度的乘积)之间的差异，声波速度与密度和可压缩性的乘积的平方根成反比。被这些物体后向散射的信号取决于液体和物体的相对声阻抗、这些物体的大小甚至形状。
在被散射的声能的波长可能大于弱散射(非谐振)粒子的大小(即λ>2πa，其中λ可以表示波长并且“a”可以表示粒子半径)的长波长极限中，经后向散射的能量可能是由瑞利(Rayleigh)散射引起的，并且其可能取决于粒子的可压缩性和密度与液体悬浮液介质的可压缩性和密度之间的对比度以及粒子的体积。例如，在20MHz的超声波频率下，声波波长为75μm。对于10μm或更小的量级的细胞或其他粒子，比值2πa/λ可能较小(<1，其中a/λ<1/10)，并且后向散射效应在瑞利区域内。以较高频率和/或对于较大粒子，后向散射的功率可能变成其他粒子性质的函数，这可能使得后向散射数据的幅值的解释变得复杂。
本发明的方法可以例如允许对具有与悬浮其的介质相比的声阻抗比差的任何粒子种类的浓度测量。测量可以在不接触被测液体的情况下使用。此外，可以通过本发明的实施例生成的后向散射频谱可以提供关于粒子性质的信息。例如，细胞对频率的响应的差异可能暗示多于一种类型或大小的细胞的存在。通过作为通过超声在液体的开放体积(openvolume)中的运动而生成的体声流(Eckart streaming)或简单的“声流”可生成粒子运动或速度。通过该声流推动的粒子的移动回波在数据处理中可以用来改善来自细胞的小回波的检测。
基于超声的设备还可以包括信号生成器，其产生由换能器投射至液体中的信号(也称为询问信号)。该信号例如可以包括例如在所选的中心频率处具有相等长度的一系列脉冲或猝发音(tone burst)。如上所指示的，在特定的实施例中，由换能器投射的信号生成器以20MHz的中心频率和500ns的脉冲以及75μm的波长操作。
在脉冲之间的时段(本文中也称为“间隙”)中，可以关闭询问信号。在这个间隔中，信号可以从病灶(focal)区返回，例如，返回信号可以在包括超声波信号的脉冲之间的间隔期间被接收。例如，病灶区距换能器约7mm，所以到该区并返回的双向传播距离为14mm，并且信号的前沿可以在9.3微秒(14mm/1500m/sec)之后返回至换能器。返回的、经后向散射的信号可以落在所发射的脉冲之间，在信号被关闭的地方。被细胞后向散射的脉冲的数量携带在病灶区域处存在的细胞的数量的信息。所接收的脉冲的能量取决于细胞的性质，但也取决于皮肤衰减。信号处理可以区分开两种效应。
一旦由数据处理系统分析超声数据，可获得关于细胞的信息和/或关于它们在液体中的浓度的信息。在特定的实施例中，获得的细胞性质是细胞大小、细胞浓度和/或细胞活性。
最后，在第三步骤，步骤c)中，本发明的第一方法包括将步骤b)中获得的信息与个体中的循环细胞的存在和量相关联，所述循环细胞指示疾病的存在或致病性细胞。可以例如通过以所扫描的体积除所接收的个体超声回波的数量来执行将步骤b)中获得的信息与循环细胞的存在和量之间相关联。
在本发明的上下文中，“致病性细胞”是指那些在人体体液中具有足够浓度以引发免疫响应并且能够引发个体疾病的细胞。
如本领域技术人员所理解的，步骤b)中获得的信息的形式为来自检测到的循环细胞的回波。液体中的循环细胞越多，检测到的回波数量越高。如有必要，存在可以改善细胞回波检测以获得更准确的测量值的几种方式。这些方式的示例可以是但不限于增大信号幅度(信号幅度扫视)、测量细胞的速度、以及使用激励信号的编码序列。
·信号幅度扫视：组织衰减局部地以及在受试者之间变化。高的组织衰减可能阻止从病灶中心之外的细胞接收回波。因此，真实的浓度可能被低估。可以通过2D和3D扫描克服这种效应，其中对较大的体积进行采样以确保足够的细胞穿过病灶体积以具有统计上的细胞浓度的可靠的测量。可选地，在换能器处通过组织接收的细胞回波的最大能量可以与离体获得的细胞回波的最大能量相关，以估计每个患者的皮肤衰减。该患者相依系数可用来校正使用示例1中描述的方法获得的离体计数。
·细胞速度：可以通过将使内部结构移位的自然液体流动、超声信号的辐射力或使用者在组织上施加的压力引起细胞速度。
在低信噪比(SNR)下，单个细胞速度增大单个细胞后向散射的检测能力，因为其允许将其与不传播的噪声区分开来。通过测量悬浮液中单个细胞的速度，例如借助于连续数据获取之间的相关性，可以知道细胞在给定时间内的最大位移。因此，还可通过选用或给定细胞速度范围来改善检测能力或灵敏度(如图9所示)。
·借助于激励信号的编码序列的灵敏度提升。
在信噪比(SNR)受损并且信号功率不能增大的情况下，例如，出于安全考虑，可以使用编码的激励序列增大SNR。一方面，因为不是单个脉冲，而是多个脉冲产生，信号能量的量较大。由于信号传输时间较长，功率保持不变但空间分辨率降低。为了恢复空间分辨率的损失，利用产生用于激励序列的唯一信号模式的匹配滤波器(或编码器)对脉冲序列进行卷积。这是被发送至系统的信号。在接收模式下，信号被解卷积或解码。对于源自其他源的接收信号，即噪声，因为信号模式不被识别，解码器输出低信号值。相反，当接收到编码信号时，信号被解码并产生高窄(相关)峰值。即使在信噪比接近于零的模拟中，该策略也很好地分辨出来自单个细胞的后向散射(如图10所示)。
如在本说明书开头所解释的，本发明的方法可用作诊断工具，并用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性。因此，本发明涉及本发明方法的用于诊断病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病以及对感染的炎症反应的用途。
因此，在第二方面，本发明涉及用于诊断受试者中的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病，或用于鉴别可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的方法，在下文中，本发明的第二方法包括：
a)通过根据本发明的第一方法的方法对受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，以及
b)将所述循环细胞的量与受试者中的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的存在相关联，其中高于参考值的循环细胞的量指示病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病，或指示受试者可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病。
用于待诊断的不同疾病的参考值在现有技术水平中是公知的，并且对技术人员而言是可获得的，以便将本发明付诸实施。
如本领域的技术人员所理解的，针对本发明的第一方法公开的所有特定实施例可以应用于本发明的第二方法。
在本发明的上下文中，术语“病毒疾病”是指由病毒引起的疾病，“原生动物疾病”是指由原生动物引起的疾病，“真菌疾病”是指由真菌引起的疾病，并且“细菌疾病”是指由细菌引起的疾病。
原生动物是可以从一个人传播至另一个人的单细胞生物体。那些居住在人肠中的原生动物可以通过排泄物-口腔途径从一个人传播至另一个人，例如通过共享被感染者触及的食物以及通过直接的人与人接触。生活在血液中的原生动物可以通过诸如蚊子的第三种来源传播。主要有四种引起人类感染的原生动物：肉足虫纲(变形虫)、鞭毛虫纲(鞭毛虫)、纤毛虫纲(纤毛虫)和孢子虫纲。可以用本发明的方法诊断的原生动物疾病的非限制性示例是变形虫病(例如痢疾阿米巴病(Entamoeba histolytica))、贾第虫病(例如兰伯氏贾第虫病(Giardia lamblia))、非洲昏睡病(例如，布氏锥虫病(Trypanosoma brucei))、利什曼病(例如利什曼原虫病(Leishmania.major)、婴儿利什曼虫病(L.infantum)和巴西利什曼虫病(L.braziliensis))、弓形体病(例如刚地弓形虫病(Toxoplasma gondii))、疟疾(例如恶性疟原虫病(Plamodium falciparum)、间日疟原虫病(P.vivax)、卵形疟原虫病(P.ovale)和三日疟原虫病(P.malariae))、巴贝斯虫病(例如微小巴贝斯虫病(Babesiamicroti)、邓氏巴贝斯虫病(B.duncani)、巴贝斯竹禾盾介壳虫病(B.divergens)和费氏巴贝斯虫病(B.venatorum))、毛滴虫病(阴道毛滴虫病)。
真菌疾病称为真菌病，可根据渗透至人体组织中的层将影响人类的真菌病进行分组。皮下真菌病侵入皮肤下面以涉及皮下、结缔以及骨组织。全身或深部真菌病能够感染内脏并在整个身体内广泛传播。真菌疾病的非限制性示例包括由真菌曲霉引起的曲霉菌病、诸如隐球菌性脑膜炎以及由真菌新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和隐球菌虫(C.gattii)引起的隐球菌性肺炎的隐球菌感染、由荚膜组织胞浆菌引起的组织胞浆菌病等。
可以通过本发明的第二方法诊断的细菌疾病的示例包括脑膜炎(由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)或大肠杆菌(Escherichia coli)引起)；脑炎、肺炎、肺结核等。
病毒疾病的示例包括但不限于脑膜炎、水痘、流感(流行性感冒)、疱疹、人体免疫缺陷病毒(HIV/AIDS)、人体乳头瘤病毒(HPV)、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、麻疹、风疹和带状疱疹。
在一个特定的实施例中，病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病是脑膜炎。
因此，本发明涉及一种用于诊断受试者的脑膜炎或用于鉴别可能患有脑膜炎的受试者的方法，包括：
a)通过根据本发明的第一方法的方法对受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，
b)将所述循环细胞的量与脑膜炎的诊断相关联，其中高于参考值的循环细胞的量指示脑膜炎，或指示受试者可能患有脑膜炎。
参考值在现有技术中是公知的，如本领域技术人员所知，它取决于患者的年龄。由于血脑屏障(blood brain barrier，BBB)随着年龄变得越来越难以渗透，脑膜炎的脑脊液(CSF)白血细胞(WBC)浓度的诊断水平对于小于29天的患者(大于20WBC/μl)要比对于在30-90天之间的患者(大于9WBC/μl)和对于大于90天(大于5WBC/μl)的患者高(Army,etal.2003Am Fam Physician 2003；68:1103-1108；Edwards等.2013.编辑D,TorchiaMM.Clinical features and diagnosis of acute bacterial meningitis in childrenolder than one month of age.Up to Date 2013；1-19)。
此外，如本说明书开头所解释的，由于可以通过囟门进行测量，本方法对于测量婴儿的CSF内的循环细胞是尤其有用的，而无需执行腰椎穿刺。在另一个特定的实施例中，循环细胞是WBC和/或浅表体液是CSF。
在第三方面中，本发明涉及一种用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性的方法，在下文中，本发明的第三方法包括：
a)通过根据本发明的第一方法的方法，在治疗之前和之后对受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，以及
b)将所述循环细胞的检测与施用于所述受试者的治疗的有效性相关联，
其中治疗之后的受试者中的循环细胞的量低于治疗之前的循环细胞的量指示治疗是有效的。
在本发明的第三方面中使用的术语和表达已经在先定义和解释，并且可以应用于本方面。类似地，涉及在先方面的所有特定的实施例也适用于本发明的第三方面。正如本领域技术人员所理解的，有必要留出足够的时间使治疗对于受试者发挥作用。
此外，CSF中的循环细胞的存在也可指示白血病。因此，本发明还涉及一种诊断白血病的方法，包括实施本发明的第一方法，以及如上面针对脑膜炎所解释的，将循环细胞的存在与受试者的白血病的存在相关联。
本发明还包括对应于本文公开的本发明的方法以及其特定实施例的用途实施例。
因此，另一方面，本发明涉及一种用于检测和量化受试者的浅表体液中的循环细胞的基于超声的设备的非介入性用途，用于诊断受试者的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病，用于鉴别可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者，或用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性，其中基于超声的设备以在10-50MHz范围内的中心频率和50-1000ns之间的脉冲持续时间以及30-150μm之间的波长操作。
在特定的实施例中，基于超声的设备发射的信号以20MHz的中心频率和/或500ns的脉冲持续时间和/或75μm的波长操作。
在特定的实施例中，循环细胞是白血细胞、红血细胞或癌细胞。
在特定的实施例中，浅表体液选自由脑脊液、血液、尿液、胸膜液、滑液和心包液组成的群组。
在特定的实施例中，病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病是脑膜炎。
另一方面，本发明第一方法的相同测量原理可应用于从受试者中提取的液体样品的离体(或体外)自动分析。在这种情况下，由于没有皮肤衰减，甚至可以使用更高的频率，并且超声设备可能能够在10-100MHz之间操作，其中脉冲在25和1000ns之间以及波长在15和150μm之间。
因此，在第四方面，本发明涉及一种用于检测和量化受试者的浅表体液中的循环细胞的体外方法，在下文中，本发明的第四方法包括：
a)将基于超声的设备放置为与从受试者的浅表体液分离的液体样品接触，以获得液体样品的超声数据；
b)通过提供关于细胞及其在液体中的浓度的信息的数据处理系统对步骤a)中获得的超声数据进行分析，以及
c)将步骤b)中获得的信息与个体中的循环细胞的存在和量相关联，
其中基于超声的设备以在10-100MHz范围内的中心频率和25-1000ns之间的脉冲持续时间以及15和150μm之间的波长操作。
另外，对于本发明的第一方法公开的所有特定的实施例以及与所述实施例相关的所有公开可以应用于本发明的第四方法。
本发明的第三方法的步骤a)包括将基于超声的设备放置为与从受试者的浅表体液分离的液体样品接触，以获得液体样品的超声数据。如本领域技术人员所理解的，基于超声的设备与液体样品之间的接触可以通过包含受体的样品的表面来完成。受体的衰减对于超声分析可能是微不足道的。
在第五方面，本发明涉及一种用于诊断受试者的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病、用于鉴别可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的体外方法，在下文中，本发明的第五方法包括：
a)通过根据本发明的第四方法的方法对受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，以及
b)将所述循环细胞的量与受试者的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的存在相关联，其中高于参考值的循环细胞的量指示病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病，或者指示受试者可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病。
在本发明第五方法的特定的实施例中，病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病是脑膜炎。
最后，在第六方面中，本发明涉及一种用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性的体外方法，下文中，本发明的第六方法包括：
a)通过根据本发明第四方法的方法，在治疗之前和之后对受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，以及
b)将所述循环细胞的量与施用于所述受试者的治疗的有效性相关联，
其中治疗之后的受试者中的循环细胞的量低于治疗之前的循环细胞的量指示治疗是有效的。
另外，对于本发明的第四方法公开的所有特定的实施例以及与所述实施例相关的所有公开可以应用于本发明的第五和第六方法。
此外，本发明还包括与本文公开的本发明的方法及其特定实施例对应的用途实施例。
因此，另一方面，本发明涉及用于检测和量化受试者的浅表体液中的循环细胞的基于超声的设备的体外用途，用于诊断受试者的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病或者用于鉴别可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者，或者用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性，其中基于超声的设备以在10-100MHz范围内的中心频率和25-1000ns之间的脉冲持续时间以及15-150μm之间的波长操作。
在特定的实施例中，基于超声的设备发射的信号以20MHz的中心频率和/或500ns的脉冲持续时间和/或75μm的波长操作。
在特定的实施例中，循环细胞是白血细胞、红血细胞或癌细胞。
在特定的实施例中，基于超声的设备包括换能器。
在特定的实施例中，浅表体液选自由脑脊液、血液、尿液、胸膜液、滑液和心包液组成的群组。
在特定的实施例中，病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病是脑膜炎。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。与本文所描述的相似或等同的方法和材料可用于实施本发明。在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变形不旨在排除其他技术特征、添加剂、组件或步骤。本发明的其他目的、优点和特征对于阅读说明书后的本领域技术人员将变得显而易见，或者可以通过实施本发明了解本发明的其他目的、优点和特征。以下示例是以说明的方式提供的，并不意图限制本发明。
附图说明
图1：所用方法的示意图。
图2：与用Fuchs Rosenthal血细胞计数器测量的WBC浓度相关的超声后向散射系数。虚线表示线性拟合，该线性拟合解释相较于WBC浓度的数据的后向散射变化(97％)，借助于判定系数R^2测得。该图展示高频超声用以明确地区分低于和高于脑膜炎诊断阈值的WBC浓度的能力，对于1-3个月大的婴儿和新生儿该阈值分别被设置为10个细胞/μL和20个细胞/μL。为了体内验证，需要调整系统以抵消囟门衰减以保持诊断灵敏度。
图3：血细胞计数器测量的WBC浓度为0、12和100个细胞/μL时的CSF样品的2D超声图像。在WBC浓度增大的图像中观察到散射体(细胞)的数量增加。在0个细胞/μL下没有观察到散射体(细胞)，而在多达100个细胞/μL时可以观察到个体散射。
图4：CSF空间中的细胞检测的图示描述。第一组信号从囟门层反射，如果细胞存在于液体中则获得第二组后向散射，并且第三组信号从液体-大脑接触面反射。该最后一组信号可用于指示换能器的最佳对准，因为它与所有组织层正交。
图5展示可用于将超声能量聚焦于不同点的换能器阵列。
图6：展示与液体接触的单个元件换能器的图示。(左)换能器在病灶区域中传送最大声能。换能器的灵敏度在病灶区域内最好。为了对液体的不同区域进行采样，如果使用多个元件则换能器的声束可以机械地移位或电子地移位。(中)施加至液体中的声压(或声辐射力)暗示遵循图案的液体位移，即，流体。(右)如果粒子被限制在液体中，只要它们的位置在换能器的视场内，它们就会被困在流体中。能量和脉冲重复频率越高，流速和被困在流体内部时的粒子速度越高。
图7：粒子的后向散射信号是通过散射物体被反射回换能器的信号。发射信号的波长越接近散射直径，后向散射信号越强。如右图所观察到的，由于部分能量被粒子反射而部分通过介质衰减，发射信号以较低能量在液体中保持传播。
图8：(左)不同大小的细胞的后向散射频谱示出能量随着细胞直径的增大而增加。在较大的频段实施(离体应用)中，对于较小的细胞，频率的最大值也向较高的频率移位。(右)由于较高的蛋白质浓度导致介质的衰减增加，后向散射频谱向较低的频率移位并且带宽变宽。
图9：在每次脉冲发射时，声压以取决于脉冲的能量和重复频率以及粒子和介质性质的速度导致粒子的位移。后向散射信号速度可以例如通过将连续采集相关联(图的右侧)而被跟踪，并被用于提高技术在受损的信噪比条件下的检测灵敏度。
图10：提高细胞灵敏度的编码系统的示意图。(顶部)在传输中，电脉冲被编码为具有总体较高能量的较大序列。该序列激发将该能量转换为输入至系统中的机械信号的换能器。(底部)在接收模式下，信号的SNR可能接近0dB，但编码模式仍然可以被解码器识别(解卷积、解相关)，如果检测到序列，解码器将输出一个峰值。
具体实施方式
在非介入性地检测体液成分变化方面存在临床兴趣。一个非常明显的示例是脑脊液(CSF)，其中目前只有介入性方法提供了液体成分或特征的准确信息。在感染的情况下，主要关注点在于检测外部病原体是否已经进入CSF空间。在这种情况下，免疫系统作出反应并将白血细胞(WBC)送至感染部位以杀死外部生物体。在离开外周血流的过程中，WBC穿透血管壁并允许血液蛋白渗漏至感染部位。液体空间中的细胞性和蛋白质水平的增加逐渐改变液体的整体性质，如其密度和粘度。
示例1
样品制备
CSF模拟样品以在0-100个细胞/μl范围内的不同浓度的白血细胞(WBC)被制成超滤形式的人血浆。将到达医院的液体分析实验室的来自多个白血细胞增多症患者的多个血液样品收集于试管中并用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)处理。将试管以300g离心10分钟，并使用来自每个EDTA试管的1-2mL血浆产生血浆混合库。测量混合库蛋白并添加生理盐水血清以获得0.5g/L的蛋白质水平的50mL的最终血浆体积。这种蛋白质基质构成了我们健康的模拟CSF。从每个EDTA试管中，用巴斯德移液管吸取1mL血沉棕黄层并转移至Wintrobe试管中。然后将10个Wintrobe试管以300g离心10分钟。对于每个试管，将WBC层吸取出并稀释在1mL蛋白质基质中。从该1mL母液中制备细胞稀释液以获得0-100WBC/μL范围内的浓度。借助于Fuchs Rosenthal血细胞计数器进行细胞计数和分类。
方法
使用单个元件换能器(V3320，Olympus，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)对细胞样品进行超声波扫描。换能器中心频率为75MHz，具有从42.5MHz到101MHz的-6dB带宽、焦点位于12.5mm处、f值为2。用Panametrics 5900PR脉冲发生器(Olympus，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)激发换能器，并将换能器连接至Picoscope 6402D示波器(Pico Technology，剑桥郡，英国)。以焦点为中心的序列RF信号被获取并存储于工作站中用于后处理。使细胞样品与换能器直接接触，并被包含在专门设计的盘绕在换能器上的PVC盖中。由于通过液体介质的衰减和细胞响应，接收到的脉冲以45MHz为中心，具有33μm的波长和45ns的脉冲持续时间。通过6mm孔径将样品吸取进和吸取出盖腔(图1)。样品保持在4℃，并在样品制备后三小时内测量，以保持细胞活性水平高于90％。使用450μL样品体积以确保声聚焦浸没在样品中。使用图1中描述的方法并相较于血细胞计数器结果从RF信号计算后向散射系数。使用泊松模量接近于0.5(在此频率范围中该值用于细胞)的Anderson模型，在理论上研究来自细胞的经后向散射的信号的时间和频率响应。
结果
图2展示将后向散射能量与血细胞计数器测得的总WBC计数相关以及将后向散射能量与血细胞计数器测得的WBC计数相关的两种线性趋势。结果显示后向散射信号与WBC增加呈线性一致(R^2：0.97)。
示例2
细胞样品制备
见上面的示例1。
方法
使用商业超声系统(DermaScan C USB,Corex Technologies,海松,丹麦)对细胞样品进行超声波扫描。换能器中心频率为20MHz(脉冲波长，75μm)，其具有从17.5MHz到22.5MHz的范围的-6dB带宽、60μm(轴向)×150μm(横向)的系统分辨率、位于6mm处的焦点、1.21mm的线性扫描、5fps的帧率。
结果
从成像系统获得0-100个细胞/μl浓度的2D图像。图3展示与0、12和100WBC/μl样品对应的三个图像。尽管系统分辨率与粒子大小不匹配，但在图像中观察到的个体回波可附属于(attached to)单个细胞。在被散射的声能的波长可能大于弱散射(非谐振)粒子的大小(即λ>2πa，其中λ可以表示波长并且“a”可以表示粒子半径)的长波长极限中，经后向散射的能量可能是由瑞利散射引起的，并且它可能取决于粒子的可压缩性和密度与液体悬浮液介质的可压缩性和密度之间的对比度以及粒子的体积。由制造商给出的轴向分辨率为60μm，样品中WBC的半径约为6μm。因此，2πa/λ等于0.63(<1且a/λ<1/10)，结论是后向散射效应在瑞利区域内。
示例3
脑膜炎的非介入性诊断
细菌性脑膜炎(BM)是一种非常具有攻击性的疾病，会影响中枢神经系统并且仍然会导致年幼婴儿和新生儿的高发病率和死亡率。发展中国家中的死亡率约为40-58％，发达国家中的死亡率约为10％。这种疾病的临床表现非常明确，以发热最常见，有时仅为征兆。诊断需要脑脊液(CSF)的样品，脑脊液是围绕脑和脊髓的液体。目前，腰椎穿刺是获得CSF样品以分析其成分特征的唯一方法。然而，腰椎穿刺是一种介入性过程，难以对婴儿和新生儿进行，并且经常(高达48％)是创伤性的，这意味着血液污染样品导致不可靠的CSF结果。在比发达国家的疾病发病率(每10万人10例)高10倍(流行地区)甚至100倍(流行季节)的发展中国家，通常由于缺乏用于分析样品的实验室设施而无法进行腰椎穿刺。因此，诊断主要基于医生或在他/她缺席时遵循临床方案的护士察觉到的临床症状。在发达国家，由于实验室设施丰富，并且考虑到在延迟治疗情况下受感染患者预后不佳，医生对脑膜症状(例如发热)患者进行腰椎穿刺的阈值较低。此外，具有增大的CSF WBC计数(小于1个月的新生儿超过20个细胞/μL，1-3个月大的婴儿超过10个细胞/μL)的患者将立即获得对于BM的经验性抗生素治疗，直到CSF细菌培养物结果可用(48-72小时后)。虽然这是一项安全的策略，但这导致95％的没得BM的婴儿接受腰椎穿刺术，其中许多患者也接受抗生素治疗。因此，在BM发病率低的发达国家，这种策略不会给非BM患者的医疗保健带来任何好处。因此，对于发达国家以及资源匮乏的国家，我们认为需要更好的、更易于使用的方法。
本发明的方法使用高频超声以通过囟门(图4)感测CSF中细胞的存在以及信号处理以检测个体细胞并提供CSF细胞浓度，以帮助脑膜炎的非介入性诊断并将腰椎穿刺数量减少到仅仅是必需的数量。
高频超声制造商：
临床前期成像
VisualSonics Inc.(加拿大)
Atys medical(法国)
皮肤科
Atys medical(法国)
TPM,Taberna Pro Medicum(德国)
Cortex技术(丹麦)
Sonoscape(中国)
Sonosite,Inc(美国)
Longwood,Inc(美国)
Esaote(意大利)
GE Healthcare(美国)
1.听觉基础和概念发展
1.1采样
1.1.1.体积采样
超声设备(或换能器)在液体体积的小区域(即病灶区域)施加最大的压力信号。如果设备由保持静态的一个单个元件组成，则仅获得一维数据。如果要对液体体积的多个区域进行采样，则可以对单个元件进行机械或电子移位，并可以获得二维或三维数据(或图像)。当使用多个元件时，可以通过电子操控声束来对一部分或整个液体体积进行成像(图5)。
1.1.2聚焦的声辐射力
换能器施加的声压产生可引起液体体积中的流动的声辐射力。这种流动随着脉冲重复频率(PRF)(即压力信号发射的频率)增大而增加，并且在病灶区域中是最大的(图6)。
1.2液体表征
1.2.1单个细胞的声后向散射
如果液体体积(悬浮液)中有细胞，部分压力信号被细胞反射回至换能器(图7)。这些来自单个细胞的反射信号被称为声后向散射的信号或后向散射。随着发射信号的波长接近细胞的大小(即发射信号的频率增大)，后向散射能量增加。因此，每当我们在文中提到换能器时，应该理解我们指的是高频换能器。也需要信号和数据处理以提供细胞浓度的测量(参见第2节)。
1.2.2来自细胞的后向散射的谱含量
后向散射信号的谱含量是产生这种后向散射信号的细胞的标志。诸如大小和成分的细胞性质与后向散射信号的能量、频率和带宽有关。类似地，悬浮液介质的粘度还可以与后向散射谱以及在液体和容器远端壁之间的接触面处反射的信号的谱的频移和带宽变化有关。这种分析只有在非常低的皮肤衰减或离体液体分析时才是可行的(图8)。
1.2.3细胞速度
可以通过将使内部结构移位的自然液体流动、超声信号的辐射力或使用者对组织所施加的压力引起细胞速度。
在低SNR下，单个细胞速度增大了单个细胞后向散射的检测能力，因为它允许将单个细胞后向散射与不传播的噪声区分开来。通过测量悬浮液中单个细胞的速度，例如借助于连续数据获取之间的相关性，可以知道细胞在给定时间内的最大位移。因此，还可通过选用或给定细胞速度范围来改善检测能力或灵敏度(图9)。
1.2.4借助于激励信号的编码序列的灵敏度提升
在信噪比(SNR)受损并且信号功率不能增大的情况下，例如，出于安全考虑，可以使用编码的激励序列增大SNR。一方面，因为不是单个脉冲，而是多个脉冲产生，信号能量的量较大。由于信号传输时间较长，功率保持不变但空间分辨率降低。为了恢复空间分辨率的损失，利用产生用于激励序列的唯一信号模式的匹配滤波器(或编码器)对脉冲序列进行卷积。这是被发送至系统的信号。在接收模式下，信号被解卷积或解码。对于源自其他源的接收信号，即噪声，因为信号模式不被识别，解码器输出低信号值。相反，当接收到编码信号时，信号被解码并产生高窄(相关)峰值。即使在信噪比接近于零的模拟中，该策略也很好地分辨出来自单个细胞的后向散射(图10)。
1.3结构测量
1.3.1液体厚度计算
当体液被限制在两个组织之间时，可以基于信号在液体中的声速和在液体周围的组织的接触面处的反射信号的时间距离来估计液体的厚度。
由换能器接收到的信号应当由来自外部组织的第一组反射、代表液体中的成分的第二信号(细胞的后向散射，如有)和来自液体周围的最浅组织的最后一组反射信号组成。
1.4.操作因素
1.4.1.对准检查
继续上面的描述，当没有给出该接收信号结构和构成时，这意味着至少一个组织成分不在换能器的视场内。通过重新定位或重新定向换能器，可以识别反射信号组，这将指示换能器的对准是正确的。此时，来自液体的单个细胞后向散射信号可以被隔离或被选用并进一步分析。应注意，不接收来自液体周围的较深组织的反射的事实不一定阻止从液体接收单个细胞后向散射。
2.信号处理和分析
2.1在感兴趣的频率范围内的后向散射能量分析
返回的后向散射的信号是时间选通的，以仅包括位于5-15mm之间的距离处且具有从几百微米到2mm的长度的声聚焦。病灶体积是对液体中的细胞具有最大灵敏度的区域。信号经过快速傅立叶变换，分析15-30MHz频率范围内的功率谱，以计算细胞浓度和细胞性质。
2.2改进的细胞回波检测
2.2.1互相关
连续的RF信号(或其包络形式)被互相关以找到归因于细胞的信号线性一致性。在将互相关的信号归一化为RF信号的能量之后，使用范围为从0.3至0.9的阈值识别可以附属于来自细胞的回波的互相关峰。在十分之几毫秒量级的获取速率下，通过焦点的对应于移动细胞的互相关峰的移位被用来确定细胞速度。可选地，可以使用谱后向散射频率峰值的相移。如果借助于线性扫描的单个元件换能器或线性阵列或2D阵列获得2D-3D图像，则可以将霍夫(Hough)变换应用于数据，作为检测细胞及其轨迹和速度的有效技术。在使用细胞检测算法对细胞的数目进行计数之前，霍夫变换后的数据随后可被设定阈值。
2.2.2编码激励
编码激励技术(chirp,golay,barker)用来改善接收到的后向散射信号的信噪比。由匹配滤波器将脉冲编码为序列或序列的组合并传输至身体中。只有当接收到的信号特征与匹配滤波器的编码序列相匹配时，然后通过接收器电路中的匹配的滤波器的副本对接收到的信号进行解卷积，在脉冲频带中产生明显的谱峰。
2.3体积估算
2.3.1基于细胞回波强度的方法(1D或2D)
通过关于先前以不同衰减测得的有效病灶体积关联病灶区域中的细胞回波的平均强度水平，可以获得对采样体积的估计，因为衰减越大，有效采样体积减小越多。为此，对细胞回波的强度频率分布进行分组(binned)，并且计算横跨概率阈值(例如10％)的分布参数，如强度水平跨度。细胞回波强度水平跨度越大，被采样的病灶体积越大。强度水平跨度和有效采样体积之间的这种关系可以针对不同的衰减进行校准。可选地，可以将强度水平改变映射至有效采样体积。细胞回波强度水平越低，衰减越大，有效采样体积越小。类似地，可以预先校准细胞回波相对于有效采样体积的强度移位。
2.3.2 2D阵列、线性扫描的1D阵列、2D扫描的单个元件
如果3D体积是借助于2D阵列、经线性扫描的线性阵列或2D扫描的单个元件获得的，则可以通过与图像像素维度的最小误差估计体积。
2.4细胞性质和活性
可以从返回的细胞后向散射信号的谱能量、谱带宽或谱斜率确定细胞浓度、大小和活性。
细胞后向散射能量与范围为0-100个细胞/μL的细胞浓度线性相关。在较高浓度下，位于散射细胞和换能器之间的细胞在后向散射信号的方向上衰减细胞后向散射。
如果通过将回波强度与细胞大小相关联获得3D图像，则大小由细胞回波宽度确定。
可以通过在感兴趣的频率范围内的后向散射能量(细胞核硬度的测量)和谱斜率(散射体大小的测量)的组合确定细胞活性。存在涉及细胞核的不同结构变化的不同的细胞死亡方式。在细胞凋亡中，细胞核被压缩和分裂，细胞的大小减小，后向散射的能量增加且谱斜率得以维持。在有丝分裂抑制/突变中，细胞和细胞核大小增大，后向散射能量增加，但谱斜率减小。

Claims (33)

1.一种用于检测和量化受试者的浅表体液中的循环细胞的基于超声的设备的体外用途，用于诊断受试者中的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病，用于鉴别可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者，或用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性，其中所述基于超声的设备以在10-100MHz范围内的中心频率和25-1000ns之间的脉冲持续时间以及15和150μm之间的波长操作。
2.根据权利要求1所述的体外用途，其中由所述基于超声的设备发射的信号以20MHz的中心频率和/或500ns的脉冲持续时间和/或75μm的波长操作。
3.根据权利要求1或2所述的体外用途，其中所述循环细胞是白血细胞、红血细胞或癌细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外用途，其中所述基于超声的设备包括换能器。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的体外用途，其中所述浅表体液选自由脑脊液、血液、尿液、胸膜液、滑液和心包液组成的群组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的体外用途，其中所述病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病是脑膜炎。
7.一种用于检测和量化受试者的浅表体液中的循环细胞的体外方法，包括：
a)将基于超声的设备放置为与从所述受试者的浅表体液分离的液体样品接触，以获得所述液体样品的超声数据；
b)通过提供关于细胞及其在所述液体中的浓度的信息的数据处理系统对步骤a)中获得的所述超声数据进行分析，以及
c)将步骤b)中获得的所述信息与所述个体中的所述循环细胞的存在和量相关联，
其中所述基于超声的设备以在10-100MHz范围内的中心频率和25-1000ns之间的脉冲持续时间以及15和150μm之间的波长操作。
8.根据权利要求7所述的方法，其中由所述基于超声的设备发射的信号以20MHz的中心频率和/或500ns的脉冲持续时间和/或75μm的波长操作。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述循环细胞是白血细胞、红血细胞或癌细胞。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述基于超声的设备包括换能器。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中获得的所述超声数据的形式为(i)A线数据的采集和/或(ii)B模式或C模式类型的2D数据或3D数据。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述数据处理系统包括算法。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述关于细胞的信息是细胞大小、细胞浓度和/或细胞活性。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述浅表体液选自由脑脊液、血液、尿液、胸膜液、滑液和心包液组成的群组。
15.一种用于诊断受试者中的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病或用于鉴别可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的体外方法，包括：
a)通过根据权利要求7至14中任一项所述的方法对所述受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，以及
b)将所述循环细胞的量与所述受试者中的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的存在相关联，其中所述循环细胞的量高于参考值指示病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病，或指示所述受试者可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病。
16.一种用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性的体外方法，包括：
a)通过根据权利要求7至14中任一项所述的方法，在治疗之前和之后对所述受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，以及
b)将所述循环细胞的量与施用于所述受试者的所述治疗的所述有效性相关联，
其中所述治疗之后的所述受试者中的所述循环细胞的量低于所述治疗之前的所述循环细胞的量指示所述治疗是有效的。
17.根据权利要求15或16所述的体外方法，其中所述病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病是脑膜炎。
18.一种用于检测和量化受试者的浅表体液中的循环细胞的基于超声的设备的非介入性用途，用于诊断受试者中的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病，用于鉴别可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者或用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性，其中所述基于超声的设备以在10-50MHz的范围的中心频率和50-1000ns之间的脉冲持续时间以及30和150μm的波长操作。
19.根据权利要求18所述的非介入性用途，其中由所述基于超声的设备发射的信号以20MHz的中心频率和/或500ns的脉冲持续时间和/或75μm的波长操作。
20.根据权利要求18或19所述的非介入性用途，其中所述循环细胞是白血细胞、红血细胞或癌细胞。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的非介入性用途，其中所述浅表体液选自由脑脊液、血液、尿液、胸膜液、滑液和心包液组成的群组。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的非介入性用途，其中所述病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病是脑膜炎。
23.一种用于检测和量化浅表体液中的循环细胞的非介入性方法，包括：
a)将基于超声的设备放置在受试者的皮肤上以用于获得所述皮肤下的所述浅表体液的超声数据；
b)通过提供关于细胞及其在所述液体中的浓度的信息的数据处理系统分析步骤a)中获得的所述超声数据；以及
c)将步骤b)中获得的所述信息与所述受试者中的循环细胞的存在和量相关联，
其中所述基于超声的设备以在10-50MHz的范围中的中心频率和50-1000ns之间的脉冲持续时间以及30和150μm之间的波长操作。
24.根据权利要求23所述的方法，其中由所述基于超声的设备发射的信号以20MHz的中心频率和/或500ns的脉冲持续时间和/或75μm的波长操作。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述循环细胞是白血细胞、红血细胞或癌细胞。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述基于超声的设备包括换能器。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中获得的所述超声数据的形式为(i)A线数据的采集和/或(ii)B模式或C模式类型的2D数据或3D数据。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述数据处理系统包括算法。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述关于细胞的信息是细胞大小、细胞浓度和/或细胞活性。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述浅表体液选自由脑脊液、血液、尿液、胸膜液、滑液和心包液组成的群组。
31.一种用于诊断受试者中的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病或用于鉴别可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的方法，包括：
a)通过根据权利要求23至30中任一项所述的方法对所述受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，以及
b)将所述循环细胞的量与所述受试者中的病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的存在相关联，其中所述循环细胞的量高于参考值指示病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病，指示所述受试者可能患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病。
32.一种用于监测施用于患有病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病的受试者的治疗的有效性的方法，包括：
a)通过根据权利要求23至30中任一项所述的方法，在治疗之前和之后对所述受试者的浅表体液中的循环细胞进行量化，以及
b)将所述循环细胞的检测与施用于所述受试者的所述治疗的所述有效性相关联，
其中所述治疗之后的所述受试者中的所述循环细胞的量低于所述治疗之前的所述循环细胞的量指示所述治疗是有效的。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述病毒、原生动物、真菌和/或细菌疾病是脑膜炎。
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