CN108472374A - 调节纤毛发生 - Google Patents
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Abstract
本公开是基于以下发现:能够与染色质结合/重塑复合物(例如多梳家族PRC1和三胸家族MLL)结合(或相互作用)和/或对其进行调节的化合物能够用于调节(例如开/关转换)可出现在例如人肺支气管上皮中的纤毛发生。提供了可以用于治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症的化合物、组合物、方法和药物。
Description
技术领域
本发明涉及细胞中的纤毛发生,并且提供了用于调节纤毛发生以及预防和/或治疗与其相关的疾病的化合物、组合物、用途、药物和方法。
背景技术
命名为R2R1的蛋白质属于FAM25蛋白质家族,并且对于肺上皮细胞的维持和再生是必不可少的,更特别是对于基底细胞程序。浸没的原代支气管上皮细胞(PrimaryBronchial Epithelial Cells,PBEC)的实验发现了这种功能。浸没培养条件的特征在于未分化PBEC的细胞快速增殖。因此,浸没培养条件对于研究基底细胞(′人支气管肺(′气道’)上皮的干细胞′是理想的。
纤毛细胞的丧失导致粘膜纤毛清除效率低下,特别是在患有COPD的患者中。这实际上是COPD的病理学标志:异常的支气管上皮细胞(纤毛细胞丢失,鳞状分化和基底细胞超常增生)不能清除气道的粘液、细菌、病毒和碎片。这种无效的清除机制将导致严重的症状(包括咳嗽,支气管肺感染和肺内气体交换不足),导致高死亡率。
本发明旨在提供利用R2R1在纤毛发生中的作用来提供与其相关的病症和疾病的治疗的化合物,组合物、用途、药物和方法。
发明概述
本发明源于发现能够与染色质结合/重塑复合物结合(或相互作用)的化合物(例如多梳家族PRC1(Polycomb group PRC1)和三胸家族MLL(Trithorax group MLL))和/或其调节可以用于调节(例如变换开/关状态)例如可能发生在人肺支气管上皮中的纤毛发生。
具体而言,命名为呼吸细胞再生基因1(regenerative gene for respiratorycells 1,R2R1)的基因编码蛋白质,该蛋白质现在已经被鉴定为多梳抑制剂复合物1(Polycomb Repressor Complex 1,PRC1)和三胸家族-MLL(Trithorax group-MLL,TrxG-MLL)复合物的组分的结合配偶体。PRC1复合物由一组定义的多梳家族(Polycomb group,PcG)蛋白组成。TrxG-MLL复合物也称为COMPASS样复合物,由一组定义的三胸家族(Trithorax group,TrxG)蛋白组成。R2R1蛋白质与PRC1/trxG-MLL复合物和/或PcG或TrxG蛋白之间的相互作用导致调节人支气管上皮中的纤毛发生。
第一方面,本发明提供与染色质结合/重塑复合物结合、缔合合或相互作用的化合物,用于治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症。
进一步提供的是与染色质结合/重塑复合物结合、缔合合或相互作用的化合物在制造用于治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症的药剂中的用途。
还提供了治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生相关的疾病和/或病症的方法,所述方法包括以下步骤:给有其需要的受试者施用治疗有效量的化合物,所述化合物与染色质结合/重塑复合物结合、缔合合或相互作用。PRC1类复合物压缩染色质并抑制染色质重塑。同样地三胸家族-MLL(TrxG-MLL)复合物也参与染色质结合/重塑。
因此,本发明的另一方面提供了与PRC1和/或TrxG-MLL结合、缔合或相互作用的化合物,用于治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症。
另一方面提供了与PRC1和/或TrxG-MLL结合、缔合或相互作用的化合物在制造用于治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症的药物中的用途。
本发明进一步提供治疗或预防与异常或有缺陷的纤毛发生相关的疾病或病症的方法,所述方法包括给有其需要的受试者施用治疗有效量的化合物,所述化合物与PRC1和/或TrxG-MLL结合、缔合合或相互作用。
不希望受理论束缚并且如下更详细地解释,发明人已经发现R2R1蛋白质可以与染色质结合/重塑复合物的组分(例如蛋白质或肽组分)结合或缔合/相互作用,所述复合物包括例如PRC1和TrxG-MLL复合物;在这样做的过程中,R2R1蛋白质可作为人体支气管上皮细胞发生的“开/关”的切换开关。因此,调节或模拟R2R1的表达、功能和/或活性的化合物可用作调节(例如恢复,增强或抑制(即开/关))细胞中纤毛发生的手段和/或作为由异常或有缺陷的纤毛发生引起或促成的疾病、病症和/或综合征的治疗基础。调节或模拟R2R1的表达、功能和/或活性的化合物可以与存在于染色质结合/重塑复合物(包括PRC1/TrxG-MLL复合物)内的或其某些(或特异性)组分内的R2R1结合位点结合或以其他方式缔合。与这些(PRC1/TrxG-MLL)复合物(或其组分)内的R2R1结合位点的任何结合或缔合的作用可以是调节细胞中的纤毛发生。因此,可以使用或利用与这些复合物内的R2R1结合位点(例如PRC1/TrxG-MLL R2R1结合位点)结合和/或缔合的化合物以调节纤毛发生和/或治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生相关或由其引起或促成的疾病、病症和/或综合征。
鉴于以上所述,本公开涉及供使用的化合物(所述化合物能够与染色质结合/重塑复合物PRC1、TrxG-MLL和/或其R2R1结合位点结合、缔合或相互作用),使用的组合物(包含能够与染色质结合/重塑复合物PRC1、TrxG-MLL和/或其R2R1结合位点结合、缔合或相互作用的一种或多种化合物),包含能够与染色质结合/重塑复合物PRC1、TrxG-MLL和/或R2R1结合位点结合、缔合或相互作用的化合物的组合物/药物的用途以及利用其的方法。此外,本发明涉及化合物(供使用),组合物(供使用),药物(供使用)以及利用模拟或调节R2R1的表达、功能和/或活性的化合物的方法。模拟R2R1功能的化合物可表现出野生型R2R1蛋白质的一个或多个性质和/或功能。例如,R2R1模拟物可能与PRC1、TrxG-MLL或其组分或亚基结合或缔合。R2R1模拟型化合物可以例如经由R2R1结合位点与染色质结合/重塑复合物,PRC1,TrxG-Mll或其组分结合或缔合-换句话说,R2R1模拟型化合物可以与染色质结合/重塑复合物,PRC1和/或TrxG-MII R2R1结合位点结合或缔合/相互作用。调节R2R1的表达、功能和/或活性的化合物可以增强或抑制其表达、功能和/或活性。用于本发明的化合物可干扰、防止或抑制天然或野生型R2R1和PRC1TrxG-MLL和/或二者中任一种的组分或亚基之间的结合。
贯穿本公开,这些方面和实施方案将被称为“化合物、组合物、用途、药物和方法”。此外,本公开内容常规地提及术语“PRC1”和“TrxG-M11”-这些是“染色质结合/重塑”复合物的示例性(但不一定是限制性)实例。
应该理解的是,在整个说明书中,术语“包括”用于表示本公开的方面和实施方案“包括”了一个或多个特定特征。应该理解的是,术语“包括”还可以涵盖“基本上由相关特征组成”或“由相关特征组成”的方面和/或实施方案。
多梳抑制复合物1(Polycomb Repressive Complex 1,PRC1)是多蛋白质复合物,并且用于本发明各方面和实施方案(即用途,组合物,药物和方法)的化合物可包括与一种或多种PRC1亚基或其任何R2R1结合位点结合或缔合的那些。众所周知,PRC1可以互换组分,产生典型和非典型的复合物。PRC1对染色质的作用(H2A泛素化,募集PRC2和以其抑制形式辅助PRC2)由其不同的组分蛋白质决定。然而,注意到PRC1的环指蛋白2(Ring FingerProtein 2,RNF2)亚基始终存在。在本发明的背景下,各种组合物、用途、药物和方法可利用能够结合PRC1的环指蛋白2(RNF2)亚基的化合物。能够与RNF2结合或缔合的化合物可以靶向其R2R1结合位点。
可用于本发明各方面和实施方案(即用途,组合物,药物和方法)的化合物可包括与染色质修饰性TrxG-MLL(Trithorax Group-Mixed Lineage Leukemia)复合物的组分结合或缔合的那些。与PRC1相反,TrxG-MLL通过H3K4甲基化维持活性基因表达。事实上,TrxG-MLL的功能与PRC1的功能是互补的。PRC1负责抑制染色质修饰,并因此涉及与TrxG-MLL的重度相互沟通联系,TrxG-MLL是控制激活转录的染色质修饰的复合物。TrxG-MLL包含核心结构,其本身包含许多亚基蛋白质,包括例如命名为DPY-30和ASH2L的蛋白质。DPY-30和ASH2L总是存在于不同的TrxG-MLL复合物中,并且对于TrxG-MLL的组蛋白H3Lys-4(三)甲基化活性是必不可少的。本发明的化合物可以经由DPY-30和/或ASH2L组分与TrxG-MLL复合物结合或缔合。换句话说,用于本发明的化合物可以与DPY-30和/或ASH2L结合或缔合。能够与DPY-30和/或ASH2L组分结合或缔合的化合物可以靶向这些组分中的任一个(或两者)的R2R1结合位点。
可用于本发明各方面和实施方案(即用途,组合物,药物和方法)的化合物可进一步包括结合SF3B2蛋白质(一种非典型PRC1复合物的组分)的那些。在本发明的背景下,各种组合物、用途、药物和方法可以利用结合PRC1的SF3B2亚基的化合物。能够靶向PRC1的SF3B2亚基的R2R1结合位点的化合物可以靶向其R2R1结合位点。
可用于本发明各方面的化合物(所述化合物与PRC1,TrxG-MLL(包括其组分,亚基和/或R2R1结合位点)结合或缔合)可以采取核酸(RNA,DNA和/或合成/人造形式),反义寡核苷酸,碳水化合物,蛋白质,肽,小分子,抗体(包括其抗原或靶标结合片段)的形式。
用于本发明的核酸分子(作为表达或编码R2R1蛋白质/肽的试剂,其结合(i)上述任何公开的复合物(ii)所述复合物的任何R2R1结合位点或(iii)其自身调节R2R1的功能,表达和/或活性)可以包含或来源于下文命名为SEQ ID NO:1的序列。
SEQ ID NO:1表示鼠R2R1基因的示例性转录物。该序列的编码或翻译部分加下划线并包含约267个核苷酸。SEQ ID NO:1的这个特定部分应被指定并称为SEQ ID NO:2。
用于本发明的核酸分子可以包含或来源于下文命名为SEQ ID NO:3的序列。
SEQ ID NO:3代表人R2R1基因的示例性转录物。该序列的编码或翻译部分加下划线并包含约267个核苷酸。SEQ ID NO:3的这个特定部分应被指定并称为SEQ ID NO:4。
SEQ ID NO:2的267个核苷酸残基编码包含89个氨基酸并具有以下序列(命名为SEQ ID NO:5)的蛋白质/肽:
SEQ ID NO:4的267个核苷酸编码包含89个氨基酸并具有以下序列(命名为SEQ IDNO:6)的蛋白质/肽:
因此,本发明涉及核酸序列,其包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的全部或部分(部分或片段),由其编码的氨基酸序列以及包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的全部或部分(部分或片段)的氨基酸序列。本发明进一步涉及与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的全部或部分(片段)显示一定程度的同一性和/或同源性的核酸和/或氨基序列。
为了方便起见,SEQ ID NO:1-6(其中每个编码或提供R2R1蛋白质)的序列在下文中可以称为“参考序列”。
本公开的参考序列的片段可以包含任何数量的核酸/氨基酸残基。例如,用于本发明的片段可以包含约5-10个残基至约n-1个残基,其中“n”是参考序列中(核酸/氨基酸)残基的总数。例如,本发明的参考序列的片段或部分可以包含至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、80、85、88、90、95、100、150、200、250、265、266、267、300、341、350、400或424个残基-上限(n-1)取决于编码完整蛋白的核酸序列的大小(n)或包含蛋白质的完整一级序列的氨基酸残基的数量(n)。
同源或相同的序列可以是天然存在的并且可以在诸如啮齿动物和/或人类的哺乳动物中发现。使用本文所述的核酸和/或氨基酸序列,本领域技术人员可以容易地鉴定较大的基因组序列中的和其他物种例如其他哺乳动物等中的相关(例如同源的或相同的)序列。例如,衍生自本文公开的任何核酸序列的核酸序列可以用作探针以检测其他(非鼠或人)物种的基因组内的同源/相同或紧密相关的序列。
可以使用例如分子,测序,PCR和/或克隆技术构建同源或相同的序列。本领域的技术人员将容易理解,与本文公开的任何序列(下文中称为“参考序列”)同源或相同的序列(包括此类序列的(功能)片段)可相比于相关序列或片段的全部或部分表现出约20%或30%的序列同源性或同一性。在其他情况下,同源或相同序列可表现出与本文公开的任何序列至少40、50、60、6570、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%同源性或同一性。例如,SEQ ID NO:2和4-两者都提供在本发明中有用的核酸序列(作为药物本身或编码有用蛋白质或肽的序列)在整个267个氨基酸长度中具有81.3%同一性。因此,例如参照SEQ IDNO:2的序列,显示约80%序列同源性同一性的序列是有用的。当比对SEQ ID NO:1和3时,序列约64%相同,因此,参照SEQ ID NO:1,例如,其表现出约64%的序列同源性或同一性的序列是有用的。
两个或更多个(氨基酸或核酸)序列之间的“同源性”程度(或百分比)可以通过以下来确定:比对序列和确定相同或不相同(由于冗余核苷酸取代取代而不同(冗余核苷酸取代对特定密码子编码的氨基酸或保守氨基酸取代没有影响))的比对残基的数目。可以使用基本局部比对搜索工具(BLAST:Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.(1990)″Basic local alignment search tool.″J.Mol.Biol.215:403-410)来评估同源性。
两个或更多个(氨基酸或核酸)序列之间的“同一性”程度(或百分比)也可以通过比对序列和确定比对的序列之间精确的残基匹配的数目并将该数目除以比较的残基总数-将得到的数字乘以100将产生序列之间的同一性百分比。
每个参考序列编码与PRC1和/或TrxG-MLL(一个组分/多个组分或R2R1结合位点)结合、相互作用或以其它方式缔合的蛋白质或肽;因为此处描述的参考序列中任何一个的有用片段或显示出与SEQ ID NO 1-6(或其片段)中的任一个所需的同源性或同一性水平的有用序列可以编码或提供功能性蛋白质或肽-即表现出对PRC1和/或TRXG-MLL和/或任何这些的组分或亚基结合或具有亲和力的蛋白质或肽。表现出与PRC1和/或TRXG-MLL结合/缔合/具有亲和力的蛋白质或肽可以与其R2R1结合位点结合/缔合/具有亲和力。
鉴于上文,可用于本发明各方面的化合物可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:本文公开的核酸(例如由SEQ ID NO:1、2、3或4提供的核酸),由此编码的肽/蛋白质以及本文公开的任何蛋白质或肽(例如由SEQ ID NO:5或6提供的蛋白质或肽),包含本文所述的核酸/氨基酸序列的部分或片段的核酸或蛋白质/肽序列,与本文公开的核酸或氨基酸序列表现出一定水平的同源性或同一性的核酸或蛋白质/肽序列。
另外,本发明可以利用变体核酸或氨基酸序列。例如,相对于本发明的参考序列,变体核酸或氨基酸序列可以是包含(或带有或包括)一种或多种多态性或核酸/氨基酸添加、取代、倒位或缺失的天然变体。此外,本领域众所周知,遗传密码的简并性允许在密码子中取代一个或多个碱基而不改变一级氨基酸序列。如此,可以利用遗传简并性以产生编码与本文所述参考序列基本上相同的肽或蛋白质序列的变体核酸序列。通过利用一个或多个“保守”残基置换也可以产生有用的变体序列。本领域的技术人员将理解,术语“保守置换”旨在包括例如用具有类似性质并且基本上不改变天然(或野生型)蛋白质的物理化学性质和/或结构或功能的替代性氨基酸替换本公开的参考蛋白质或肽序列的一个或多个氨基酸。
因此,应当理解的是,所有这些变体,尤其是那些功能性的或显示期望的活性或编码功能性肽/蛋白质的变体,也就是说,表现出结合或缔合PRC1和/或TrxG-MLL复合物和/或任何这些的组分或亚基的能力的蛋白质/肽可用于本发明。
本发明可以利用在细胞中调节R2R1基因(其示例性序列如上述SEQ ID NO:1-4所示)表达和/或R2R1蛋白质/肽(其示例性序列提供为上述SEQ ID NO:5和6)的活性、功能和/或表达的化合物(例如抑制剂化合物)。例如,用于本发明的化合物可以采取反义寡核苷酸或RNAi型抑制剂的形式。这种类型的化合物被设计为通过靶向特定的DNA或RNA序列干扰转录/翻译过程。反义寡核苷酸/分子可以包含DNA和/或RNA,并且可以用于显著降低或消除R2R1基因或其蛋白质产物的表达。例如,反义DNA序列可以包含与本文公开的任何核酸参考序列的一部分互补的短序列。例如,反义序列可以包含以SEQ ID NO 1-4提供的任何序列的约5至50个连续核酸残基。用于本发明的反义RNA序列可以与R2R1 mRNA序列的某个部分互补。其他类型的有用的反义或抑制性RNA/DNA分子可以包括称为microRNA(miRNA),小/短干扰RNA(siRNA)或shRNA的那些。这种RNA寡核苷酸可以是以某种方式(例如通过化学修饰)修饰为核酸酶抗性的天然RNA双链体或双链体的形式。另外或可替代地,RNA寡核苷酸可采取短发夹RNA(shRNA)表达或对应于或包含本文所述类型的siRNA的质粒构建体的形式。有利地,潜在有用的RNAi分子可以采取双链RNA分子的形式。在所有情况下,反义DNA或RNA分子可以包含与本文公开的R2R1序列互补的序列。应该注意的是,对于本文描述的反义技术的所有应用,用于实现基因表达的反义控制的技术和方案是已知的,并且计算预测对于给定基因具有最佳敲低效果的反义序列的算法可以用于设计合适的反义分子/寡聚物。
本发明可以利用重组化合物-特别是重组蛋白/肽和/或核酸序列。例如,使用本文公开的参考序列,技术人员可以使用分子、克隆和PCR技术来产生用于本发明的重组R2R1序列和/或蛋白质/肽。关于用于产生重组序列的PCR和基于克隆的技术的进一步信息可以在例如PCR Primer:A Laboratory Manual,Second Edition Edited by CarlW.Dieffenbach&Gabriela S.Dveksler:Cold Spring Harbour Laboratory Press andMolecular Cloning:A Laboratory Manual by Joseph Sambrook&David Russell:ColdSpring Harbour Laboratory Press中找到。
用于本发明的化合物可以包含抗体(包括其抗原或靶标结合片段)。抗体可以结合R2R1蛋白质/肽(或其表位)或对应于PRC1和/或TrxG-MLL复合物结合位点内的R2R1占据的结合位点的或位于其内的表位。术语“抗体”可以涵盖多克隆和/或单克隆抗体,例如IgG、IgM、IgD、IgE和/或IgA同种型。此外,术语“抗体片段”应该解释为包括包含一条或两条轻链和/或一条或两条重链的那些以及称为Fab片段,Fab2片段和scfv片段的片段的那些。合适的抗体和/或其片段可以是功能性的,并且可以包括能够干扰、阻断或中和R2R1与PRC1和/或TrxG-MLL复合物的结合的那些。或者,有用的抗体或其片段可以与PRC1和/或TrxG-MLL复合物内的R2R1结合位点结合。结合PRC1和/或TrxG-MLL复合物内的R2R1结合位点的抗体或其功能片段可以用于影响R2R1样功能。换句话说,这种类型的抗体(或其功能片段)可以在不存在R2R1的情况下用于取代R2R1功能。
如所述,本文使用的术语抗体可以包括多克隆和/或单克隆抗体。多克隆抗体是源自用抗原免疫的动物血清或其抗原功能衍生物的抗体分子的异质群体。因此,为了产生对R2R1具有特异性或亲和力的多克隆抗体,可以用R2R1蛋白质/肽(例如由本文所述序列编码或提供的蛋白质或肽或合适的(抗原性蛋白质/肽编码序列))或其片段免疫(可能通过注射)宿主动物(例如兔、羊、猪等等)。然后免疫的动物会产生对R2R1具有特异性和/或亲和力的抗体,并且这些可以从血清中收集。单克隆抗体是对特定抗原或其表位具有特异性/亲和力的同源抗体群体。它们可以通过任何提供由培养物中的连续细胞系产生抗体分子的技术来获得。这些包括但不限于Kohler和Milstein(1975),Nature 256:495-497;和USPat.No.4,376,110的杂交瘤技术),人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.,1983,Immunology Today 4:72;Cole et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.,1985,Monoclonal Anti-bodies和Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)。用于本发明的单克隆抗体可使用利用本文公开的任何核酸、蛋白质或肽序列(例如,由SEQ ID NO:1-4中任一个的核酸序列编码的蛋白质或肽或SEQ ID NO:5或6的序列)的方法来获得。
用于本发明的化合物还可以包含能够替代或抑制R2R1的作用的小分子(例如小有机化合物)。例如,具有以下特点的小分子也可用于本发明:(i)与以下相互作用或干扰以下的结合:R2R1与RNF2、DPY-30/ASH2L或SF3B2;(ii)抑制R2R1与RNF2、DPY-30/ASH2L或SF3B2的结合;(iii)增强R2R1与RNF2、DPY-30/ASH2L或SF3B2的结合或(iv)调节R2R1与RNF2、DPY-30/ASH2L或SF3B2的结合。
适用于本发明的化合物(即调节纤毛发生和/或适用于恢复纤毛发生和/或治疗或预防疾病的化合物)可以使用以下方法来鉴定,所述方法包括提供测试化合物并使该化合物与细胞接触,并且确定与受试化合物接触之后细胞中是否有纤毛发生的任何调节。可以通过任何观察到的纤毛发生和/或纤毛形成的增加或减少、相对于纤毛发生或纤毛形成水平的发育或活性、尚未与测试剂接触过的细胞中的发育或活性来检测对纤毛发生的调节。用于这种类型的方法的细胞可以是任何能够经历或进行纤毛发生的细胞。所述细胞可以是来自人类供体的未分化的、正在分化的或已经分化的原代支气管上皮细胞(PBEC)。细胞还可以是未分化的、正在分化的或已经分化的iPS细胞(诱导性多能干细胞),其具有或不具有遗传修饰。例如,iPS细胞可以在编码R2R1的基因中携带基因修饰。所述细胞可以在特定条件下培养,例如作为单层,在悬浮液中或在空气液体界面条件下培养。
术语“异常或有缺陷的纤毛发生”可包括过度或不适当的纤毛发生或其中纤毛发生的过程或与纤毛发生相关的过程已被消除、抑制或失效(或正在失效)的情况。术语“异常或有缺陷的纤毛发生“可以包括那些广泛地被归类为”纤毛疾病“的疾病或病症。纤毛发生的丧失可导致异常的支气管上皮。
技术人员会认识到,纤毛发生是导致形成纤毛细胞的重要过程,纤毛细胞在促进粘液清除方面发挥关键作用。纤毛细胞的丧失(例如通过某种形式的异常或有缺陷的纤毛发生)可能导致患有例如慢性阻塞性肺病(COPD)的患者的低效粘膜纤毛清除。在这种情况下,异常的支气管上皮(以纤毛细胞丢失、鳞状分化和基底细胞增生为特征)不能清除气道中的粘液、细菌、病毒和其他碎片。这种无效的清除机制可导致严重的症状,包括例如咳嗽、支气管肺感染和肺中气体交换不足。这种并发症常常与高死亡率有关。
因此,本文所述的各种化合物(所述化合物能够与PRC1和/或TrxG-MLL结合或相互作用/缔合并且可以采取核酸(正义/反义DNA/RNA)、蛋白质/肽、小分子和/或抗体的形式)可用于恢复或校正展现如上所述的异常(例如减少的、抑制的、损害的、缺陷的或消除的)纤毛发生的细胞中的纤毛发生。其他化合物(例如,核酸(正义/反义DNA/RNA),蛋白质/肽,小分子和/或抗体)可用于抑制或减少细胞中的纤毛发生。
技术人员将认识到,异常血管发生可以是任何纤毛发生,其中当与正常水平的纤毛发生(可能发生在健康细胞中)相比时其增加或减少。异常纤毛发生(无论增加还是减少)可能与许多疾病有关,包括那些被称为纤毛疾病的疾病(例如原发性纤毛运动障碍,脑积水,多囊肝和肾脏疾病以及某些形式的视网膜变性以及肾消耗病(nephronophthisis),Bardet-Biedl综合征,Alstrom综合征和Meckel-Gruber综合征)。异常或有缺陷的纤毛发生也可导致或促成肺系统疾病和气道疾病,包括例如COPD等。如此,本文所述的各种化合物(所述化合物能够与PRC1和/或TrxG-MLL结合或相互作用/缔合)可用于治疗和/或预防纤毛疾病和/或COPD。例如,本发明的化合物可以用于恢复患有COPD或倾向患和/或易患COPD的患者的纤毛发生。
用于本发明的化合物可以配制成用于施用于有需要的受试者的组合物。这些化合物可以作为药物组合物提供。使用的组合物可以包含合适的(例如药学上合适的)赋形剂、稀释剂和/或缓冲剂。本发明的化合物可以与一种或多种用于施用的其它化合物一起配制-例如一种或多种其它药物,所述药物可以用于预防和/或治疗其他疾病和/或与纤毛发生相关疾病和/或病症。优选地,由本发明提供的药物组合物被配制成无菌药物组合物。
合适的赋形剂、载体或稀释剂可以包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇甘油、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂等、或它们的组合。
用于本发明的药物配制品可以配制成例如适合于口服、肠胃外、粘膜或局部施用的形式。所述组合物可以被配制成可以被吸入。通过吸入施用的组合物可以采取可以作为液滴被雾化和吸入的细粉或溶液的形式。本领域技术人员将熟悉可用于通过例如吸入将组合物直接递送至肺部的装置。可以改变组合物的液滴或粒度,使得药物可以进入肺部的不同区域。例如,一旦吸入,小颗粒或液滴可能深入肺组织,并且在一些情况下可到达肺泡。
其中载体为固体的适用于口服给药的组合物最优选以单位剂量配制品形式存在,例如大丸剂,胶囊或片剂,其各自含有预定量的一种或多种本发明的结合PRC1和/或TrxG-MLL的化合物。片剂可以通过压制或模制来制备,任选地与一种或多种辅助成分一起。压制的片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式的结合PRC1和/或TrxG-MLL的活性化合物(例如粉末或颗粒),任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合。模制的片剂可以通过将结合PRC1和/或TrxG-MLL的活性化合物与惰性液体稀释剂进行模制来制备。片剂可以任选地被包衣,并且如果未包衣,可以任选地被刻痕。胶囊可以通过将活性化合物单独或与一种或多种辅助成分混合填充到胶囊壳中并且然后以通常方式密封来制备。活性成分(例如本发明的结合PRC1和/或TRXG-MLL的化合物)也可以配制成可分散颗粒剂,其可以例如在施用前悬浮于水中或撒在食物上。可以将颗粒包装在例如小袋中。其中载体为液体的适于口服施用的配制品可以作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液或作为水包油液体乳液提供。
适用于口服施用的组合物包括控释剂型,例如其中结合PRC1和/或TrxG-MLL的活性化合物被配制在合适的控释基质中、或者用合适的控释膜包衣的片剂。这类组合物对于预防性使用可以特别方便。
为肠胃外施用配制的组合物包括本发明的活性PRC1和/或TrxG-MLL化合物在水性或油性运载体中的无菌溶液或悬浮液。本发明的组合物可包含或另外包含冷冻保护剂化合物或组合物、防腐剂、抗生素、佐剂等。
可注射组合物和疫苗可适用于快速注射或连续输注。这些制剂可方便地以单位剂量或多剂量容器提供,其在引入配制品之后密封直至需要使用。或者,本发明的活性PRC1和/或TrxG-MLL化合物可以是粉末形式,其在使用前由合适的载体如无菌无热原水或磷酸盐缓冲盐水PBS构成。
包含一种或多种本发明的PRC1和/或TrxG-MLL化合物的组合物也可以配制成长效储库制剂,其可以通过肌内注射或通过植入例如皮下或肌内植入进行施用。储库制剂可以包括例如合适的聚合物或疏水材料或离子交换树脂。它们也可以包括已知可增强亲和力和/或动物(例如牛,羊或山羊)免疫应答持久性的制剂或佐剂,例如油在水中的单或双乳剂。这种长效组合物对于预防性使用特别方便。
适合的(或配制的)用于粘膜施用的组合物包括含有用于气溶胶分散的或分散在饮用水中的颗粒的组合物。当分配时,这样的组合物应该理想地具有10-200微米的粒径以保留在例如鼻腔中;这可以通过适当地使用合适粒度的粉末或者选择合适的阀门来实现。其它合适的组合物包括具有20-500微米粒径的粗粉,用于通过鼻腔通道从靠近鼻子的容器快速吸入施用,以及包含0.2-5%w/v的在水性或油性溶液或悬浮液中的活性化合物的滴鼻剂。
应该理解的是,除了上述载体成分之外,本文所述的各种组合物可包括适当的一种或多种另外的(药学上可接受的)载体成分,例如稀释剂,缓冲剂,调味剂,结合剂,表面活性剂,增稠剂,润滑剂,防腐剂(包括抗氧化剂)等,以及为使配制品与预期接受者的血液等渗的目的而包括的物质。药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的,并且包括但不限于不限于0.1M,优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8%盐水。此外,药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇,聚乙二醇,植物油如橄榄油,和可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水,酒精/水溶液,乳液或悬浮液,包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液,林格氏葡萄糖,右旋糖和氯化钠,乳酸林格氏液或不挥发性油。也可以存在防腐剂和其他添加剂,例如抗微生物剂,抗氧化剂,螯合剂,惰性气体等。
可以提供适用于局部配制品(例如凝胶,乳膏或软膏)的组合物。
用于兽用的组合物可以方便地以粉末或液体浓缩物形式。根据标准的兽药配制品实践,常规的水溶性赋形剂如乳糖或蔗糖可以掺入粉末中以改善其物理性质。因此,本发明特别合适的粉末包含50-100%w/w,优选60-80%w/w的活性成分(例如本发明的一种或多种PRC1和/或TrxG-MLL化合物)和0-50%w/w,优选20至40%w/w的常规兽用赋形剂。这些粉末可以添加到例如动物饲料中-可能通过中间预混物或在动物饮用水中稀释。
本发明的液体浓缩物合适地含有一种或多种本发明的PRC1和/或TrxG-MLL化合物,并且可以任选地进一步包括用于兽用的可接受的与水混溶的溶剂,例如聚乙二醇,丙二醇,甘油,甘油缩甲醛或这样的溶剂与高达30%v/v的乙醇混合。液体浓缩物可以施用于动物的饮用水。
附图说明
现在将参考以下附图详细描述本发明,附图示出:
图1:R2R1在纤毛发生中的功能说明。
图2:R2R1共免疫沉淀实验的蛋白质印迹图示。
图3:表示R2R1敲低(FAM25KD)的转录效应和COPD疾病状态的差异表达的对数比率比较。
图4:说明示例性纤毛基因上调的Log2强度图。
图5:框图,说明了在shRNA介导的FAM25(R2R1)基因表达敲低后差异表达的纤毛基因的显著性。
图6:Log2比率图,说明了由shRNA介导的FAM25(R2R1)基因表达下调引起的纤毛基因(纤毛运动)的上调。
图7:Log2比率图,说明了由shRNA介导的FAM25(R2R1)基因表达下调引起的纤毛基因(纤毛形态发生)的上调。
图8:第一主成分(X轴上的PC1)和第二主成分(Y轴上的PC2)的光谱图分析。
图9:DYNLRB2基因表达谱,MC PBEC,非COPD(Br331)与COPD(Br370)供体。
图10:在非COPD Br331 PBEC和COPD Br370 PBEC中组成型表达shRNA_R2R1后的R2R1基因表达(测定ABI Hs04194072_mH和测定ABI Hs04194073_mH)的RTqPCR。
图11:在非COPD Br331 PBEC和COPD Br370 PBEC中组成型表达FHR2R1后的R2R1基因表达(测定ABI Hs04194072_mH和测定ABI Hs04194073_mH)的RTqPCR。
图12:空气暴露第1周时COPD Br370 PBEC中的荧光图谱。
图13:在空气暴露的第1、2和3周,作为非COPD Br331 PBEC中R2R1蛋白质表达的量度的经校正的总细胞荧光(CTCF)。
图14:在一张图表中总结了在空气暴露的第1、2和3周,作为非COPD Br331 PBEC中R2R1蛋白质表达的量度的经校正总细胞荧光(CTCF)。
图15:所有实验样品的基因表达水平的SPM分析。
图16:R2R1′下调′条件子集的基因表达水平的SPM分析。
图17:R2R1′上调′条件子集的基因表达水平的SPM分析。
图18:所有实验样品的基因表达水平的SPM分析。
图19:Log2强度图,说明了R2R1基因表达下调后ROPN1L表达的上调。
图20:Log2强度图,说明了R2R1基因表达下调后ROPN1L表达的上调。
图21:Log2强度图,说明了调R2R1基因表达上后ROPN1L表达的下调。
图22:纤毛细胞(非COPD Br331)的数量。
图23:纤毛细胞(COPD Br370)的数量。
图24:产生粘液的细胞(非COPD Br331)的数量。
图25:产生粘液的细胞(非COPD Br331)的数量。
图26:非COPD Br331/2w AE/MC,shRNA_NC,shRNA_R2R1染色的图示。
图27:COPD Br370/2w AE/MC,shRNA_NC,shRNA_R2R1染色的图示。
图28:非COPD Br331/2w AE/MC,FH,FHR2R1染色的图示。
图29:COPD Br370/2w AE/MC,FH,FHR2R1染色的图示。
图30:非COPD Br331/3w AE/MC,shRNA_NC,shRNA_R2R1染色的图示。
图31:COPD Br370/3w AE/MC,shRNA_NC,shRNA_R2R1染色的图示。
图32:非COPD Br331/3w AE/MC,FH,FHR2R1染色的图示。
图33:COPD Br370/3w AE/MC,FH,FHR2R1染色的图示。
实施例1
1.1:R2R1蛋白质(FAM25蛋白家族)与多梳家族PRC1(通过亚基RNF2)和三胸家族TrxG-MLL(通过亚基DPY-30和ASH2L)染色质结合/重塑复合物的结合是一种人肺支气管上皮中纤毛发生的开/关转换。
R2R1对于肺上皮细胞的维持和再生至关重要,更特别是对基底细胞程序。浸没的原代支气管上皮细胞(PBEC)的实验发现了这种功能。浸没培养条件的特征在于未分化PBEC的细胞快速增殖。因此,浸没培养条件对于研究基底细胞(′人支气管肺(′气道’)的干细胞上皮是理想的。
进行后续实验以研究R2R1在正在分化/已经分化的PBEC中的功能。PBEC在空气液体界面(′ALI′)条件下生长。在ALI条件下生长的PBEC中shRNA介导的R2R1基因表达的敲低揭示了两个独立实验中R2R1在人支气管上皮细胞分化中的互补功能。图4-7显示了针对R2R1表达的组成型和可诱导表达的shRNA′FAM25147′(=TRCN0000284147,也称为shRNA_R2R1)的作用。
1.2:R2R1的表达的敲低导致纤毛发生或纤毛基因表达程序的充分上调。
纤毛基因表达程序包括运动纤毛的结构和动作/运动蛋白。因此,R2R1控制基底细胞和纤毛细胞之间的门控。R2R1的功能是“对称的”:具体来说,在R2R1存在下中基底细胞细胞程序被执行,在R2R1不存在下,纤毛细胞程序启动。对称是基底细胞纤毛细胞(参见图1)。应该指出的是,没有证据表明对称的基底细胞粘液产生细胞,这是一项具有重要治疗效果的发现。
纤毛细胞的丧失导致患有COPD的患者中的粘膜纤毛清除效率低下。这实际上是COPD的病理学标志:异常的支气管上皮细胞(纤毛细胞丢失,鳞状分化和基底细胞超常增生)不能清除气道的粘液、细菌、病毒和碎片。这种无效的清除机制将导致严重的症状(咳嗽,支气管肺感染、肺内气体交换不足...),导致高死亡率。
发现在ALI条件下生长的PBEC表现出持续的纤毛基因表达程序的下调。在两次独立实验中,在来自多个供体的PBEC中观察到这种现象。
比较COPD疾病状态和PBEC中shRNA介导的R2R1的敲低(ALI培养条件)的转录效应,参见图3。左上象限突出了R2R1对纤毛发生和COPD的影响。沿着Y轴显示由于PBEC中shRNA介导的R2R1的敲低(ALI条件)而差异表达的基因。因R2R1敲低而上调的基因将出现在Y轴上的零点之上。差异表达的基因(COPD相比于非COPD状态)沿着X轴显示。由于COPD疾病状态下调的基因将出现在X轴零点的左侧。左上象限现在将代表由于R2R1敲低而上调的基因与由于COPD而下调的基因之间的交集。该基因组的大部分参与纤毛发生。
1.3:研究R2R1发挥门控功能(基底细胞纤毛细胞的作用机制)。
纤毛发生需要产生许多纤毛蛋白。这些多基因的同时表达必须严格控制。因此,该调控必须充当开/关转换。
我们在两个独立的酵母双杂交(Y2H)实验中(第一个实验:7个命中,4个是RNF2-第二个实验4个命中,1个是RNF2)鉴定了PRC1复合物的核心组分、作为R2R1结合配偶体的RNF2。DPY-30是TrxG-MLL复合物的组分,被确定为另一个结合配偶体(在第一次Y2H实验中为1/7命中)。最后,SF3B2(第二次Y2H实验中的1/4命中)完成染色质结合配偶体的集合。
R2R1和PRC1/TrxG蛋白之间的相互作用在体外翻译系统(1步CHO高产IVT试剂盒,Thermo Scientific)中证实。N端HA标记的R2R1构建体(在pT7CFE1载体中)与N端FLAG标记的PcG和TrxG构建体(在pT7CFE1载体中)的不同排列共表达。用EZviewTM Red抗HA亲和凝胶(Sigma Aldrich)进行免疫共沉淀以结合反应混合物中的R2R1和任何相关蛋白。通过SDS-PAGE分析结合的蛋白质并用Monoclonal 抗体(Sigma Aldrich)进行蛋白质印迹。
下表中描述了不同的排列(N-term=N端):
图2显示了使用不同排列的R2R1和不同PRC1/TrxG蛋白质的免疫共沉淀。与PRC1复合物的典型形式(泳道5)相比,RNF2更强烈地结合PRC1复合物的非典型排列(存在KMT2D(MLL4)和RYBP,泳道4)中的R2R1。ASH2L是含有TrxG-MLL蛋白质KMT2D(MLL4)、DPY-30和ASH2L的排列中的R2R1的明确结合配偶体(泳道3)。ASH2L和DPY-30是已知的相互结合配偶体和TrxG-MLL复合物的必需亚基。最后,在仅包含R2R1和DPY-30的蛋白质混合物的排列中证明了R2R1和DPY-30之间的推定异源二聚化。
因此,转录效应(许多基因同时受R2R1控制)是由改变染色质重塑子的结合特性引起的,其中PRC1是最引人注目的复合物。众所周知,PRC1可以互换组分,产生典型和非典型的复合物。PRC1对染色质的作用(H2A泛素化,募集PRC2和以其抑制功能辅助PRC2)由其不同的组分蛋白质决定。然而,RNF2总是存在于PRC1复合物中。
因此,我们发现PRC1的一个明确定义的非典型功能。该功能通过R2R1与PRC1复合物的结合被确定。R2R1与PRC1的结合对于纤毛发生来说是门控。此外,R2R1通过DPY-30和ASH2L与染色质修饰性TrxG-MLL复合物(三胸家族或TrxG)相互作用。与PRC1相反,TrxG通过H3K4甲基化维持活性基因表达。多梳家族和三胸家族蛋白质的相互作用在活跃或抑制状态下维持了一组明确定义的基因。因此,R2R1通过与多梳家族(PcG)PRC1和TrxG蛋白结合而对染色质结构域和基因表达产生充分的影响。衍生自R2R1蛋白质的肽、与R2R1(部分)相似的蛋白质或与R2R1-RNF2和/或R2R1-DPY-30/ASH2L结合位点相互作用的小分子可以恢复COPD患者的纤毛发生。
有必要证明R2R1蛋白质控制着负责人类PBEC纤毛发生的一组基因。换言之,我们必须证明R2R1结合调控或支持纤毛发生的基因的特定DNA序列(启动子或增强子)。
在CHIP-Seq实验(染色质免疫沉淀,然后下一代测序富集的DNA片段)中鉴定了人PBEC基因组中的R2R1结合位点。在ALI条件下生长的人PBEC中组成型表达(慢病毒转导)N端FLAG-HA串联表位-R2R1蛋白质和仅有N端FLAG-HA串联表位的蛋白质。通过DSG(二琥珀酰亚氨基戊二酸酯)和甲醛使染色质构成的基因组DNA和蛋白质交联。将染色质超声处理至合适的大小(~200bp)并用EZviewTM Red抗HA亲和凝胶(Sigma Aldrich)免疫沉淀以结合仅FLAG-HA-串联表位和FLAG-HA串联表位-R2R1相关基因组DNA片段。随后,从这些DNA片段(蛋白质去交联和消化后)制备用于下一代测序(NGS)的文库,并且在至少40x106个读取的深度测序。通过比较(EaSeq,http://easeq.net/)FLAG-HA串联表位-R2R1文库中的结合位点与仅有FLAG-HA串联表位的′对照’文库中的结合位点的富集,获得(~3000)R2R1结合位点的集合。重复性通过技术和生物学重复(供体Br331和Br363)进行评估和证明。
首先,对一组R2R1结合位点的分析揭示了R2R1结合TP73和FOXJ(其是刺激产生活动性纤毛的主要转录因子)的启动子位点。此外,R2R1还结合编码纤毛的中心体/基体机构(CROCC、CCDC41、CEP131、CEP164、CEP170、CEP170B、CEP192等)的组分的基因的启动子位点。最后还鉴定了纤毛发生和上皮分化的其他主要调节因子(转录因子,miRNA,染色质修饰因子等)(FUZ、FGFR1、MIR34AHG、ARID1B、JARID2、YY1、KDM2A、KDM2B、KDM4B、KDM6B、KMT2A、KMT5B、SETD1A...)。因此,本发明可涉及能够调节、结合或缔合对纤毛的中心体/基体机构的组分和/或纤毛发生和上皮的调节因子进行编码的基因的化合物(例如本文描述的基于R2R1的化合物)。
下面显示了R2R1结合位点的示例性DNA序列。
TP73
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FOXJ1
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FUZ
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FUZ
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CROCC
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CCDC41
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MIR34AHG
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示例性R2R1结合位点的DNA序列的特征在于高GC(碱基)含量。实际上,对整组R2R1结合位点(~3000个位点)的碱基含量的分析显示GC含量超过AT含量:G&C碱基代表≥基因组R2R1结合位点的碱基含量的66%。使用Regulatory Sequence Analysis Tools(RSAT,http://rsat.sb-roscoff.fr/)在R2R1结合位点的Motif发现揭示了高度特异性的GC基序。这些基序独立于RSAT中的基序发现方法而重新发生(计算一组序列中的寡核苷酸发生率,导致检测过度表示的寡核苷酸;计算寡核苷酸在一组序列中的位置分布,导致检测到显著不同于均匀分布的寡核苷酸并且检测到一组DNA序列中过度表示的间隔二联体,其中二联体是一对相同大小的寡核苷酸-由RSAT服务器提供的定义:http://rsat.sb-roscoff.fr/)。经常发生的GCC(CGG)模式在所发现的基序中显而易见。通常,高GC含量和重复的GC核苷酸段是CpG岛(CGI)的特征。这些CGI目前被认为包含PcG(多梳响应元件或PRE)和TrxG复合物(三胸响应元件或TRE)的基因组结合位点,一般也称为PRE。由此可见,我们已经建立了与多梳功能的另一条联系:R2R1表示PRE识别元件。这对于PcG复合物具有特殊的意义:与TrxG复合物相反,在PcG复合物中未发现通用的PRE识别元件。
实施例2
2.1:在ALI条件中恢复COPD供体来源的PBEC中的纤毛发生。
首先,我们必须确定由于缺乏R2R1而导致的纤毛发生不限于来自非COPD供体的PBEC。因此我们必须确定:
(a)在来自COPD和非COPD供体的PBEC中,R2R1的表达可以可靠地上调或下调。
(b)R2R1蛋白质的表达与R2R1(转录物)的表达有关。
(c)敲低R2R1表达触发COPD和非COPD供体的PBEC中的纤毛基因表达程序。相反,R2R1表达的上调导致抑制纤毛转录组。
(d)转录组变化需要反映在细胞表型中。纤毛发生转录组应该导致COPD衍生的PBEC的ALI培养物中纤毛细胞数量的增加。
以下实验展示了上述要点2.1(a),2.1(b),2.1(c)和2.1(d)。
来自非COPD供体(Br331)和COPD供体(Br370)的PBEC在ALI条件下生长。转录组学和细胞表型分析在空气暴露(AE)的第1、2和3周进行。每个条件一式三份进行。
不同的条件是:
(i)MC(培养基对照)是在没有任何干预的情况下生长的细胞群。
(ii)通过FAM25 147=TRCN0000284147(称为shRNA_R2R1)的组成型表达(慢病毒转导)实现PBEC中R2R1表达的下调。在此条件下,组成型表达乱序shRNA的PBEC(称为shRNA_NC)是阴性对照细胞。
(iii)通过N端FLAG-HA串联表位-R2R1(称为FHR2R1)构建体(慢病毒转导)的组成型表达来实现R2R1表达的上调。在这种情况下,组成型表达仅有FLAG-HA串联表位的构建体(称为FH)的PBEC是阴性对照细胞。
iv)供体:非COPD(Br331)和COPD(Br370)
(v)时间:在AE(Air Exposure,空气暴露)的第1周、2周和3周时收获PBEC。
2.2:随着时间的推移,Br370(COPD)PBEC显示持续的纤毛基因表达程序的下调。
假设是(1)在ALI培养物中PBEC的基因表达谱中,随着时间的推移,纤毛发生应该逐渐变得明显。我们还假设(2)与Br331(非COPD)PBEC相比,在Br370(COPD)PBEC中纤毛发生转录组应滞后。
分析MC PBEC(未经慢病毒转导的PBEC)中的基因表达程序将证明或否定我们的假设。
光谱图(Spectral Map,SPM)分析证实了我们的假设。光谱图分析(见图8)提供了对数据集中存在的主要基因簇和对象的无偏差鉴定。这种无监督的基因表达数据分析显示,在时间段(空气暴露周)期间基因表达变化占数据集中的最大变化(56%)。这种变化在光谱图的第一主成分(X轴或PC1)中以图形很好地表示。数据集中的第二大变化(17%)可由疾病状态(COPD与非COPD)来解释。这种变化在第二主成分(Y轴或PC2)中表示。显示最强烈表达变化的基因位于X和Y轴的极端处。
负责最大差异表达变化的基因子集完全由纤毛基因组成(参见图8)。
DYNLRB2和ROPNL1被突出显示为示例性纤毛基因。正如预期的那样,这个子集的确位于X轴的极端(PC1,这个变化是由时间决定的)。这证实了我们假设的第一(1)部分。
随后,在光谱图上叠加不同的MC PBEC样品显示它们沿前两个主成分的分布。我们现在观察到COPD(Br370)和非COPD(Br331)组根据其纤毛基因表达程序沿PC1和PC2清晰分开。非COPD Br331 PBEC聚簇最接近纤毛基因子集。COPD Br370 PBEC聚簇在纤毛基因子集的另一端。这证明了我们假设的第二部分(2)。作为实例,我们包括DYNLRB2的基因表达谱(参见图9)。这种独立监督的单变量(逐个基因)分析证实了COPD与非COPD起源(Br370相比于Br331)的作用。在第一时间点(AE周=1)收获的非COPD Br331 PBEC显示最低水平的DYNLRB2表达。相反,在第三个时间点(AE周=3)收获的非COPD Br331 PBEC显示非常高水平的DYNLRB2表达。COPD Br370 PBEC很少表达这种示例性基因。
2:3:在来自COPD和非COPD供体的PBEC中,R2R1的表达可以可靠地上调或下调。
R2R1基因表达的RTqPCR(测定ABI Hs04194072_mH和测定ABI Hs04194073_mH)证实在非COPD Br331 PBEC和COPD Br370 PBEC中组成型表达shRNA_R2R1后的完全下调(敲除)(参见图10)。相反地,R2R1基因表达的RTqPCR(测定ABI Hs04194072_mH和测定ABIHs04194073_mH)显示在非COPD Br331 PBEC和COPD Br370 PBEC中组成型表达FHR2R1后的>104的上调(参见图11)。数据用散点图表示(平均线)。RTqPCR数据证明R2R1表达可以以非常充分、显著且可靠的方式上调或下调。
2:4:R2R1蛋白质的表达与R2R1(转录物)的表达有关。
通过以下程序评估细胞核中的总R2R1蛋白质含量。用1/500抗FAM25A抗体(Abcamab177969)对PBEC进行免疫组织化学染色。用1/1500山羊抗兔IgG(H+L)二抗,Alexa缀合物(Thermo-Fisher Scientific A-11037)进行二抗染色。使用Image J(http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html),在20倍放大倍数的10个场中测定校正的总细胞荧光(CTCF)。CTCF用作对细胞核中总R2R1蛋白质含量的评估。图12说明空气暴露给定时间点不同条件(MC,FH,FHR2R1,shRNA_NC和shRNA_R2R1)的特征荧光模式。散点图(平均线具有SD)显示COPD Br370 PBEC在空气暴露(AE)第1周时的荧光模式。图13显示了非COPDBr331 PBEC中荧光模式随时间的序列。图14以一个图形表示总结了图13的3个不同时间点。
CTCF数据证明,R2R1基因表达的上调或下调随后是细胞核中R2R1蛋白质表达的上调或下调。此外,R2R1蛋白质的核定位与R2R1-PcG和R2R1-TrxG相互作用一致。
2.5:敲低R2R1表达触发COPD和非COPD供体的PBEC中的纤毛基因表达程序。相反,R2R1表达的上调导致抑制纤毛转录组。
为了证明第2.5点,我们对所有实验样品的基因表达水平进行了无监督分析(SPM)。所有样品的组由在非COPD Br331和COPD Br370 PBEC中在空气暴露1、2和3周时的条件MC,FH,FHR2R1,shRNA_NC和shRNA_R2R1组成。结果表明,负责最大差异表达变化的基因子集完全由纤毛基因组成(参见图15)。此外,对于R2R1′下调′(样品MC,shRNA_NC,shRNA_R2R1)和R2R1′上调′条件(样品MC,FH,FHR2R1)(分别为图16和图17)的子集也是如此。示例性的ROPN1L基因在每个SPM图中突出显示。
经仔细观察,我们观察到R2R1表达下调的样品聚簇更接近图15和16中的纤毛基因簇。例如,非COPD Br331 shRNA_R2R1(AE的第3周)样品位于与纤毛基因簇非常接近的位置。对于R2R1基因表达的上调而言反过来也是如此:具有上调的R2R1表达的样品(′FHR2R1样品′)位于距XY轴上的纤毛基因簇更远的距离处。例如,COPD Br370 FHR2R1(AE的第1周)样品位于纤毛基因簇的另一端。R2R1敲低对COPD Br370 PBEC纤毛发生的影响在图15、16和17的SPM图上并不明显。然而,进一步的分析表明敲低Br370 PBEC中的R2R1基因表达导致更接近XY轴上的纤毛基因簇(图18)。这种无监督分析指出COPD PBEC中“纤毛化发生的再现”。
最后,逐基因分析(LIMMA)证实了R2R1敲低对COPD Br370 PBEC中纤毛发生的影响。示例性ROPN1L基因表达的log2强度图(图19、20和21)说明了COPD Br370 PBEC中“纤毛发生的再现”。
2:6:转录组变化应该反映在细胞表型中。纤毛发生转录组应该导致COPD衍生的PBEC的ALI培养物中纤毛细胞数量的增加。
为了逆转COPD表型,需要存在更多纤毛细胞。因此,我们必须证明纤毛基因表达的上调伴随着纤毛细胞数量的增加。
PBEC(在上述实验中伴随生长)被免疫组织化学染色:
-DAPI:细胞核染色
-产生粘液的细胞的染色:抗MUC5AC抗体(45M1)+鸡抗小鼠IgG(H+L)二抗,Alexa缀合物
-纤毛细胞染色:单克隆抗乙酰化微管蛋白抗体(克隆6-11B-1)+山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗,Alexa缀合物。
在10个场(20倍放大)进行染色细胞计数。散点图(平均线具有SD)说明R2R1表达的下调(shRNA_R2R1)导致纤毛化非COPD(Br331)和COPD(Br370)PBEC的数量增加(参见图22)。反之亦然:R2R1表达的上调导致纤毛细胞群体消失(参见图23)。shRNA_R2R1介导的敲低的阴性对照条件是阴性对照shRNA_NC的表达。FHR2R1表达的阴性对照条件是仅具有FH标签的构建体的表达。
R2R1表达的变化不会导致产生粘液的细胞数量的变化(见图24、25)。这是非常重要的,因为产生粘液的细胞数量的增加会使疾病症状恶化。事实上,非COPD Br331和COPDBr370 PBEC在AE的第3周(无论何种条件)产生相同数量的产粘液细胞。这再次强调了有缺陷的纤毛发生是COPD表型的主要驱动因素的事实。
为了说明的目的,包括图26、27、28和29。每张图中的第一行显示PBEC的三重染色(蓝色:核,绿色:产生粘液的细胞,红色:纤毛细胞)。底行只显示顶行相同场的纤毛细胞(红色)。
Claims (22)
1.与PRC1和/或TrxG-MLL结合、缔合或相互作用的化合物,其用于治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症。
2.根据权利要求1所述的化合物,其用于权利要求1的用途,其中所述化合物调节或模拟称为呼吸细胞再生基因1(R2R1)的基因的表达、功能和/或活性。
3.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物与PRC1和/或TrxG-MLL复合物内的R2R1结合位点结合或缔合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物干扰、防止或抑制天然或野生型R2R1和PRC1TrxG-MLL和/或二者中任一个的组分或亚基之间的结合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物与PRC1的环指蛋白2(RNF2)亚基结合或缔合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物与TrxG-MII的DPY-30和/或ASH2L亚基蛋白结合或结合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物选自由以下各项组成的组:核酸;反义寡核苷酸;碳水化合物;蛋白质/肽;小分子;以及抗体或抗原或其靶标结合片段。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物由SEQ ID NO:1、2、3或4或其片段编码。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其中所述化合物是包含对应于SEQ IDNO:5或6或其片段的序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物是减少、抑制和/或消除R2R1基因的表达、功能和/或活性的反义寡核苷酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物是能够结合R2R1或PRC1和/或TrxG-MLL复合物内的R2R1结合位点的抗体。
12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物用于治疗或预防异常纤毛发生。
13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物用于治疗或预防纤毛疾病。
14.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其用于任何前述权利要求的用途,其中所述化合物用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)。
15.根据权利要求13或14所述的化合物,其用于权利要求13或14所述的用途,其中所述化合物(i)与PRC1的环指蛋白2(RNF2)亚基结合或缔合,和/或(ii)与TrxG-MII的DPY-30和/或ASH2L亚基蛋白结合或缔合。
16.与PRC1和/或TrxG-MLL结合、缔合或相互作用的化合物,其用于调节纤毛发生。
17.与PRC1和/或TrxG-MLL结合、缔合或相互作用的化合物,其用于调节患有或易患慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者中的纤毛发生。
18.与PRC1和/或TrxG-MLL结合、缔合或相互作用的化合物在制造用于治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症的药物中的用途。
19.治疗或预防与异常或有缺陷的纤毛发生相关的疾病或病症的方法,所述方法包括给有其需要的受试者施用治疗有效量的化合物,所述化合物与PRC1和/或TrxG-MLL结合、缔合合或相互作用。
20.与染色质重塑/结合复合物结合、缔合或相互作用的化合物,其用于治疗和/或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症。
21.SEQ ID NO:1、2、3、4或编码PRC1和/或TrxG-MLL结合分子的片段;或SEQ ID NO:5、6或其PRC1和/或TrxG-MLL结合片段,用于治疗或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症。
22.调节细胞中R2R1基因表达和/或R2R1蛋白质/肽的活性、功能和/或表达的化合物,其用于治疗或预防与异常或有缺陷的纤毛发生有关的疾病和/或病症。
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