ES2948443T3 - Modulación de la ciliogénesis - Google Patents

Abstract

La divulgación se basa en el hallazgo de que compuestos capaces de unirse a (o interactuar con) complejos de unión/remodelación de cromatina (por ejemplo, grupo Polycomb PRC1 y grupo Trithorax MLL) y/o modulación de los mismos se pueden usar para modular (por ejemplo, cambiar on/off) ciliogénesis como puede ocurrir, por ejemplo, en el epitelio bronquial pulmonar humano. Se proporcionan compuestos, composiciones, métodos y medicamentos que pueden usarse para tratar y/o prevenir enfermedades y/o afecciones asociadas con la ciliogénesis aberrante o defectuosa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Modulación de la ciliogénesis

Campo

La presente divulgación se refiere a la ciliogénesis en células y proporciona compuestos, composiciones, usos, medicamentos y métodos para ser explotados en la modulación de la ciliogénesis y en la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas a la misma.

Antecedentes

La proteína denominada R2R1 pertenece a la familia de proteínas FAM25 y es fundamental para el mantenimiento y regeneración del epitelio pulmonar, más concretamente el programa de células basales. Los experimentos en células epiteliales bronquiales primarias sumergidas (PBEC) descubrieron esta función. Las condiciones de cultivo sumergido se caracterizan por una rápida proliferación celular de PBEC no diferenciadas. Por lo tanto, las condiciones de cultivo sumergido son ideales para el estudio de las células basales ("las células madre del epitelio pulmonar bronquial humano ("vías respiratorias").

La pérdida de células ciliadas conduce a un aclaramiento mucociliar ineficaz, en particular en pacientes que padecen EPOC. Este es, de hecho, el sello patológico de la EPOC: el epitelio bronquial anormal (pérdida de células ciliadas, diferenciación escamosa e hiperplasia de células basales) no puede limpiar las vías respiratorias de moco, bacterias, virus y restos. Este mecanismo de aclaramiento ineficaz provocará síntomas graves (como tos, infecciones broncopulmonares e intercambio gaseoso ineficaz en los pulmones), lo que da como resultado una alta tasa de mortalidad.

El documento WO 2012/127289 describe que dos genes denominados R2R1 y R2R2, desempeñan un papel importante en el desarrollo de tejidos y la biología del cáncer. En particular, el presente documento describe que estos dos genes se expresan en células pulmonares, son necesarios para la morfogénesis de ramificación tardía del epitelio y el endotelio pulmonares y apoyan el desarrollo/mantenimiento de la arquitectura tridimensional refinada del pulmón. Este documento describe además el uso de genes y proteínas R2R1 para su uso en el tratamiento de enfermedades pulmonares tales como displasia broncopulmonar y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

La presente divulgación tiene como objetivo proporcionar compuestos, composiciones, usos, medicamentos y métodos que explotan el papel de R2R1 en la ciliogénesis para proporcionar tratamientos para trastornos y enfermedades asociadas con la misma.

Sumario

Los aspectos de la presente invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación surge del hallazgo de compuestos capaces de unirse a (o interactuar con) complejos de unión/remodelación de cromatina (por ejemplo, el grupo Polycomb PRC1 y el grupo Trithorax MLL) y/o la modulación de los mismos puede usarse para modular (por ejemplo, encender /interruptor de apagado) la ciliogénesis como puede ocurrir, por ejemplo, en el epitelio bronquial pulmonar humano

Específicamente, un gen denominado gen regenerativo para células respiratorias 1 (R2R1) codifica una proteína que ahora se ha identificado como una pareja de unión para los componentes del Polycomb Repressor Complex 1 (PRC1) y el complejo Trithorax grupo-MLL (TrxG-MLL). El complejo PRC1 consiste en un conjunto de proteínas definidas del grupo Polycomb (PcG). El complejo TrxG-MLL, también llamado complejo de tipo COMPASS, consiste en un conjunto de proteínas definidas del grupo Trithorax (TrxG). La interacción entre la proteína R2R1 y los complejos PRC1/trxG-MLL y/o proteínas PcG o TrxG, da como resultado la modulación de la ciliogénesis en el epitelio bronquial humano.

La divulgación proporciona además compuestos que se unen, asocian o interaccionan con complejos de unión/remodelación de cromatina para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades y/o afecciones asociadas con la ciliogénesis aberrante o defectuosa.

Se describe además el uso de un compuesto que se une, se asocia o interacciona con complejos de unión/remodelación de cromatina en la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir enfermedades y/o afecciones asociadas con la ciliogénesis aberrante o defectuosa.

También se divulga un método para tratar y/o prevenir enfermedades y/o afecciones asociadas con la ciliogénesis aberrante o defectuosa, comprendiendo dicho método la etapa de administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que se une, se asocia o interacciona con complejos de unión/remodelación de cromatina.

Los complejos de clase PRC1 compactan la cromatina e inhiben la remodelación de la cromatina. Del mismo modo, el complejo Trithorax grupo-MLL (TrxG-MLL) también está implicado en la unión/remodelación de la cromatina.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona compuestos que se unen, asocian o interaccionan con PRC1 y/o TrxG-MLL, para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades y/o afecciones asociadas con la ciliogénesis aberrante o defectuosa.

La presente divulgación proporciona además el uso de un compuesto que se une, se asocia o interacciona con PRC1 y/o TrxG-MLL, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades y/o afecciones asociadas con la ciliogénesis aberrante o defectuosa.

También se describe un método para tratar o prevenir enfermedades o afecciones asociadas con la ciliogénesis aberrante o defectuosa, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que se une, se asocia o interacciona con PRC1 y/o TrxG-MLL.

Sin pretender limitarse a la teoría y como se explica con más detalle a continuación, los inventores han descubierto que la proteína R2R1 puede unirse o asociarse/interaccionar con componentes (por ejemplo, componentes de proteínas o péptidos) de complejos de unión/remodelación de cromatina, incluyendo, por ejemplo, PRC1 y el complejo TrxG-MLL; al hacer esto, la proteína R2R1 puede actuar como un interruptor de "encendido/apagado" para la ciliogénesis en el epitelio bronquial humano. Como tal, los compuestos que modulan o imitan la expresión, la función y/o actividad de R2R1 pueden usarse como un medio para modular (por ejemplo, restaurar, mejorar o inhibir (es decir, activar/desactivar)) la ciliogénesis en células y/o como base de tratamientos para enfermedades, afecciones y/o síndromes causados o contribuidos por una ciliogénesis aberrante o defectuosa. Los compuestos que modulan o imitan la expresión, la función y/o la actividad de R2R1 pueden unirse o asociarse de otro modo con los sitios de unión de R2R1 presentes en los complejos de unión/remodelación de cromatina, incluyendo los complejos PRC1/TrxG-MLL o dentro de ciertos (o específicos) componentes de los mismos. El efecto de cualquier unión o asociación con, los sitios de unión R2R1 dentro de estos complejos (PRC1/TrxG-MLL) (o componentes de los mismos), puede ser la modulación de la ciliogénesis en las células. Por lo tanto, los compuestos que se unen y/o se asocian con los sitios de unión de R2R1 dentro de estos complejos (por ejemplo, los sitios de unión de PRC1/TrxG-MLL R2R1) pueden usarse o explotarse para modular la ciliogénesis y/o en el tratamiento y/o prevención de enfermedades, afecciones y/o síndromes asociados o causados o contribuidos por, una ciliogénesis aberrante o defectuosa.

En vista de lo anterior, la presente divulgación se refiere a compuestos para su uso (cuyos compuestos son capaces de unirse, asociarse o interactuar con complejos de unión/remodelación de cromatina, PRC1, TrxG-MLL y/o sitios de unión R2R1 de los mismos), composiciones (que comprenden uno o más compuestos capaces de unirse, asociarse o interaccionar con complejos de unión/remodelación de cromatina, PRC1, TrxG-MLL y/o sitios de unión R2R1 del mismo) para su uso, usos de composiciones/medicamentos que comprenden compuestos capaces de unirse, asociarse o interaccionar con complejos de unión/remodelación de cromatina, PRC1, TrxG-MLL y/o sitios de unión R2R1 de los mismos y métodos que los explotan. Adicionalmente, la divulgación se refiere a compuestos (para uso), composiciones (para uso), medicamentos (para uso) y métodos que explotan compuestos que imitan o modulan la expresión, la función y/o la actividad de R2R1.

Los compuestos que imitan la función de R2R1 pueden exhibir una o más propiedades y/o funciones de una proteína R2R1 de tipo salvaje. Por ejemplo, un imitador de R2R1 podría unirse o asociarse con PRC1, TrxG-MLL o un componente o subunidad del mismo. Los compuestos de tipo mimético de R2R1 pueden, por ejemplo, unirse o asociarse con complejos de unión/remodelación de cromatina, PRC1, TrxG-MII o un componente de los mismos a través de un sitio de unión R2R1, en otras palabras, un compuesto de tipo mimético de R2R1 puede unirse o asociarse/interaccionar con un complejo de unión/remodelación de cromatina, sitio de unión de PRC1 y/o TrxG-MII R2R1. Un compuesto que modula la expresión, la función y/o la actividad de R2R1 podría aumentar o inhibir la expresión, la función y/o la actividad del mismo. Un compuesto para su uso en la presente invención puede interferir con, prevenir o inhibir la unión entre R2R1 nativo o de tipo salvaje y PRC1TrxG-MLL y/o un componente o subunidad de cualquiera.

A lo largo de la presente divulgación, estos aspectos y realizaciones se denominarán "compuestos, composiciones, usos, medicamentos y métodos". Además, la divulgación se refiere regularmente a los términos "PRC1" y "TrxG-Mll" - estos son ejemplos ilustrativos (pero no necesariamente limitativos) de complejos de "remodelación/unión de cromatina".

Debe entenderse que a lo largo de la presente memoria descriptiva, la expresión "que comprende" se utiliza para indicar que los aspectos y realizaciones de la presente divulgación "comprenden" una característica o características particulares. Debe entenderse que la expresión "que comprende" también puede abarcar aspectos y/o realizaciones que "consisten esencialmente en" o "consisten en" la característica o características relevantes.

El complejo represor 1 Polycomb (PRC1) es un complejo multiproteico y los compuestos para su uso de acuerdo con los diversos aspectos y realizaciones de la presente invención pueden incluir aquellos que se unen o se asocian con una o más de las subunidades PRC1 o cualquier sitio de unión R2R1 de las mismas. Se sabe que PRC1 intercambia sus componentes, lo que da como resultado complejos canónicos y no canónicos. El efecto de PRC1 sobre la cromatina (ubiquitilación de H₂A, reclutamiento de PRC2 y ayuda a PRC2 en su forma represora) está determinado por sus diferentes proteínas componentes. Sin embargo, se observa que la subunidad de la proteína Ring Finger 2 (RNF2) de PRC1 siempre está presente. En el contexto de la presente invención, los diversos compuestos para su uso pueden aprovechar un compuesto capaz de unirse a la subunidad de la proteína Ring Finger 2 (RNF2) de PRC1. Un compuesto capaz de unirse o asociarse con RNF2 puede dirigirse a un sitio de unión de R2R1 del mismo.

Los compuestos para su uso de acuerdo con los diversos aspectos y realizaciones de la presente invención pueden incluir aquellos que se unen o se asocian con un componente del complejo modificador de cromatina TrxG-MLL (grupo Trithorax-leucemia de linaje mixto). A diferencia de PRC1, TrxG-MLL mantiene la expresión génica activa mediante la metilación de H3K4. De hecho, la función de TrxG-MLL es complementaria a la función de PRC1. PRC1 es responsable de las modificaciones represoras de la cromatina y, como consecuencia, está implicado en una fuerte diafonía con TrxG-MLL, el complejo en el control de las modificaciones de la cromatina que activan la transcripción. TrxG-MLL comprende una estructura central que a su vez comprende una serie de proteínas de subunidades, incluyendo, por ejemplo, las proteínas denominadas DPY-30 y ASH₂L. DPY-30 y ASH₂L siempre están presentes en diferentes complejos TrxG-MLL y son esenciales para la actividad de (tri)metilación de la histona H3 Lys-4 de TrxG-MLL. Un compuesto para su uso de acuerdo con la presente invención puede unirse o asociarse con el complejo TrxG-MLL a través del componente DPY-30 y/o ASH₂L. En otras palabras, un compuesto para su uso en la presente invención podría unirse o asociarse con DPY-30 y/o ASH₂L. Un compuesto capaz de unirse o asociarse con el componente DPY-30 y/o ASH₂L puede dirigirse a un sitio de unión R2R1 de cualquiera (o ambos) de estos componentes.

Los compuestos para su uso de acuerdo con los diversos aspectos y realizaciones de la presente invención pueden incluir además aquellos que se unen a la proteína SF3B2, un componente de complejos PRC1 no canónicos. En el contexto de la presente invención, los diversos compuestos para su uso pueden explotar un compuesto capaz de la subunidad SF3B2 de PRC1. Un compuesto capaz de dirigirse al sitio de unión de R2R1 de la subunidad SF3B2 de PRC1 puede dirigirse a un sitio de unión de R2R1 del mismo.

Los compuestos útiles en los diversos aspectos de la presente divulgación (compuestos que se unen o se asocian con PRC1, TrxG-MLL (incluidos los componentes, subunidades y/o sitios de unión R2R1 de los mismos) puede tomar la forma de ácidos nucleicos (ARN, ^a Dⁿ y/o formas sintéticas/artificiales), oligonucleótidos antisentido, carbohidratos, proteínas, péptidos, moléculas pequeñas, anticuerpos (incluyendo antígeno o fragmentos de unión a la diana del mismo).

Una molécula de ácido nucleico para su uso en la presente invención (como un agente que expresa o codifica una proteína/péptido R2R1 que se une a (i) cualquiera de los complejos divulgados anteriormente (ii) a cualquier sitio de unión de R2R1 de los mismos o (iii) que en sí mismo modula la función, la expresión y/o la actividad de R2R1), puede comprender o derivar de la secuencia denominada SEQ ID NO: 1 que se indica a continuación.

SEQ ID NO: 1

El SEQ ID NO: 1 representa un ejemplo de transcrito del gen R2R1 murino. La parte codificante o traducida de esta secuencia está subrayada y comprende unos 267 nucleótidos. Esta porción concreta del SEQ ID NO: 1 se designará y se denominará SEQ ID NO: 2.

Una molécula de ácido nucleico para su uso en la presente invención puede comprender o derivar de la secuencia denominada SEQ ID NO: 3 que se indica a continuación.

SEQ ID NO: 3

El SEQ ID NO: 3 representa un ejemplo de transcrito del gen R2R1 humano. La parte codificante o traducida de esta secuencia está subrayada y comprende unos 267 nucleótidos. Esta porción concreta del SEQ ID NO: 3 se designará y se denominará SEQ ID NO: 4.

Los 267 restos de nucleótidos del SEQ ID NO: 2 codifican una proteína/péptido que comprende 89 aminoácidos y tiene la siguiente secuencia (designada SEQ ID NO: 5)

SEQ ID NO: 5

Los 267 nucleótidos del SEQ ID NO: 4 codifican una proteína/péptido que comprende 89 aminoácidos y tiene la siguiente secuencia (designada SEQ ID NO: 6)

SEQ ID NO: 6

Por lo tanto, la invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que comprenden todo o parte (una porción o fragmento) de los SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, secuencias de aminoácidos codificadas de este modo, así como secuencias de aminoácidos que comprenden todo o parte (una porción o fragmento) del SEQ ID NO: 5 o el SEQ ID NO: 6. La invención se refiere además a secuencias de aminoácidos y/o ácidos nucleicos que exhiben algún grado de identidad y/u homología con la totalidad o una parte (fragmento) de los SEQ ID NO: 1, s Eq ID NO 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

Por comodidad de uso, las secuencias de SEQ ID NOS: 1-6 (cada una de las cuales codifica o proporciona proteínas R2R* 1) pueden denominarse en lo sucesivo "secuencias de referencia".

Un fragmento de una secuencia de referencia de la presente divulgación puede comprender cualquier número de restos de ácido nucleico/aminoácido. Por ejemplo, un fragmento para su uso en la presente invención puede comprender de aproximadamente 5-10 restos a aproximadamente n-1 restos, en donde "n" es el número total de restos (ácido nucleico/aminoácido) en la secuencia de referencia. Por ejemplo, un fragmento o parte de una secuencia de referencia de la presente invención puede comprender al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 88, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 265, 266, 267, 300, 341,350, 400 o 424 restos: el límite superior (n-1) según el tamaño (n) de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína completa o el número (n) de restos de aminoácidos que comprenden la secuencia primaria completa de la proteína.

Las secuencias homólogas o idénticas pueden ser de origen natural y encontrarse en animales mamíferos tales como roedores y/o seres humanos. Usando las secuencias de ácidos nucleicos y/o aminoácidos descritas en el presente documento, un experto en la técnica podría identificar fácilmente secuencias relacionadas (por ejemplo, homólogas o idénticas) dentro de secuencias genómicas más grandes y en otras especies, tales como otros mamíferos, etc. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico derivada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento puede usarse como sonda para detectar secuencias homólogas/idénticas o estrechamente relacionadas dentro de los genomas de otras especies (no murinas o humanas).

Se pueden construir secuencias homólogas o idénticas usando, por ejemplo, técnicas moleculares, de secuenciación, PCR y/o de clonación. Un experto en este campo comprenderá fácilmente que las secuencias homólogas o idénticas a cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento (denominadas en adelante como "secuencias de referencia"), incluyendo fragmentos (funcionales) de tales secuencias, pueden exhibir una homología o identidad de secuencia tan pequeña como aproximadamente 20 o 30 % sobre la totalidad o parte de la secuencia relevante o fragmento de la misma. En otros casos, las secuencias homólogas o idénticas pueden exhibir al menos 40, 50, 60, 65 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de homología o identidad con cualquiera de las secuencias divulgadas en el presente documento. Por ejemplo, los SEQ ID NOS 2 y 4, que proporcionan secuencias de ácido nucleico que son útiles en la presente invención (ya sea como medicamentos por sí mismos o como secuencias que codifican proteínas o péptidos útiles) son idénticas en un 81,3 % en toda la longitud de 267 aminoácidos. Por lo tanto, con referencia a la secuencia del SEQ ID NO: 2, por ejemplo, pueden ser útiles las secuencias que presentan una identidad de homología de secuencia de aproximadamente el 80 %. Cuando se alinean las secuencias de SEQ ID NOS: 1 y 3, las secuencias son aproximadamente un 64 % idénticas y, como tal, con referencia al SEQ ID NO: 1, por ejemplo, pueden ser útiles las secuencias que presentan aproximadamente un 64 % de homología o identidad de secuencia.

El grado (o el porcentaje) de "homología" entre dos o más secuencias (de aminoácidos o de ácido nucleico) se puede determinar alineando las secuencias y determinando el número de restos alineados que son idénticos o que no son idénticos pero que difieren por sustituciones de nucleótidos redundantes (la sustitución de nucleótido redundante que no tiene efecto en el aminoácido codificado por un codón particular, o sustituciones de aminoácidos conservadoras). La homología puede evaluarse utilizando la Herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410).

También se puede determinar un grado (o porcentaje) de "identidad" entre dos o más secuencias (de aminoácidos o de ácidos nucleicos) alineando las secuencias y comprobando el número de coincidencias exactas de los restos entre las secuencias alineadas y dividiendo este número entre el número de restos totales comparados - multiplicando la figura resultante por 100 se produciría el porcentaje de identidad entre las secuencias.

Cada una de las secuencias de referencia codifica proteínas o péptidos que se unen, interaccionan o se asocian de otro modo con (un componente/componentes o sitio de unión R2R1 de) PRC1 y/o TrxG-MLL; como tales fragmentos útiles de una cualquiera de las secuencias de referencia descritas en el presente documento o, de hecho, secuencias útiles que exhiben el nivel requerido de homología o identidad con cualquiera de los SEQ ID NOS 1-6 (o fragmentos de las mismas) pueden codificar o proporcionar una proteína o péptido funcional, que es una proteína o péptido que muestra la capacidad de unirse, o una afinidad por, PRC1 y/o TRXG-MLL y/o componentes o subunidades de cualquiera de estos. Una proteína o péptido que exhibe la capacidad de unirse/asociarse a/con, o una afinidad por, PRC1 y/o TRXG-MLL pueden unirse/asociarse a/con o tener afinidad por, un sitio de unión a R2R1 del mismo.

En vista de lo anterior, los compuestos útiles en los diversos aspectos de la presente invención pueden comprender, consistir esencialmente en un ácido nucleico divulgado en el presente documento (por ejemplo, un ácido nucleico proporcionado por los SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4), péptidos/proteínas codificados por el mismo, así como cualquiera de las proteínas o péptidos divulgados en el presente documento (por ejemplo, una proteína o péptido proporcionado por los SEQ ID NO: 5 o 6), secuencias de ácido nucleico o proteína/péptido que comprenden partes o fragmentos de las secuencias de ácido nucleico/aminoácido descritas en el presente documento, secuencias de ácidos nucleicos o proteínas/péptidos que exhiben cierto nivel de homología o identidad con una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos descrita en el presente documento.

Adicionalmente, la invención puede explotar secuencias variantes de ácidos nucleicos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico variante o una secuencia de aminoácidos puede ser una variante natural que comprende (o alberga o incluye), con respecto a una secuencia de referencia de la presente invención, uno o más polimorfismos o adiciones, sustituciones, inversiones o deleciones de ácidos nucleicos/aminoácidos. Además, es bien sabido en la técnica, que la degeneración del código genético permite la sustitución de una o más bases en un codón sin alteración de la secuencia primaria de aminoácidos. Como tal, la degeneración genética puede aprovecharse para producir secuencias de ácido nucleico variantes que codifican secuencias de péptidos o proteínas sustancialmente idénticas a las secuencias de referencia descritas en el presente documento. También se puede generar una secuencia variante útil mediante la explotación de una o más sustituciones "conservadoras" de restos. Un experto en este campo comprenderá que la expresión "sustitución conservadora" pretende abarcar el acto de, por ejemplo, reemplazar uno o más aminoácidos de una proteína o secuencia peptídica de referencia de la presente divulgación con un aminoácido alternativo con propiedades similares y que no altera sustancialmente las propiedades fisicoquímicas y/o la estructura o función de la proteína nativa (o de tipo salvaje).

Como tal, debe entenderse que todas esas variantes, especialmente aquellas que son funcionales o muestran la actividad deseada o que codifican péptidos/proteínas funcionales, es decir, proteínas/péptidos que exhiben la capacidad de unirse o asociarse con los complejos PRC1 y/o TrxG-MLL y/o componentes o subunidades de cualquiera de estos, pueden ser útiles en la presente invención.

La invención puede explotar compuestos (por ejemplo, compuestos inhibidores) que modulan la expresión de los genes R2R1 (secuencias ilustrativas de las cuales se proporcionan como SEQ ID NOS: 1-4 citadas anteriormente) y/o la actividad, la función y/o la expresión de las proteínas/péptidos R2R1 (cuyas secuencias ilustrativas se proporcionan como SEQ ID NOS: 5 y 6 citadas anteriormente) en las células. Por ejemplo, los compuestos para su uso en la presente invención pueden tomar la forma de oligonucleótidos antisentido o inhibidores de tipo ARNi. Los compuestos de este tipo están diseñados para interferir con el proceso de transcripción/traducción dirigiéndose a secuencias específicas de ADN o ARN. Una molécula/oligonucleótido antisentido puede comprender ADN y/o ARN y puede usarse para reducir o suprimir significativamente la expresión del gen R2R1 o el producto proteico del mismo. Por ejemplo, una secuencia de ADN antisentido puede comprender una secuencia corta complementaria a una porción de cualquiera de las secuencias de referencia de ácidos nucleicos descritas en el presente documento. Por ejemplo, una secuencia antisentido puede comprender entre aproximadamente 5 y 50 restos de ácido nucleico contiguos de cualquiera de las secuencias proporcionadas como SEQ ID NOS 1-4. Una secuencia de ARN antisentido para su uso en la presente invención puede ser complementaria a alguna parte de una secuencia de ARNm de R2R1. Otros tipos de moléculas útiles basadas en ARN/ADN inhibidor o antisentido pueden incluir las conocidas como microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño/corto (ARNic) o ARNhc. Dichos oligonucleótidos de ARN pueden estar en forma de dúplex de ARN nativo o dúplex que han sido modificados de algún modo (por ejemplo, mediante modificación química) para que sean resistentes a las nucleasas. De manera adicional o alternativa, los oligonucleótidos de ARN pueden adoptar la forma de expresión de ARN de horquilla corta (ARNhc) o construcciones de plásmidos que corresponden o comprenden ARNic del tipo descrito en el presente documento. De manera ventajosa, las moléculas de ARNi potencialmente útiles pueden tomar la forma de moléculas de ARN bicatenario. En todos los casos, las moléculas de ADN o ARN antisentido pueden comprender secuencias complementarias a las secuencias de R2R1 divulgadas en el presente documento. Cabe señalar que para todas las aplicaciones de la tecnología antisentido descrita en el presente documento, se conocen técnicas y protocolos para lograr el control antisentido de la expresión génica y se pueden usar algoritmos que predicen computacionalmente secuencias antisentido que tienen un efecto de silenciamiento óptimo para un gen dado para diseñar moléculas/oligómeros antisentido adecuados.

La invención puede explotar compuestos recombinantes, en particular proteínas/péptidos recombinantes y/o secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, utilizando las secuencias de referencia divulgadas en el presente documento, un experto puede usar técnicas moleculares, de clonación y PCR para producir secuencias y/o proteínas/péptidos de R2R1 recombinantes para su uso en la presente invención. Se puede encontrar más información sobre la PCR y las técnicas basadas en la clonación para la producción de secuencias recombinantes en, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, Segunda edición editada por Carl W. Dieffenbach y Gabriela S. Dveksler: Cold Spring Harbour Laboratory Press and Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Joseph Sambrook & David Russell: Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Los compuestos para su uso en la presente invención pueden comprender anticuerpos (incluyendo antígeno o fragmentos de unión a diana del mismo). Los anticuerpos pueden unirse a proteínas/péptidos R2R1 (o epítopos de los mismos) o epítopos que corresponden a, o están ubicados dentro de, el sitio de unión ocupado por R2R1 dentro de los sitios de unión del complejo PRC1 y/o TrxG-MLL. El término "anticuerpos" puede abarcar anticuerpos policlonales y/o monoclonales y, por ejemplo, los isotipos IgG, IgM, IgD, IgE y/o IgA. Adicionalmente, la expresión "fragmentos de anticuerpo" debe interpretarse como que abarca aquellos que comprenden una o ambas cadenas ligeras y/o una o ambas cadenas pesadas, así como aquellos fragmentos conocidos como fragmentos Fab, fragmentos Fab² y fragmentos scfv.

Los anticuerpos adecuados y/o fragmentos de los mismos pueden funcionar y pueden incluir aquellos que son capaces de interferir, bloquear o neutralizar la unión de R2R1 a los complejos PRC1 y/o TrxG-MLL. De manera alternativa, los anticuerpos útiles o fragmentos de los mismos pueden unirse al sitio de unión de R2R1 dentro de los complejos PRC1 y/o TrxG-MLL. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que se unen al sitio de unión de R2R1 dentro de los complejos PRC1 y/o TrxG-MLL pueden usarse para afectar a una función similar a R2R1. En otras palabras, los anticuerpos (o fragmentos funcionales de los mismos) de este tipo pueden usarse en ausencia de R2R1 para reemplazar la función de R2R1.

Como se ha indicado, el término anticuerpo como se usa en el presente documento puede incluir anticuerpos policlonales y/o monoclonales. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas del suero de animales inmunizados con un antígeno, o un derivado funcional antigénico del mismo. Por lo tanto, para producir anticuerpos policlonales con especificidad o afinidad por R2R1, animales huéspedes, por ejemplo, conejos, ovejas, cerdos, etc., pueden inmunizarse (quizás mediante inyección) con una proteína/péptido R2R1 (por ejemplo, una proteína o un péptido codificado o proporcionado por una secuencia descrita en el presente documento o fragmentos adecuados (proteína/péptido antigénico que codifican) de la misma. El animal inmunizado produciría entonces anticuerpos con especificidad y/o afinidad hacia o por R2R1 y estos podrían recogerse de los sueros. Los anticuerpos monoclonales son poblaciones homogéneas de anticuerpos con especificidad/afinidad por un antígeno particular o un epítopo del mismo. Se pueden obtener mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estos incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein (1975), Nature 256:495-497; y la patente de EE.UU. n.° 4.376.110), la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) y la técnica del hibridoma EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Los anticuerpos monoclonales para su uso en la presente invención se pueden fabricar usando métodos que explotan cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos divulgadas en el presente documento (por ejemplo, proteínas o péptidos codificados por las secuencias de ácidos nucleicos de cualquiera de los SEQ ID NOS: 1-4 o las secuencias de los SEQ ID NOS: 5 o 6).

Los compuestos para su uso en la presente divulgación pueden comprender además moléculas pequeñas (por ejemplo, compuestos orgánicos pequeños) que pueden reemplazar o inhibir los efectos de R2R1. Por ejemplo, las moléculas pequeñas que (i) interaccionan o interfieren con la unión de R2R1 a RNF2, DPY-30/ASH₂L o SF3B2; (ii) inhibir la unión de R2R1 a RNF2, DPY-30/ASH₂L o SF3B2; (iii) mejorar la unión de R2R1 a RNF2, DPY-30/ASH₂L o SF3B2 o (iv) modular la unión de R2R1 a RNF2, DPY-30/ASH₂L o SF3B2 también pueden encontrar utilidad en la presente divulgación.

Los compuestos adecuados para su uso en la presente divulgación (es decir, los compuestos que modulan la ciliogénesis y/o son adecuados para su uso en la restauración de la ciliogénesis y/o el tratamiento o la prevención de enfermedades) pueden identificarse utilizando métodos que implican proporcionar un compuesto de prueba y ponerlo en contacto con una célula y determinar si después del contacto con el compuesto de prueba, ha habido alguna modulación de la ciliogénesis en la célula. La modulación de la ciliogénesis se puede detectar mediante cualquier aumento o disminución observados en la ciliogénesis y/o la formación de cilios, desarrollo o actividad en relación con el nivel de ciliogénesis o formación de cilios, desarrollo o actividad en una célula que no ha estado en contacto con un (o el) agente de prueba. Una célula para su uso en un método de este tipo puede ser cualquier célula capaz de experimentar o ejecutar ciliogénesis. La célula puede ser células epiteliales bronquiales primarias (PBEC) diferenciadas, en diferenciación o no diferenciadas derivadas de donantes humanos. La célula también puede ser una célula iPS no diferenciada, en diferenciación o diferenciada (célula madre pluripotencial inducida) con o sin modificaciones genéticas. Por ejemplo, la célula iPS puede portar una modificación genética en el gen o genes que codifican para R2R1. Las células se pueden cultivar en condiciones específicas, por ejemplo como una monocapa, en suspensión o en condiciones de interfaz aire-líquido

La expresión "ciliogénesis aberrante o defectuosa" puede abarcar una ciliogénesis excesiva o inapropiada o condiciones en las que el proceso de, o los procesos asociados con, la ciliogénesis se ha eliminado, está inhibida o ha fallado (o está fallando). Las expresiones "ciliogénesis aberrante o defectuosa" puede incluir aquellas enfermedades o afecciones clasificadas ampliamente como "ciliopatías". La pérdida de ciliogénesis puede conducir a un epitelio bronquial anormal.

Un experto apreciará que la ciliogénesis es un proceso importante que conduce a la formación de células ciliadas que desempeñan un papel crucial en la facilitación de la eliminación de la mucosa. La pérdida de células ciliadas (por ejemplo, a través de alguna forma de ciliogénesis aberrante o defectuosa) puede conducir a una eliminación mucociliar ineficiente en pacientes que sufren de, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En dichos casos, el epitelio bronquial anormal (caracterizado por pérdida de células ciliadas, diferenciación escamosa e hiperplasia de células basales) es incapaz de limpiar las vías respiratorias de moco, bacterias, virus y otros residuos. Este mecanismo de eliminación ineficaz puede provocar síntomas graves que incluyen, por ejemplo, tos, infecciones broncopulmonares e intercambio gaseoso ineficaz en el pulmón. Tales complicaciones se asocian frecuentemente con una alta tasa de mortalidad.

Como tal, los diversos compuestos descritos en el presente documento (cuyos compuestos son capaces de unirse o interactuar/asociarse con PRC1 y/o TrxG-MLL y que pueden adoptar la forma de ácidos nucleicos (ADN/ARN sentido/antisentido), proteínas/péptidos, moléculas pequeñas y/o anticuerpos, pueden ser útiles en la restauración o corrección de la ciliogénesis en células que exhiben ciliogénesis aberrante (por ejemplo, reducida, inhibida, dañada, defectuosa o eliminada) como se ha descrito anteriormente. Otros compuestos (por ejemplo, ácidos nucleicos (ADN/ARN sentido/antisentido), proteínas/péptidos, moléculas pequeñas y/o anticuerpos) para inhibir o reducir la ciliogénesis en una célula.

Un experto apreciará que la ciliogénesis aberrante puede ser cualquier ciliogénesis que, cuando se compara con los niveles normales de ciliogénesis (como podría ocurrir en células sanas) aumenta o disminuye. La ciliogénesis aberrante (aumentada o disminuida) puede estar asociada con una serie de enfermedades, incluidas las denominadas ciliopatías (por ejemplo, discinesia ciliar primaria, hidrocefalia, enfermedad poliquística del hígado y del riñón y ciertas formas de degeneración retiniana, así como nefronoptisis, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Alstrom y síndrome de Meckel-Gruber). La ciliogénesis aberrante o defectuosa también puede causar o contribuir a enfermedades del sistema pulmonar y las vías respiratorias, incluyendo, por ejemplo, EPOC y similares. Como tal, los diversos compuestos descritos en el presente documento (cuyos compuestos son capaces de unirse o interactuar/asociarse con PRC1 y/o TrxG-MLL) pueden ser útiles en el tratamiento y/o prevención de ciliopatías y/o EPOC. Por ejemplo, los compuestos de la presente divulgación se pueden usar para restaurar la ciliogénesis en pacientes que padecen o están predispuestos y/o susceptibles a, EPOc .

Los compuestos para su uso en la presente invención pueden formularse como composiciones para administración a sujetos que lo necesiten. Los compuestos se pueden proporcionar como composiciones farmacéuticas. Una composición para su uso puede comprender un excipiente, diluyente y/o tampón adecuado (por ejemplo, farmacéuticamente adecuado). Los compuestos de la presente invención se pueden formular junto con uno o más compuestos para su administración, por ejemplo, uno o más medicamentos, medicamentos que pueden ser para la prevención y/o tratamiento de otras enfermedades y/o enfermedades y/o afecciones asociadas con la ciliogénesis. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas proporcionadas por la presente invención se formulan como composiciones farmacéuticas estériles.

Los excipientes, vehículos o diluyentes adecuados pueden incluir, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tal como seroalbúmina, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, sales de agua o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polipropileno, polietilenglicol y grasa de lana y similares, o combinaciones de los mismos.

Se puede formular una formulación farmacéutica para su uso en la presente invención, por ejemplo, en una forma adecuada para administración oral, parenteral, mucosa o tópica. La composición se puede formular de manera que se pueda inhalar. Las composiciones que se van a administrar por inhalación pueden tomar la forma de polvos finos o soluciones que se pueden aerosolizar e inhalar como gotículas. Un experto en este campo estará familiarizado con los dispositivos que se pueden usar para administrar composiciones directamente al pulmón mediante, por ejemplo, inhalación. El tamaño de las gotículas o partículas de la composición se puede alterar de modo que el fármaco pueda acceder a diferentes regiones del pulmón. Por ejemplo, una vez inhaladas, las pequeñas partículas o gotículas pueden penetrar profundamente en el tejido pulmonar y, en algunos casos, pueden llegar a los alvéolos.

Las composiciones adecuadas para administración oral, en donde el vehículo es un sólido, se presentan más preferentemente como formulaciones de dosis unitaria tales como bolos, cápsulas o comprimidos cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de uno o más de los compuestos de unión a PRC1 y/o TrxG-MLL para su uso de acuerdo con la presente invención. Se puede fabricar un comprimido mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Las pastillas comprimidas se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada los compuestos aglutinantes activos de PRC1 y/o TrxG-MLL en una forma fluida, tal como un polvo o gránulos mezclados opcionalmente con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, un agente lubricante, agente tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando el (los) compuesto(s) aglutinante(s) activo(s) de PRC1 y/o TrxG-MLL con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir opcionalmente y, si no se recubren, se pueden marcar opcionalmente. Las cápsulas se pueden preparar rellenando un compuesto activo, bien solo o en mezcla con uno o más ingredientes accesorios, en las cubiertas de la cápsula y después sellándolo de la forma habitual. Una sustancia activa (por ejemplo, un compuesto de unión a PRC1 y/o TRXG-MLL para su uso de acuerdo con la presente invención) también se puede formular como gránulos dispersables, que, por ejemplo, se pueden suspender en agua antes de la administración, o espolvorear sobre los alimentos. Los gránulos se pueden envasar, por ejemplo en un sobre. Las formulaciones adecuadas para la administración oral en las que el vehículo es un líquido se pueden presentar como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua.

Las composiciones adecuadas para la administración oral incluyen formas de dosificación de liberación controlada, por ejemplo comprimidos en los que el (los) compuesto(s) de unión activo(s) a PRC1 y/o TrxG-MLL se formula(n) en una matriz de control de liberación adecuada, o se recubre con una película de control de liberación adecuada. Tales composiciones pueden ser particularmente convenientes para uso profiláctico.

Las composiciones formuladas para administración parenteral incluyen soluciones o suspensiones estériles de compuestos activos PRC1 y/o TrxG-MLL (para su uso de acuerdo con la presente invención) en vehículos acuosos u oleaginosos. Las composiciones para su uso de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, o comprender además, compuestos o composiciones crioprotectoras, conservantes, antibióticas, adyuvantes y similares.

Las composiciones inyectables y las vacunas se pueden adaptar para la inyección de bolos o la infusión continua. Tales preparaciones se presentan de manera conveniente en dosis unitaria o en recipientes multidosis, que se sellan tras la introducción de la formulación hasta que se requiera su uso. De manera alternativa, un compuesto activo de PRC1 y/o TrxG-MLL para su uso de acuerdo con la presente invención puede estar en forma de polvo que se constituye con un vehículo adecuado, tal como agua apirógena estéril o solución salina tamponada con fosfato PBS antes de su uso.

Las composiciones que comprenden uno o más compuestos PRC1 y/o TrxG-MLL para su uso de acuerdo con la presente invención también se pueden formular como preparaciones de depósito de acción prolongada, que se pueden administrar mediante inyección intramuscular o mediante implantación, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular. Las preparaciones de medicamento de acción prolongada pueden incluir, por ejemplo, materiales poliméricos adecuados o hidrófobos, o resinas de intercambio iónico. También pueden incluir preparaciones o adyuvantes conocidos por mejorar la afinidad y/o la longevidad de la respuesta inmunitaria de un animal (por ejemplo, bovino, ovino o caprino), tal como emulsiones únicas o dobles de aceite en agua. Tales composiciones de acción prolongada son particularmente convenientes para uso profiláctico.

Las composiciones adecuadas (o formuladas) para la administración mucosal incluyen composiciones que comprenden partículas para la dispersión en aerosol o dispensadas en agua potable. Cuando se dispensan, tales composiciones deben tener de forma deseable un diámetro de partículas en el intervalo de 10 a 200 micrómetros para permitir la retención en, por ejemplo, la cavidad nasal; esto se puede lograr mediante, según proceda, el uso de un polvo de un tamaño de partícula adecuado o la elección de una válvula apropiada. Otras composiciones adecuadas incluyen los polvos gruesos que tiene un diámetro de partícula en el intervalo de 20 a 500 micrómetros, para la administración mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente que se mantiene cerca de la nariz, y gotas nasales que comprenden del 0,2 al 5 % en p/v de un compuesto activo en solución o suspensión acuosa u oleosa.

Debe entenderse que, además de los ingredientes vehículo mencionados anteriormente, las diversas composiciones descritas en el presente documento pueden incluir uno o más ingredientes vehículos adicionales adecuados (farmacéuticamente aceptables) tales como diluyentes, tampones, agentes saborizantes, aglutinantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluyendo antioxidantes) y similares, y sustancias incluidas con el fin de hacer que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, tampón fosfato 0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina al 0,8 %. Adicionalmente, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer o aceites fijos. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.

Se pueden proporcionar composiciones adecuadas para la formulación tópica, por ejemplo, como geles, cremas o ungüentos.

Las composiciones para uso veterinario pueden estar convenientemente en forma de concentrado líquido o en polvo. De acuerdo con la práctica estándar de formulación veterinaria, se pueden incorporar excipientes hidrosolubles convencionales, tales como lactosa o sacarosa, en los polvos para mejorar sus propiedades físicas. Por lo tanto, los polvos particularmente adecuados comprenden del 50 al 100 % p/p y, preferentemente, del 60 al 80 % p/p del principio o principios activos (por ejemplo, uno o más compuestos PRC1 y/o TrxG-MLL para su uso de acuerdo con la presente invención) y 0 al 50 % p/p y preferentemente del 20 al 40 % p/p de excipientes veterinarios convencionales. Estos polvos se pueden o bien añadir a, por ejemplo, el pienso de los animales - quizás a modo de una premezcla intermedia, o bien se diluyen en el agua potable de los animales.

Los concentrados líquidos de la presente invención contienen adecuadamente uno o más compuestos PRC1 y/o TrxG-MLL para su uso según la presente invención y pueden incluir opcionalmente un disolvente miscible en agua aceptable para uso veterinario, por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol, glicerol, glicerol formal o tal disolvente mezclado con hasta el 30 % v/v de etanol. Los concentrados líquidos se pueden administrar al agua potable de los animales.

Descripción detallada

La presente invención se describirá a continuación en detalle con referencia a las siguientes Figuras que muestran:

Figura 1: Ilustración de la función de R2R1 en la ciliogénesis.

Figura 2: ilustración del experimento de co-inmunoprecipitación de transferencia Western de R2R1.

Figura 3: Comparación de las proporciones en log que representan la expresión diferencial del efecto transcripcional de la caída de R2R1 (FAM25_KD) y el estado de la enfermedad de la EPOC.

Figura 4: Gráficos de intensidad log₂ que ilustran la regulación positiva de genes ciliares ilustrativos.

Figura 5: Diagramas de caja que ilustran la importancia de los genes ciliares expresados diferencialmente en la eliminación mediada por ARNhc de la expresión del gen FAM25 (R2R1).

Figura 6: Gráfico de la proporción log₂ que ilustra la regulación positiva de los genes ciliares (movimiento ciliar) causada por la regulación negativa mediada por ARNhc de la expresión del gen FAM25 (R2R1).

Figura 7: Gráfico de la proporción Log² que ilustra la regulación positiva de los genes ciliares (morfogénesis ciliar) causada por la regulación negativa mediada por ARNhc de la expresión del gen FAM25 (R2R1).

Fig.8. Análisis de mapa espectral con primer componente principal (PC1 en el eje X) y segundo componente principal (PC2 en el eje Y).

Fig.9: Perfil de expresión del gen DYNLRB2, PBEC en CM, donante sin EPOC (Br331) frente a EPOC (Br370). Fig.10: RTqPCR de la expresión del gen R2R1 (ensayo ABI Hs04194072_mH y ensayo ABI Hs04194073_mH) tras la expresión constitutiva de shRNA_R2R1 en PBe C Br331 sin EPOC y PBe C Br370 con EPOC.

Fig.11: RTqPCR de la expresión del gen R2R1 (ensayo ABI Hs04194072_mH y ensayo ABI Hs04194073_mH) tras la expresión constitutiva de FHR2R1 en PBEC Br331 sin EPOC y PBEC Br370 con EPOC.

Fig.12: Patrón de fluorescencia en PBEC Br370 con EPOC la semana 1 de exposición al aire.

Fig.13: Fluorescencia celular total corregida (CTCF) como medida de la expresión de la proteína R2R1 en PBEC Br331 sin EPOC en las semanas 1, 2 y 3 de exposición al aire.

Fig.14: Fluorescencia celular total corregida (CTCF) como medida de la expresión de la proteína R2R1 en PBEC Br331 sin EPOC en las semanas 1, 2 y 3 de exposición al aire resumida en un gráfico.

Fig15: Análisis SPM de los niveles de expresión génica de todas las muestras del experimento.

Fig.16: Análisis SPM de los niveles de expresión génica del subconjunto de condiciones de "regulación negativa" de R2R1.

Fig.17: Análisis SPM de los niveles de expresión génica del subconjunto de condiciones de "regulación positiva" de R2R1.

Fig.18: Análisis SPM de los niveles de expresión génica de todas las muestras del experimento.

Fig.19: Gráfico de la intensidad log₂ que ilustra la regulación positiva de la expresión de ROPN1L tras la regulación negativa de la expresión del gen R2R1.

Fig.20: Gráfico de la intensidad log₂ que ilustra la regulación positiva de la expresión de ROPN1L tras la regulación negativa de la expresión del gen R2R1.

Fig. 21: Gráfico de la intensidad log₂ que ilustra la regulación negativa de la expresión de ROPN1L tras la regulación positiva de la expresión del gen R2R1.

Fig.22: número de células ciliadas Br331 sin EPOC.

Fig.23: número de células ciliadas Br370 con EPOC.

Fig.24: número de células productoras de moco Br331 sin EPOC.

Fig.25: número de células productoras de moco Br331 sin EPOC.

Fig.26: ilustración de tinción de Br331/2s EA/CM sin EPOC, ARNhc_CN, ARNhc_R2R1.

Fig.27: ilustración de tinción de Br370/2s EA/CM con EPOC, ARNhc_CN, ARNhc_R2R1.

Fig.28: ilustración de tinción de Br331/2s EA/CM sin EPOC, FH, FHR2R1.

Fig.29: ilustración de tinción de Br370/2s EA/CM con EPOC, FH, FHR2R1.

Fig.30: ilustración de tinción de Br331/3s EA/CM sin EPOC, ARNhc_CN, ARNhc_R2R1.

Fig.31: ilustración de tinción de Br370/3s EA/CM con EPOC, ARNhc_CN, ARNhc_R2R1.

Fig.32: ilustración de tinción de Br331/3s EA/CM sin EPOC, FH, FHR2R1.

Fig.33/34: ilustración de tinción de Br370/3s EA/CM con EPOC, FH, FHR2R1.

EJEMPLO 1

1.1: La unión de proteínas R2R1 (familia de proteínas FAM25) a los complejos de unión/remodelación de cromatina del grupo Polycomb PRC1 (a través de la subunidad RNF2) y del grupo Trithorax TrxG-MLL (a través de las subunidades DPY-30 y ASH2L) es un interruptor de encendido/apagado para la ciliogénesis en el epitelio bronquial pulmonar humano.

R2R1 es esencial para el mantenimiento y la regeneración del epitelio pulmonar, más concretamente el programa de células basales. Los experimentos en células epiteliales bronquiales primarias sumergidas (PBEC) descubrieron esta función. Las condiciones de cultivo sumergido se caracterizan por una rápida proliferación celular de PBEC no diferenciadas. Por lo tanto, las condiciones de cultivo sumergido son ideales para el estudio de las células basales ("las células madre del epitelio pulmonar bronquial humano ("vías respiratorias").

Se realizaron experimentos de seguimiento para estudiar la función de R2R1 en las PBEC en diferenciación/diferenciadas. Las PBEC se cultivaron en condiciones de interfaz aire-líquido ("IAL"). La eliminación mediada por ARNhc de la expresión del gen R2R1 en PBEC cultivadas en condiciones IAL reveló en dos experimentos independientes la función complementaria de R2R1 en la diferenciación de células epiteliales bronquiales humanas. El efecto del ARNhc "FAM25 147" expresado de manera constitutiva e inducible (= TRCN0000284147, también denominado ARNhc_R2R1) dirigido contra la expresión de R2R1 se muestra en las Figuras 4-7.

1.2: La inactivación de la expresión de R2R1 conduce a una profunda regulación positiva de la ciliogénesis o del programa de expresión génica ciliar.

El programa de expresión génica ciliar abarca las proteínas estructurales y motoras/de movimiento del cilio móvil. De ello se deduce que R2R1 controla la puerta de entrada entre las células basales y las células ciliadas. La función de R2R1 es "simétrica": específicamente, en presencia de R2R1 se ejecuta el programa de células basales, en ausencia de R2R1 se inicia el programa de células ciliadas. La simetría es de células basales ^ células ciliadas (véase la Figura 1). Cabe señalar que no hay evidencia de una célula basal de simetría ^ célula productora de mucosa, un hallazgo con importantes consecuencias terapéuticas.

La pérdida de células ciliadas conduce a un aclaramiento mucociliar ineficaz en pacientes que padecen EPOC. Este es, de hecho, el sello patológico de la EPOC: el epitelio bronquial anormal (pérdida de células ciliadas, diferenciación escamosa e hiperplasia de células basales) no puede limpiar las vías respiratorias de moco, bacterias, virus y restos. Este mecanismo de eliminación ineficaz provocará síntomas graves (tos, infecciones broncopulmonares, intercambio gaseoso ineficiente en el pulmón...), lo que da como resultado una alta tasa de mortalidad.

Se descubrió que las PBEC cultivadas en condiciones de IAL exhibían una regulación negativa persistente del programa de expresión génica ciliar. Este fenómeno se observó en PBEC de múltiples donantes en dos experimentos independientes.

Se realizó una comparación entre el efecto transcripcional del estado de la enfermedad de la EPOC y la eliminación mediada por ARNhc de R2R1 en PBEC (condiciones de cultivo IAL), véase la Figura 3. El cuadrante superior izquierdo destaca el efecto de R2R1 sobre la ciliogénesis y la EPOC). Los genes que se expresan de manera diferencial debido a la eliminación de R2R1 mediada por ARNhc en PBEC (condiciones IAL) se muestran a lo largo del eje Y. Los genes que están regulados de forma positiva debido a la inactivación de R2R1 aparecerán por encima del cero en el eje Y. Los genes que se expresan de manera diferencial (estado de EPOC frente a sin EPOC) se muestran a lo largo del eje X. Los genes que están regulados de forma negativa debido al estado de la enfermedad de la EPOC aparecerán a la izquierda del cero en el eje X. El cuadrante superior izquierdo representará ahora la intersección entre los genes que están regulados de forma positiva debido a la inactivación de R2R1 y los genes que están regulados de forma negativa debido a la EPOC. La mayoría de este conjunto de genes está implicado en la ciliogénesis.

1.3: Investigar el mecanismo de acción por el cual R2R1 ejerce esta función de puerta de enlace (célula basal ^ célula ciliada).

La ciliogénesis requiere la producción de muchas proteínas ciliares. La expresión simultánea de estos múltiples genes tiene que estar estrictamente regulada. En consecuencia, esta regulación tiene que actuar como un interruptor de encendido/apagado.

Se identificó a RNF2, el componente central del complejo PRC1, como pareja de unión de R2R1 en dos experimentos independientes de dos híbridos de levadura (Y2H) (primer experimento: 7 coincidencias, 4 siendo RNF2 - segundo experimento 4 coincidencias, 1 siendo RNF2). DPY-30, un constituyente del complejo TrxG-MLL, se identificó como otra pareja de unión (1/7 coincidencias, en el primer experimento Y2H). Por último, SF3B2 (1/4 de las coincidencias en el segundo experimento Y2H) completa el conjunto de parejas de unión a la cromatina.

La interacción entre las proteínas R2R1 y PRC1/TrxG se confirmó en un Sistema de traducción in vitro (kit IVT de alto rendimiento CHO de 1 etapa, Thermo Scientific). Se coexpresó una construcción R2R1 marcada con HA N-terminal (en el vector pT7CFE1) con diferentes permutaciones de constructos PcG y TrxG marcadas con MARCADOR en N-terminal (en el vector pT7CFE1). La co-inmunoprecipitación se realizó con EZview™ Red Anti-HA Affinity Gel (Sigma Aldrich) para unir R2R1 y cualquier proteína asociada en la mezcla de reacción. Las proteínas unidas se analizaron mediante SDS-PAGE y se sometieron a transferencia Western con anticuerpo Monoclonal ANTI-FLAG.® M2 (Sigma Aldrich).

Las diferentes permutaciones se describen en la siguiente tabla (N-term. = N-terminal):

La Figura 2 demuestra la co-inmunoprecipitación de R2R1 y diferentes proteínas PRC1/TrxG usando diferentes permutaciones. RNF2 se une a R2R1 más fuertemente en una permutación no canónica del complejo PRC1 (en presencia de KMT2D (MLL4) y RYBP, calle 4) en comparación con una forma canónica del complejo PRC1 (calle 5). ASH₂L es una pareja de unión clara de R2R1 (calle 3) en una permutación que contiene las proteínas TrxG-MLL KMT2D (MLL4), DPY-30 y ASH₂L. ASH₂L y DPY-30 son parejas de unión recíproca conocidas y subunidades esenciales de los complejos TrxG-MLL. Por último, la supuesta heterodimerización entre R2R1 y DPY-30 se demuestra en la permutación de la mezcla de proteínas que contiene solo R2R1 y DPY-30.

De ello se deduce que el efecto transcripcional (muchos genes están controlados por R2R1 al mismo tiempo) es causado por el cambio de las propiedades de unión de los remodeladores de la cromatina, Siendo PRC1 el complejo más llamativo. Se sabe que Pr C1 intercambia sus componentes dando como resultado complejos canónicos y no canónicos. El efecto de PRC1 sobre la cromatina (ubiquitilación de H₂A, reclutamiento de PRC2 y ayuda a PRC2 en su función represiva) está determinado por sus diferentes proteínas componentes. Sin embargo, RNF2 siempre está presente en el complejo PRC1.

Por lo tanto, se ha encontrado una función no canónica bien definida de PRC1. Esta función está determinada por la unión de R2R1 al complejo PRC1. La unión de R2R1 a PRC1 es una puerta de entrada a la ciliogénesis. Adicionalmente, R2R1 interactúa con el complejo modificador de cromatina TrxG-MLL (grupo Trithorax o TrxG) a través de DPY-30 y ASH₂L. A diferencia de PRC1, TrxG mantiene la expresión génica activa mediante la metilación de H3K4. La interacción de las proteínas del grupo Polycomb y del grupo Trithorax mantiene un conjunto bien definido de genes en un estado activo o reprimido. Por consiguiente, R2R1 tiene un profundo efecto sobre los dominios de cromatina y la expresión génica al unirse al grupo Polycomb (PcG) PRC1 y las proteínas TrxG. Un péptido derivado de la proteína R2R1, una proteína (parcialmente) similar a R2R1, o una molécula pequeña que interacciona con el sitio de unión R2R1-RNF2 y/o R2R1-DPY-30/ASH₂L puede restaurar la ciliogénesis en pacientes que padecen EPOC. Es necesario demostrar que la proteína R2R1 controla el conjunto de genes responsables de la ciliogénesis en las PBEC humanas. Indicado de otra manera, se tiene que mostrar evidencia de que R2R1 se une a secuencias de ADN específicas (promotores o potenciadores) de genes que regulan o apoyan la ciliogénesis.

Los sitios de unión a R2R1 en el genoma de las PBEC humanas se identificaron en experimentos CHIP-Seq (inmunoprecipitación con cromatina seguida de secuenciación de próxima generación de fragmentos de ADN enriquecidos). La proteína R2R1 del epítopo en tándem FLAG-HA N-terminal y la proteína solo del epítopo en tándem FLAG-HA N-terminal se expresaron constitutivamente (transducción lentiviral) en PBEC humanas que se cultivaron en condiciones IAL. El ADN genómico y las proteínas que constituyen la cromatina se entrecruzaron mediante DSG (glutarato de disuccinimidilo) y formaldehído. La cromatina se sometió a ultrasonidos al tamaño apropiado (-200 pb) y se inmunoprecipitó con EZview™ Red Anti-HA Affinity Gel (Sigma Aldrich) para unir FLAG-HA-epítopo en tándem solo y FLAG-hA en tándem epítopo-R2R1 asociado a fragmentos de ADN genómico. En consecuencia, se preparó una biblioteca para la secuenciación de próxima generación (NGS) a partir de estos fragmentos de ADN (después de la digestión y el entrecruzamiento de proteínas) y se secuenció a una profundidad de al menos 40 x 106 lecturas. El conjunto de (~3000) sitios de unión a R2R1 se obtuvo comparando (EaSeq, http://easeq.net/) el enriquecimiento de sitios de unión en bibliotecas de epítopo en tándem FLAG-HA-R2R1 con sitios de unión en epítopo en tándem FLAG-HA -solo bibliotecas de "control". La reproducibilidad se evaluó y demostró realizando duplicados técnicos y biológicos (donantes Br331 y Br363).

En primer lugar, el análisis del conjunto de sitios de unión de R2R1 revela que R2R1 se une a los sitios promotores de TP73 y FOXJ, los factores maestros de transcripción que estimulan la producción de cilios móviles. Adicionalmente, R2R1 también se une a los sitios promotores de los genes que codifican los componentes de la maquinaria del cuerpo centrosomal/basal del cilio (CROCC, CCDC41, CEP131, CEP164, CEP170, CEP170B, CEP192, etc.). Por último, otros reguladores maestros (factores de transcripción, miARN, modificadores de cromatina y similares) de ciliogénesis y diferenciación epitelial también fueron identificados (FUZ, FGFR1, MIR34AHG, ARID1B, JARID2, YY1, KDM2A, KDM2B, KDM4B, KDM6B, KMT2A, KMT5B, SETD1A...). Por lo tanto, la divulgación puede referirse a compuestos (por ejemplo, los compuestos basados en R2R1 descritos en el presente documento) capaces de modular, unirse o asociarse con, genes que codifican componentes de la maquinaria corporal centrosomal/basal del cilio y/o reguladores de la ciliogénesis y la diferenciación epitelial.

A continuación se muestran ejemplos de secuencias de ADN de los sitios de unión de R2R1.

TP73

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FOXJ1

>hg19_dna range=chr17:74118677-741188765'pad=03'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

FUZ

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FUZ

>hg19_dna range=chr19:50304563-503047625'pad=03'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

CROCC

>hg19_dna range=chr1:17266175-172664685'pad=03'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

CROCC

>hg19_dna range=chr1:17239197-172394545'pad=03'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

CROCC

>hg19_dna range=chr1:17249731-172499305'pad=03'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

CROCCP2 (región CROCC)

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CROCCP3 (región CROCC)

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CEP131

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CEP164

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CEP170

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CEP170B

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CEP170B

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CEP170B

>hg19_dna range=chr14:105332644-1053328435'pad=03'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

CEP170B

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CEP192

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CCDC41

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MIR34AHG

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Las secuencias de ADN de los sitios de unión a R2R1 ilustrativos se caracterizan por un alto contenido de GC (base). De hecho, el análisis del contenido base de todo el conjunto de sitios de unión a R2R1 (~3000 sitios) muestra que el contenido de GC excede el contenido de AT: Las bases G y C representan > 66 % del contenido de base de los sitios de unión genómicos R2R1. El descubrimiento de motivos en los sitios de unión de R2R1 utilizando las herramientas de análisis de secuencia regulatoria (RSAT, http://rsat.sb-roscoff.fr/) revela motivos de GC altamente específicos. Estos motivos vuelven a aparecer independientemente del método de descubrimiento de motivos en RSAT (cálculo de apariciones de oligonucleótidos en un conjunto de secuencias que conducen a la detección de oligonucleótidos sobrerrepresentados, cálculo de la distribución posicional de oligonucleótidos en un conjunto de secuencias que conduce a la detección de aquellos que difieren significativamente de una distribución homogénea y detección de diadas espaciadas sobrerrepresentadas en un conjunto de secuencias de ADN con una diada que es un par de oligonucleótidos del mismo tamaño - definiciones proporcionada por el servidor RSAT: http://rsat.sb-roscoff.fr/). Los patrones recurrentes de GCC (CGG) son evidentes en los motivos descubiertos. En general, un alto contenido de GC y tramos repetitivos de nucleótidos de GC son característicos de las islas CpG (CGl). Actualmente se cree que estos CGl comprenden los sitios de unión genómica de PcG (elementos de respuesta de Polycomb o PRE) y complejos TrxG (elementos de respuesta de Trithorax o TRE), también denominados PRE en general. De ello se deduce que hemos establecido otro enlace a la función Polycomb: R2R1 representa un elemento de PRE-reconocimiento. Esto tiene un significado especial para los complejos PcG: a diferencia de los complejos TrxG, no se ha identificado ningún elemento de PRE-reconocimiento universal en los complejos PcG.

Ejemplo 2

2.1: Restauración de la ciliogénesis en PBEC derivadas de donantes de EPOC en todas las condiciones. Primero se debe determinar que la ciliogénesis debida a la ausencia de R2R1 no se limita a las PBEC derivadas de donantes sin EPOC. Por lo tanto hay que establecer que:

(a) La expresión de R2R1 puede regularse hacia arriba o hacia abajo de manera confiable en PBEC de un donante con EPOC y sin EPOC.

(b) La expresión de la proteína R2R1 está relacionada con la expresión del R2R1 (transcrito).

(c) La eliminación de la expresión de R2R1 desencadena el programa de expresión génica ciliar en PBEC de un donante con EPOC y sin EPOC. Por el contrario, la regulación positiva de la expresión de R2R1 conduce a la supresión del transcriptoma ciliar.

(d) Los cambios transcriptómicos deben reflejarse en el fenotipo celular. El transcriptoma de ciliogénesis debería conducir a un aumento en el número de células ciliadas en cultivos ALI de PBEC derivados de EPOC.

El siguiente experimento demuestra los puntos 2.1 (a), 2.1 (b), 2.1 (c) y 2.1 (d) anteriores.

Las PBEC derivadas de un donante sin EPOC (Br331) y un donante de EPOC (Br370) se cultivaron en condiciones de IAL. Se realizan análisis transcriptómicos y fenotípicos celulares a las 1, 2 y 3 semanas de Exposición al Aire (EA). Cada experimento se realizó por triplicado.

Las diferentes condiciones son:

(i) CM (Control en Medio) es la población celular que crece sin ninguna intervención.

(ii) La regulación negativa de la expresión de R2R1 en PBEC se logra mediante la expresión constitutiva (transducción lentiviral) de FAM25 147 = TRCN0000284147 (denominado ARNhc_R2R1). Las Pb EC que expresan constitutivamente ARNhc codificado (denominado ARNhc_CN) son las células de control negativo en esta condición.

(iii) La regulación positiva de la expresión de R2R1 se logra mediante la expresión constitutiva de un epítopo en tándem FLAG-HA N-terminal-R2R1 (denominado FHR2R1) constructo (transducción lentiviral). Las PBEC que expresan constitutivamente la construcción de solo epítopo en tándem FLAG-HA (denominada FH) son las células de control negativo en esta condición.

iv) Donante: sin EPOC (Br331) y EPOC (Br370)

(v) Tiempo: Las PBEC se recolectan a las 1, 2 y 3 semanas de EA (exposición al aire)

2.2: Las PBEC Br370 (EPOC) exhiben una regulación negativa persistente del programa de expresión génica ciliar a lo largo del tiempo.

La hipótesis es que (1) la ciliogénesis debería volverse progresivamente evidente con el tiempo en el perfil de expresión génica de PBEC en cultivo IAL. También se plantea la hipótesis de que (2) el transcriptoma de ciliogénesis debería retrasarse en las PBEC Br370 (EPOC) en comparación con las PBEC Br331 (sin EP^o C).

El análisis del programa de expresión génica en PBEC CM (PBEC que no se transducen lentiviralmente) probará o refutará nuestra hipótesis.

El análisis del Mapa Espectral (SPM) confirma nuestra hipótesis. El análisis de mapas espectrales (véase la Figura 8) proporciona una identificación imparcial de los grupos predominantes de genes y sujetos que están presentes en el conjunto de datos. Este análisis no supervisado de los datos de expresión génica revela que los cambios en la expresión génica durante el tiempo (semana de exposición al aire) representan la variación más grande (56 %) en el conjunto de datos. Esta variación está bien representada gráficamente en el primer componente principal (eje X o PC¹) de un mapa espectral. La segunda mayor variación en el conjunto de datos (17 %) puede explicarse por el estado de la enfermedad (EPOC frente a sin EPOC). Esta variación está representada en el segundo componente principal (eje Y o PC²). Los genes que muestran los cambios de expresión más fuertes se encuentran en los extremos de los ejes X e Y.

El subconjunto de genes responsables de los mayores cambios de expresión diferencial consiste completamente en genes ciliares (véase la Figura 8).

DYNLRB2 y ROPNL1 se destacan como ejemplos de genes ciliares. Como era de esperar, este subconjunto se encuentra de hecho en el extremo del eje X (PC¹, la variación explicada por el tiempo). Esto confirma la primera (1) parte de nuestra hipótesis.

En consecuencia, la superposición de las diferentes muestras de PBEC de MC en el mapa espectral muestra su distribución a lo largo de los dos primeros componentes principales. Se observa ahora que los grupos EPOC (Br370) y no EPOC (Br331) están claramente separados según su programa de expresión génica ciliar a lo largo de PC¹ y PC². Las PBEC Br331 que no tienen EPOC se agrupan más cerca del subconjunto de genes ciliares. Las PBEC Br370 con EPOC se agrupan en el extremo opuesto del subconjunto de genes ciliares. Esto prueba la segunda parte (2) de nuestra hipótesis. A modo de ejemplo, se incluye el perfil de expresión génica de DYNLRB2 (véase la Figura 9). Este análisis univariante independiente supervisado (gen por gen) confirma el efecto de la EPOC frente al origen sin EPOC (Br370 frente a Br331). Las PBEC Br331 sin EPOC recolectadas en el primer momento (semana AE = 1) muestran el nivel más bajo de expresión de DYNLRB2. Por el contrario, las PBEC Br331 sin EPOC recolectadas en el tercer punto de tiempo (semana AE = 3) muestran un nivel muy alto de expresión de DYNLRB2. Las PBEC Br370 con EPOC expresan pobremente este gen ilustrativo.

2:3: La expresión de R2R1 se puede regular de forma positiva o negativa de forma fiable en PBEC de un donante con EPOC y sin EPOC.

La RTqPCR de la expresión génica de R2R1 (ensayo ABI Hs04194072_mH y ensayo ABI Hs04194073_mH) demuestra una regulación negativa completa (inactivación) tras la expresión constitutiva de ARNhc_R2R1 en PBEC Br331 sin EPOC y PBEC Br370 con EPOC (véase la Figura 10). Por el contrario, la RTqPCR de la expresión génica de R2R1 (ensayo ABI Hs04194072_mH y ensayo ABI Hs04194073_mH) demuestra una regulación positiva > 104 tras la expresión constitutiva de FHR2R1 en PBEC Br331 sin EPOC y PBEC Br370 con EPOC (véase la Figura 11). Los datos se representan en diagramas de puntos de dispersión (línea en la media). Los datos de RTqPCR prueban que la expresión de R2R1 puede ser regulada de forma positiva o negativa de un modo muy profundo, significativo y fiable.

2:4: La expresión de la proteína R2R1 está relacionada con la expresión del R2R1 (transcrito).

El contenido total de proteína R2R1 en el núcleo se evalúa mediante el siguiente procedimiento. Las PBEC se tiñen inmunohistoquímicamente con 1/500 de anticuerpo anti-FAM25A (Abeam ab177969). La tinción del anticuerpo secundario se realiza con 1/1500 de anticuerpo secundario de cabra anti-conejo IgG (H L), Alexa Flúor® 594 conjugado (Thermo-Fisher Scientific A-11037). Mediante el uso de la imagen J (http://rsbweb.nih.gov/i¡/¡ndex.html). se determina la fluorescencia celular total corregida (CTCF) en 10 campos con un aumento de 20X. la CTCF se utiliza como una evaluación del contenido de proteína R2R1 total en el núcleo. La Figura 12 ilustra el patrón de fluorescencia característico de las diferentes condiciones (CM, FH, FHR2R1, ARNhc_CN y ARNhc_R2R1) en un momento determinado de exposición al aire. El gráfico de puntos de dispersión (línea en la media con SD) muestra el patrón de fluorescencia de las PBEC Br370 con EPOC en la semana 1 de exposición al aire (EA).

La figura 13 demuestra la secuencia a lo largo del tiempo del patrón de fluorescencia en PBEC Br331 sin EPOC. La figura 14 resume los 3 puntos de tiempo diferentes de la figura 13 en una representación gráfica.

Los datos de CTCF prueban que la regulación al alza o a la baja de R2R1 la expresión génica va seguida de una regulación positiva o negativa de la expresión de proteínas R2R1 en el núcleo. Adicionalmente, la localización nuclear de la proteína R2R1 es consistente con la interacción R2R1-PCG y R2R1-TrxG.

2.5: La inactivación de la expresión de R2R1 activa el programa de expresión génica ciliar en PBEC de un donante con EPOC y sin EPOC . Por el contrario, la regulación positiva de la expresión de R2R1 conduce a la supresión del transcriptoma ciliar.

Para demostrar el punto 2.5, se realizó un análisis no supervisado (SPM) de los niveles de expresión génica de todas las muestras del experimento. El conjunto de todas las muestras consiste en las condiciones de CM, FH, FHR2R1, ARNhc_CN y ARNhc_R2R1 a 1, 2 y 3 semanas de exposición al aire en PBEC Br331 sin EPOC y Br370 con EPOC. Los resultados muestran que el subconjunto de genes responsables de los mayores cambios de expresión diferencial consiste completamente en genes ciliares (véase la Figura 15). Adicionalmente, lo mismo es válido para los subconjuntos de condiciones de "regulación negativa" de R2R1 (muestras MC, ARNhc_CN, ARNhc_R2R1) y de "regulación positiva" de R2R1 (muestras de CM, FH, FHR2R1) (Figura 16 y Figura 17 respectivamente). El gen ROPN1L ilustrativo se resalta en cada gráfico de SPM.

Al inspeccionarlos más de cerca, se observa que las muestras con el grupo de expresión de R2R1 regulada de forma negativa más cerca del grupo de genes ciliares en las Figuras 15 y 16. Por ejemplo, las muestras de ARNhc_R2R1 de Br331 sin COVID (semana 3 de EA) se localizan muy cerca del grupo de genes ciliares. Lo contrario es cierto para la regulación positiva de la expresión del gen R2R1: muestras con la expresión de R2R1 regulada de forma positiva ("muestras FHR2R1") se localizan a una mayor distancia del grupo de genes ciliares en el eje XY. Por ejemplo, las muestras de Br370 con EPOC FHR2R1 (semana 1 de EA) se localizan en el extremo opuesto del grupo de genes ciliares. El efecto de la inactivación de R2R1 sobre la ciliogénesis en las PBEC Br370 con EPOC no es evidente en los gráficos de SPM de las Figuras 15, 16 y 17. Sin embargo, un análisis más detallado revela que la inactivación de la expresión del gen de R2R1 en PBEC Br370 conduce a una posición más cercana al grupo de genes ciliares en el eje XY (Figura 18). Este análisis no supervisado apunta a un "resurgimiento de la ciliogénesis" en las PBEC con EPOC.

Por último, el análisis gen por gen (LIMMA) confirma el efecto de la inactivación de R2R1 en la ciliogénesis en las PBEC Br370 con EPOC. Los gráficos de la intensidad log₂ de la expresión del gen ROPN1L ilustrativo (Figuras 19, 20 y 21) ilustran el "resurgimiento de la ciliogénesis" en las PBEC Br370 con EPOC.

2:6: Los cambios transcriptómicos deberían reflejarse en el fenotipo celular. El transcriptoma de ciliogénesis debería dar lugar a un aumento del número de células ciliadas en todos los cultivos de PBEC derivadas de EPOC.

Para revertir el fenotipo de EPOC, es necesario que haya más células ciliadas. Por consiguiente, hay que demostrar que la regulación positiva de la expresión génica ciliar va acompañada de un aumento en el número de células ciliadas.

Las PBEC (cultivadas simultáneamente en los experimentos descritos anteriormente) se tiñen inmunohistoquímicamente:

- DAPI: tinción de núcleos

- Tinción de células productoras de moco: anticuerpo anti-MUC5AC (45M1) Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de pollo (H+L), Alexa Flúor® 488 conjugado

- Tinción de células ciliadas: anticuerpo monoclonal anti-tubulina acetilada (clon 6-11B-1) Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, Alexa Flúor® 594 conjugado

Las células teñidas se cuentan en 10 campos (aumento de 20x). Los diagramas de puntos de dispersión (línea en la media con SD) ilustran que la regulación a la baja de la expresión de R2R1 (ARNhc_R2R1) conduce a un aumento en el número de PBEC ciliadas sin EPOC (Br331) y con EPOC (Br370) (véase la Figura 22). Lo contrario también es cierto: la regulación positiva de la expresión de R2R1 conduce a la desaparición de la población de células ciliadas (véase la Figura 23). La condición de control negativo para la inactivación mediada por ARNhc_R2R1 es la expresión del control negativo ARNhc_CN. La condición de control negativo para la expresión de FHR2R1 es la expresión del constructo de solo etiqueta FH.

Los cambios en la expresión de R2R1 no conducen a cambios en la cantidad de células productoras de moco (véanse las Figuras 24 y 25). Esto es de suma importancia ya que un aumento en el número de células productoras de moco empeoraría los síntomas de la enfermedad. De hecho, las PBEC Br331 sin EPOC y Br370 con EPOC producen la misma cantidad de células productoras de moco en la semana 3 de EA (cualquiera que sea la condición). Esto subraya nuevamente el hecho de que la ciliogénesis defectuosa es el principal impulsor del fenotipo de EPOC.

Para fines ilustrativos, Se incluyen las figuras 26, 27, 28 y 29. La fila superior de cada figura muestra la triple tinción (azul: núcleos, verde: células productoras de moco, rojo: células ciliadas) de PBEC. La fila inferior solo muestra las células ciliadas (rojas) del mismo campo de la fila superior.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto para su uso en el tratamiento o la prevención de una ciliopatía, en donde el compuesto se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(i) un compuesto que expresa o codifica una proteína o un péptido y que se une, se asocia o interacciona con PRC1 y/o TrxG-MLL, en donde el compuesto interfiere con, previene o inhibe la unión entre R2R1 nativo o de tipo salvaje y PRC1 y/o TrxG-MLL, comprendiendo el compuesto una secuencia correspondiente a los SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, una secuencia idéntica en al menos un 70 % a la misma o un fragmento de unión a PRC1 y/o TrxG-MLL de la misma;

(ii) una proteína o un péptido que se unen, se asocian o interaccionan con PRC1 y/o TrxG-MLL, en donde el compuesto interfiere con, previene o inhibe la unión entre R2R1 nativo o de tipo salvaje y PRC1 y/o TrxG-MLL, la proteína o el péptido que comprenden una secuencia correspondiente a los SEQ ID NO: 5 o 6, una secuencia idéntica en al menos un 95 % a la misma o un fragmento de unión a PRC1 y/o TrxG-MLL de la misma;

(iii) un oligonucleótido antisentido que reduce, inhibe y/o elimina la expresión, la función y/o la actividad del gen R2R1; y

(iv) un anticuerpo o un antígeno o un fragmento de unión a diana del mismo capaz de unirse a una proteína o un péptido R2R1, o a un sitio de unión de R2R1 dentro de los complejos PRC1 y/o TrxG-MLL.

2. El compuesto para el uso de la reivindicación 1, en donde el compuesto modula o imita la expresión, la función y/o la actividad del gen denominado gen regenerativo para células respiratorias 1 (R2R1).

3. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto se une o se asocia a sitios de unión a R2R1 dentro de los complejos PRC1 y/o TrxG-MLL.

4. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto interfiere con, previene o inhibe la unión entre R2R1 nativo o de tipo salvaje y un componente o una subunidad de PRC1 y/o TrxG-MLL.

5. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto se une o se asocia a la subunidad de la proteína Ring Finger 2 (RNF2) de PRC1.

6. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el compuesto se une o se asocia a las proteínas de las subunidades DPY-30 y/o ASH₂L de TrxG-MII.

7. El compuesto para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la ciliopatía se selecciona de entre discinesia ciliar primaria, hidrocefalia, enfermedad poliquística de hígado y de riñón, degeneración de retina, nefronoptisis, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Alstrom y síndrome de Meckel-Gruber.