CN105142659A

CN105142659A - Csf1治疗剂

Info

Publication number: CN105142659A
Application number: CN201480017323.XA
Authority: CN
Inventors: 斯图尔特·福布斯; 戴维·休姆; 本·斯图奇菲尔德; 黛博拉·高; 格雷姆·班布里奇; 希欧多尔·奥利芬特; 托马斯·L·威尔逊
Original assignee: University of Edinburgh
Current assignee: University of Edinburgh
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2015-12-09
Also published as: US20180112193A1; MX2015011199A; WO2014132072A1; BR112015020235A2; EA201591501A1; US20160040142A1; CA2901368A1; KR20150121715A; AU2014222509A1; EP2961421A1; JP2016510977A

Abstract

本发明提供包含CSF-1融合蛋白的物质组合物以及在增强受损肝脏再生或恢复其功能中使用该物质组合物的方法。这些物质组合物有用于治疗肝病，例如用于预防和/或治疗肝脏疾病以及改善在肝脏手术之后的结果。

Description

CSF1治疗剂

技术领域

本发明涉及物质组合物以及在增强受损肝脏再生或恢复其功能中使用该物质组合物的方法。该物质组合物适用于治疗肝病，例如用于预防和/或治疗急性或慢性肝脏疾病或用作支持疗法以改善在肝脏切除或肝脏移植之后的结果。

背景技术

肝脏疾病是世界范围内致病率和死亡率的主要原因，但尽管如此，目前不存在增强患病或受损肝脏的再生的有效疗法。增强肝脏再生的疗法可以在一系列医学和手术情形内应用于包括急性、慢加急或慢性肝脏衰竭的适应症中。在医学环境中，急性肝脏衰竭可能起因于一系列病因，但最常归因于感染(病毒性肝炎)、酒精摄取或毒素用药过量(如用药过量)。在急性肝脏衰竭中，可能发生分布广泛的肝脏组织坏死，这可以快速导致死亡。急性肝脏衰竭可能起因于慢性肝脏疾病背景(慢加急)，其中预先存在的肝脏疾病(归因于病毒性肝炎、酒精、非酒精性脂肪肝病以及其他原因)进一步削弱肝脏的再生能力。慢性肝脏衰竭可能起因于肝脏功能的逐步恶化(原因如上)直到肝脏不能维持内稳态为止。在威胁生命的肝脏衰竭中，唯一的选择是肝脏移植，然而在潜在供体与接受者之间的差额意味着许多患者将在等待肝脏移植的过程中死亡。

肝脏再生是涉及许多生长因子、细胞因子以及细胞类型的复杂过程。肝脏巨噬细胞起到一系列至关重要的内稳态作用，并且对有效肝脏再生是关键的。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)也称为集落刺激因子1(CSF1)可互换使用，其表达于肝脏中并且是负责产生和维持单核细胞/巨噬细胞谱系细胞(包括肝脏巨噬细胞)的主要因子。巨噬细胞的耗尽和CSF1的缺乏在部分肝切除之后导致肝脏再生被削弱。从现有技术中已知，在M-CSF缺失小鼠模型中，在部分肝切除之后，M-CSF诱生的库普弗细胞(Kupffercell)在肝脏再生中起关键作用(雨宫(Amemiya)等人，《外科研究杂志》(J.Surg.Res.)165，59-67，2011)。然而，CSF1补充以增强肝脏再生的潜能迄今未得到考虑。

增强肝脏再生和/或恢复其功能的疗法可以在一系列医学和手术情形内应用于包括急性、慢加急或慢性肝脏衰竭的适应症中，并且将立即向患者、临床医师以及类似的健康服务提供益处。

增强肝脏再生的疗法可以按急救疗法的形式应用以在移植之后或在压倒性衰竭情形下促进再生、或用于预防慢性肝脏疾病中的衰退，该疗法将立即向患者、临床医师以及类似的健康服务提供益处。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供一种CSF1蛋白生物活性片段或其同系物或变体或衍生物，用于增强肝脏再生和/或恢复肝脏功能和/或调节肝脏内稳态。

也包括编码该CSF1蛋白生物活性片段或其同系物或变体或衍生物的核酸。

诸位发明人已经出乎意料地发现，向具有正常CSF-1水平的受试者给予另外或额外或补充的CSF-1增加健康动物中肝脏的大小并且提升在由不同原因造成的功能损失之后修复肝脏的能力。意外的发现是，向个体中已经起作用的CSF-1补充CSF-1将改善肝再生或功能。肝脏处于极严格的内稳态下，并且迄今为止尚未认识到可以在临床环境中成功地调节肝内稳态并且将肝脏大小增加到高于相对于总体重的正常值的药剂。然而，本发明提供在哺乳动物物种中使用CSF-1作为适当的肝营养和内稳态剂的证据。此外，本发明是基于CSF-1可以恢复肝脏吞噬能力的观察结果，并且因此使用CSF-1蛋白来恢复肝脏功能的这个方面在本发明中尤其受关注。

根据本发明的另一个方面，提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含：

(i)CSF-1生物活性片段或其同系物或变体或衍生物；和

(ii)生物活性抗体片段。

优选地，出于人类疗法的目的，CSF-1的生物活性片段是人类CSF-1的残基33-182(SEQIDNO:5)或其生物活性部分、或来自任何哺乳动物物种的CSF-1生物学等效片段。

CSF-1的生物活性片段可以是天然的，或它可以是重组的。

优选地，抗体是选自下组的免疫球蛋白，该组包括IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，更优选地，该抗体是IgG。

优选地，抗体片段选自下组，该组包括F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、Fc以及rlgG，并且更优选地，该抗体片段是FC片段。

优选地，融合蛋白的CSF-1生物活性片段或其同系物或变体或衍生物与生物活性抗体片段直接或经由连接子部分共价连接。

根据本发明的另一个方面，提供一种编码该融合蛋白的核酸。

根据本发明的又另一个方面，提供一种包含本发明的经分离核酸的载体。

根据本发明的又另一个方面，提供一种包含本发明载体的宿主细胞。

根据本发明的又另一个方面，提供一种制造本发明第一方面的融合蛋白的方法，该方法包括：

(i)培养本发明的宿主细胞；并且

(ii)从所述培养物中收集该融合蛋白。

根据本发明的又另一个方面，提供一种组合物，该组合物包含：

(a)至少一种融合蛋白，该融合蛋白包含(i)CSF-1生物活性片段或其同系物或变体或衍生物；和(ii)生物活性抗体片段；和

(b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

在替代性实施例中，该组合物可以包含本发明的核酸或载体。

根据本发明的另一方面，提供一种融合蛋白的用途，该融合蛋白包含：

(i)CSF-1生物活性片段或其同系物或变体或衍生物；和

(ii)生物活性抗体片段

用于增强肝脏再生和/或恢复肝脏功能和/或调节肝脏内稳态。

在手术环境中，手术去除肝脏中含有肝癌的区域是治愈性管理的主体。这可能产生手术后肝脏衰竭的风险，尤其在患者具有慢性肝脏疾病背景的情况下。在肝脏移植的情形下，如果所移植的器官不足以满足接受者的需求，那么肝脏衰竭可能继续。用增强再生的疗法来治疗可以在手术之前、期间或之后来进行应用。

根据本发明的另一个方面，提供本发明的融合蛋白或核酸或载体的用途，用于制造用于增强肝脏再生和/或恢复肝脏功能和/或调节肝脏内稳态的药剂。

根据本发明的又另一个方面，提供一种治疗患有肝癌并且将进行手术的个体的方法，该方法包括在手术程序之前、期间或之后给予本发明的融合蛋白或核酸或载体。

根据本发明的又另一个方面，提供一种治疗正进行肝脏移植手术的个体的方法，该方法包括在手术程序之前、期间或之后给予本发明的融合蛋白或核酸或载体。

根据本发明的又另一个方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包括一个或多个具有药物剂量单元的容器，这些药物剂量单元包含有效量的本发明的融合蛋白或核酸或载体，其中该容器包装有任选的用于使用它的说明书。

本发明的不同方面提供在人类和其他哺乳动物物种中增强受损肝脏再生或恢复其功能的组合物和方法

归于本发明任何方面的特征在加以必要修正的情况下可适用于本发明的所有其他方面。

附图说明

借助于非限制性实例、参考附图进一步在下文中描述本发明的实施例，在这些附图中：

图1显示三个损伤模型中的卡普兰-梅尔存活率(KapleinMeirofsurvival)，并且图表显示在干预和处理之后的重量变化百分比。***p<0.001曼-惠特尼U(MannWhitneyU)。[实线＝使用fc-CSF1处理；虚线＝PBS对照]

图2是展示肝脏重量/体重比率(表示为百分比)和肝细胞增殖(表示为每个高倍视野中的Ki67阳性肝细胞)的条形图。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001曼-惠特尼U。[处理＝fc-CSF1；对照＝PBS]

图3显示如上文所描述给予的CSF-1对体重的作用。图3A比较CSF-1(1mg/kg)与Fc-CSF-1(1mg/kg)。未经修饰的蛋白质在这个剂量下没有作用，而Fc-CSF-1明显增加总体重。图3B显示剂量响应曲线，表明在0.1mg/kgFc-CSF-1下的可检测活性。图3C显示，在更大实验系列中证实1mg/kg剂量的作用。在后续幻灯片中进一步分析这个系列中的动物。

图4A显示CSF-1(1mg/kg)和Fc-CSF-1(1mg/kg)对小鼠脾脏重量的作用，图4B显示CSF-1(1mg/kg)和Fc-CSF-1(1mg/kg)对小鼠肝脏重量的作用。

图5显示Fc-CSF-1对脾脏中巨噬细胞数目(使用csf1r-EGFP报告基因来检测)的作用，图5A是对照并且图5B显示经处理的样本。

图6A显示对图5A和5B的剂量响应曲线，图6A显示基于巨噬细胞特异性F4/80抗原的免疫组织化学定位的剂量响应曲线。

图7显示对小鼠中巨噬细胞特异性F4/80抗原的免疫染色。图7A显示经PBS处理的对照肝脏；图7B显示用Fc-CSF-1处理的小鼠的肝脏，图7C显示经PBS处理的对照脾脏，图7D显示用Fc-CSF-1处理的小鼠的脾脏。

图8A显示具有针对增殖细胞核抗原(PCNA)免疫染色的经PBS处理的对照小鼠肝脏，图8B显示在用Fc-CSF-1处理之后的小鼠肝脏。

图9显示向断奶仔猪给予的CSF-1的药物动力学影响。图9A显示未经修饰的CSF-1的清除率，图9B和9C显示在分别静脉内和皮下给予时1.2mg/kg的Fc-CSF-1的清除率。

图10显示在给予0.5mg/Kg×6的断奶仔猪中的血液作用；图10A显示总白细胞计数，图10B显示单核细胞计数，图10C显示淋巴细胞计数，并且图10D显示中性粒细胞计数。

图11显示在给予0.5mg/Kg×6的断奶仔猪中血液作用的剂量响应曲线；图11A显示总白细胞计数，图11B显示单核细胞计数，图11C显示淋巴细胞计数，并且图11D显示中性粒细胞计数。

图12显示对给予0.12mg/Kg×3的断奶仔猪中的器官重量的作用。图12A显示对肝脏重量的作用，图12B显示对脾脏重量的作用，图11C显示对肺重量的作用，并且图11D显示对肾脏重量的作用。

图13A显示在患有扑热息痛诱发的肝脏衰竭的存活或死亡/进行肝脏移植的患者中，在入院时的患者血清CSF1水平。图13B显示随后死亡或存活的患者子集的血清水平。图13C显示接受者操作特征曲线分析，该分析评估入院时CSF1充当在扑热息痛用药过量之后不进行移植的情况下的存活率的生物标记的潜能。

图14A显示在扑热息痛中毒之后的肝CSF1基因表达和血清CSF1水平。图14B显示通过Ki67免疫组织化学在扑热息痛中毒之后第3天评估的肝脏与体重比率和肝细胞增殖。图14C显示在扑热息痛中毒后第3天时比较对照和CSF1受体抑制的血清分析。

图15A显示在扑热息痛中毒之后比较CSF1-Fc(实线)或对照(点线)给药的小鼠中平均肝脏重量与体重比率和肝细胞增殖(ki67免疫组织化学)。图15B显示扑热息痛中毒后的血清参数。(n＝8个/组)。

图16A显示在2/3部分肝切除之后的肝CSF1基因表达和血清CSF1水平。图16B显示通过Ki67免疫组织化学在2/3部分肝切除之后第2天评估的使用CSF1受体抑制(GW2580)或对照的肝脏与体重比率和肝细胞增殖。图16C显示在扑热息痛中毒后第2天比较对照和使用GW2580的CSF1受体抑制的血清分析。(n＝每组8个)。

图17A显示在2/3部分肝切除之后比较CSF1-Fc(实线)或对照(点线)给药的小鼠中平均肝脏重量与体重比率和肝细胞增殖(ki67免疫组织化学)。图17B显示扑热息痛中毒后的血清参数。(n＝8个/组)。图17C显示再生前细胞因子Il6和抑瘤素M(OSM)以及生长因子活化子尿激酶受体(UR)在阻断CSF1受体(GW2580)和给予CSF1-Fc的情况下对比对照的相对基因表达。

图18A显示卡普兰-梅尔曲线图(KaplanMeirplot)，该曲线图显示在慢性受损肝脏中部分肝切除之后使用CSF1-Fc治疗的手术后地存活率(p＝0.07)和增加体重的倾向(实线＝CSF1-Fc，点线＝对照；n＝8个/组，在第4天和第7天)。图18B显示平均肝脏重量与体重比率、肝细胞增殖(ki67免疫组织化学)以及经由天狼星红量化(Siriusredquantification)的纤维化量化。图18C显示血清参数。

图19显示A)相对于对照组(MARCO：具有胶原结构的巨噬细胞受体；MSR1：巨噬细胞清除剂受体1)平均值的基因表达(白色＝对照；阴影＝CSF1-Fc)；B)显示在血管内注射之后从1-15分钟时覆盖在选通的荧光珠粒上的流动曲线图的珠粒清除率分析(点线＝对照；实线＝CSF1-Fc；灰色线＝未受损伤、未经处理的小鼠)；C)在血管内注射荧光珠粒之后15分钟时的离体荧光器官。(n＝每组6个)

图20显示A)相对于对照组(MARCO：具有胶原结构的巨噬细胞受体；MSR1：巨噬细胞清除剂受体1)平均值的基因表达[白色＝对照；阴影＝CSF1-Fc]；B)珠粒清除率分析；C)在血管内注射荧光珠粒之后15分钟时的离体荧光器官。

图21显示A)在手术前以及手术后第1天和手术后第3天取得的55名进行部分肝切除的患者的血清CSF1水平。B)根据肝脏切除程度来分离的同期组群。具有事后分析的双因素方差分析(twowayANOVA)显示，与具有小于3个切除区段的患者相比较，具有超过5个切除区段的患者的CSF1水平明显增加。C)以点显示的出现手术后肝脏衰竭的患者与同期组群中的其余患者(中值和范围)相比较。

具体实施方式

术语“M-CSF”、“巨噬细胞集落刺激因子”、“CSF-1”、“CSF1”、“集落刺激因子1”以及“集落刺激因子-1”在此可互换地使用。

术语“补充(supplementation)”、“补充剂(supplement)”或“补充(supplementing)”是希望以超过个体已经具有的起作用的CSF-1水平的另外或额外量向个体给予CSF-1。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatmentof)”是希望与将在不存在治疗的情况下发生的情况相比，降低病症的严重性或减少病症的症状、或部分或完全地消除病症。治疗不需要实现病症的完成治愈。

术语“恢复(restore)”、“恢复(restoring)”或“恢复(restorationof)”是希望与将在不存在治疗的情况下发生的情况相比，降低病症的严重性或减少病症的症状、或部分或完全地消除病症。治疗不需要实现病症的完成治愈。

“治疗学上有效”或“有效”量希望指代如经由临床测试和评估、患者观察等等所提到，使疾病或病症的症状缓解的剂量。“有效量”或“有效”可以进一步指代造成生物学或化学活性的可检测变化的剂量。可检测变化可以由本领域的普通技术人员针对相关机制或过程来检测和/或进一步量化。此外，“有效量”或“有效”可以指代保持所需生理学状态，即，减少或预防明显衰退和/或促进所关注病状的改善的量。如在本领域中一般理解的，剂量将取决于给药途径、患者的症状和体重、并且也取决于所给予的化合物而变化。

可以在本发明中治疗的病状包括由于物理外伤、药物或毒性化学品不良作用、感染、自身免疫性、局部缺血、酒精诱发的肝损害或任何其他肝损害原因所致的肝损害或肝炎。肝损伤通常由物理外伤(如道路交通事故、跌倒、攻击等等)造成。扑热息痛(乙酰胺苯酚)用药过量是药物诱发的肝损害的相对常见原因，但肝损害也可以由许多其他药剂造成，例如甲胺喋呤、他汀类、烟酸、胺碘酮、化学治疗剂以及一些抗生素。酒精诱发的肝脏疾病是分布极广泛的肝损害原因。造成肝损害的感染尤其包括A、B或C型肝炎病毒感染。虽然CSF1治疗可能并非在所有肝损害情况下都将是适当的，但它在许多情况下可以具有有益作用。

术语“Fc”是希望指抗体分子中与细胞(如巨噬细胞和肥大细胞)表面上的抗体受体以及补体蛋白结合的区域。Fc(50,000道尔顿)片段含有CH2和CH3区以及由一个或多个二硫化物和非共价相互作用保持在一起的铰链区的一部分。Fc和Fc5μ片段分别由IgG和IgM的碎片化产生。术语Fc来源于这些抗体片段结晶的能力。Fc片段完全由免疫球蛋白的重链恒定区生成。Fc片段无法结合抗原，但它是造成抗体的效应子功能(如补体固定)的原因。

“多肽”是指经由肽键连接的氨基酸聚合物(二肽或更大)。因此，术语“多肽”包括蛋白质、寡肽、蛋白质片段、蛋白质类似物等等。术语“多肽”涵盖如上文所定义的多肽，这些多肽由核酸编码、重组地产生、从适当来源中分离或经合成。

如在此所用，“功能性”多肽是保持至少一种通常与该多肽相关联的生物活性的多肽。优选地，“功能性”多肽保持未经修饰的肽所具有的所有活性。“保持”生物活性意味着多肽保持天然多肽生物活性的至少约50％、60％、75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多(并且可能甚至具有比天然多肽高的活性水平)。“非功能性”多肽是基本上不展现可检测的通常与该多肽相关联的生物活性的多肽(例如，至多仅不显著的量，例如小于约10％或甚至5％)。

如在此所用的“融合蛋白”是指在对两种(或更多种)不同多肽或其片段进行编码的两个异源核苷酸序列或其片段以正确的翻译读取框融合在一起时产生的蛋白质。该两种或更多种不同多肽或其片段包括在自然界中未被发现融合在一起的那些多肽或其片段和/或包括天然存在的突变体。

如在此所用，“片段”是实质上保持至少一种通常与蛋白质或多肽相关联的生物活性的片段。在具体实施例中，“片段”实质上保持未经修饰的蛋白质所具有的所有活性。“实质上保持”生物活性意味着蛋白质保持天然蛋白质生物活性的至少约50％、60％、75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多(并且可能甚至具有比天然蛋白质高的活性水平)。

“重组多肽”是由重组核酸产生的多肽。

“经分离”多肽意味着与天然存在的生物体或病毒中的至少一些其他组分(例如通常发现与该多肽缔合的细胞或病毒的结构性组分、或其他多肽或核酸)分离或实质上不含这些组分的多肽。如在此所用，“经分离”多肽的纯度是至少约25％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多(w/w)。

术语“衍生物”应理解为是指从CSF-1衍生(实质上衍生)或获得(实质上获得)、但保持CSF-1生物学功能的相似性或实质性相似性的任何分子。在某些方面中，生物学功能是促进肝脏器官发育的能力。衍生物可以例如通过CSF-1裂解产生生物活性片段、环化、生物偶联和/或与一个或多个另外的部分偶合来提供，这些另外的部分改善例如溶解度、稳定性或生物学半衰期或充当后续检测的标签等等。衍生物也可以由翻译后或合成后修饰来产生，该修饰如碳水化合物部分的附接、或产生结构性修饰(多个)的化学反应(多个)(如氨基酸(多个)的烷基化或乙酰化)或涉及化学键形成的其他变化。在适合用于本发明中的衍生物的尤其优选的实施例中，衍生物是CSF-1的成熟结构域。在适合用于在此所披露的方法中的衍生物的另一个优选实施例中，该衍生物是CSF-1的生物活性C端片段(例如包含具有536个氨基酸的蛋白质中的C端氨基酸1到150的CSF-1片段)。CSF-1衍生物的其他实施例包括包含C端和/或N端(例如用乙酸酐对N端的酰化)化学修饰侧链(例如赖氨酰基ε-氨基的聚乙二醇化)或连接到不同载体(例如人类血清白蛋白或组氨酸(His6)标记)上的CSF-1。

如一般在此所用，“同系物”视具体情况与另一个核酸或多肽共有可界定的核苷酸或氨基酸序列关系。“蛋白质同系物”优选地与如在此所描述多肽的氨基酸序列共有至少70％或80％序列一致性、更优选地至少85％、90％并且甚至更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。CSF的同系物也可以根据本发明来加以使用。这类CSF同系物的特征将优选地在于与具有较高或实质性生物活性的CSF蛋白质的生物活性大约相同或更大的生物活性。

如在此所用，“变体”蛋白质是其中一个或多个氨基酸已经由不同氨基酸替代的蛋白质。保持天然或野生型CSF生物活性的CSF蛋白质变体可以根据本发明来加以使用。在本领域中充分理解，一些氨基酸可以在不改变多肽活性的性质的情况下变成具有广泛类似特性的其他氨基酸(保守取代)。一般来说，很可能在多肽的特性中产生最大变化的取代是以下那些取代，其中(a)亲水性残基(例如，Ser或Thr)被取代成疏水性残基((例如Leu、Ile、Phe或Val)或被该疏水性残基取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸被取代成任何其他残基或被该残基取代；(c)具有正电性侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)被取代成负电性残基(例如，Glu或Asp)或被该负电性残基取代或(d)具有巨大侧链(例如，Phe或Trp)的残基被取代成具有较小侧链的残基(例如，Ala、Ser)或无侧链的残基(例如，Gly)或被该残基取代。

本发明的实施例进一步提供一种编码在此所描述的融合蛋白的经分离核酸(例如，“经分离DNA”或“经分离载体基因体”)。核酸与天然存在的生物体或病毒中的至少一些其他组分(如例如通常发现与该核酸缔合的细胞或病毒的结构性组分、或其他多肽或核酸)分离或实质上不含这些组分。构成本发明活性剂的多肽的编码序列经转录，并且任选地经翻译。根据本发明的实施例，编码序列的转录与翻译将导致产生所描述的融合蛋白。

本领域的普通技术人员应了解，归因于遗传密码的简并，在编码本发明融合多肽的核酸中可能存在变化性。核酸序列中的进一步变化可以用过存在(或不存在)非翻译序列(如内含子序列以及5'和3'未翻译序列)来引入。此外，本发明的经分离核酸包涵编码与在此具体披露的多肽序列、或对应于包括在本发明方面中的蛋白质(或其片段)的那些已知序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或更高氨基酸序列相似性的融合蛋白的那些核酸、并且进一步编码如在此所定义的功能性融合蛋白。

本发明的经分离核酸包括RNA、DNA(包括cDNA)以及其嵌合体。经分离核酸可以进一步包括经修饰的核苷酸或核苷酸类似物。

编码本发明多肽的经分离核酸可以与适当的表达控制序列(例如转录/翻译控制信号和聚腺苷酸化信号)相关联。

应了解，取决于所需水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子要素。取决于所需表达模式，启动子可以是构成性或可诱导的(例如，金属硫蛋白启动子或激素可诱导的启动子)。启动子可以是天然(native)或外来的，并且可以是天然(natural)或合成性序列。外来是希望转录起始区未见于该转录起始区引入到其中的野生型宿主中。选择启动子以使得它将在所关注的靶细胞(多个)中起作用。

本发明进一步提供制造在此所描述的融合蛋白的方法。制造融合蛋白的方法在本领域中得到充分理解。这类方法包括使包含有包含编码融合蛋白的核酸的载体的宿主细胞在适合于表达和后续分离该融合蛋白的条件下生长。因此，编码构成本发明融合蛋白的多肽的经分离核酸可以例如出于克隆或其他实验室操作、重组蛋白产生或基因递送的目的而结合到载体中。示例性载体包括细菌性人工染色体、粘粒、酵母人工染色体、噬菌体、质粒、脂质载体以及病毒载体(下文更详细描述)。

在具体实施例中，经分离核酸结合到表达载体中。在本发明的其他实施例中，包括在此所描述的经分离核酸的载体包括于宿主细胞中。与不同宿主细胞相容的表达载体是本领域中众所周知的并且含有适合于核酸转录与翻译的要素。典型地，表达载体含有“表达盒”，该表达盒沿5'到3'方向包括启动子、以可操作方式与该启动子缔合的编码本发明多肽或其活性片段的编码序列、以及任选地，包括用于RNA聚合酶的停止信号和用于聚腺苷酸化酶的聚腺苷酸化信号的终止序列。

除上文所论述的调控控制序列之外，重组表达载体还可以含有另外的核苷酸序列。举例来说，重组表达载体可以编码可选标记基因以识别已经结合有载体和/或可以包含所关注的另一种异源序列的宿主细胞。

可以经由常规转化或转染技术将载体引入到原核或真核细胞中。如在此所用，术语“转化”和“转染”是指多种本领域公认的用于将外来核酸(例如，DNA)引入到宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、电穿孔、微注射、DNA负载的脂质体、脂染胺-DNA复合物、细胞音波处理、使用高速微弹的基因轰击以及病毒介导的转染。就给药而言，在任何给定情况下最合适的途径将取决于所治疗的肝脏病状的性质和严重性、并且取决于所给予的融合蛋白、病毒载体、核酸或药物配制品。

本发明的融合蛋白、病毒载体以及核酸(例如，DNA和/或RNA)可以被配制成用于在根据已知技术的药物载体中给予。参见例如，雷明顿(Remington)，《制药科学与实践》(TheScienceAndPracticeofPharmacy)(第9版1995)。在制造本发明的药物配制品中，融合蛋白、病毒载体或核酸典型地与尤其可接受的载体混合。载体可以是固体或液体或两者，并且任选地被配制成单位剂量配制品，该配制品可以通过任何众所周知的制药技术来制备。

用于这类医药组合物的载体和添加剂可以取决于预见的给药模式而采取多种形式。因此，用于口服给药的组合物可以是例如固体制剂，如片剂、经糖包覆的片剂、硬胶囊、软胶囊、颗粒剂、散剂等等，其中合适的载体和添加剂是淀粉、糖、粘合剂、稀释剂、成粒剂、润滑剂、崩解剂等等。因为其易用性和较高患者顺应性，片剂和胶囊代表用于许多医学病状的最有利口服剂型。

类似地，用于液体制剂的组合物包括溶液、乳液、分散液、悬浮液、糖浆剂、酏剂等等，其中合适的载体和添加剂是水、醇、油、二醇、防腐剂、调味剂、着色剂、悬浮剂等等。

在溶液的情况下，它可以被冻干成粉末、并且然后在即将使用之前复水。对于分散液和悬浮液，适当的载体和添加剂包括水性胶、纤维素、硅酸盐或油。

对于注射，载体典型地是液体，如无菌的无热原质的水、无热原质的磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌性水或聚氧乙烯蓖麻油[R](新泽西州派西派尼的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))，也可以包括非经肠可接受的油(包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油)、以及其他用于辅助溶解度或防腐的添加剂。对于其他给药方法，载体可以是或者固体或者液体。

对于口服给药，可以按固体剂型(如胶囊、片剂以及散剂)或按液体剂型(如酏剂、糖浆剂以及悬浮液)来给予融合蛋白、病毒载体或核酸。融合蛋白、病毒载体或核酸可以与非活性成分和粉末状载体一起被封装在明胶胶囊中，这些非活性成分和粉末状载体如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等等。可以添加以提供所需颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散或其他已知所需特征的另外的非活性成分的实例是红色氧化铁、硅胶、月桂基硫酸钠、二氧化钛、可食用白色墨等等。类似的稀释剂可以用于制造压缩片剂。片剂和胶囊两者都可以被制造成持续释放的产品以提供药物治疗经数小时时间的连续释放。压缩片剂可以经糖包覆或经膜包覆以掩盖任何令人不愉快的味道并且保护片剂不受大气影响、或经肠溶衣包覆以用于在胃肠道中选择性崩解。用于口服给药的液体剂型可以含有着色剂和调味剂以增加患者接受性。

适合于肠胃外给药的本发明配制品可以包括融合蛋白、病毒载体或核酸的无菌水性和非水性注射溶液，这些制剂一般与预定接受者的血液等张。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及溶质，它们使得配制品与预定接受者的血液等张。水性和非水性无菌悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。配制品可以呈现在单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可以存储于冷冻干燥(冻干)条件下，并且仅需要在即将使用之前添加无菌液体载体(例如生理盐水或注射用水)。

即用型注射溶液和悬浮液可以由无菌散剂、颗粒剂以及片剂来制备。举例来说，在本发明的一个方面中，提供一种可注射的稳定的无菌组合物，该组合物以单位剂型在密封容器中包含本发明的融合蛋白、病毒载体或核酸。任选地，以冻干物的形式提供组合物，该冻干物能够使用合适的药学上可接受的载体来复水以形成适合于将它注射到受试者中的液体组合物。

在本发明的具体实施例中，给药是通过皮下或皮内给药。皮下和皮内给药可以通过本领域中已知的任何方法，包括但不限于注射、基因枪、粉末喷射装置、生物喷射装置、微增强剂阵列、微米针以及划痕法(即，擦伤表面并且然后涂覆包含融合蛋白、病毒载体或核酸的溶液)。

在其他实施例中，肌肉内给予融合蛋白、病毒载体或核酸，例如通过肌肉内注射或通过局部给药。

核酸(例如，DNA和/或RNA)也可以与脂质体(如卵磷脂脂质体或本领域中已知的其他脂质体(例如WO93/24640中所描述))缔合而递送，并且可以进一步与佐剂缔合。包含阳离子性脂质的脂质体自发并快速地与聚阴离子(如DNA和RNA)相互作用，从而产生捕获最多100％的多核苷酸的脂质体/核酸复合物。另外，聚阳离子复合物与细胞膜融合，从而产生绕过溶酶体隔室中降解酶的多核苷酸胞内递送。PCT公开WO94/27435描述用于遗传免疫的组合物，该组合物包含阳离子性脂质和多核苷酸。可以包括辅助核酸的细胞吸收的药剂，如钙离子、病毒蛋白质以及其他转染促进剂。

根据本发明，本发明的方法包括向受试者给予有效量的如上文所描述的本发明组合物。组合物的有效量(其使用处于本发明的范围内)将在某种程度上随受试者而变化、并且将取决于如受试者年龄和条件以及递送途径的因素。这类剂量可以根据本领域的普通技术人员已知的常规药理学程序来确定。举例来说，本发明的活性剂可以用按组合物重量计介于下限约0.01％、0.05％、0.10％、0.50％、1.0％、5.0％或10％到上限范围约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％范围内的量向受试者给予。在一些实施例中，活性剂占按组合物重量计的约0.05％到约95％。在其他实施例中，活性剂占按组合物重量计的约0.05％到约60％。在再其他实施例中，活性剂占按组合物重量计的约0.05％到约10％。

猪Fc融合物的克隆和表达

将对应于猪CSF-1活性片段的序列

(SENCSHMIGDGHLKVLQQLIDSQMETSCQIAFEFVDQEQLTDPVCYLKKAFLQVQDILDETMRFRDNTPNANVIVQLQELSLRLNSCFTKDYEEQDKACVRTFYETPLQLLEKIKNVFNETKNLLKKDWNIFSKNCNNSFAKCSSQHERQPEGR)(SEQIDNO:1)连接到猪IgG1a序列的铰链-CH3区

(GTKTKPPCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCVWDVSKEHAEVQFSWYVDGVEVHTAETRPKEEQFNSTYRWSVLPIQHQDWLKGKEFKCKVNNVDLPAPITRTISKAIGQSREPQVYTLPPPAEELSRSKVTVTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQQDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGETFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGK)(SEQIDNO:2)上。这整个区域由GeneArt(美国加利福尼亚州的英杰公司(Invitrogen,CA,USA))针对哺乳动物表达进行密码子优化、并且使用分别被工程化到5'和3'端中的HindIII和NotI限制位点来克隆到表达质粒pS00524中。对所得质粒进行测序以确保由经转染HEK293F或CHO细胞来表达ORF完整性和蛋白质。

猪CSF-1:Fc融合物的分离

使用蛋白A亲和色谱法来分离猪CSF-1Fc融合蛋白。简言之，使来自细胞培养物的条件培养基澄清，并且将它负载到使用PBS平衡的蛋白A琼脂糖上。在负载之后，用2BV的PBS和2BV的35mM乙酸钠(pH5.5)来洗涤柱。使用80％B缓冲液(35mM乙酸，无pH调节)、85％B缓冲液以及100％B缓冲液的阶段梯度来洗脱蛋白质。基于缺少聚集蛋白质(分析型SEC)而将80％和85％B洗脱份合并，而100％B洗脱份不包括在内。将合并的的pH调节到7.2、并且针对PBS进行透析。

通过ELISA的血浆中猪CSF-1Fc融合物定量

使用内部开发的常规夹层ELISA利用可商购的抗体来检测猪CSF-1Fc融合物血浆水平。捕获抗体是艾碧康(Abcam)ab9693(0.3μg/mL)，并且检测抗体是兔抗猪IgG(Fc)生物素化的α诊断(AlphaDiagnostic)90440(1:5000稀释液)。内部生成和纯化标准蛋白质(批次2/24/11JAS)。将标准品以及样本添加到每一个培养板中，从而产生2700ng/mL到0.046pg/mL的11点标准范围。这允许在每一个分析培养板上相对于标准曲线对每一个样本进行定量。使用皮尔斯(Pierce)高敏感性抗生蛋白链菌素-HRP(1:10,000稀释液)和TMB微孔过氧化酶底物系统溶液(KPL)。

猪PK

断奶龄的阉猪(<14kg)分成如下接受单个静脉内(IV)或皮下(SC)剂量的三个处理组。三只猪接受皮下投药的0.5mg/kgCSF-1非融合物。两只猪接受静脉内投药的1.2mg/kgCSF-1:Fc融合物。两只猪接受皮下投药的1.2mg/kgCSF-1:Fc。经由颈内静脉在EDTA抗凝血剂管中获得1ml血浆样本并且放置在冰上直到离心为止。将血浆转移到存储在≤-10℃下的无菌管中直到分析为止。在投药前以及投药后5分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、48小时和72小时从每一只动物获得一系列血浆样本使用ELISA分析在血浆中对CSF-1和CSF-1:Fc融合蛋白水平进行定量。

MTT细胞活力分析

在MTT分析之前将表达猪CSF-1R的稳定Ba/F3细胞保持在具有补充有或者10⁴单位/毫升rh-CSF-1或者10％IL-3条件培养基的完全RPMI的培养物中。一式三份或一式四份地在96孔培养板中接种2×10⁴个细胞/孔(Ba/F3细胞和Ba/F3转染物)或5×10⁴个细胞/孔(猪BMM)，并且添加适当的处理(rh-CSF-1或猪FcCSF-1的连续稀释液)以得到每孔100μl的总量。将细胞在37℃以及5％CO₂下孵育48小时。对于Ba/F3细胞，向每一个孔中直接添加10μl的MTT(西格玛-阿尔德里奇(SigmaAldrich)M5655)储备溶液(5mg/ml)以实现0.5mg/ml的最终浓度，并且在37℃下孵育3小时，之后进行增溶作用隔夜。对于粘附性小鼠BMM细胞，用50μl的1mg/mlMTT溶液替代培养基并且在37℃下孵育1小时。去除MTT溶液和用100μl增溶剂(0.1MHCL、10％Tritonx-100以及异丙醇)增溶的四唑盐，接着在37℃与5％CO2下孵育10分钟。在570nm下使用405nm的参考波长来读取培养板。

小鼠研究

10-12周龄的48只雄性C57BI6小鼠进行或者2/3部分肝切除或者扑热息痛中毒或者慢性肝损伤加2/3部分肝切除。2/3通过结扎左叶以及左中和右中叶来进行部分肝切除。通过腹膜内给予扑热息痛溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的350mg/kg溶液来进行扑热息痛中毒。通过八周中每周两次腹膜内给予四氯化碳溶解于橄榄油中的1mcl/g溶液、接着如上文所描述2/3部分肝切除来进行慢性肝损伤加2/3部分肝切除。处理组(n＝每种损伤模型8只)在或者部分肝切除或者扑热息痛中毒之后立即接受皮下给予0.75mcg/gFC-CSF1并且随后给予三个另外的剂量，每24小时一次。对照小鼠(n＝每种损伤模型8只)皮下接受适当体积的PBS。在损伤(部分肝切除或扑热息痛中毒)之后第4天对所有小鼠进行采集。

在中线剖腹手术之后，切下肝脏并且称量。计算肝脏重量与体重比率并且表示为百分比。将肝脏固定在4％福马林中持续隔夜、然后转移到70％乙醇中。然后将肝脏包埋在石蜡块中，并且切割出4μm切片。在于Tris/EDTA溶液中在pH9下进行热介导的抗原修复之后，进行Ki67(在整个细胞周期中表达的细胞增殖标记)的免疫组织化学。通过对在每只动物20个高倍视野(400×)中的ki67阳性肝细胞进行计数并计算平均值来量化肝细胞增殖。

实例1

研究Fc-CSF1对急性肝损伤(部分肝切除；扑热息痛中毒)和慢加急肝损伤(慢性肝损伤加部分肝切除)的鼠类模型中肝脏再生的作用。处理组(n＝每种损伤模型8只)在或者部分肝切除或者扑热息痛中毒之后立即接受皮下给予0.5mcg/gFC-CSF1并且随后给予三个另外的剂量，每24小时一次。对照小鼠(n＝每种损伤模型8只)皮下接受适当体积的PBS。干预和处理得到良好耐受。在最严重的损伤模型(慢性肝损伤与2/3部分肝切除)中，存在小鼠重量的明显增加(在第4天p<0.001)和提升存活率的倾向(p＝0.08)(图1)。其他发现包括跨损伤模型的肝脏重量与肝细胞增殖两者的增强的再生参数(图2)。这些研究的结果表明，给予Fc-CSF1可以跨一系列肝损伤模型增强再生响应。在最严重的肝损伤模型(慢性肝损伤加部分肝切除)中，存在提升存活率的倾向和明显的体重增加，指示改善的手术后疗程。发现Fc-CSF1在所有损伤模型中具有对肝重量和肝细胞增殖的生长促进作用。虽然在引起有效肝脏再生的许多途径中存在冗余，但似乎CSF1对于实现最佳恢复是关键的，并且本发明的研究已经显示补充这种因子可以进一步促进再生。据设想，这些发现将在临床环境中的肝脏衰竭管理中转变为改善的结果。

实例2

在4天中的每一天都对小鼠皮下注射Fc-CSF-1，并且在第5天杀死小鼠。小鼠是C57BI/6背景的csf1r-EGFP(麦克格林(MacGreen))小鼠。如(阿里汗(Alikhan)等人《美国病理学杂志》(AmJ.Pathol.)179，1243-1256，2011和麦克唐纳(Macdonald)等人《血液》(Blood)116，3955-3963，2010)中所描述进行组织处理和免疫组织化学。使用在高(Gow)等人《细胞因子》(Cytokine)60，793-805，2012)中所描述的分析来进行的重组猪CSF-1或Fc-CSF-1对小鼠骨髓细胞或Ba/F3CS1R报告基因细胞系增殖的作用的比较显示，生物活性不存在差异(数据未显示)，表明将Fc组分添加到CSF-1的C端上不干扰与受体的结合。

实例3

评估所给予的CFS-1对体重的作用。图3A比较CSF-1(1mg/kg)与Fc-CSF-1(1mg/kg)。未经修饰的蛋白质在这个剂量下没有作用，而Fc-CSF-1明显增加总体重。图3B显示剂量响应曲线，表明在0.1mg/kgFc-CSF-1下的可检测活性。图3C显示，在更大实验系列中证实1mg/kg剂量的作用。在后续研究中进一步分析这个系列中的动物。器官重量研究显示，1mg/kg下的Fc-CSF-1处理使脾脏重量几乎加倍并且明显增加总肝脏重量；而在整个组或雄性或雌性的分组中都没有观察到Fc-CSF-1对肺或肾脏重量的作用。

评估向小鼠给予的Fc-CSF-1对血液的作用。结果显示，Fc-CSF-1使白血球计数和总血液单核细胞计数升高。注意到在雄性和雌性小鼠之间存在一些变化，前者(雄性)的平均计数比后者(雌性)高，但在两个性别中都见到作用。也观察到，Fc-CSF-1增加分段的中性粒细胞计数。再次，雄性可以与雌性区别。相反，Fc-CSF-1对总淋巴细胞无作用。

也评估向小鼠给予的Fc-CSF-1对脾脏中巨噬细胞数目(用csf1r-EGFP报告基因来检测)的作用。注意到在经处理的图5B中极大地增加的荧光。在图6A中在剂量响应曲线中对这种情况进行定量。在图6B中，基于巨噬细胞特异性F4/80抗原的免疫组织化学定位表明相同结果。

评估向小鼠给予的Fc-CSF-1对骨中的骨再吸收破骨细胞的作用。结果显示在处理组中，在生长培养板、再吸收区和轴中的破骨细胞增加(数据未显示)

实例4

图7B显示对在用Fc-CSF-1处理的小鼠的肝脏中的巨噬细胞特异性F4/80抗原的免疫染色，表明巨噬细胞数目相对于对照图7A有较大增加。图7D显示对在用Fc-CSF-1处理的小鼠的脾脏中的巨噬细胞特异性F4/80抗原的免疫染色，表明巨噬细胞数目以及F4/80强度相对于对照图7C有较大增加。图8B显示对增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫染色。在对照小鼠肝脏图8A中没有观察到染色。图8B显示Fc-CSF-1造成大量细胞增殖。基于大小和核形态，增殖细胞被识别为肝细胞。除组织化学染色之外，已经在昂飞(Affymetrix)微阵列上使用基因表达谱分析来检查对照和经Fc-CSF-1处理小鼠的肝脏。数据证实，在已知巨噬细胞特异性基因(csf1r、emr1(F4/80)的丰度中存在4-8倍增加，并且在细胞周期相关基因的检测中存在甚至更大的增加。重要的是，不存在诱生经典炎性基因(如TNF-a、IL-6或IL-1)的证据。

实例5

图9表明向断奶仔猪给予的CSF-1的药物动力学影响。图9A显示未经修饰的CSF-1的清除率。注意到所获得的峰值血浆水平是仅约100ng/ml，并且它在20小时内得到完全清除。相比之下，Fc-CSF-1(图9B和C)达到100倍高的血浆浓度并且保持升高持续多达72小时。对断奶仔猪的初步实验确定，每隔一天使用0.4mg/kg的Fc-CSF-1进行处理持续三次产生循环单核细胞数目的2-3倍增加。

在新生猪中进行其他测试以评估Fc-CSF-1功效/安全性处理试验。在所测试的两个剂量(0.12mg/Kg×3和0.5mg/Kg×6)下，Fc-CSF-1处理在任何时间点时对体重增加几乎不具有作用。在较高剂量下观察到重量增加的边际减少(数据未显示)。图10A-D以及11A-D表明处理的功效。注意到在对照动物中，总血细胞计数、单核细胞计数以及粒细胞计数在猪生命前两周中降低。Fc-CSF-1明显增加单核细胞、淋巴细胞以及粒细胞计数。图12A-D显示在这个剂量和计时下，Fc-CSF-1并不改变肝脏、脾脏、肺或肾脏分别在实验结束时的器官重量测量结果。PCNA染色揭示，在对照中存在猪肝脏的大量增殖，这可能限制这个年龄下的任何作用。病变报告描述在肝脏中存在数目增加的组织细胞。

实例6

在呈现出由扑热息痛用药过量诱发的急性肝脏衰竭的78名患者的同期组群中使用电化学发光平台来评估血清巨噬细胞集落刺激(CSF1)。存活的患者显示明显比死亡或需要肝脏移植的那些患者高的血清CSF1水平(图13A)。分析来自患者子集(7名存活者，7名死亡/肝脏移植)的系列样本，表明存活患者中的血清CSF1水平增加，并且死亡的那些患者显示CSF1水平的降低(图13B)。入院时的CSF1水平表明对存活率的明显预测值(ROC-AUC0.84)(图13C)。

在扑热息痛中毒(350mg/kg扑热息痛，空腹过夜后腹膜内)之后最多4天的时间点时评估小鼠中的肝CSF1基因表达，在第2天显示峰值CSF1基因表达(图14A)。经由密理博(Millipore)Milliplex分析来评估的血清CSF1水平在扑热息痛中毒后第1天显示峰值水平(图14A)。用扑热息痛中毒阻断CSF1受体(180mg/kgGW2580经由管饲，LC实验室(LClaboratories))在损伤后第3天引起由减少的肝脏重量与体重比率和削弱的肝细胞增殖所表明的削弱的肝脏再生(图14B)血清分析显示在图14C中，表明在损伤后第3天的升高的ALT(肝损伤标记)与CSF1受体阻断。

在扑热息痛中毒之后12小时时向小鼠给予CSF1-Fc或对照，从而在扑热息痛中毒后第4天明显地增加肝脏重量与体重比率并且增加肝细胞增殖(图15A)，血清分析显示在图15B中。

结果表明血清CSF1的较高水平与由扑热息痛中毒诱发的急性肝脏衰竭之后的人类存活率相关联、并预测该存活率。在扑热息痛中毒的小鼠模型中，肝CSF1基因表达在部分肝切除之后增加。阻断CSF1受体削弱肝脏再生，并且在扑热息痛中毒之后12小时时在小鼠中给予CSF1-Fc可以增强再生参数。

实例7

在2/3部分肝切除之后，在手术后最多7天的时间点时评估小鼠中的肝CSF1基因表达。在第1天存在早期肝CSF1基因表达减少(图16A)。经由密理博Milliplex分析评估的血清CSF1水平在这种小鼠模型中不可检测(图16A)。然而，用2/3部分肝切除阻断CSF1受体(180mg/kgGW2580经由管饲，LC实验室)在第3天引起由显著削弱的肝细胞增殖所表明的削弱的肝脏再生(图16B)。血清分析显示在图16C中，表明升高的ALT(肝损伤标记)与CSF1受体阻断。

在2/3部分肝切除之后立即向小鼠给予CSF1-Fc或对照，从而明显地增加肝脏重量与体重比率并且增加肝细胞增殖(图17A)。血清分析显示在图17B中。CSF1-Fc给药明显地增强再生前细胞因子Il6和抑瘤素M(OSM)的基因表达，而使用GW2580的CSF1受体抑制在部分肝切除之后第2天引起其表达的明显减少。涉及生长因子活化的尿激酶受体(UR)在CSF1-Fc给药的情况下明显升高，并且在CSF1受体阻断(GW2580)的情况下尿激酶受体表达减少(图17C)。

在8周四氯化碳诱发慢性肝损伤(每周2次，每次1mcl/g四氯化碳/小鼠)的背景下，在2/3部分肝切除之后立即向小鼠给予CSF1-Fc或对照。存在使用CSF1-Fc处理而改善存活率的倾向和体重的明显增加(图18A)。肝脏重量与体重比率和增殖肝细胞数目明显增加，并且存在通过天狼星红量化评估的纤维化减少倾向(图185B)。血清参数显示在图18C中，表明在CSF1-Fc处理的情况下在肝切除后第4天胆红素和ALT的明显减少。

与扑热息痛中毒的情况对比，发现CSF1基因表达和血清水平在部分肝切除之后并不上升。然而，CSF1受体的阻断明显削弱肝脏再生。给予CSF1-Fc在正常和慢性受损小鼠肝脏中明显地增强部分肝切除模型中的再生标记。

实例8

CSF1-Fc增强损伤之后的肝吞噬能力

背景

定位于肠道下游的肝脏一直暴露于病原性物质中，并且它在这种情形下进行对于维持内稳态而言重要的解毒和固有免疫功能。肝巨噬细胞代表在直接循环接触中最大的巨噬细胞群，从而在病原性和其他不溶性物质的吞噬作用中起主要作用。肝损伤对肝脏提出实质性再生需求，因而显著降低吞噬能力和免疫功能[1，2]。目前，不存在可获得的增强肝吞噬能力的疗法。

方法

C57BI6雄性小鼠(8-10周)进行或者部分肝切除(2/3切除)或者扑热息痛中毒(350mg/kg，空腹过夜后腹膜内)。如先前给予CSF1-Fc(0.75mg/kg)。使用凯杰(Qiagen)Quantitect引物(MSR1和MARCO)进行基因分析，并且将它与每个样本的GAPDH水平相关。对于吞噬作用分析，用2％异氟烷使小鼠麻醉，并且对下腔静脉进行插管。输注0.1ml的5000IU/ml肝素溶液以预防导管阻塞。经由导管输注100μl红色荧光珠粒溶液(1:51.0μm胶乳珠粒，红色荧光，)(1:2溶液用于在扑热息痛损伤之后分析)。从注射后1分钟时开始，每两分钟从导管中移出20mcl血液，持续15分钟。立即用300μlFACS裂解溶液(碧迪生物科学公司(BDBiosciences))固定血液。在15分钟之后，在切开门静脉以流出之后，经由IVC导管向小鼠灌注15ml0.9％生理盐水。然后移出器官(肝脏、脾脏、肺、肾脏、大脑)并且用柯达(Kodak)体内多光谱FX影像装置(激发：550nm；发射：600nm；曝光1秒；f-制光圈2.8)来成像。随后使用LSR-Fortessa^TM流式细胞仪(碧迪生物科学公司)用通过在较低流动速率设定下采集1分钟样本在蓝色通道(B695/40)上所检测到的荧光珠粒来分析血液样本。

发现

CSF1-Fc和部分肝切除

在部分肝切除以及CSF1-Fc处理之后第2天，整个肝脏的基因分析揭示与吞噬作用相关联的基因MSR1(巨噬细胞清除剂受体1)和MARCO(具有胶原结构的巨噬细胞受体)的上调。CSF1受体阻断引起这些基因的表达的互反减少。

如由从荧光胶乳微珠循环的清除率所评估的，在部分肝切除之后用CSF1-Fc处理显著增强肝脏的吞噬能力(图B)。整个肝脏的荧光成像揭示与存在增强的吞噬作用相符的增加的肝脏荧光强度(图C)。其他器官的荧光成像揭示肝脏是珠粒吸收的主要位点。

CSF1-Fc和扑热息痛中毒

在扑热息痛中毒之后第2天，整个肝脏的基因分析揭示与吞噬作用相关联的基因MSR1(巨噬细胞清除剂受体1)和MARCO(具有胶原结构的巨噬细胞受体)的上调。

在扑热息痛中毒模型中的肝组织损失与部分肝切除相比较显著地较不严重，并且与此相符，我们在扑热息痛模型中并未注意到增强的来自循环中的胶乳微珠的清除率。然而，我们确实见到在离体成像之后肝荧光的明显增加，暗示增加的吞噬能力。

结论

这些发现表明在肝损伤之后，肝脏的吞噬能力可以通过用CSF1-Fc处理来增强。

实例9

如下评估部分肝切除和血清CSF1水平在人类中的作用。

方法

在进行部分肝切除的55名患者的同期组群中使用电化学发光平台来评估血清巨噬细胞集落刺激(CSF1)。在手术前以及手术后第1天和第3天取得血清样本。

发现

在人类中，在部分肝切除之后，在第1天可见血清CSF1水平的明显降低，并且CSF1水平在第3天后续增加(图21A)。最大增加见于最大数目的区段被去除(超过5个区段，与小于3个相比较)的患者中(图21B)。在整个同期组群中，2名患者出现手术后肝脏衰竭。这些患者的CSF1水平处于最低的四分之一(图21C)。

贯穿本说明书的描述和权利要求中，词语“包含”和““含有”以及它们的变化形式意味着“包括但不限于”，并且它们并不希望(并且并不)排除其他部分、添加剂、组分、完整的事物或步骤。贯穿本说明书的描述和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数涵盖复数。具体地说，当使用不定冠词时，除非上下文另有要求，否则本说明书应被理解为考虑到复数以及单数。

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读者的关注点是针对与本说明书同时或在本说明书之前与本申请结合提交并且与本说明书一起开放以供公众检验的所有论文和文献，并且所有这类论文和文献的内容以引用的方式结合在此。

参考文献

1.卡纳莱斯(Canalese)，J.等人，爆发性肝衰竭中的网状内皮系统和肝细胞功能(Reticuloendothelialsystemandhepatocyticfunctioninfulminanthepaticfailure)《肠道》(Gut)，1982.23(4)：第265-9页。

2.辛德尔(Schindl)，M.J.等人，网状内皮系统对人类中大部分肝脏切除的适应性响应(Theadaptiveresponseofthereticuloendothelialsystemtomajorliverresectioninhumans)《外科年鉴》(AnnSurg)，2006.243(4)：第507-14页。

人类CSF-1序列

全长(残基1-554)：

MTAPGAAGRCPPTTWLGSLLLLVCLLASRSITEEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQME

TSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLK

SCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS

QDVVTKPDCNCLYPKAIPSSDPASVSPHQPLAPSMAPVAGLTWEDSEGTEGSSLLPGEQP

LHTVDPGSAKQRPPRSTCQSFEPPETPVVKDSTIGGSPQPRPSVGAFNPGMEDILDSAMG

TNWVPEEASGEASEIPVPQGTELSPSRPGGGSMQTEPARPSNFLSASSPLPASAKGQQPA

DVTGTALPRVGPVRPTGQDWNHTPQKTDHPSALLRDPPEPGSPRISSLRPQGLSNPSTLS

AQPQLSRSHSSGSVLPLGELEGRRSTRDRRSPAEPEGGPASEGAARPLPRFNSVPLTDTG

HERQSEGSFSPQLQESVFHLLVPSVILVLLAVGGLLFYRWRRRSHQEPQRADSPLEQPEGSPLTQDDRQVELPV(SEQIDNO:3)

具有信号肽去除的序列(残基33-554)：

EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDI

MEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNV

FNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQDVVTKPDCNCLYPKAIPSSDPASVSPHQPLA

PSMAPVAGLTWEDSEGTEGSSLLPGEQPLHTVDPGSAKQRPPRSTCQSFEPPETPVVKDS

TIGGSPQPRPSVGAFNPGMEDILDSAMGTNWVPEEASGEASEIPVPQGTELSPSRPGGGS

MQTEPARPSNFLSASSPLPASAKGQQPADVTGTALPRVGPVRPTGQDWNHTPQKTDHPSA

LLRDPPEPGSPRISSLRPQGLSNPSTLSAQPQLSRSHSSGSVLPLGELEGRRSTRDRRSP

AEPEGGPASEGAARPLPRFNSVPLTDTGHERQSEGSFSPQLQESVFHLLVPSVILVLLAVGGLLFYRWRRRSHQEPQRADSPLEQPEGSPLTQDDRQVELPV(SEQIDNO:4)

活性片段，即残基33-182：

EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDI

MEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQD(SEQIDNO:5)

Claims

1.一种CSF-1蛋白生物活性片段或其同系物或变体或衍生物，用于增强肝脏再生和/或恢复肝脏功能和/或调节肝脏内稳态。

2.一种核酸，该核酸编码如权利要求1所述的CSF-1蛋白生物活性片段或其同系物或变体或衍生物。

3.一种融合蛋白，该融合蛋白包含：

(i)CSF-1生物活性片段或其同系物或变体或衍生物；和

(ii)生物活性抗体片段。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，该CSF-1蛋白生物活性片段是人类CSF-1的残基33-182或其生物活性部分、或来自任何哺乳动物物种的CSF-1生物学等效片段。

5.如或者权利要求3或者权利要求4所述的融合蛋白，其中该CSF-1蛋白生物活性片段或其同系物或变体或衍生物或者是天然/天然存在的或者是重组的。

6.如权利要求3到5中任一项所述的融合蛋白，其中，该抗体是选自下组的免疫球蛋白，该组包括IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中该免疫球蛋白是IgG。

8.如权利要求3到7中任一项所述的融合蛋白，其中，该抗体片段选自下组，该组包括F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、Fc以及rlgG。

9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中该片段是FC片段。

10.根据权利要求3到9中任一项所述的融合蛋白，其中，该融合蛋白的该CSF-1生物活性片段或其同系物或变体或衍生物与该生物活性抗体片段直接或经由连接子部分共价连接。

11.一种经分离核酸，该核酸编码根据以上任何一项权利要求所述的融合蛋白。

12.一种载体，该载体包含如权利要求11所述的经分离核酸。

13.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求12所述的载体。

14.一种制造本发明第一方面的融合蛋白的方法，该方法包括：

(i)培养如权利要求13所述的宿主细胞；并且

(ii)从所述培养物中收集该融合蛋白。

15.一种组合物，该组合物包含：

(b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

16.根据权利要求15所述的组合物，该组合物进一步包括如权利要求4到10所述的特征中的任何一种或多种。

17.一种组合物，该组合物包含或者如权利要求11所述的核酸或者如权利要求12所述的载体(vector)、药学上可接受的载体(carrier)、赋形剂或稀释剂。

18.一种融合蛋白的用途，该融合蛋白包含：

(i)CSF-1生物活性片段或其同系物或变体或衍生物；和

(ii)生物活性抗体片段

19.一种根据权利要求3到10中任一项所述的融合蛋白或如权利要求11所述的核酸或如权利要求12所述的载体的用途，用于制造用于增强肝脏再生和/或恢复肝脏功能和/或调节肝脏内稳态的药剂。

20.一种治疗患有肝癌并且将进行手术的个体的方法，该方法包括在手术程序之前、期间或之后给予根据权利要求3到10中任一项所述的融合蛋白或如权利要求11所述的核酸或如权利要求12所述的载体。

21.根据本发明的又另一个方面，提供一种治疗将进行肝脏移植手术的个体的方法，该方法包括在手术程序之前、期间或之后给予根据权利要求3到10中任一项所述的融合蛋白或如权利要求11所述的核酸或如权利要求12所述的载体。

22.一种试剂盒，该试剂盒包括一个或多个具有药物剂量单元的容器，这些药物剂量单元包含有效量的本发明的融合蛋白或核酸或载体，其中该容器包装有任选的用于使用它的说明书。