CN108459126A - 内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果的不确定度评定方法 - Google Patents

Abstract

内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果的不确定度评定方法，属于水产品质量安全检测分析技术领域，包括以下步骤：步骤一、采用气相色谱仪测定、绘制内标标准曲线的方法计算水产品种多氯联苯含量；步骤二、建立水产品中多氯联苯含量检测结果不确定度的定量数学模型：

Description

内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果的不确 定度评定方法

技术领域

本发明属于水产品质量安全检测分析技术领域，特别是涉及到内标法定量水产品中多氯联苯含量检测结果的不确定度评定方法。

背景技术

多氯联苯(PolychlorinatedBiphenyls，简称PCBs)是最具有代表性的一类持久性有机污染物(POPs)，具有突出的致癌、致畸、致突变的生物毒性、生物蓄积性和环境持久性，对人类健康危害极大。全球环境监测系统/食品规划部分(GEMS/FOOD)中规定7种“指示性PCB”单体(PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180)作为常用的监测PCBs污染情况指标，通常以水产类食品的PCBs总量分析为主要监测指标，美国食品药品管理局(FDA)就建议水产品中PCBs最大允许浓度为2ug/g(湿质量)。我国最近发布的《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB2762-2017)中规定，水产动物及其制品中多氯联苯的限量指标为0.5mg/kg(以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153和PCB180总和计)。目前水产品中PCBs含量测定数据通常由气相色谱法和气相色谱—质谱联用法获得，由于水产品基质成分复杂，前处理过程难度大，多组分仪器分析干扰多，这些因素都会对检测结果的质量产生影响。为此，有必要对检测结果质量进行定量评估，以确保监测数据的准确性与可比性，以便及时发现、准确预警、正确分析、科学解决水产品质量安全问题。

我国在《检测和校准实验室能力的通用要求》(ISO17025)就规定，“当检测方法要求；测量不确定度与检测结果的有效性或应用领域有关；客户提出要求；当测试结果处于规定指标临界值附近时，测量不确定度对判断结果符合性会产生影响时，需要对测量不确定度进行评定，并在检测报告中给出不确定度值”。测量不确定度的大小很大程度上决定了测量结果的可用性。因此，水产品PCBs检测作为一项与环境、食品安全密切相关的重要指标，其不确定度的正确评估、准确计算和科学表达对实现测量数据科学检测、准确度量、合理判定、互认共享以及量值溯源、检测过程关键因素控制、提高检测水平具有重要意义。因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果的不确定度评定方法，通过建立不确定度计算数学模型、分析相关不确定度来源、对各分量合理的量化计算，实现样品处理过程、仪器测量过程以及内标标准曲线定量分析过程不确定度的准确分析与合理表达。

内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果的不确定度评定方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，

步骤一、采用气相色谱仪测定、绘制内标标准曲线的方法计算水产品种多氯联苯含量；

步骤二、建立水产品中多氯联苯含量检测结果不确定度的定量数学模型：

式中：X——样品中PCBs含量，μg/kg；

x——样品溶液中目标物与内标物浓度比；

C_n3——样品溶液中内标物质量浓度，ng/ml；

V₁——样品最终定容体积，ml；

m——待测样品称量质量，g；

f_rep——测量重复性系数。

步骤三、分析不确定度来源，包括

A、测量重复性f_rep引入的不确定度u(f_rep)；

B、试样称量质量m引入的不确定度u(m)，来源于天平秤量试样的过程；

C、试样最终定容体积V₁引入的不确定度u(V₁)；

D、样品溶液中内标物浓度C_n3引入的不确定度u(C_n3)；

E、样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度u(x)，来源于内标标准曲线拟合引入的不确定度u(x₀)、上机标准溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n2)、上机标准溶液中目标物引入不确定度u(C_s)；

步骤四、测量不确定度各分量的评定

A、测量重复性引入的不确定度u(f_rep)

所述步骤一进行n次重复测量，结果为n次测量的均值，测量重复性引入的不确定度相对标准不确定度其中，单次测量标准偏差为：

式中：X_i为每一次独立测量的样品中PCBs含量；

为n次独立重复测量样品中PCBs含量的均值；

B、试样称量质量引入的不确定度u(m)

采用Ⅰ级电子天平，实际分度值为d＝0.1mg，检定分度值为e＝10d＝1mg，称量重复偏差和最大允许误差取最大值1.0mg，通过矩形分布，换算成标准不确定度为：测定的鱼肉样本称量质量引入的不确定度：

u_rel(m)＝u(m)/m；

C、试样最终定容体积引入的不确定度u(V₁)

综合定容所用移液器校准和温度对体积的影响并假定矩形分布得到：u(V₁)＝0.0058V₁ml,u_rel(V₁)＝0.0058；

D、样品溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n3)

采用定值浓度C_n0、标准不确定度u(C_n0)的内标标准溶液配制内标物浓度为C_n3的测量样品溶液，样品溶液中内标物浓度不确定度

E、样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度u(x)

E.1、上机标准溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n2)

采用定值浓度C_n0、标准不确定度u(C_n0)的内标标准溶液配制上机内标标准溶液，得到上机标准溶液中内标物浓度引入的不确定度其中

E.2、上机标准溶液中目标物引入不确定度u(C_s)

采用定值浓度C_s0、标准不确定度u(C_s0)的指示性多氯联苯混合标准溶液配制上机标准溶液，得到上机标准溶液中目标物引入的不确定度

E.3、内标标准曲线拟合引入不确定度u(x₀)

取国家有证标准物质逐级稀释获得五个浓度级别的标准混合溶液，进行线性拟合，得到标准曲线y＝mx+b，其中x——浓度比，y——面积比，

x引入的不确定度为：u_rel(x₀)＝u(x₀)/x

其中

S_R——回归曲线的剩余残差；P——待测样品重复测定次数p＝1；n——回归曲线的点数n＝5；y_j——为各级标准溶液实测的峰面积比值；x_j——为配制各级标准溶液与内标标准溶液浓度比值；X——为待测溶液目标物与内标物浓度比值；

样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度

步骤五、计算合成标准不确定度

将步骤四中获得的不确定度分量按

合成，水产品样本中多氯联苯含量的测定结果为X，则u(X)＝u_rel(X)×X；

扩展不确定度的计算：U＝k×u(X)其中95％置信概率下，取包含因子k＝2；

水产品样本中多氯联苯含量：X±U，k＝2。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果的不确定度评定方法，通过建立不确定度数学评估模型，给出不确定度来源，并按类别采用A类或B类评估方法，实现了水产品多残留检测仪器分析的不确定度量化计算，填补了水产品中药物残留检测量值溯源相关研究的空白，为提供准确可靠的水产品质量安全检测数据，以便于实现更广范围的互认共享奠定基础；

建立系统化、模块化内标标准曲线定量评估模式，通过对水产品中PCBs残留测定的不确定度分析，将内标标准曲线法定量模式通过数学模型转化为各相关不确定度来源的相对不确定度之和，实现了内标标准曲线法定量与外标标准曲线法定量不确定度评估模式的统一，提出了内标标准曲线法定量不确定度评估的模块化模式。该模式既统一又简化了相关仪器分析不确定度的量化评估过程；

建立了包括内标标准溶液和目标物标准溶液的不确定度公式化评估模式，校准过程是水产品质量安全仪器分析必须的定量过程，校准溶液的配制是仪器能否准确定量的关键步骤，一般都需经过标准储备液、标准工作液、标准使用液，其不确定度影响因素具有共同特征，通过建立配制过程不确定度公式，使得该步骤的不确定度评估简单化、标准化、系统化，而且给出了该步骤不确定度来源及其灵敏度，更加有利于标准溶液配制过程的质量控制。

具体实施方式

内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果的不确定度评定方法，本发明方法中的采用气相色谱仪测定、绘制内标标准曲线的方法计算水产品种多氯联苯含量具体操作步骤为：

(1)样品称量：

称取粉碎均匀的鱼肉样品，给出称量质量m为5.0g，精确到0.1g。

(2)40ng/mL(C_n1)内标标准工作液的配制：

将购买的浓度为2.0μg/mL(C_n0)国家标准物质定级证书中制定编号的PCB198标准溶液1mL(V_1.0)全部转移并定容至50mL(V_50.0)容量瓶中。

(3)样品中内标物的加入：

在称量好的鱼肉样品中，用量程为100μL～1000μL的移液器，精密移取内标物标准溶液(C_n1)0.1ml(V_0.1)，混合均匀后待提取，使得样品最终定容后内标物浓度为0.8ng/ml(C_n3)。

(4)提取：

在上述样品中等比例加入正己烷和二氯甲烷适量，于40℃水浴震荡提取2h，保持震荡速度200r/min，离心后倾出全部上清液，逐渐减压蒸馏至-0.1Mpa，然后移取5ml正己烷溶解并转移至刻度管中，获得定容体积为5mL(V_5.0)的提取液。

(5)净化：

在提取液中加入浓硫酸除去杂质，直至提取液清澈透明后，上机测定。

(6)测定：

注射1μL净化彻底的样品溶液至气相色谱仪GC中，得到样品溶液中目标物峰与内标物峰面积之比，通过校准曲线得到目标物与内标物浓度比，以及内标物浓度，然后通过计算得到样品溶液中目标物组分浓度及含量。

(7)80ng/ml(C_s1)混合标准工作液的配制：

将购买的定值浓度为2.0ug/ml(C_s0)PCB混合标准溶液1ml(V_1.0)全部转移并定容于25ml(V_25.0)容量瓶；

(8)56ng/ml(C_s2)混合标准使用液的配制：

用移液器(量程1000uL～5000uL)分两次移取浓度C_s1标准溶液各3.5(V_3.5)mL，并定容至10mL(V_10.0)容量瓶中。

(9)40ng/ml(C_s3)、24ng/ml(C_s4)、8ng/ml(C_s5)混合标准使用液的配制：

用移液器(量程1000uL～5000uL)移取浓度为C_s1的标准溶液5mL(V_5.0)、3mL(V_3.0)、1mL(V_1.0)并分别定容至10mL(V_10.0)容量瓶中。

(10)加入内标的混合标准溶液的配制：

用移液器(量程100uL～1000uL)移取步骤(7)、(8)、(9)配制的不同浓度的混合标准溶液各0.8ml(V_0.8)，分别与0.2ml(V_0.2)内标标准溶液(C_n1)混合均匀，得到最终PCB混合标准溶液浓度分别为64ng/ml(C_s11)、44.8ng/ml(C_s22)、32ng/ml(C_s33)、19.2ng/ml(C_s44)、5.6(C_s55)ng/ml并且内标物PCB198最终浓度为8ng/ml(C_n2)。

(11)用制备的标准溶液作GC校准：

注射1μL不同浓度级别的含有内标的最终PCB混合标准溶液，得到不同浓度级别的目标物标准溶液与内标物溶液的面积比和浓度比，绘制相应标准曲线用于仪器校准。

本发明不确定度评估的方法为：

1、测量结果数学模型的建立

上述内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量结果不确定度的定量数学模型为：

式中：X——样品中PCBs含量，μg/kg；

x——样品溶液中目标物与内标物浓度比；

C_n3——样品溶液中内标物质量浓度，ng/ml；

V₁——样品最终定容体积，ml；

m——待测样品称量质量，g；

f_rep——测量重复性系数。

2、不确定度来源分析

根据数学模型与样品前处理过程、仪器测定过程、结果定量过程分析样品中PCBs含量的不确定度来源包括：测量重复性引入的不确定度u(f_rep)；试样称量质量引入的不确定度u(m)，源于天平秤量试样的过程；试样最终定容体积引入的不确定度u(V₁)；样品溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n3)；样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度u(x)，来源于内标标准曲线拟合引入的不确定度u(x₀)、上机标准溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n2)、上机标准溶液中目标物引入不确定度u(C_s)；

3、不确定度分量的量化

3.1测量重复性引入的不确定度u(f_rep)

上述内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果不确定度的评定方法，在重复性条件下，对同一样本从取样开始重复测量6次，结果是6次测定的平均。按以及计算测定结果见表1。

表1 PCBs重复性测定结果

3.2称量质量引入的不确定度u(m)

对于精度为十万分之一且检定合格的Ⅰ级电子天平，当实际分度值d＝0.1mg，检定分度值e＝10d＝1mg，在5×10⁴≤m≤2×10⁵范围内，最大允许称量误差为±1.0e＝±1.0×1mg＝±1mg。称量重复偏差同样满足不超过相应在和最大允许误差绝对值的要求，取最大值1.0mg。假定为矩形分布，换算成标准不确定度为：则样本称量质量引入的不确定度u_m为：

u_rel(m)＝u(m)/m＝1.154/5000＝0.00023。

3.3样本最终定容体积引入的不确定度u(V₁)

综合考虑定容所移液器校准和温度对体积的影响并假定矩形分布，试样定容体积引入的不确定度u(V₁)＝0.0058V₁，u_rel(V₁)＝0.0058。

3.4样品溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n3)

按照含有内标的样品处理过程，样品中最终内标物浓度的数学模型为

忽略V_1.0不确定度，按所使用单标线容量瓶及移液器允许误差和有机溶剂随温度的体积变化，假定均匀分布，

依据国家标准物质定级证书，使用浓度为2.0ug/ml，内标标准储备液不确定度u(C_n0)为0.018ug/ml，u_rel(C_n0)＝0.018/2＝0.009。

3.6样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度u(x)

3.6.1上机标准溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n2)

根据含有内标物的上机标准溶液配制过程，C_n2的数学模型为：内标标准上机液引入的不确定度忽略V_1.0不确定度，按所使用单标线容量瓶及移液器，分别依据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》和JJG646-2006《移液器检定规程》给定的允许误差，假定矩形分布计算校准产生的不确定度。单标线容量瓶和移液器校准温度均为20℃，而实验室温度在20±8℃范围内变化，有机溶剂膨胀系数为1.0×10^-3℃，由此产生的体积变化为：±(V×8×1.0×10^-3)＝±0.008VmL，假定矩形分布，整理后计算得到：u² _rel(C_n2)＝u² _rel(C_n0)+0.00028，

3.6.2上机标准溶液中目标物引入不确定度u(C_s)

按照上机标准溶液的配制过程，得到数学模型：

(其中一个V_1.0为购买储备液全部转移体积，忽略其不确定度)。于是

上述公式中，体积量不确定度一般由定量所用单标线容量瓶及移液器校准和溶剂随温度变化决定，按均匀分布有

u² _rel(C_s11)＝u² _rel(C_s0)+0.00028，

u² _rel(C_s22)＝u² _rel(C_s0)+0.00033，

u² _rel(C_s33)＝u² _rel(C_s0)+0.00086，

u² _rel(C_s44)＝u² _rel(C_s0)+0.0012，

u² _rel(C_s55)＝u² _rel(C_s0)+0.00036，

则上机标准溶液中目标物引入不确定度

其中标准储备液引入的不确定度u(C_s0)由国家标准物质定级证书给定数据计算得到。上述计算结果见表2。

表2标准储备液、上机标准溶液不确定度

	urel(Cs0)	urel(Cs)
			PCB28	0.0032	0.0553
PCB52	0.0028	0.0551
			PCB101	0.0038	0.0554
PCB118	0.0025	0.0551
			PCB138	0.0040	0.0555
PCB153	0.0028	0.0551
			PCB180	0.0030	0.0552

3.6.3内标标准曲线拟合引入不确定度u(x₀)

根据国家有证标准物质逐级稀释得到64ng/ml、44.8ng/ml、32ng/ml、19.2ng/ml、5.6ng/ml五个浓度级别的标准混合溶液，测定后进行线性拟合，得到标准曲线y＝mx+b，其中x——浓度比，y——面积比。内标标准曲线数据见表3。

表3内标标准曲线线性回归结果

对样本进行色谱测量，从标准曲线方程计算所得样品溶液中目标物与内标物组分浓度比X引入的不确定度u(X)按下式计算：u_rel(x₀)＝u(x₀)/x

其中

S_R——回归曲线的剩余残差(残差的标准差)；P——待测样品重复测定次数p＝1；n——回归曲线的点数n＝5(每个标准溶液浓度进行各进行1次测量)；y_j——为各级标准溶液实测的峰面积比值；x_j——为配制各级标准溶液与内标标准溶液浓度比值；X——为待测溶液目标物与内标物浓度比值。由内标标准曲线拟合引入的不确定度结果见表4。

表4标准曲线拟合引入的不确定度

综合上述，样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度

四、合成标准不确定度的计算

内标标准曲线法定量的水产品中指示性多氯联苯含量测定的不确定度分量见表5。

表5不确定度分量汇总表

将上述不确定度分量按

合成，得到气相色谱法测定、内标标准曲线法定量的水产品中多氯联苯含量不确定度评估结果见表11。若水产品样本中多氯联苯含量的测定结果为X，则u(X)＝u_rel(X)×X。

扩展不确定度的计算：U＝k×u(X)(其中95％置信概率下，取包含因子k＝2)。

水产品中多氯联苯含量：X±U，k＝2。

表11不确定度评估结果

Claims (1)

1.内标标准曲线法计算水产品中多氯联苯含量检测结果的不确定度评定方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，

步骤一、采用气相色谱仪测定、绘制内标标准曲线的方法计算水产品种多氯联苯含量；

步骤二、建立水产品中多氯联苯含量检测结果不确定度的定量数学模型：

式中：X——样品中PCBs含量，μg/kg；

x——样品溶液中目标物与内标物浓度比；

C_n3——样品溶液中内标物质量浓度，ng/ml；

V1——样品最终定容体积，ml；

m——待测样品称量质量，g；

步骤三、分析不确定度来源，包括

A、测量重复性f_rep引入的不确定度u(f_rep)；

B、试样称量质量m引入的不确定度u(m)，来源于天平秤量试样的过程；

C、试样最终定容体积V₁引入的不确定度u(V₁)；

D、样品溶液中内标物浓度C_n3引入的不确定度u(C_n3)；

E、样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度u(x)，来源于内标标准曲线拟合引入的不确定度u(x₀)、上机标准溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n2)、上机标准溶液中目标物引入不确定度u(C_s)；

步骤四、测量不确定度各分量的评定

A、测量重复性引入的不确定度u(f_rep)

所述步骤一进行n次重复测量，结果为n次测量的均值，测量重复性引入的不确定度相对标准不确定度其中，单次测量标准偏差为：

式中：X_i为每一次独立测量的样品中PCBs含量；

为n次独立重复测量样品中PCBs含量的均值；

B、试样称量质量引入的不确定度u(m)

采用Ⅰ级电子天平，实际分度值为d＝0.1mg，检定分度值为e＝10d＝1mg，称量重复偏差和最大允许误差取最大值1.0mg，通过矩形分布，换算成标准不确定度为：测定的鱼肉样本称量质量引入的不确定度：

u_rel(m)＝u(m)/m；

C、试样最终定容体积引入的不确定度u(V₁)

综合定容所用移液器校准和温度对体积的影响并假定矩形分布得到：u(V₁)＝0.0058V₁ml,u_rel(V₁)＝0.0058；

D、样品溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n3)

采用定值浓度C_n0、标准不确定度u(C_n0)的内标标准溶液配制内标物浓度为C_n3的测量样品溶液，样品溶液中内标物浓度不确定度

E、样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度u(x)

E.1、上机标准溶液中内标物浓度引入的不确定度u(C_n2)

采用定值浓度标准不确定度u(C_n0)的内标标准溶液配制上机内标标准溶液，得到上机标准溶液中内标物浓度引入的不确定度其中

E.2、上机标准溶液中目标物引入不确定度u(C_s)

采用定值浓度C_s0、标准不确定度u(C_s0)的指示性多氯联苯混合标准溶液配制上机标准溶液，得到上机标准溶液中目标物引入的不确定度

E.3、内标标准曲线拟合引入不确定度u(x₀)

取国家有证标准物质逐级稀释获得五个浓度级别的标准混合溶液，进行线性拟合，得到标准曲线y＝mx+b，其中x——浓度比，y——面积比，

x引入的不确定度为：u_rel(x₀)＝u(x₀)/x

其中

S_R——回归曲线的剩余残差；P——待测样品重复测定次数p＝1；n——回归曲线的点数n＝5；y_j——为各级标准溶液实测的峰面积比值；x_j——为配制各级标准溶液与内标标准溶液浓度比值；X——为待测溶液目标物与内标物浓度比值；

样品溶液中目标物与内标物浓度比引入的不确定度

步骤五、计算合成标准不确定度

将步骤四中获得的不确定度分量按合成，水产品样本中多氯联苯含量的测定结果为X，则u(X)＝u_rel(X)×X；

扩展不确定度的计算：U＝k×u(X)其中95％置信概率下，取包含因子k＝2；

水产品样本中多氯联苯含量：X±U，k＝2。