CN108445224A - 一种心型脂肪酸结合蛋白抗体片段复合胶乳颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种心型脂肪酸结合蛋白抗体片段复合胶乳颗粒及其制备方法,其原理为先由无花果蛋白酶将h-FABP抗体切割成F(ab')2片段,再将F(ab')2片段交联于羧基胶乳微球上,形成h-FABP抗体片段复合胶乳颗粒,从而显著降低Fc的非特异性结合,实现与样本抗原高效结合。以本发明做样品中心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)含量的检测,与传统方法相比,本发明抗体利用率高,灵敏度高,能有效控制批间差,值得进一步推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测试剂领域,具体涉及一种心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)抗体片段复合胶乳颗粒及其制备方法。
背景技术
心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白。由132个氨基酸组成,分子量为15kDa。它具有高度心脏特异性,主要存在于心肌细胞中,但在心脏以外的组织中也有低浓度表达,如骨骼肌中存在微量。在心脏全部可溶性蛋白中h-FABP约占4%~8%。h-FABP可以和心肌内的长链脂肪酸相结合,将其转运到线粒体中,最终氧化分解成三磷酸腺苷ATP,为心肌活动提供能量。因此h-FABP是重要的能源脂肪酸的载体蛋白。由于正常人的血浆和尿中不含或只含极微量h-FABP,当心肌细胞受损时,h-FABP被快速释放到血液和尿中,在AMI的超急性期h-FABP的浓度在血液和尿中显著升高。因此h-FABP的浓度变化可作为AMI早期诊断的较好指标且其敏感性和可预见性均较为理想。
目前市场上心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)检测技术常用的方法有如下几种:放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)、酶联免疫测定法(ELISA)、免疫传感器技术、免疫胶体金技术、胶乳增强免疫比浊法等,以胶乳增强免疫比浊法居多。胶乳增强免疫比浊法属于普通免疫比浊技术的衍生技术,克服了普通免疫比浊技术信号量非常有限的缺点,使抗体体积有了数量级上的增长,大幅提升了可检测性,但该方法也存在巨大的技术难点,即抗体连接到胶乳微球上的方向无法控制,使得其活性及稳定性(包括不随时间的改变而发生变化及批间一致性)不能保证。
因此,找到一种抗体与胶乳微球间有效偶联的方法,是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种心型脂肪酸结合蛋白抗体片段复合胶乳颗粒的制备方法,该方法提高了抗体利用率,也进一步提高了整个试剂的准确度,能有效控制批间差。
本发明的第二个目的是提供了一种心型脂肪酸结合蛋白抗体片段复合胶乳颗粒,它能显著降低Fc的非特异性结合,实现与样本抗原高效结合。
为实现第一个目的,本发明采用的技术方案是:在含半胱氨酸的缓冲环境下,先由无花果蛋白酶对h-FABP抗体进行切割,形成F(ab')2片段和Fc的多肽碎片,经Protein A离心柱洗脱纯化,去除Fc的多肽碎片,获得纯化的F(ab')2片段,再将F(ab')2片段交联于羧基胶乳微球上,形成h-FABP抗体片段复合胶乳颗粒。
本发明具体操作如下
(1)由无花果蛋白酶将h-FABP抗体切割成F(ab')2片段;
h-FABP抗体选择鼠抗人h-FABP抗体。将鼠抗人h-FABP抗体用Spin-OUTTM GT-600,Medi离心式去盐柱脱盐,所用缓冲液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)。取相同的磷酸盐缓冲液20ml,加入无花果蛋白酶1mg,1mol/L半胱氨酸溶液1ml,0.5mol/L EDTA溶液1ml,置于37℃,100r/min恒温水浴摇床中均匀溶解2h。过Sephadex G50柱,并用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱,收集获得含活化的无花果蛋白酶酶溶液,并浓缩至原体积。以体积比5:1混合透析后的鼠抗人h-FABP抗体与活化无花果蛋白酶酶溶液,置于37℃,100r/min恒温水浴摇床中酶解3h,3h后再次加入等量的活化无花果蛋白酶酶溶液继续酶解3h,重复三次。酶解结束后加入0.1mmol/L碘乙酰胺0.5ml冰浴1h终止反应。过Protein A离心柱,并用含0.1mol/LNaCl的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱,最后用超纯水透析24h,收集获得h-FABP抗体F(ab')2片段,置于2-8℃保存。
(2)将F(ab')2片段交联于羧基胶乳微球上,形成h-FABP抗体片段复合胶乳颗粒
取粒径为120nm浓度为10%胶乳微球1ml,加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)9ml,室温震荡2mins,混合均匀后迅速加入120μl EDC水溶液(50mg/ml),加入150μl sulfo-NHS水溶液(100mg/ml),室温搅拌40min,2-8℃离心30min(转速15000),用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤三次,除去上清液,沉淀用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)1ml超声重悬。取0.5ml h-FABP抗体F(ab')2片段,加入0.5ml胶乳微球重悬液,室温搅拌1h,再重复加入0.5ml胶乳微球重悬液,继续室温搅拌3h,加入400μl 5%盐酸羟胺水溶液淬灭试剂和200μl 1%BSA水溶液,室温震荡1h;4℃离心30mi n(转速15000),沉淀用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤三次,除去上清液,用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)1ml超声分散30mins,2-8℃密封保存。
进一步设置是所述的h-FABP抗体选择鼠抗人h-FABP抗体。
进一步设置是,所述的0.2mol/L磷酸盐缓冲液pH为6.5。
本发明还提供一种根据上述制备方法制备的心型脂肪酸结合蛋白抗体片段复合胶乳颗粒。
采用上述方案,本发明的优势在于:利用抗体片段化,显著降低Fc的非特异性结合,实现与样本抗原高效结合,提高了抗体利用率,也进一步提高了整个试剂的准确度,能有效控制批间差。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
附图1为本发明具体实施1所制得的心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)检测试剂的线性相关图;
附图2为本发明具体实施例2所制得的心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)检测试剂与市售检测试剂的线性相关图。
具体实施方式
本发明结合具体实施例说明技术方案,本发明的保护范围不局限于上述具体实施方式,本领域一般技术人员根据本发明公开的内容,可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的,或者凡是采用本发明的设计结构和思路,做简单变化或更改的,都落入本发明的保护范围。
制备实施例
在含半胱氨酸的缓冲环境下,先由无花果蛋白酶对h-FABP抗体进行切割,形成F(ab')2片段和Fc的多肽碎片,经Protein A离心柱洗脱纯化,去除Fc的多肽碎片,获得纯化的F(ab')2片段,再将F(ab')2片段交联于羧基胶乳微球上,形成h-FABP抗体片段复合胶乳颗粒。
本发明具体操作如下
(1)由无花果蛋白酶将h-FABP抗体切割成F(ab')2片段;
h-FABP抗体选择鼠抗人h-FABP抗体。将鼠抗人h-FABP抗体用Spin-OUTTM GT-600,Medi离心式去盐柱脱盐,所用缓冲液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)。取相同的磷酸盐缓冲液20ml,加入无花果蛋白酶1mg,1mol/L半胱氨酸溶液1ml,0.5mol/L EDTA溶液1ml,置于37℃,100r/min恒温水浴摇床中均匀溶解2h。过Sephadex G50柱,并用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱,收集获得含活化的无花果蛋白酶酶溶液,并浓缩至原体积。以体积比5:1混合透析后的鼠抗人h-FABP抗体与活化无花果蛋白酶酶溶液,置于37℃,100r/min恒温水浴摇床中酶解3h,3h后再次加入等量的活化无花果蛋白酶酶溶液继续酶解3h,重复三次。酶解结束后加入0.1mmol/L碘乙酰胺0.5ml冰浴1h终止反应。过Protein A离心柱,并用含0.1mol/LNaCl的0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱,最后用超纯水透析24h,收集获得h-FABP抗体F(ab')2片段,置于2-8℃保存。
(2)将F(ab')2片段交联于羧基胶乳微球上,形成h-FABP抗体片段复合胶乳颗粒
取粒径为120nm浓度为10%胶乳微球1ml,加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)9ml,室温震荡2mins,混合均匀后迅速加入120μl EDC水溶液(50mg/ml),加入150μl sulfo-NHS水溶液(100mg/ml),室温搅拌40min,2-8℃离心30min(转速15000),用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤三次,除去上清液,沉淀用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)1ml超声重悬。取0.5ml h-FABP抗体F(ab')2片段,加入0.5ml胶乳微球重悬液,室温搅拌1h,再重复加入0.5ml胶乳微球重悬液,继续室温搅拌3h,加入400μl 5%盐酸羟胺水溶液淬灭试剂和200μl 1%BSA水溶液,室温震荡1h;4℃离心30min(转速15000),沉淀用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤三次,除去上清液,用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)1ml超声分散30mins,2-8℃密封保存。
使用实施例
以技术方案中的所提到的方法制备h-FABP抗体片段复合胶乳颗粒,并以此复合胶乳颗粒为原料制成检测试剂进行性能分析。
该检测试剂为液体双试剂,分为试剂1与试剂2,试剂1与试剂2的体积比为3:1。具体成分如下
试剂R1:磷酸盐缓冲液pH6.0-7.0 0.1-0.5mol/L
聚乙二醇8000 9-15g/L
叠氮钠 0.01wt%
该具体组分优选实施例为:
磷酸盐缓冲液,pH6.5 0.2mol/L
聚乙二醇8000 12g/L
叠氮钠 0.01wt%
所述试剂2成分如下:
重复性测定:同一样品连续抽取20次进行测定,计算测定值的均数、标准差和变异系数,
表1精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度,CV值越小,表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言,CV小于5%的方法精密度公认是可以接受的。表1中CV值小于5%,表明本发明具有较好的精密度。
批间差测定:分别配制3批检测试剂,标记为①、②、③,每个批号对同一样品测试3次,分别计算每批3次检测的均值(i=1,2,3),按以下公式计算相对偏差R。
式中:
——中的最大值;——中的最小值;——3批试剂检测均值。
表2批间差检测结果
3个批号检测试剂之间的批间差应不大于10%为可接受,本发明3个批号的检测试剂经检测,批间差为5.3%,处于可接受范围内。
准确度测定:用同一质控品,重复测定3次,取平均值,与质控品靶值相对偏差应在±15%范围内。
表3准确度检测结果
表3中相对偏差CB=5.33%,处于±15%范围内,表明本发明具有优良的准确度。线性测定:使用去离子水将试剂稀释成5个梯度浓度,每个梯度浓度检测3次,取平均值,对测定值与预期值作回归分析,计算r值和相对偏差(结果见图1,单位ng/ml)。
表4线性相关检测结果
稀释浓度 | 37.50 | 62.50 | 125.00 | 187.50 | 250.00 |
测定值 | 36.51 | 59.26 | 128.14 | 186.40 | 242.03 |
36.74 | 56.15 | 132.58 | 191.10 | 230.87 | |
38.76 | 56.48 | 134.16 | 182.43 | 231.93 | |
均值 | 37 | 57 | 132 | 187 | 235 |
绝对偏差 | 1.81 | 5.65 | 9.20 | 4.72 | 6.46 |
相对偏差 | 4.63% | 8.98% | -7.51% | -2.60% | 2.68% |
通过表4得到相关系数:r2=0.9935,线性方程为:y=0.9518x+3.4609,结果表明本发明相关性良好。
实施例2
以技术方案中的所提到的方法制备h-FABP抗体片段复合胶乳颗粒,并以此复合胶乳颗粒为原料制成检测试剂,与市售检测试剂的性能指标比较
对照的市售检测试剂,其信息如下:
产品名称:心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(金华市强盛生物科技有限公司)
剂型:液体双试剂(1:1)
试剂成份:
试剂1:
甘氨酸缓冲液 100mmol/L
牛血清白蛋白 适量
甲基异噻唑啉酮 适量
试剂2:
包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的纳米微球 0.05%-0.5%
牛血清白蛋白 适量
甲基异噻唑啉酮 适量
检验方法:
1、试剂准备:试剂为即用式。
2、基本参数:方法:终点法样本/R1/R2/:6/100/100
主波长:570nm副波长:800nm反应温度:37℃
3、操作:
4.计算:△A=A2-A1
样本h-FABP(g/L)=△Au/△As x Cs
市售检测试剂按说明书操作。
线性测定:分别采用本发明检测试剂与市售检测试剂,采用AU480全自动生化分析仪,对50份样本(包含正常和异常样本),按各自参数进行测定,并对测定值进行相关分析(结果见图2,X轴表示的是本发明检测试剂的测定值,Y轴表示的是市售检测试剂的测定值)。相关系数:r2=0.9921,线性方程为:y=0.976x+0.214,结果表明本发明检测试剂与市售检测试剂相关性良好。
表5线性相关检测结果
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (5)
1.一种心型脂肪酸结合蛋白抗体片段复合胶乳颗粒的制备方法,其特征在于,其特征在于:运用抗体片段化技术,在含半胱氨酸的缓冲环境下,先由无花果蛋白酶对h-FABP抗体进行切割,形成h-FABP抗体F(ab')2片段和Fc的多肽碎片,经Protein A离心柱洗脱纯化,去除Fc的多肽碎片,获得纯化的h-FABP抗体F(ab')2片段,再将h-FABP抗体F(ab')2片段交联于羧基胶乳微球上,形成心型脂肪酸结合蛋白抗体片段复合胶乳颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)由无花果蛋白酶将h-FABP抗体切割成F(ab')2片段;
将h-FABP抗体用离心式去盐柱脱盐,脱盐所用缓冲液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液;取相同的磷酸盐缓冲液20ml,加入无花果蛋白酶1mg,1mol/L半胱氨酸溶液1ml,0.5mol/L EDTA溶液1ml,置于37℃,100r/min恒温水浴摇床中均匀溶解2h;过Sephadex G50柱,并用0.2mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱,收集获得含活化的无花果蛋白酶酶溶液,并浓缩至原体积;以体积比5:1混合透析后的h-FABP抗体与活化无花果蛋白酶酶溶液,置于37℃,100r/min恒温水浴摇床中酶解3h,3h后再次加入等量的活化无花果蛋白酶酶溶液继续酶解3h,重复三次;酶解结束后加入0.1mmol/L碘乙酰胺0.5ml冰浴1h终止反应;过Protein A离心柱,并用含0.1mol/L NaCl的0.2mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱,最后用超纯水透析24h,收集获得h-FABP抗体F(ab')2片段,置于2-8℃保存;
(2)将h-FABP抗体F(ab')2片段交联于羧基胶乳微球上,形成h-FABP抗体片段复合胶乳颗粒
取粒径为120nm浓度为10%胶乳微球1ml,加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液9ml,室温震荡2mins,混合均匀后迅速加入120μl 50mg/ml EDC水溶液,加入150μl100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺水溶液,室温搅拌40min,2-8℃离心30min,转速为15000rpm,用0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗涤三次,除去上清液,沉淀用0.2mol/L磷酸盐缓冲液1ml超声重悬;取0.5ml h-FABP抗体F(ab')2片段,加入0.5ml胶乳微球重悬液,室温搅拌1h,再重复加入0.5ml胶乳微球重悬液,继续室温搅拌3h,加入400μl 5%盐酸羟胺水溶液淬灭试剂和200μl 1%BSA水溶液,室温震荡1h;4℃离心30min,转速为15000rpm,沉淀用0.2mol/L、pH6.5磷酸盐缓冲液洗涤三次,除去上清液,用0.2mol/L磷酸盐缓冲液1ml超声分散30mins,2-8℃密封保存。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的h-FABP抗体选择鼠抗人h-FABP抗体。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的0.2mol/L磷酸盐缓冲液pH为6.5。
5.一种根据权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的心型脂肪酸结合蛋白抗体片段复合胶乳颗粒。
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