CN108430478B - 用于治疗骨关节炎的包含亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗骨关节炎的组合物及其制备方法，更具体地涉及一种包含亲水化柳氮磺胺吡啶作为活性成分和透明质酸，以除了通过关节内或局部给药来缓解症状外还通过预防关节磨损来有效治疗退行性骨关节炎等骨关节炎的组合物及其制备方法。在通过本发明的制备方法制备这种用于治疗骨关节炎的组合物时，溶解后，除了中和步骤之外还保持溶解状态，从而阻止中和后发生柳氮磺胺吡啶盐析沉淀，因此，可以制备包含高浓度的柳氮磺胺吡啶的组合物，并且由此制备的组合物通过关节内或局部给药非常有助于治疗骨关节炎，特别是退行性骨关节炎，因为其包含高浓度的柳氮磺胺吡啶，以前柳氮磺胺吡啶由于溶解性差必须通过常规方法以低浓度配制。

Description

用于治疗骨关节炎的包含亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸的 组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于治疗骨关节炎的组合物及其制备方法，更具体地涉及一种包含亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸作为活性成分，以除了通过关节内注射和局部给药来缓解症状外还通过预防软骨退变来有效治疗退行性骨关节炎等骨关节炎的组合物及其制备方法。

背景技术

骨关节炎指的是关节内软骨由于细胞因子和软骨破坏酶而不断退化和损伤导致疼痛、关节不稳定和丧失活动性的状态，其中细胞因子和软骨破坏酶通过关节区域的物理刺激从软骨细胞和滑膜表达。

目前，除了外科手术外，还有几种药物、关节内(滑膜腔内)施用透明质酸等用于治疗骨关节炎，但这些主要用于缓解症状，对减少软骨损伤作用很小。因此，在很大程度上很需要能够有效治疗骨关节炎的药物。

同时，目前使用柳氮磺胺吡啶作为类风湿性关节炎和炎症性肠病的口服治疗剂，但最近几项研究的结果报告指出，有可能通过预防软骨细胞的变化及抑制滑膜中软骨破坏因子的表达而将柳氮磺胺吡啶用于治疗骨关节炎，其中软骨细胞的变化为骨关节炎的病因(Nose M.等，J Rheumatol，1997；24:550-4，Lakey等，Rheumatology 2009；48:1208-1212，Endo W.等，Mod Rheumatol 2014；24(5):844-50)。

已知当口服柳氮磺胺吡啶时，即使在最大剂量为4g/天后，其吸收率非常低，血液浓度为12μg/ml，并且由于溶解性差还会引起消化障碍，有报告指出各种副作用是由高血浓度的磺胺吡啶造成的，磺胺吡啶为柳氮磺胺吡啶的降解产物(Hoult JRS.Drugs 1986；32：18-26)。因此，期望直接关节内注射柳氮磺胺吡啶，可避免由口服给药引起的那些副作用。然而，柳氮磺胺吡啶的溶解性差妨碍了具有足够浓度的液体制剂来显示抗骨关节炎作用。另外，由于已知滑液的翻转时间(turn-over time)为2小时(Levick JR等，Ann Rheuma1995；54:417-423)，所以关节内施用柳氮磺胺吡啶预计不会充分有效。

另一方面，透明质酸是体内滑液的主要成分之一，存在于关节软骨之间，起润滑剂的作用。由于就骨关节炎患者而言，透明质酸在关节中的浓度会降低，所以透明质酸补充剂被广泛用作骨关节炎治疗物质。不同于其他组分的滑液，透明质酸的半衰期超过了13小时(Brown TJ等，ExpPhysiol 1991:76；125-134)。因此，当柳氮磺胺吡啶和透明质酸混合时，预计柳氮磺胺吡啶在滑液腔中的停留可保持24小时或更长时间。

在这些情况下，为了利用溶解性差的柳氮磺胺吡啶创建有效的骨关节炎治疗方法，本发明人开发了一种包含高浓度的柳氮磺胺吡啶作为活性成分的药物组合物，该高浓度的柳氮磺胺吡啶可用特定浓度的碱性添加剂溶解，与透明质酸混合。此外，通过将含有高浓度的柳氮磺胺吡啶和透明质酸的组合物应用于动物模型，结果证实具有特定浓度水平的柳氮磺胺吡啶的组合物不仅抑制了骨关节炎的发展，还同时显示了对疼痛有所控制，由此完成了本发明。

发明内容

技术问题

为了解决上述问题，本发明旨在提供一种能够在关节内或局部给药的用于治疗骨关节炎的组合物，其包含亲水化柳氮磺胺吡啶作为活性成分，还包含透明质酸、其盐或衍生物。

此外，本发明旨在提供一种能够在关节内或局部给药的用于治疗骨关节炎的组合物的制备方法。

有益效果

在通过本发明的制备方法制备包含亲水化柳氮磺胺吡啶以及透明质酸的用于治疗骨关节炎的组合物时，即使是在溶解后又经过了中和步骤后也还保持溶解状态，从而阻止中和后发生柳氮磺胺吡啶盐析沉淀。因此，可以制备包含高浓度的柳氮磺胺吡啶的组合物，并且由此制备的组合物通过关节内注射或局部给药非常有助于治疗骨关节炎，特别是退行性骨关节炎，因为其与由于柳氮磺胺吡啶的溶解性差而浓度低的传统制剂相比包含高浓度的柳氮磺胺吡啶。

附图说明

图1为根据本发明包含1、2、4和8mM的亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸的用于治疗骨关节炎的组合物的照片。

图2为示出了体外试验结果的图表，其中在用IL-1b诱导了炎症的人体脂肪细胞衍生的干细胞中，通过本发明的组合物来抑制炎症和软骨破坏因子表达。

图3为当在盐水中含有亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸的混合物时，测量释放到盐水中的柳氮磺胺吡啶的累积释放量的图表。

图4为施用0～8mM的本发明的包含亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸的骨关节炎组合物后8周，通过在滑膜中处理1mg MIA而诱导的骨关节炎动物模型(大鼠)的X射线照片。

图5为向通过在滑膜中处理1mg MIA而诱导的骨关节炎动物模型(大鼠)施用0～8mM的本发明的包含亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸的骨关节炎组合物，以及使用能够检测动物模型症状水平的设备对症状减轻观察6周的结果图。

具体实施方式

作为实现目的的一个方面，本发明涉及一种能够在关节内或局部给药的用于治疗骨关节炎的组合物，其包含2至10mM的亲水化柳氮磺胺吡啶和1至2(w/v)％的透明质酸作为活性成分，以及通过施加该组合物来改善或治疗骨关节炎的方法。

柳氮磺胺吡啶(以下简称为“SSZ”)是一种由磺胺吡啶和5-氨基水杨酸(5-ASA)的偶氮键形成的化合物，其具有以下化学式1的结构。

化学式1

在本发明中，组合物的特征在于含有2～10mM的亲水化柳氮磺胺吡啶作为有效成分用于骨关节炎治疗。

本文中，术语“亲水化柳氮磺胺吡啶”是指水介质中水溶性差的柳氮磺胺吡啶的溶解性或分散均匀性增加，并且这种亲水化柳氮磺胺吡啶包含：i)水溶性盐形式的柳氮磺胺吡啶，或ii)通过将亲水化溶剂和柳氮磺胺吡啶混合在水介质中而均匀分散的混合物，亲水化溶剂可以是聚乙二醇(PEG)。

i)水溶性柳氮磺胺吡啶的盐的形式可以是通过向柳氮磺胺吡啶中加入盐酸、氯化钠、氯化钙或氯化钾而成为酸加成盐或碱加成盐的形式，并且可以通过将柳氮磺胺吡啶与聚乙二醇混合来获得。

优选地，本发明中的柳氮磺胺吡啶可为与ii)聚乙二醇混合的状态。与聚乙二醇混合的柳氮磺胺吡啶可通过向使用了盐的经pH调节的水溶性介质中加入聚乙二醇，并向包含聚乙二醇的水溶性介质中加入柳氮磺胺吡啶来获得。

该平衡盐溶液可包含各种分子量和浓度的聚乙二醇，例如，其可包含浓度为1％至40％(w/v)，平均分子量为380至420的聚乙二醇。

就这一点而言，本发明人证实，柳氮磺胺吡啶的骨关节炎治疗效果仅在足够高的浓度下显示，但在低于上述范围的浓度下，例如1mM，未显示。当包含低于2mM(0.08w/v％)的柳氮磺胺吡啶时，则无法显示抗骨关节炎作用，而当其超过10mM(0.4w/v％)时，由于柳氮磺胺吡啶本身溶解性差，而不适用于液体制剂或注射制剂。

同时，透明质酸、其盐或其衍生物可进一步包含在本发明描述的具有亲水化柳氮磺胺吡啶的组合物中。

透明质酸是细胞外基质的主要成分，已知其通过其机械和生理缓冲作用来保护例如虹膜、视网膜等组织以及血管内皮细胞、上皮细胞等细胞，在生理条件下形成广泛分布于结缔组织的细胞基质中的粘着弹性溶液。在本发明中，透明质酸对物理性质、形式、尺寸等没有限制，并且优选经过无菌处理，但更优选地，可使用重均分子量为1.0×10⁶至6.0×10⁶g/mol的透明质酸。此外，透明质酸可作为药学上可接受的盐的形式使用，药学上可接受的盐包含钠盐、钾盐、钙盐等，并优选包含钠盐。另外，也可以使用透明质酸衍生物，该衍生物可以是通过交联、硫化、酯化或氨基酸键合而被化学改性的透明质酸。如上所述，在本发明中，透明质酸的浓度优选为全部组合物的1～2％(wt/vol)。当使用量低于上述范围时，由于粘弹性过低，可能不会在骨关节炎的滑液腔中停留适当的时间，当使用量超过上述范围时，由于粘弹性过高，难以保证作为液体制剂流动性适当。

作为具体的一个方面，本发明中用于治疗骨关节炎的组合物的特征在于在关节内或局部给药。根据本发明人的实验，柳氮磺胺吡啶要求在2mM以上的浓度下使用很有必要，因为在低浓度下，例如1mM下，无法显示有效的骨关节炎治疗效果水平，但是当口服给药时，维持血液中如此高浓度的柳氮磺胺吡啶，存在严重的副作用高风险。因此，本发明中用于治疗骨关节炎的组合物可优选地配制成液体制剂，更优选地，通过将要在骨关节炎区域的关节内或局部施用的柳氮磺胺吡啶亲水化而配制成可注射制剂。对于制剂，本发明中用于治疗骨关节炎的组合物除了特定浓度的柳氮磺胺吡啶和透明质酸以外还可以包含药学上可接受的添加剂。药学上可接受的添加剂是指在不显著刺激生物体的情况下不抑制活性成分的生物活性和特性的载体或稀释剂。药学上可接受的添加剂有等渗剂、缓冲剂、稳定剂、pH调节剂等。此外，由于本发明的组合物优选为液体制剂，因此其可以进一步包含载体，该载体包含用于其的水溶液。包含水溶液的载体可包含选自由蒸馏水、磷酸盐缓冲盐水、平衡盐溶液和盐水组成的组中的一种或多种药学上可接受的载体。然后，可根据要制备的液体制剂或注射制剂的总容量所需的量来调整所用载体的含量。平衡盐溶液是指具有生理pH值和盐浓度(渗透压)的盐溶液，可将其称为均衡盐溶液，常见的平衡盐溶液包含选自由钠、钾、钙、镁及其氯化物组成的组中的一种或多种。本文中，术语“给药”是指通过任何适当的方法将本发明的某种组分引入给患者，并且本发明中的给药途径是关节内或局部注射。本文中，“治疗”是指当用于显示有致病症状的受试者时，停止、延迟或改善疾病的进展。本发明的治疗方法包括以治疗有效剂量施用亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸。某些患者的具体治疗有效剂量可以根据各种因素而变化，这些因素包括要达到的反应种类和水平、患者的年龄、体重、总体的健康状况、年龄性别和饮食、给药时间、治疗期、组合的药物以及医学领域中众所周知的类似因素。

作为另一方面，本发明涉及一种制备包含亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸、能够在关节内或局部给药的用于治疗骨关节炎的组合物的方法。作为优选的一个方面，本发明中用于治疗骨关节炎的组合物的制备方法包含：a)通过将碱性添加剂和PEG溶解于水中而制备pH值为11至14的PEG水溶液并将柳氮磺胺吡啶溶解于其中的步骤；b)在步骤a)的产物中溶解透明质酸、其盐或衍生物的步骤；以及c)用酸性添加剂中和步骤b)中制备的产物的步骤。

步骤a)为将可溶性差的柳氮磺胺吡啶亲水化的步骤，也是将柳氮磺胺吡啶与碱性添加剂和聚乙二醇(PEG)反应的步骤。具体而言，作为碱性添加剂，可以使用0.01～1(w/v)％的NaOH、KOH或氨，由此PEG水溶液的pH值变为11以上至14以下。由此，可有效地溶解柳氮磺胺吡啶。当碱性添加剂的浓度超出上述范围时，在以下中和步骤过程中将柳氮磺胺吡啶盐析沉淀。因此，不可能用作液体制剂。对于柳氮磺胺吡啶等的含量，可以原样应用本发明中的组合物的具体用量。同时，通过溶解亲水组分和疏水组分的性质，聚乙二醇使得柳氮磺胺吡啶的增溶作用得到稳定，优选使用重均分子量为400至20000的聚乙二醇，更优选使用PEG400、1500、4000、6000、20000，可以以总组合物的1至40(w/v)％的量使用PEG。

此外，步骤b)为向溶解后的柳氮磺胺吡啶中加入透明质酸并将其混合的步骤。透明质酸的物理性质、形态、大小、含量与本发明的组合物中限定的相同，优选进行无菌处理。加入的透明质酸可以是粉末状或液体溶液，例如可以是粉末状。此外，优选将亲水化柳氮磺胺吡啶和透明质酸在10至40℃下混合3至6小时。当在低于该温度范围下混合时，组合物的组分可能不会均匀混合，并且在超过该温度范围下的混合是不可取的，因为难以制备稳定的制剂。另外，当其混合时间少于该时间范围时，组合物的组分可能不均匀，并且混合超过该时间时，透明质酸的粘度可能会发生变化。

另外，步骤c)为用酸性添加剂中和步骤b)中制备的产物以使pH值达到适于施用于人体的水平的步骤。只要酸性添加剂可调节适当的pH值并且对人体无害，就可以将其毫无限制地作为酸性添加剂使用，例如醋酸、盐酸、磷酸、硫酸、柠檬酸、硝酸和酒石酸，但不限于此。

同时，用于治疗骨关节炎的组合物的制备方法还可以包含加入药学上可接受的添加剂、载体或盐的步骤或用于制备无菌制剂的杀菌步骤。

即使含有高浓度的柳氮磺胺吡啶的制剂在过去对于骨关节炎治疗也是必需的，但由于柳氮磺胺吡啶独有的溶解性差而不能制备高浓度的柳氮磺胺吡啶制剂，上述方法，通过解决该问题，使得本发明人制备了包含浓度足以治疗骨关节炎的柳氮磺胺吡啶的稳定组合物。具体而言，由于在本发明的制备方法中，使用特定浓度的碱性添加剂防止了在中和步骤中通过盐析而沉淀柳氮磺胺吡啶，并且允许稳定的溶解状态，所以可以制备包含高浓度的柳氮磺胺吡啶的制剂。

实施例

在下文中，将通过实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制。

在下文中，将通过实施例对本发明进行更详细的描述。然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不受以下实施例的限制。

实施例1：制备1至8mM的亲水化柳氮磺胺吡啶和1至2(w/v)％的透明质酸的混合组合物

通过以下方法制备包含1、2、4和8mM的亲水化柳氮磺胺吡啶和1至2(w/v)％的透明质酸的组合物。

首先，使用1％的KOH制备pH值为10以上的溶液。之后，向制备的溶液中加入4(w/v)％的PEG6000，然后加入最终浓度为1、2、4、8mM的柳氮磺胺吡啶并搅拌3小时。接下来，将通过搅拌制备的溶液用0.22um的无菌过滤器(Millipore Company Millex-GP)过滤，然后加入最终浓度为1％w/vol(10mg/ml)的透明质酸(Ildong透明质酸Ildong原材料)，并将其搅拌混合。混合4小时后，加入1％的盐酸溶液调节其pH值至7.5，由此制备亲水化柳氮磺胺吡啶与透明质酸的混合组合物(参见图1)。

实施例2：1至6mM的亲水化柳氮磺胺吡啶与1至2(w/v)％的透明质酸的持续释放确认试验

盐水中包含实施例1中制备的混合物，定量从柳氮磺胺吡啶-透明质酸混合物累积释放到盐水中的柳氮磺胺吡啶。结果证实，与透明质酸混合的柳氮磺胺吡啶的释放维持了至少60天以上，这表明柳氮磺胺吡啶是持续释放的(参见图2)。

实施例3：1至8mM的亲水化柳氮磺胺吡啶-透明质酸混合物的体外抗骨关节炎疗效测试

通过来自人体脂肪衍生干细胞(ATCC PCS-500-011)的实时-PCR证实了对炎症和软骨破坏因子(MMP-3、MMP-13、ADMT-5、COX-2)的表达的作用，这些人体脂肪衍生干细胞感染有IL-b，随后对实施例1中制备的混合物进行处理。结果证实炎症和软骨破坏因子的表达得到抑制，抑制水平直接取决于亲水化柳氮磺胺吡啶的浓度。

实施例4：1至8mM的亲水化柳氮磺胺吡啶-透明质酸混合物的体内抗骨关节炎疗效测试

通过对8周龄大鼠(Sprague Dawley)的滑膜处理1mg MIA(谷氨酸钠碘乙酸)诱导骨关节炎动物模型1周后，通过关节内注射施用实施例1中制备的混合物。施用后8周，通过X射线观察实验动物的关节区域。观察结果证实透明质酸的单一制剂对软骨没有任何的保护作用，但与对照组相比，1～4mM的柳氮磺胺吡啶-透明质酸复合物延迟了骨关节炎的发展，6～8mM亲水化柳氮磺胺吡啶-透明质酸复合物完全抑制了骨关节炎的发展。

实施例5：2至8mM的亲水化柳氮磺胺吡啶-透明质酸混合物对骨关节炎症状抑制的动物模型疗效测试

通过与实施例3相同的方法在动物模型中诱发骨关节炎1周后，将盐水、透明质酸(仅HA)的单一制剂、8mM的亲水化柳氮磺胺吡啶溶液(仅8mM SSZ)或实施例1中制备的8mM的亲水化柳氮磺胺吡啶-透明质酸(8mM SSZ-HA)复合物通过关节内注射施用。施用后第4周，每周使用失能测试仪(Linton instrument Co.，UK，Ser No.01/45/25)或等效测量设备分别测量右脚和左脚的重量。当大鼠的腿由MIA发展出骨关节炎时，大鼠立在测试仪的支架上，测试仪倚靠在未经MIA处理的脚上。在大鼠腹部未接触装置的传感器的情况下测量和显示左右腿各自的重量(g)。通过计算右脚与双脚重量的重量比，将实验结果表示为平均(％)±标准误差。

结果表明，单独的柳氮磺胺吡啶没有显示出主要的疼痛控制效果，透明质酸的单一制剂仅在开始时才显示出效果，而8mM的柳氮磺胺吡啶-透明质酸混合物从测试开始到结束显示出了均匀的疼痛控制效果。

Claims (7)

1.一种能够在关节内和局部给药的用于治疗骨关节炎的组合物，其包含2至10mM的用聚乙二醇即PEG亲水化的柳氮磺胺吡啶作为活性成分以及量为总组合物的1～2w/v％的透明质酸、其盐或衍生物，其中，所述透明质酸的衍生物的特征在于，是通过交联而被化学改性的透明质酸，并且基于总组合物，PEG为1至40w/v％。

2.根据权利要求1所述的用于治疗骨关节炎的组合物，其中，所述组合物为液体制剂。

3.根据权利要求1所述的用于治疗骨关节炎的组合物，其中，所述组合物为可注射制剂。

4.一种能够在关节内和局部给药的用于治疗骨关节炎的组合物的制备方法，其包括：

a)通过将碱性添加剂和聚乙二醇即PEG溶解于水中而制备pH值为11以上至14以下的水溶液，并将柳氮磺胺吡啶溶解于该水溶液中的步骤；

b)在步骤a)的产物中溶解透明质酸、其盐或衍生物的步骤，其中，所述透明质酸的衍生物是通过交联而被化学改性的透明质酸；以及

c)用酸性添加剂中和步骤b)中制备的产物的步骤，其中，所述组合物包含2至10mM的用聚乙二醇亲水化的柳氮磺胺吡啶以及量为总组合物的1～2w/v％的透明质酸、其盐或衍生物，

其中，所述透明质酸的衍生物的特征在于，是通过交联而被化学改性的透明质酸，并且基于总组合物，PEG为1至40w/v％。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述碱性添加剂为选自由0.01～1w/v％的氢氧化钠、氢氧化钾和氨组成的组中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，PEG的平均分子量为400至20000。

7.一种能够在关节内和局部给药的用于治疗骨关节炎的组合物，其是通过权利要求4～6中任一项所述的方法制备的。

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