CN108424769A - 一种生物成像用碳点的绿色制备方法 - Google Patents

Abstract

碳点是一种新型荧光材料，光稳定性高、生物相容性好，在生物成像等领域有极大的应用潜力，然而现有制备方法复杂、能量消耗高或需要危险性较大的化学试剂，导致碳点难于大量制备和应用。本发明是为了解决上述缺点而提出的碳点绿色制备方法，大大简化了碳点制备方法，从根本上保证碳点的低毒性和良好的生物相容性，更适用于生物成像。该方法包括：(一)原料的准备：选择富含酚类物质的原料，大块原料应进行粉碎筛分。(二)酚类物质的提取：将准备好的原料，通过溶剂提取获得酚类物质的溶液。(三)碳点分离：将酚类溶液用离心、透析等物理方法进行分离，获得碳点分散液。再经减压干燥后，以生理盐水等分散，即可用于生物成像。

Description

一种生物成像用碳点的绿色制备方法

技术领域

本发明属于碳量子点技术领域，涉及生物成像用碳点的制备方法。

背景技术

生物成像是细胞生物学和生物研究发展奠基石，而其中的荧光材料起到至关重要的作用。传统的荧光材料如有机染料、半导体量子点等大多毒性较大、生物相容性差。近几年，一种以碳元素为主要元素、直径小于10nm的新型荧光材料——碳点因其光稳定性高、生物相容性好等优异特性，在生物成像、生物传感器领域展现出极大的应用潜力，受到了广泛关注。

碳点又称碳量子点，是单分散的、几何形状近乎准球形的一种新兴的碳纳米功能材料。碳量子点具有独特的光学性质，受激发可发出荧光。相对于半导体量子点和有机染料，碳点粒径小、水溶性好、光稳定性高。特别是，碳点的组成大部分是碳元素，其余多是氧元素和氢元素，毒性低，生物相容性好。除了正常的下转换荧光性质，碳量子点还可能具有上转换荧光性质，在近红外光激发下产生荧光，这对于活体标记的应用有重大意义。

目前，常见的制备方法大致分为物理和化学两类。物理法有电弧放电、激光消融法；化学法主要有电化学法、微波法、溶剂热法、燃烧法、微乳液法、溶胶-凝胶法等。这里所说的物理法只是使用的是物理的手段，实质上发生了明显的化学变化。原料方面，相比石油、矿产资源的日益枯竭，生物质资源储量大、绿色可再生，研究热点向生物质资源靠近，蔗糖、淀粉、明胶、木瓜等被用于制备碳点。为了让这些物质具有荧光性质，必须要经历芳构化才能够形成共轭体系，以吸收激发光、释放荧光；需要有羟基、烷氧基等给电子基团，提高荧光性能。此外，为了提高水溶性，还需要有较多的羟基等强极性官能团。

总之，现有的制备方法复杂，制备过程中或者需要较高的能量消耗、或者需要危险性较大的化学试剂，导致碳点难于大量制备和应用。而自然界中广泛存在的酚类物质不但具有吸收激发光、释放荧光的芳环共轭体系，还拥有大量的羟基、烷氧基等给电子基团，本身具有荧光性质，通过π-π堆积作用能够形成颗粒，经过离心、透析等物理的分离手段，即可获得碳点分散液。再经减压干燥后，以生理盐水等分散，即可用于生物成像。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的碳点制备方法上述缺点而提出的碳点绿色制备方法，不仅大大简化了碳点的制备方法，还从根本上保证了碳点的低毒性和良好的生物相容性，使其更适用于生物成像等生命领域。

该生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征是它通过以下步骤实现：(一)原料的准备：选择原料应富含酚类物质，大块原料应进行粉碎筛分。(二)酚类物质的提取：将准备好的原料，通过溶剂提取方法提取其中的酚类物质。(三)碳点分离：将酚类溶液用离心、透析等物理方法进行分离，获得碳点分散液。其中的原料应富含酚类物质，如茶叶、落叶松树皮、咖啡壳、葡萄籽、黑荆树树皮等；为缩短提取时间，大块原料应进行粉碎筛分，提取所用原料颗粒直径应小于2.0厘米，优选粒度为20目-200目；酚类物质的提取溶剂为稀碱液、水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等极性溶剂中的一种或多种混合，优选为乙醇；当采用稀碱液提取时，需要进行酸中和、沉淀，取沉淀减压干燥，再以上述其他溶剂溶解；碳点分离时，采用离心方法除去大颗粒物质、或用透析的方法获得碳点，也可以两种方法并用；采用离心方法除去颗粒较大物质时，离心转速一般应大于3000转/分钟，优选大于10000的转/分钟；采用透析的方法获得碳点，透析膜截留分子量不大于30万道尔顿，优选为8000～14000道尔顿；透析膜外液体即为碳点分散液。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、酚类物质广泛存在于自然界，包括黄酮类、单宁类、酚酸类等。酚类物质固有的苯环结构符合共轭体系的要求，无需碳水化合物的脱水、炭化、芳构化过程，就能够吸收激发光并释放荧光，并且羟基、烷氧基等供电子基的存在会增强荧光，从而使碳量子点的制备过程大大简化。

2、碳点制备过程简单、操作方便、无污染，不涉及化学反应，仅通过溶剂提取、在溶液中π-π堆积作用能够形成颗粒、离心或透析分离，获得碳点分散液，所有操作均为绿色的物理分离步骤，确保产物碳点的低毒性和生物相容性。

附图说明

图1为咖啡壳粉末原料经碱溶酸沉精制后，以水-甲醇(1:1，v/v)混合溶剂溶解分散，经8000Da透析袋透析24小时所获得液体样品的荧光发射和激发光谱。样品以波长为380nm的紫外光激发，获得了较强的荧光，发射峰位置位于320nm。图中左侧曲线为样品的荧光激发光谱(发射光位于320nm)，右侧曲线为样品的发射光谱(激发光位于380nm)。

图2为咖啡壳粉末原料碱溶酸沉精制后，以水-甲醇(1:1，v/v)混合溶剂溶解分散，经过8000Da的透析袋透析后所获得液体样品的透射电镜图。碳点粒径约2.0纳米。

图3为该碳点和DAPI用于Hela细胞荧光标记后的激光扫描共聚焦显微镜观察图片。图中a、d为DAPI标记，b、e为碳点标记，c、f为两者叠加；a、b、c为处理0.5h，d、e、f为处理1h。图中比例尺为50μm。

具体实施方式

具体实施方式一：称取80目咖啡壳粉末1g，以100mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡提取，过滤，取滤液，用0.5mol/L的盐酸溶液调节pH至2～3，静置沉淀，过滤并以蒸馏水洗涤沉淀，将沉淀在40℃、绝对压力0.01Mpa下干燥24小时，然后以100mL水-甲醇(1:1，v/v)混合溶液溶解分散，以12000转/分钟的速度离心分离30分钟，取上清液，再以8000Da透析袋透析24小时，截留粒径较大的粒子，透析袋外液体即为碳点分散液。

具体实施方式二：称取40目落叶松树皮粉末1g，以100mL甲醇浸泡提取，以10000转/分钟的速度离心分离20分钟，取上清液，再以8000Da透析袋透析12小时，即获得碳点分散液。

具体实施方式三：称取红茶1g，以100mL水通过微波辅助提取后，以5000转/分钟的速度离心15分钟，即获得碳点分散液。

具体实施方式四：称取120目葡萄籽粉末1g，经溶剂提取精制后，以100mL 50％乙醇水溶液超声辅助提取，提取液经8000Da透析袋透析24小时，即获得碳点分散液。

具体实施方式五：称取20目黑荆树树皮皮粉末100g，经溶剂提取精制后，以1000mL丙酮加热回流提取，提取液经8000Da透析袋透析10小时，即获得碳点分散液。

Claims (8)

1.一种生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征是它通过以下步骤实现：(一)原料的准备：选择原料应富含酚类物质，大块原料应进行粉碎筛分。(二)酚类物质的提取：将准备好的原料，通过溶剂提取方法提取其中的酚类物质。(三)碳点分离：将酚类溶液用离心、透析等物理方法进行分离，获得碳点分散液。

2.根据权利要求1所述生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征在于步骤(一)中的原料应富含酚类物质，如茶叶、落叶松树皮、咖啡壳、葡萄籽、黑荆树树皮等。

3.根据权利要求1所述生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征在于步骤(一)中的大块原料应进行粉碎筛分，为缩短提取时间，提取所用原料颗粒直径应小于2.0厘米，优选粒度为20目-200目。

4.根据权利要求1所述生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征在于步骤(一)中的提取方法可采用超声波辅助提取、微波提取、索氏提取、渗漉法、回流法、浸泡法提取等。

5.根据权利要求1所述生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征在于步骤(二)中酚类物质的提取，其中溶剂为稀碱液、水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等极性溶剂中的一种或多种混合，优选为乙醇。当采用稀碱液提取时，需要进行酸中和、沉淀，取沉淀减压干燥，再以上述其他溶剂溶解。

6.根据权利要求1所述生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征在于步骤(三)碳点的分离，采用离心方法除去大颗粒物质、或用透析的方法获得碳点，也可以两种方法并用。

7.根据权利要求1所述生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征在于权利要求5中采用离心方法除去颗粒较大物质，离心转速一般应大于3000转/分钟，优选大于10000的转/分钟。

8.根据权利要求1所述生物成像用碳点的绿色制备方法，其特征在于权利要求5中采用透析的方法获得碳点，透析膜截留分子量不大于30万道尔顿，优选为8000～14000道尔顿。