CN108420922A - 抗罗非鱼链球菌病中草药制剂及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗罗非鱼链球菌病中草药制剂及其制备工艺，该中草药制剂由以下重量份的原料药制成：黄芩10～25份、连翘10～25份、大黄10～25份、黄药子10～25份。该制备工艺为：按上述配方量称取原料药，加入原料药总重量的20倍的蒸馏水进行100℃水浴3次，每次1h，醇沉浓度60％，浓缩即得。该中草药制剂具有清热解毒、抗菌、抗应激、调节机体免疫力的作用，能有效提高罗非鱼机体抗病能力，同时其药物残留低，不会造成药物残留超标，不会使病菌产生耐药性；同时本发明的制备工艺能有效提高抗罗非鱼链球菌病中草药制剂的有效成分含量，从而提高药效，制备工艺简单，节约成本。

Description

抗罗非鱼链球菌病中草药制剂及其制备工艺

技术领域

本发明属于抗罗非鱼链球菌病的防治技术领域，特别是一种抗罗非鱼链球菌病中草药制剂及其制备工艺。

背景技术

罗非鱼链球菌病是一种由海豚链球菌和无乳链球菌为主要病原体引发的细菌性传染疾病。一般暴发于夏秋之季。温度、含氧量、氨含量等不利环境因素以及饲养条件恶劣、养殖过密等应激条件均为链球菌的感染流行创造了有利条件。传统治疗方法是在饲料中添加抗生素，长期应用该类药物不仅会给生态环境造成污染，还会导致药源性疾病和药物残留，使致病菌产生耐药性，防治效果不佳，既增加养殖成本，又造成药物残留超标。因此，在罗非鱼的养殖生产中应尽量减少抗菌药物的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种抗罗非鱼链球菌病中草药制剂，该中草药制剂具有清热解毒、抗菌、抗应激、调节机体免疫力的作用，能有效提高罗非鱼机体抗病能力，同时其药物残留低，不会造成药物残留超标，不会使病菌产生耐药性，从而提高了罗非鱼链球菌病的防治效果。同时本发明提供了一种最佳的抗罗非鱼链球菌病中草药制剂制备工艺，能有效提高抗罗非鱼链球菌病中草药制剂的有效成分含量，从而提高了药效，制备工艺简单，节约成本。

本发明所要解决的技术问题通过如下技术方案实现：

一种抗罗非鱼链球菌病中草药制剂，由以下重量份的原料药制成：黄芩10～25份、连翘10～25份、大黄10～25份、黄药子10～25份。

一种抗罗非鱼链球菌病中草药制剂制备工艺，具体步骤如下：

S1.按照如下配比称取原料药：黄芩10～25份、连翘10～25份、大黄10～25份、黄药子10～25份；

S2.向步骤S1称取的原料药加入原料药总重量的20倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1h，过滤，分别得到滤液和滤渣；

S3.向步骤S2得到的滤渣加入原料药总重量的20倍的蒸馏水，100℃水浴1h，过滤，分别得到滤液和滤渣；

S4.向步骤S3得到的滤渣加入原料药总重量的20倍的蒸馏水，100℃水浴1h，过滤，保留滤液；

S5.将三次过滤所得滤液合并得到总滤液，然后3000r/min离心30min，取上清液浓缩至总滤液体积的1/10；然后加入浓度为95％的酒精至混合液中酒精浓度为60％，静置24h，取上清液浓缩至总滤液体积的1/30，制得抗罗非鱼链球菌病中草药制剂。

本发明具有以下有益效果：

1、黄芩是临床上常用药物，在许多方剂中均有配伍，主要配伍意义表现在清热燥湿、清肠止痢、泻火解毒等方面。黄芩配伍连翘，主清热解毒，治热毒疮疡。大黄配伍黄芩，主清热泻火，治湿热腹痛，泄泻，咯血等热伤血络证。黄芩、连翘、大黄和黄药子对链球菌、葡萄球菌和肺炎球菌等病原微生物具有较强的抑制作用，将四者按特定的配比组合复配，可发挥良好的抗病毒、抗细菌、清热泻火解毒、消炎镇痛等功效。

2、本发明以复方中草药提取液中黄芩苷、连翘苷、大黄素含量和浸膏得率为评价指标，用正交试验设计优选了复方中草药组方提取的条件，最终得出的最优提取工艺为：按处方量称取药材，加20倍量水进行水浴3次，每次1小时，醇沉浓度为60％。原有工艺中黄芩苷、连翘苷和大黄素的含量分别为4.70mg/mL、1.32mg/mL和20.49μg/mL，经过抗罗非鱼链球菌病中草药制剂制备工艺优化后，黄芩苷、连翘苷和大黄素的含量分别升至7.34mg/mL、3.39mg/mL和32.90μg/mL，有效地提高了抗罗非鱼链球菌病中草药制剂的有效成分黄芩苷、连翘苷和大黄素的含量。

3、本发明制备的抗罗非鱼链球菌病中草药制剂，提高了药效，能在一定程度上降低罗非鱼的死亡率。实验中120mg/kg剂量的抗罗非鱼链球菌病中草药制剂给药组较感染不给药组显著降低至40.00％，药物有效率达60％，说明投喂120mg/kg剂量的抗罗非鱼链球菌病中草药制剂对罗非鱼链球菌病有良好的效果，满足市场需求。

附图说明

图1是黄芩苷对照品色谱图。

图2是连翘苷对照品色谱图。

图3是大黄素对照品色谱图。

图4是抗罗非鱼链球菌病中草药制剂色谱图。

具体实施方式

实施例1

抗罗非鱼链球菌病中草药制剂提取工艺条件的优选在保证药材批次、浓缩、过滤等条件一致的情况下，以加水量倍数、水浴时间、水浴次数与醇沉浓度为主要考察因素，设定考察水平表，并用正交试验设计法设计了抗罗非鱼链球菌病中草药制剂提取的条件，分别用高效液相色谱法、恒重测定法测定黄芩苷、连翘苷、大黄素含量和浸膏得率，数据进行方差分析。将黄芩苷、连翘苷、大黄素作为指标，正交试验设计如表1所示。

表1正交因素水平L₉(3⁴)表

表2三黄连合剂提取工艺正交试验分析结果

实施例2

专属性试验精密称定黄芩苷对照品30mg置于10mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀，当做储备液(3mg/mL)，再准确移取2.5mL储备液至10mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀，即得黄芩苷对照品溶液(750μg/mL)。精密称定连翘苷对照品24mg置于10mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀，当做储备液(2.4mg/mL)，再准确移取6.25mL储备液至100mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀，即得连翘苷对照品溶液(150μg/mL)。精密称定大黄素对照品10mg置于10mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀，当做储备液(1mg/mL)，再准确移取1mL储备液至10mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀，即得大黄素对照品溶液(100μg/mL)。利用高效液相色谱法测定实施例1中按表2制备所得煎煮药液9份，在色谱条件下：PhenomenexLuna C18色谱柱(250mm*4.60mm*5μm)，流动相甲醇(A)：0.3％磷酸(B)梯度洗脱(0～30min，39％A；30～32min，39％～82％A；32～50min，82％A)；检测波长280nm，柱温30℃，流速1mL/min；进样量为10μL测定，结果见图1-图4。

如图，连翘苷保留时间为21.2min，各峰分离度大于1.5，理论塔板数大于3000。黄芩苷保留时间为29.7min，各峰分离度大于1.5，理论塔板数大于2500。大黄素保留时间为42.5min，各峰分离度大于1.5，理论塔板数大于3000。供试样品相同的保留时间处无杂峰干扰。

实施例3

精密度试验精密移取实施例2项下黄芩苷、连翘苷对照品溶液用甲醇稀释成各600μg/mL的溶液，精密移取大黄素对照品溶液制备成300μg/mL的溶液，将三者等量混合，即制成含黄芩苷200μg/mL、连翘苷200μg/mL、大黄素100μg/mL的混合对照品溶液。将混合对照品溶液以10μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件连续进样6次，测定黄芩苷、连翘苷和大黄素峰面积，黄芩苷、连翘苷和大黄素的RSD分别为0.10％、0.31％、0.13％，精密度符合兽药典要求。

实施例4

稳定性试验将实施例1中按表2制备所得煎煮药液9份于室温下放置，分别在0、2、4、6、8、10、12h进样10μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件测定黄芩苷、连翘苷和大黄素峰面积，黄芩苷、连翘苷和大黄素的RSD分别为0.21％、0.96％、0.90％，说明成分在12h内稳定。

实施例5

重复性试验将实施例1中按表2制备所得煎煮药液9份，分别以10μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件测定黄芩苷、连翘苷和大黄素峰面积，黄芩苷、连翘苷和大黄素的RSD分别为0.62％、1.34％、1.30％，表明测定方法的重复性好。

实施例6

加样回收率试验将实施例1中按表2制备所得煎煮药液9份，分别取1 mL置于10mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀。取稀释后的药液1 mL，分别加入750μg/mL黄芩苷对照品溶液1 mL之后混匀，将所得溶液各进样10μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件测定黄芩苷峰面积，计算回收率。平均回收率为98.75％，RSD为0.71％。

将实施例1中按表2制备所得煎煮药液9份，分别取1 mL置于10mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀。取稀释后的药液1 mL，分别加入300μg/mL连翘苷对照品溶液1 mL之后混匀，将所得溶液各进样10μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件测定连翘苷峰面积，计算回收率。平均回收率为98.53％，RSD为0.53％。

将实施例1中按表2制备所得煎煮药液9份，分别取1mL置于10mL量瓶中并用甲醇定容至刻度，摇匀。取稀释后的药液1mL，分别加入3.125μg/mL大黄素对照品溶液1mL之后混匀，将所得溶液各进样10μL注入液相色谱仪，按实施例2所述色谱条件测定大黄素峰面积，计算回收率。平均回收率为98.28％，RSD为0.90％。

实施例7

黄芩苷线性关系的考察精密移取实施例2项下黄芩苷对照品溶液制备成3000、1500、750、375、187.5、93.75、46.88μg/mL系列溶液，用0.45μm滤膜过滤，分别进样10μL按实施例2所述色谱条件检测，以峰面积(A)为纵坐标，以对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标进行回归分析。得回归方程为Y＝32065.9X+993326.2 R²＝0.999黄芩苷在46.88μg/mL～3000μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

连翘苷线性关系的考察精密移取实施例2项下连翘苷对照品溶液制备成2400、1200、600、300、150、75、37.5μg/mL系列溶液，用0.45μm滤膜过滤，分别进样10μL按实施例2所述色谱条件检测，以峰面积(A)为纵坐标，以对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标进行回归分析。得回归方程为Y＝6194.2X+146175R²＝0.9992连翘苷在37.5μg/mL～2400μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

大黄素线性关系的考察精密移取实施例2项下大黄素对照品溶液制备成100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563μg/mL系列溶液，用0.45μm滤膜过滤，分别进样10μL按实施例2所述色谱条件检测，以峰面积(A)为纵坐标，以对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标进行回归分析。得回归方程为Y＝47700.4X-12924.8R2＝0.9999大黄素在1.563μg/mL～100μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

实施例8

方差分析列出方差分析表，进行F检验。方差分析表见表3-表5。

表3黄芩苷方差分析

表4连翘苷方差分析

表5大黄素方差分析

结果表明，在所选因素水平范围内，其影响因素大小顺序为C(水浴次数)＞A(加水量倍数)＞B(水浴时间)。以极差最小的D因素为误差项进行方差估算，方差分析表明，在所选因素内，水浴次数对黄芩苷、连翘苷和大黄素的提取率影响最大，加水量倍数次之，具有显著性(P＜0.05)，其它因素影响不显著。结合实际生产以及节约能源等因素综合考虑，最终得出最优的提取工艺为A₃B₂C₃D₁：按处方量称取药材，加20倍量水进行水浴3次，每次1小时，醇沉浓度为60％。

实施例9

验证试验用实施例8项下确定的最优生产工艺条件制备样品：

按照如下配方量称取原料药50g：黄芩10～25份、连翘10～25份、大黄10～25份、黄药子10～25份；向原料药加入1000mL蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1h，过滤，分别得到滤液和滤渣；向所得滤渣加入1000mL蒸馏水，100℃水浴1h，过滤，分别得到滤液和滤渣；向所得滤渣加入1000mL蒸馏水，100℃水浴1h，过滤，保留滤液；将三次过滤所得滤液合并得到总滤液，然后3000r/min离心30min，取上清液于旋转蒸发仪浓缩至300mL；然后加入浓度为95％的酒精至混合液中酒精浓度为60％，静置24h，取上清液于旋转蒸发仪回收酒精，浓缩至100mL，制得抗罗非鱼链球菌病中草药制剂。

根据实施例1检测样品中黄芩苷、连翘苷、大黄素含量，结果见表6。

表6抗罗非鱼链球菌病中草药制剂制备工艺验证结果

原有工艺中黄芩苷、连翘苷和大黄素的含量分别为4.70mg/mL、1.32mg/mL和20.49μg/mL，经过抗罗非鱼链球菌病中草药制剂制备工艺优化后，黄芩苷、连翘苷和大黄素的含量分别升至7.34mg/mL、3.39mg/mL和32.90μg/mL。可见，采用本发明能有效提高抗罗非鱼链球菌病中草药制剂有效成分的含量，据此优选出了最佳提取条件为按配方量称取药材，加20倍量水进行水浴3次，每次1小时，醇沉浓度为60％，为今后规模化制备抗罗非鱼链球菌病中草药制剂提供了很好的工艺路线，可有效的提高其制剂的药效，降低成本，有利于抗罗非鱼链球菌病中草药制剂的研发，满足市场需求。

实施例10

取暂养7天后的吉富罗非鱼180尾，分为空白对照组、感染不给药组、30mg/kg剂量给药组、60mg/kg剂量给药组、120mg/kg剂量给药组、氟苯尼考对照组共6个组。每组30尾。

试验开始前一天禁食24h，试验第一天早上空白对照组与感染不给药组均饲喂不加药的基础料。30mg/kg剂量给药组、60mg/kg剂量给药组、120mg/kg剂量给药组分别饲喂含相应剂量抗罗非鱼链球菌病中草药制剂添加饲料。氟苯尼考对照组饲喂0.05g/kg的含药饲料。3小时后，空白对照组均腹腔注射0.2mL的PBS缓冲液，其他5组均腹腔注射浓度为1.5×10⁹CFU/mL的菌液0.2mL/尾。试验期间，早中晚各饲喂一次，连续7天。观察感染无乳练球菌的罗非鱼的发病情况，每天统计各实验组罗非鱼的死亡情况。死亡罗非鱼在无菌条件下，采取其脑组织、肝脏组织、腹腔积液接种于血平板观察有无链球菌菌落生长，确定死亡原因。

采取罗非鱼脑组织、肝胰脏、腹腔积液接种于血平板进行培养鉴定，各组织中均发现有菌落生长。菌落表面湿润，灰白色，有光泽，菌落较小，如针尖样大小，突起。在培养基上可见形成β溶血圈，挑取单一菌落进行涂片吉姆萨染色后镜检可见单个、成双、链状排列、长短不一的细菌。镜检结果与无乳链球菌相似，呈革兰氏阳性链球菌。

挑取单个菌落，接种于BHI培养基进行扩大培养，抽提细菌DNA，PCR扩增后测序，序列经Blast比对确定为无乳链球菌，证实罗非鱼成功感染无乳链球菌。

表8抗罗非鱼链球菌病中草药制剂治疗效果

注：a表示给药组与感染不给药组相比差异显著(P＜0.05)；A表示给药组与感染不给药组相比差异极显著(P＜0.01)；B表示感染不给药组与空白对照组相比差异极显著(P＜0.01)。

结果表明，空白对照组的吉富罗非鱼无死亡，死亡率为0。感染不给药组的死亡数量最多，死亡率为66.67％。氟苯尼考对照组的死亡率为60％，有效率为40％；与感染不给药组的死亡率相比，给药组均能在一定程度上降低吉富罗非鱼的死亡率。在给药组中，死亡率最低的是120mg/kg剂量的中药制剂给药组，该组死亡率显著低于感染不给药40.00％(P＜0.05)，说明投喂120mg/kg剂量的中药制剂能有效降低吉富罗非鱼的死亡率，并且该组的有效率最高，达到60％。

Claims (2)

1.一种抗罗非鱼链球菌病中草药制剂，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：黄芩10～25份、连翘10～25份、大黄10～25份、黄药子10～25份。

2.一种抗罗非鱼链球菌病中草药制剂制备工艺，其特征在于，具体步骤如下：

S1.按照如下配比称取原料药：黄芩10～25份、连翘10～25份、大黄10～25份、黄药子10～25份；

S2.向步骤S1称取的原料药加入原料药总重量的20倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1h，过滤，分别得到滤液和滤渣；

S3.向步骤S2得到的滤渣加入原料药总重量的20倍的蒸馏水，100℃水浴1h，过滤，分别得到滤液和滤渣；

S4.向步骤S3得到的滤渣加入原料药总重量的20倍的蒸馏水，100℃水浴1h，过滤，保留滤液；

S5.将三次过滤所得滤液合并得到总滤液，然后3000r/min离心30min，取上清液浓缩至总滤液体积的1/10；然后加入浓度为95％的酒精至混合液中酒精浓度为60％，静置24h，取上清液浓缩至总滤液体积的1/30，制得抗罗非鱼链球菌病中草药制剂。