CN108410027B - 一种纳米石墨烯凝胶材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物纳米材料及生物医用领域，具体涉及一种纳米石墨烯凝胶材料及其制备方法和应用。本发明公开了一种纳米石墨烯凝胶材料及其制备方法，主要包括：将需要粉碎原料粉碎后，把粉碎后的纳米石墨烯与聚乙二醇、β‑环糊精进行超声、混匀，然后再向其加入海藻酸、丙二醇、乙基纤维素，磁力搅拌、分散均匀后移入振荡器摇床中振荡一定时间，即形成纳米石墨烯凝胶溶液；本发明制备方法简单、绿色环保，不会产生“三废”，成本低、耗时少。本发明还公开了所述的纳米石墨烯凝胶在提取血清中外泌体的应用，采用本发明所述的纳米石墨烯凝胶提取的人体血清中外泌体得率高、纯度高，而且成本低廉，便于下一步的实验研究。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米材料及生物医用领域，具体涉及一种纳米石墨烯凝胶材料及其制备方法和应用。
背景技术
石墨烯(Graphene)是从石墨材料中剥离出来、由碳原子组成的只有一层原子厚度的二维晶体。石墨烯既是最薄的材料，也是最强韧的材料，断裂强度比最好的钢材还要高200倍，同时它又有很好的弹性，拉伸幅度能达到自身尺寸的20％。石墨烯及其衍生物已被广泛用于制储能材料、环境吸附材料、能量转换材料、催化材料及医学材料等领域。但因石墨烯的二维平面结构，其在干燥和材料处理过程中极易发生团聚和片层间的再堆积现象，从而大大降低石墨烯的比表面积，不利于石墨烯材料在新型领域中的应用。然而，石墨烯凝胶是一种三维多孔状宏观石墨烯结构体，具有密度小、比表面积大、导电性能好等优点，其在电学、环保、生物医药等领域都存在巨大的应用潜能。由于凝胶自身具有的特殊独特性能，凝胶的应用在生物医药领域越来越受到重视，尤其是在仿生生物材料的制备和生物药物的提取与释放两个领域。石墨烯纳米凝胶是一种多空疏松材料，并且表面带有大量的含氧基团，它可以与生物体中含有嘌呤类的物质在静电力和吸附作用相结合，并在一定条件下再进行脱附，从而可以用来提取生物体中的某些物质。目前，合成石墨烯凝胶的方法主要有化学气相沉积法、模板法、水热或溶剂热法、冷冻干燥法及超临界干燥法。化学气相沉积法和模板法合成过程相对复杂且耗时耗能，难以大规模合成石墨烯气凝胶；水热或溶剂热法受限于反应容器的限制，难以合成大尺寸的水凝胶，而且整个过程比较耗时；冷冻干燥法和超临界干燥法，虽然该法能够制得大尺寸凝胶，但干燥过程耗时长、成本高。所以探究一种工艺过程简单、成本低、耗时少的石墨烯凝胶合成方法是非常有必要的。
外泌体是一种直径为30-150nm包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡,是由活细胞选择性包装并释放，在人体液中含量丰富。外泌体内含有种类不同的脂质、核酸以及蛋白质等，这些物质能够随体液运输到特定的靶器官以及相关的靶细胞，从而发挥其相应的生物学功能。相关的研究也已经表明，外泌体在细胞间通讯以及生理和病理过程中均发挥着巨大的作用，例如其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面，所以从人体液中提取出外泌体，用来研究其在细胞间通讯以及生理和病理过程中发挥的作用显得越来越重要。到目前为止，外泌体的提取主要包括以下几种方法：超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、试剂盒法和色谱法。但是每种方法都会存在一定的不足，超速离心法所获得的外泌体量多，但是纯度较低；过滤离心操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题；密度梯度离心法虽然获得的外泌体纯度较高，但是获得的量较少且前期准备工作繁杂、耗时；免疫磁珠法可以保证获得的外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验和应用；试剂盒法外泌体的得率高，但是其共同点是外泌体的纯度太低，在获取外泌体的同时，也会得到许多血清中高丰度的蛋白质；色谱法分离得到的外泌体在电镜下观察大小均一，但是需要特殊的设备才能达到，应用范围不广泛。
发明内容
针对现有问题中存在的不足，本发明的目的是提供一种纳米石墨烯凝胶材料及其制备方法和应用。
本发明的纳米石墨烯凝胶材料，主要包括以下重量份的成分：纳米石墨烯材料35-80份、β-环糊精15-35份、聚乙二醇10-30份、海藻酸20-45份、丙二醇12-28份、乙基纤维素18-35份。
优选为，纳米石墨烯材料40-70份、β-环糊精18-28份、聚乙二醇14-22份、海藻酸26-35、丙二醇15-25份、乙基纤维素22-30份。
进一步优选为，纳米石墨烯材料48-62份、β-环糊精20-25份、聚乙二醇16-20份、海藻酸28-33份、丙二醇18-22份、乙基纤维素24-29份。
所述纳米石墨烯的粒径为20-200nm；优选50-150nm；进一步优选60-100nm。
所述聚乙二醇分子量为800-20000道尔顿，优选聚乙二醇分子量为2000-20000道尔顿；进一步优选聚乙二醇分子量为8000-20000道尔顿。
本发明所述的纳米石墨烯凝胶材料的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)按照重量份分别称取上述原料：纳米石墨烯、β-环糊精、聚乙二醇、海藻酸、丙二醇、乙基纤维素，并将石墨烯和其他需要粉碎的原料用进行粉碎；
(2)向步骤(1)中已粉碎的石墨烯中加入一定量的去离子水，放入超声波清洗仪中进行超声，待石墨烯均匀分散于去离子水中，再向其中加入聚乙二醇和β-环糊精，此时边超声边用玻璃棒搅拌，直至聚乙二醇和β-环糊精均匀分散；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入海藻酸、丙二醇、乙基纤维素，然后从超声仪中取出后放在磁力搅拌器上进行加热搅拌，直至海藻酸、丙二醇、乙基纤维素完全溶解分散，将其移入恒温振荡器摇床中，振荡一定时间，即形成纳米石墨烯凝胶溶液。
所述步骤(2)中加入去离子水的用量为石墨烯的20-50倍。
所述步骤(2)超声的功率为60-100W，超声温度为45-60℃，超声时间为5-12h。
所述步骤(3)中磁力搅拌的速率为300-650r/min，磁力搅拌温度为30-50℃，磁力搅拌时间为2.5-4h。
所述步骤(3)中振荡器摇床的工作频率为120-300r/min,振荡时间为3.5-6h。
本发明所述的纳米石墨烯凝胶材料在提取血清中外泌体的应用。
本发明的有益效果在于：(1)采用本发明方法合成的纳米石墨烯凝胶，大小尺寸均匀、生物学活性高；(2)本发明的合成方法具有简单、绿色环保，不会产生“三废”，成本低、耗时少等优点；(3)利用本发明合成的纳米石墨烯凝胶来提取人体血清中的外泌体得率高、纯度高，而且成本低廉，便于下一步的实验研究
附图说明
图1为纳米石墨烯凝胶的SEM图。
图2为纳米石墨烯凝胶的TEM图。
图3为振荡后形成的纳米石墨烯凝胶。
具体实施方式
下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但这些实例并不限制本发明的范围。
实施例1
称取7.5g粒径为30nm石墨烯、3.2gβ-环糊精、2.7g聚乙二醇、4.0g海藻酸、1.4g丙二醇、2.0g乙基纤维素，石墨烯用球磨机将其粉碎，其他需要粉碎的原料分别用搅拌机粉碎；将粉碎后的石墨烯粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入150g去离子水，放入超声波清洗仪中进行超声，超声功率为60W，超声温度为45℃，待石墨烯完全均匀分散于去离子水中，向其中加入β-环糊精和聚乙二醇，此时边加入边用玻璃棒搅拌，继续超声，直至β-环糊精和聚乙二醇完全分散于石墨烯水溶液中，超声6h后再向其中加入海藻酸、丙二醇和乙基纤维素，从超声波清洗仪中移出烧杯放在磁力搅拌器上进行加热搅拌，搅拌速率350r/min，加热温度为35℃，搅拌2.5h，直至海藻酸、丙二醇和乙基纤维素完全溶解分散，将其移入恒温振荡器摇床中，在150r/min频率下振荡4h，即形成纳米石墨烯凝胶溶液。
实施例2
称取6.0g粒径为50nm石墨烯、2.4gβ-环糊精、1.5g聚乙二醇、2.7g海藻酸、2.3g丙二醇、2.6g乙基纤维素，石墨烯用球磨机将其粉碎，其他需要粉碎的原料分别用搅拌机粉碎；将粉碎后的石墨烯粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入240g去离子水，放入超声波清洗仪中进行超声，超声功率为80W，超声温度为52℃，待石墨烯完全均匀分散于去离子水中，向其中加入β-环糊精和聚乙二醇，此时边加入边用玻璃棒搅拌，继续超声，直至β-环糊精和聚乙二醇完全分散于石墨烯水溶液中，超声8.5h后再向其中加入海藻酸、丙二醇和乙基纤维素，从超声波清洗仪中移出烧杯放在磁力搅拌器上进行加热搅拌，搅拌速率450r/min，加热温度为40℃，搅拌3h，直至海藻酸、丙二醇和乙基纤维素完全溶解分散，将其移入恒温振荡器摇床中，在200r/min频率下振荡5h，即形成纳米石墨烯凝胶溶液。
实施例3
称取5.0g粒径为80nm石墨烯、2.2gβ-环糊精、1.8g聚乙二醇、3.0g海藻酸、2.0g丙二醇、2.5g乙基纤维素，石墨烯用球磨机将其粉碎，其他需要粉碎的原料分别用搅拌机粉碎；将粉碎后的石墨烯粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入250g去离子水，放入超声波清洗仪中进行超声，超声功率为90W，超声温度为58℃，待石墨烯完全均匀分散于去离子水中，向其中加入β-环糊精和聚乙二醇，此时边加入边用玻璃棒搅拌，继续超声，直至β-环糊精和聚乙二醇完全分散于石墨烯水溶液中，超声10h后再向其中加入海藻酸、丙二醇和乙基纤维素，从超声波清洗仪中移出烧杯放在磁力搅拌器上进行加热搅拌，搅拌速率550r/min，加热温度为48℃，搅拌4h，直至海藻酸、丙二醇和乙基纤维素完全溶解分散，将其移入恒温振荡器摇床中，在280r/min频率下振荡6h，即形成纳米石墨烯凝胶溶液。
实施例4
冰箱中取人体血清样本，在25℃、无菌条件下解冻，取2ml解冻后的血清样本，8℃，2000g，离心20min，留取上清液；取离心后血清1.5ml，均分到6个2ml的离心管中，每个离心管中250uL，依次编号为1、2、3、4、5、6；向编号为1、2、3的3支离心管中分别加入实施例1、实施例2、实施例3中制备的纳米石墨烯凝胶溶液，向编号为4、5、6的3支离心管中分别加入除了未添加纳米石墨烯，其他都与实施例1、实施例2、实施例3相同的试剂，将上述6支离心管中的溶液混合均匀，在8℃下静置60min后，4000g，离心20min，弃上清液，得底部沉淀即为外泌体。将所得的外泌体用100uLPBS重悬，将6种样本各取40uL重悬液1500倍稀释，然后进行粒度测定，粒子大小及粒子浓度如表1所示。
表1 不同试剂提取出的外泌体的粒子大小和浓度分布
从表1的结果可以看出，使用本发明的纳米石墨烯凝胶试剂从血清中提取出外泌体的粒子数和粒子浓度都要高于未添加纳米石墨烯的试剂，说明了本发明的纳米石墨烯凝胶用于血清外泌体的提取剂，外泌体的得率更高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (14)
1.一种纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，主要包括以下重量份的成分：纳米石墨烯材料35-80份、β-环糊精15-35份、聚乙二醇10-30份、海藻酸20-45份、丙二醇12-28份、乙基纤维素18-35份。
2.根据权利要求1所述纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，纳米石墨烯材料40-70份、β-环糊精18-28份、聚乙二醇14-22份、海藻酸26-35份、丙二醇15-25份、乙基纤维素22-30份。
3.根据权利要求2所述纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，纳米石墨烯材料48-62份、β-环糊精20-25份、聚乙二醇16-20份、海藻酸28-33份、丙二醇18-22份、乙基纤维素24-29份。
4.根据权利要求1或2所述的纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，所述纳米石墨烯的粒径为20-200nm。
5.根据权利要求4所述的纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，纳米石墨烯的粒径为50-150nm。
6.根据权利要求5所述的纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，纳米石墨烯的粒径为60-100nm。
7.根据权利要求1或2任一项所述的纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，所述聚乙二醇分子量为800-20000道尔顿。
8.根据权利要求7所述的纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，聚乙二醇分子量为2000-20000道尔顿。
9.根据权利要求8所述的纳米石墨烯凝胶材料，其特征在于，聚乙二醇分子量为8000-20000道尔顿。
10.权利要求1或2所述的纳米石墨烯凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)按照重量份分别称取上述原料：纳米石墨烯、β-环糊精、聚乙二醇、海藻酸、丙二醇、乙基纤维素，并将石墨烯和其他需要粉碎的原料进行粉碎；
(2)向步骤(1)中已粉碎的石墨烯中加入一定量的去离子水，放入超声波清洗仪中进行超声，待石墨烯均匀分散于去离子水中，再向其中加入聚乙二醇和β-环糊精，此时边超声边用玻璃棒搅拌，直至聚乙二醇和β-环糊精均匀分散；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入海藻酸、丙二醇、乙基纤维素，然后从超声仪中取出后放在磁力搅拌器上进行加热搅拌，直至海藻酸、丙二醇、乙基纤维素完全溶解分散，将其移入恒温振荡器摇床中，振荡形成纳米石墨烯凝胶溶液，振荡器摇床的工作频率为120-300r/min，振荡时间为3.5-6h。
11.根据权利要求10所述的纳米石墨烯凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入去离子水的用量为石墨烯20-50倍。
12.根据权利要求10所述的纳米石墨烯凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)超声的功率为60-100W，超声温度为45-60℃，超声时间为5-12h。
13.根据权利要求10所述的纳米石墨烯凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中磁力搅拌的速率为300-650r/min，磁力搅拌温度为30-50℃，磁力搅拌时间为2.5-4h。
14.根据权利要求1或2所述的纳米石墨烯凝胶材料在提取血清中外泌体的应用。
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