CN108404122A - 一种延缓衰老的组合物及其制备技术 - Google Patents
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Abstract
一种延缓衰老的组合物，所述组合物的组分按如下重量份数制成：胶原蛋白4‑30份、雨生红球藻0.02‑2份、银耳多糖0.01‑0.5份、针叶樱桃果粉0.01‑1份、维生素C0.1‑2份、辅料3‑10份、纯化水50‑98份。本发明各组分协同作用，不但能补充人体需要的外源性保水抗氧化物质，还可以提高体内的内源性保水抗氧化物质的增加，促进外源性和内源性抗氧化物质共同作用，形成保水抗氧化的共生环，使其在补水、抗氧化方面产生高效全面的综合效应，安全可靠、无毒副作用；采用有效检测组合物组分含量的方法，特别是检测含有蛋白质样品溶液中虾青素含量的方法，操作简单，灵敏度高，应用广泛。
Description
技术领域
本发明涉及一种延缓衰老的组合物及其制备技术，属于保健药品、食品领域。
背景技术
人类的衰老是自然规律，人人都避免不了。人的生长发育过程可以分为生长、成熟和退化三个过程。衰老是在退化期人体各个器官、组织和细胞所发生的退行性改变。这些退行性变化，使人类生理功能衰退，故老年人容易患多种疾病，加快整个机体衰老的速度。衰老是许多因素综合作用的结果，一般将衰老分为生理衰老和心理衰老。生理衰老可以从年龄、容貌、声音、举目动作等方面看出，生理衰老涉及到各组织器官和系统，影响人的各种生理功能和生命活动。人的衰老还与体内的自由基有密切关系。在人体新陈代谢过程中，会产生多种“自由基”，又称游离基，它们是一些化学分子团或原子团，其在体内有很强的氧化作用，过多的自由基会对人体的正常组织和细胞造成损坏，引起人体快速衰老。另外，人体免疫功能的强弱也是衰老速度的决定因素。随着年龄增长，人的免疫功能下降，衰老速度加快。
皮肤是人体最大的器官，具有保护、感觉、调节体温、分泌、排泄和免疫等诸多方面的作用。随着年龄的增长，皮肤也会像人体的其他器官一样逐渐老化，功能减弱、丧失，产生各种疾病等。衰老的皮肤，明显特征为皮肤松弛和皱纹出现，尤其是身体暴露部位皮肤变得粗糙、皱纹加深加粗；表皮结构异常、色素沉着；肌肤弹性不再、变得松弛；血管扩张、表皮角化不良等等。在衰老的皮肤中表皮细胞更新减慢、屏障功能减弱，角质形成细胞活力下降，表皮受伤后修复能力的减弱，其中屏障功能的减弱导致皮肤干燥、脱屑、皱纹等。衰老皮肤的真皮层中成纤维细胞数量逐渐减少、合成胶原蛋白和弹性蛋白的能力下降，导致皮肤粗糙、干裂。
由于衰老对人们的生活、工作有着复杂的心理与生理影响，它会引发人们焦虑、抑郁、自卑等一系列的心理问题，因此，延缓衰老治疗，尤其是对皮肤的延缓衰老治疗一直是人们研究的焦点之一。关于皮肤衰老的机理研究得非常多，先后出现过三十几个学说，其中比较有代表性的如：自由基衰老学说、代谢失调学说、基因调控学说、光老化学说、线粒体学说、免疫功能退化学说、内分泌功能减退学说、非酶糖基化衰老学说、交联学说、羧基毒化衰老学说、DNA损伤积累学说、细胞凋亡学说等。虽然，有关皮肤衰老的机理学说有很多种，且各种学说都有一定的理论和实验依据，但是，皮肤衰老是一个多层次、多方面的复杂过程，依据以上单一机理研制的延缓衰老的产品，只是从某一层次、某一方面起到延缓衰老的作用，效果不明显。因此为了研制出功效更为突出的延缓衰老的产品，需要多层次、多角度、多途径来延缓皮肤衰老。
目前依据这一思路开发的产品还不是很多，一些大的国际品牌已经推出了几款复合多种延缓衰老活性成分的化妆品。传统上人们为改善皮肤的状况注重使用化妆品，但是，现在越来越多的人开始注重身体内部的调养，对美丽的追求趋向于“由外而内”。经大量临床试验研究证实通过口服虾青素、胶原蛋白和银耳多糖等物质，可以增加其在皮肤中的含量，能达到保水、抗氧化、延缓衰老的生理功能，从而消除皮肤皱纹、延缓皮肤衰老，比涂抹在皮肤表面上的化妆品利用效果更好。
有人研究了一种含有虾青素和胶原蛋白的组合物，说明清除自由基和补充胶原蛋白具有一定的延缓衰老功效，但是总体效果欠佳。目前，综合运用多种延缓衰老途径解决衰老问题，通过多层面、多角度的深入研究，开发出功效更为突出的延缓衰老的口服产品已逐渐成为延缓衰老产品发展的必然趋势。
虾青素作为延缓衰老组合物的关键组分，对提高组合物效果起到重要作用。但是，由于虾青素稳定性较差，结构复杂，为了保证产品质量，建立一种快速、高效、简便的测定虾青素含量的方法是非常必要的。现有的测定虾青素的方法主要有HPLC和UV法。这些方法主要是用于测定天然提取物进行生物转化生产出的虾青素的含量，主要是检测固体样品中虾青素含量，其系统性、重现性都较差，且虾青素出峰的分离度达不到要求。此外，至今还未发现用于检测含有蛋白质样品溶液中虾青素含量的方法。
发明内容
本发明所要解决的问题是克服已有技术的缺陷，提供一种延缓衰老的组合物及其制备技术，各组分协同作用，不但能补充人体需要的外源性保水抗氧化物质，还可以提高体内的内源性保水抗氧化物质的增加，促进外源性和内源性抗氧化物质共同作用，形成保水抗氧化的共生环，使其在补水、抗氧化方面产生高效全面的综合效应，安全可靠、无毒副作用；采用有效检测组合物虾青素含量的方法，特别是检测含有蛋白质样品溶液中虾青素含量的方法，操作简单，系统性、重现性强，灵敏度高，应用广泛。
本发明针对以上问题的解决，提出如下技术方案：
一种延缓衰老的组合物，所述组合物由如下重量份数的组分制成：胶原蛋白4-30份、雨生红球藻0.02-2份、银耳多糖0.01-0.5份、针叶樱桃果粉0.01-1份、维生素C0.1-2份、辅料3-10份、纯化水50-98份。
上述延缓衰老的组合物，所述辅料包括甜味剂、酸味剂、矫味剂及防腐剂。
上述延缓衰老的组合物，所述组合物由如下重量份数的组分制成：胶原蛋白5-20份、雨生红球藻0.03-1.6份、银耳多糖0.05-0.1份、针叶樱桃果粉0.02-0.8份、维生素C0.2-1份、甜味剂0.01-6份、酸味剂0.2-1份、矫味剂0.01-0.1份、防腐剂0-0.1份、纯化水60-95份。
上述延缓衰老的组合物，所述胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白、鱼骨胶原蛋白、胶原低聚肽中的一种或几种；所述雨生红球藻为雨生红球藻粉、虾青素微囊粉、雨生红球藻油中的一种或几种；所述针叶樱桃果粉为针叶樱桃果粉、针叶樱桃提取物、针叶樱桃固体饮料中的一种或几种；所述维生素C为L-抗坏血酸、抗坏血酸-6-棕榈酸酯、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙中的一种或几种。
上述延缓衰老的组合物，所述雨生红球藻的主要有效成分为虾青素，虾青素的含量为1.5％-3.0％。
上述延缓衰老的组合物，所述虾青素微囊粉是从雨生红球藻中提取出的天然虾青素油经微囊包埋技术制成的微囊粉。
上述延缓衰老的组合物口服液的制备技术，包括如下步骤：
a.配置液制备：按组分重量比称取各组分原料，各组分按顺序用2/3配方量的纯化水溶解，搅拌均匀；用纯化水定容至配方量，搅拌均匀，待用；将定容后的各组分溶液用板框过滤机过滤，备用；
b.组合物各组分含量的检测：采用高压液相色谱进行虾青素含量的检测；
c.口服液瓶、盖洗涤：将口服液瓶、盖用饮用水冲洗两次，再用纯化水冲洗两次，75％乙醇浸泡灭菌1h，烘干，备用；
d.制剂灌封：将配置液按产品规格分装于棕色口服液瓶中；
e.灭菌：蒸汽高温灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为30min；
f.包装：检查合格后，包装入库。
上述延缓衰老的组合物口服液的制备技术，所述步骤a中各组分原料按银耳多糖-雨生红球藻-胶原蛋白-针叶樱桃粉的顺序加入纯化水中进行溶解。
上述延缓衰老的组合物口服液的制备技术，所述步骤b中虾青素含量，按如下步骤检测：
a、色谱条件：色谱柱为C18柱，规格为250mm×4.6mm，5μm；柱温为20℃；流动相为甲醇-水-乙酸乙酯；梯度淋洗为0.0min,75:15:10；20.0min,29:1:70；22.0min,29:1:70；24.0min,82:8:10；30.0min,82:8:10；流速为1.2mL/min；检测波长为474nm；进样量为20μL；
b、供试品溶液的制备：取10mL组合物口服液，置于20mL试管中，加入甲醇-二氯甲烷溶液4mL，摇匀，离心，将油层收集至10mL容量瓶中，加入2.8mL 0.1％的氢氧化钠-甲醇溶液，摇匀，置冰箱中皂化3h，加入1.6mL 2％的磷酸-甲醇溶液，用甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即为供试品溶液；
c、对照品溶液的制备：称取5mg的虾青素对照品于50mL容量瓶中，加入甲醇-二氯甲烷溶液，溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1mL所述虾青素对照溶液置10mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即为对照品溶液；
d、在上述色谱条件下，吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到虾青素的含量。
上述延缓衰老的组合物口服液的制备技术，所述步骤b、c中甲醇-二氯甲烷溶液的体积比为3：1。
本发明以采用内源性作用的胶原蛋白作为基础，配以具有保水作用的银耳多糖，再配以具有强抗氧化作用的虾青素和调节机体微循环的针叶樱桃果粉，本发明组合物不仅具有清除过量的自由基，促进细胞新陈代谢，补充胶原蛋白和弹性蛋白的功效，而且还具有可以刺激表皮细胞的更新，缓和黑素细胞的活性，减少色斑的出现，刺激角质细胞的脱落，加速细胞更新的优点，本发明综合运用了多种延缓衰老的途径，安全可靠、无毒副作用，适合长期服用。
各组分之间协同发挥作用，增强抗衰老的功效。其中胶原蛋白能加速真皮层细胞生长，活化表皮细胞，其三螺旋结构形成紧密的弹力网锁住皮肤中的水份；胶原蛋白还具有健骨、提高人体免疫力、提高睡眠质量的作用。雨生红球藻是天然虾青素的最好生物来源，虾青素是一种最高效的纯天然抗氧化剂，其主要作用是清除人体内的自由基，提高人体抗衰老能力，其天然抗氧化性是类胡萝卜素的10倍、VE的550倍。且虾青素是迄今为止人类发现的唯一能通过血脑屏障的强抗氧化剂，其抗氧化活性远超过现有抗氧化剂，还具有保护血管、降低胆固醇、保护视力、预防老年痴呆、缓解关节疼痛等多方面的营养保健作用。银耳多糖主要是利用水提取法、碱提法、酶提法等从银耳子实体、孢子、发酵液中分离纯化的带有分支的杂多糖，是天然保湿因子，能够延缓衰老，维持皮肤环境的水平衡。国内外的药理作用研究，银耳多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞生成及改善记忆力等多方面的活性。针叶樱桃果粉是目前世界上已知含维生素C最丰富的水果，是名副其实的"维生素C之王"。同时针叶樱桃还含有维生素A、B1、B2、E、P、烟碱酸、抗衰老因子(SOD)、钙、铁、锌、钾和蛋白质等多种营养物质，营养价值极高，有"生命之果"的美誉，可有效抵抗外来有害物质的侵袭，具有延缓衰老的作用。维生素C是水溶性抗氧化剂，能够消除有害的氧自由基的毒性，促进胶原蛋白吸收。
上述各组分不但能补充人体需要的外源性保水抗氧化物质，更为重要的是可以提高体内的内源性保水抗氧化物质的增加，促进外源性和内源性抗氧化物质共同作用，形成保水抗氧化的共生环，使其在补水、抗氧化方面产生高效全面的综合效应。
虾青素作为延缓衰老组合物的关键组分，对提高组合物效果起到重要作用，质量合格的产品中虾青素含量的最佳值应为5mg/100mL，为了保证产品质量，本发明建立了一种检测含有蛋白质样品溶液中虾青素含量的新方法，该方法操作简单，系统性、重现性强，灵敏度高，应用广泛，可用于蛋白质类复杂样品基质中虾青素含量的检测。
附图说明
图1为本发明维生素C添加量和PH值变化对虾青素含量Y的影响关系图；
图2为维生素C添加量和灭菌温度对虾青素含量Y的影响关系图；
图3为维生素C添加量和灭菌时间对虾青素含量Y的影响关系图；
图4为PH值和灭菌温度对虾青素含量Y的影响关系图；
图5为PH值和灭菌时间对虾青素含量Y的影响关系图；
图6为灭菌温度和灭菌时间对虾青素含量Y的影响关系图；
图7为本发明供试品溶液液相色谱图；
图8为对照品溶液液相色谱图；
图9为阴性辅料样品溶液液相色谱图；
图10为虾青素线性范围图。
具体实施方式
实施例1：
准确称取如下重量份的各组分：胶原蛋白1500g、雨生红球藻20g、银耳多糖80g、针叶樱桃果粉700g、维生素C 150g、木糖醇9930g、苹果酸550g、三氯蔗糖8g、香精7g、山梨酸钾40g，按配方比例称取各组分原辅料，按顺序用75L纯化水溶解，搅拌均匀；定容至100L，搅拌均匀，板框过滤机过滤，灌装(50mL/瓶)、灭菌、包装、检验，即为成品。
实施例2：
准确称取如下重量份的各组分：胶原蛋白3000g、雨生红球藻35g、银耳多糖40g、针叶樱桃果粉1200g、维生素C 100g、木糖醇8341g、苹果酸500g、三氯蔗糖10g、香精9g、山梨酸钾20g，按配方比例称取各组分原辅料，按顺序用75L纯化水溶解，搅拌均匀；定容至100L，搅拌均匀，板框过滤机过滤，灌装(50mL/瓶)、灭菌、包装、检验，即为成品。
实施例3：
准确称取如下重量份的各组分：胶原蛋白5000g、雨生红球藻64g、银耳多糖50g、针叶樱桃果粉500g、维生素C 300g、木糖醇6216g、苹果酸420g、三氯蔗糖13g、香精12g、山梨酸钾10g，按配方比例称取各组分原辅料，按顺序用75L纯化水溶解，搅拌均匀；定容至100L，搅拌均匀，板框过滤机过滤，灌装(50mL/瓶)、灭菌、包装、检验，即为成品。
实施例4：
准确称取如下重量份的各组分：胶原蛋白6000g、雨生红球藻44g、银耳多糖60g、针叶樱桃果粉600g、维生素C 400g、木糖醇5000g、苹果酸310g、三氯蔗糖16g、香精15g、山梨酸钾30g，按配方比例称取各组分原辅料，按顺序用75L纯化水溶解，搅拌均匀；定容至100L，搅拌均匀，板框过滤机过滤，灌装(50mL/瓶)、灭菌、包装、检验，即为成品。
实施例5：
准确称取如下重量份的各组分：胶原蛋白8000g、雨生红球藻80g、银耳多糖80g、针叶樱桃果粉200g、维生素C 200g、木糖醇3215g、苹果酸220g、三氯蔗糖18g、香精17g、山梨酸钾15g，按配方比例称取各组分原辅料，按顺序用75L纯化水溶解，搅拌均匀；定容至100L，搅拌均匀，板框过滤机过滤，灌装(50mL/瓶)、灭菌、包装、检验，即为成品。
实施例6：
准确称取如下重量份的各组分：胶原蛋白10000g、雨生红球藻120g、银耳多糖30g、针叶樱桃果粉400g、维生素C 100g、木糖醇1610g、苹果酸150g、三氯蔗糖20g、香精20g、山梨酸钾25g，按配方比例称取各组分原辅料，按顺序用75L纯化水溶解，搅拌均匀；定容至100L，搅拌均匀，板框过滤机过滤，灌装(50mL/瓶)、灭菌、包装、检验，即为成品。
实施例7：
虾青素作为本发明延缓衰老组合物的关键组分，对提高组合物效果起到重要作用。质量合格产品中虾青素含量最佳值应为5mg/100mL，为了保证产品质量，需要检测组合物中虾青素的具体含量，具体步骤为：
a、色谱条件：色谱柱为C18柱，规格为250mm×4.6mm，5μm；柱温为20℃；流动相为甲醇-水-乙酸乙酯；梯度淋洗为0.0min,75:15:10；20.0min,29:1:70；22.0min,29:1:70；24.0min,82:8:10；30.0min,82:8:10；流速为1.2mL/min；检测波长为474nm；进样量为20μL；
供试品溶液的制备：取10mL组合物口服液，置于20mL试管中，加入体积比为3：1的甲醇-二氯甲烷溶液4mL，摇匀，离心，将油层收集至10mL容量瓶中，加入2.8mL 0.1％的氢氧化钠-甲醇溶液，摇匀，置冰箱中皂化3h，加入1.6mL 2％的磷酸-甲醇溶液，用甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即为供试品溶液；
对照品溶液的制备：称取5mg的虾青素对照品于50mL容量瓶中，加入体积比为3：1的甲醇-二氯甲烷溶液，溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1mL所述虾青素对照溶液置10mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即为对照品溶液；
在上述色谱条件下，吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到虾青素的含量。
本发明的关键制备步骤是采取适当的措施使胶原蛋白、雨生红球藻、银耳多糖、针叶樱桃粉在溶液中充分溶解并均匀分布，功效成分在有效期内稳定。
对此，R&D人员对制备技术进行了研究，试验方法和结果如下：
1、溶解性的研究：
本发明组合物有效成分为胶原蛋白、雨生红球藻、银耳多糖、针叶樱桃粉、维生素C，其中银耳多糖不易溶于水，胶原蛋白易结团。在研究技术过程中，R&D人员发现各组分的加入顺序对组合物的溶解性影响很大。表1为各组分不同加入顺序的溶解性。
表1溶解性研究表
由表1可以看出，最佳加入顺序为银耳多糖-雨生红球藻-胶原蛋白-针叶樱桃粉，得到的溶液无结块、易分散、溶解快，适合工业化生产。
2、制备技术中各影响因素的研究：
本发明组合物制成的口服液，制备技术受多种因素影响，为了保证组合物的质量，避免技术的盲目性，用星点设计-效应面法对制备技术进行系统考察，为制备技术的科学性提供依据。虾青素作为本发明组合物的关键组成成分，其含量直接影响产品的质量，因此主要研究制备技术中各因素对虾青素含量的影响。
仪器与试样：梅特勒PH计；日立高效液相色谱仪；蒸汽灭菌柜；虾青素对照品；甲醇、二氯甲烷、氢氧化钠、磷酸，所用试剂均为分析纯。
Box-Behnken实验设计及实验结果：以维生素C添加量(A)、溶液PH值(B)、灭菌温度t(C)、灭菌时间h(D)为因素，以虾青素含量为指标，根据Box-Behnken实验设计的原理，采用Design-Expert实验设计软件(8.0.6，Stat-Ease Inc)辅助设计，Box-Behnken设计因素、水平具体如表2，实验设计及实验结果见表3。
表2因素水平表
表3 Box-Behnken实验设计及实验结果
注：A：维生素C的含量(g)；B：PH值；C：灭菌温度(℃)；D：灭菌时间(min)；Y：虾青素含量(mg/100mL)。
表4模型拟合和相关系数
表5二次多项式模型方差分析
注：Value：数值；SS：平方和；DF：自由度；MS：均方差；Residual：残差；Lack offit：失拟误差；Pure error：纯误差；Cor total：总和。
模型拟合：用Design-Expert实验设计软件(8.0.6，Stat-Ease Inc)以响应值分别对各因素进行多元线性回归和双因素模型，二次多项式模型拟合，模型的拟合优度通过复相关系数和方差分析来判定。对这三个模型进行比较，可以发现二次多项式模型的拟合相关系数最大，具有较好的拟合度，且该模型的P值最小<0.05，可靠性好，因此可以用二次多项式模型对技术条件进行分析和优化，如表4所示。由表5可以看出，各因素对研究结果影响的顺序为B>C>A>D，其中因素B对Y有显著的影响(P<0.05)。
效应面分析和优化图：本实验欲得到最佳的技术条件，使据此条件制成的产品口感好、质量稳定、生物利用度高。因素间二阶交互作用的响应面包括等高线图和三维曲面图两种，且在这两种图中除各图考察因素外，其余的因素取值一定(后续分析时同)，均分别为维生素C添加量为200g、PH值为4.45、灭菌温度为110℃、灭菌时间为30min。
图1为灭菌温度和灭菌时间取值一定时，维生素C添加量和PH值变化对虾青素含量Y的影响关系图。由等高线图1a可以看出当虾青素含量Y等于4mg/100mL时，随着维生素C添加量的增加，溶液的PH值呈现先增大后减小的趋势。由三维曲面图1b可以看出，当维生素C添加量一定时，虾青素的含量随着溶液PH值得增加而呈下降趋势，且在维生素C添加量为200g时，虾青素含量为最大，此时溶液的PH值为4.45。
图2为维生素C添加量和灭菌温度对虾青素含量Y的影响关系图。由图2a可知，在保证虾青素含量Y值一定的情况下(为4的等高线)，随着维生素C添加量的增加，所需的灭菌温度呈现先下降后上升的情况。由图2b且当维生素C添加量为200g时，随着灭菌温度的升高，虾青素含量Y值也逐渐升高，当灭菌温度达到110℃时，虾青素的含量Y值达到最大值。
图3为维生素C添加量和灭菌时间对虾青素含量Y的影响关系图。由图3a可以看出，当为保证虾青素含量Y值不变时(例如Y＝4)，随着维生素C添加量的增加，所需的灭菌时间呈现由中间向两端延伸的情况，类似于一条抛物线。由图3b且当维生素C添加量一定的情况下，随着灭菌时间的延长，所测得的虾青素含量Y呈先增高后降低的趋势。当维生素C添加量为200g，灭菌时间为30min时，所得虾青素含量Y最大。
图4为PH值和灭菌温度对虾青素含量Y的影响关系图。由图4a可知，当虾青素含量Y值一定时(例如Y＝4)，溶液的PH值越高，所需的灭菌温度也越高。由图4b且当PH值最小时，即为4.45时，虾青素含量Y值最大，随着灭菌温度的升高呈继续上升的趋势，在灭菌温度为110℃时，虾青素含量Y值达到最大值。
图5为PH值和灭菌时间对虾青素含量Y的影响关系图。由等高线图5a可以看出，在虾青素含量Y为4时，随着PH值的增加，所需的灭菌时间呈现由两端向中间聚拢的趋势。由三维曲面图5b可以看出，当溶液PH值一定，且为4.45时，虾青素含量Y值随着灭菌时间的延长呈现现增加后降低的趋势，在灭菌时间为30min时，虾青素含量Y值达到最大。
图6为灭菌温度和灭菌时间对虾青素含量Y的影响关系图。由等高线图6a可以看出，在虾青素含量Y值为4时，随着灭菌时间的延长，所需的灭菌温度呈先降低后增高的趋势。由三维曲面图6b可以看出，当灭菌温度一定时，随着灭菌时间的延长，所得的虾青素含量Y值先增加后降低，且由图可得，当灭菌温度为110℃，灭菌时间为30min时，所得的虾青素含量Y达到最大。
Box-Behnken实验结果表明，当维生素C为200g，PH值为4.45，灭菌温度为110℃，时间为30min时，是最佳技术条件。根据Box-Behnken设计的最佳配方技术，平行制备三批产品，依据此制备技术制成的产品各项指标均符合要求，且口感好、质量稳定、生物利用度高。
3、虾青素含量的测定
虾青素作为本发明延缓衰老组合物的关键组分，对提高组合物效果起到重要作用。质量合格产品中虾青素含量最佳值应为5mg/100mL，为了保证产品质量，需要检测组合物中虾青素的具体含量。本发明建立了一种检测含有蛋白质的样品溶液中虾青素含量的新方法，该发明具有操作简单，灵敏度高，应用广泛且可用于蛋白质类复杂样品基质中虾青素含量的检测。
色谱条件：色谱柱为C18柱，规格为250mm×4.6mm，5μm；柱温为25℃；流动相为甲醇-水-乙酸乙酯；梯度淋洗为0.0min,75:15:10；20.0min,29:1:70；22.0min,29:1:70；24.0min,82:8:10；30.0min,82:8:10；流速为1.2mL/min；检测波长为474nm；进样量为20μL；
供试品溶液的制备：取10mL组合物口服液，置于20mL试管中，加入体积比为3：1的甲醇-二氯甲烷溶液4mL，摇匀，离心，将油层收集至10mL容量瓶中，加入2.8mL 0.1％的氢氧化钠-甲醇溶液，摇匀，置冰箱中皂化3h，加入1.6mL 2％的磷酸-甲醇溶液，用甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即为供试品溶液；
对照品溶液的制备：称取5mg的虾青素对照品于50mL容量瓶中，加入体积比为3：1的甲醇-二氯甲烷溶液，溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1mL所述虾青素对照溶液置10mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即为对照品溶液；
在上述色谱条件下，吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到虾青素的含量。
a、专属性研究：
按“对照品溶液的制备”和“供试品溶液的制备”方法配制对照品溶液、供试品溶液，按配方比例称取辅料约0.6g，置50mL容量瓶中，加纯化水溶解，用纯化水定容至刻度摇匀，滤纸过滤，即为阴性辅料溶液。在本发明色谱条件下，吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性辅料溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。由图7～图9可知，在与对照品溶液色谱相同保留时间处，有相同的峰，峰行对称，理论塔板数(N)为4000以上；阴性辅料样品溶液色谱图中，无与虾青素对照品相同的峰出现，即为阴性无干扰。
b、线性范围研究：
称取5mg的虾青素对照品于50mL容量瓶中，加入体积比为3：1的甲醇-二氯甲烷溶液，溶解并定容至刻度，摇匀。后依次移取0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL的所述溶液于10mL容量瓶中，用体积比为3：1的甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，进样20μL，记录谱图。以虾青素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做标准曲线，参看图10得回归方程和相关系数r。具体结果如表6。
表6线性范围研究结果
参看图10得到回归方程为:y＝7E+08x+41477，r＝0.999。可以得出在进样浓度为0.008～0.018mg/ml范围内，虾青素的浓度与峰面积呈良好线性关系。
c、精密度研究：
称取5mg虾青素对照品，按“对照品溶液的制备”方法操作，重复进样6次；取10mL供试品，按“供试品溶液的制备”方法操作，取上清液重复进样6次，得到不同峰面积。
表7对照品与供试品精密度研究结果
由表7可看出，对照品峰面积RSD＝0.84％，供试品峰面积RSD＝1.10％。表明仪器的精密度良好。
d、溶液稳定性研究：
称取5mg虾青素对照品，按“对照品溶液的制备”方法操作。在室温条件下放置，分别间隔0h，1h，2h，3h，4h，6h，8h后进样，考察虾青素总峰面积的变化。取供试品，按“供试品溶液的制备”方法制备并测定供试品溶液，在室温条件下放置，分别间隔0h，1h，2h，3h，4h，6h，8h后进样，考察虾青素总峰面积的变化。
表8溶液稳定性研究结果
参看表8，虾青素对照品溶液和供试品溶液峰面积的RSD分别为1.05％、1.50％。结果表明对照品和供试品衍生物溶液在8h内稳定。
e、回收率试验研究：
分别称取已知含量的虾青素原料，按本发明配方量加入其它原料和辅料，配成含虾青素占配方量80％、100％、120％的样品各三份，按“供试品溶液的制备”中方法处理并测定样品，记录色谱图，计算回收率。
表9回收率研究结果
参看表9，回收率试验结果表明，本测定方法回收率高，准确可靠。
f、耐用性研究：
虾青素高效液相含量测定法耐用性考察，主要考察不同柱温条件下，虾青素主峰保留时间的变化。称取5mg虾青素对照品，按“对照品溶液的制备”方法制备对照品溶液，将柱温分别调整为20℃；25℃；30℃后，分别进样，记录色谱图，考察虾青素溶液保留时间的变化。
表10柱温研究结果
参看表10可以得出在不同柱温条件下，虾青素主峰保留时间差别不大，峰形良好。因此采用更接近室温的柱温20℃条件。
g、虾青素含量测定结果：
按照“供试品溶液的制备”的方法，检测三批产品中虾青素的含量，具体结果表现为表9。由表9可见，三组虾青素含量测定结果精密偏差为2.8％，符合要求。
表11虾青素的含量测定结果
本发明检测方法依据试验结果表明其重复性、线性关系、精密度、耐用性、回收率均良好，方法稳定可靠，可用于此类产品的质量控制。
本发明延缓衰老的作用是通过以下试验实现的：
经动物试验和人体试食试验都证实本发明组合物具有延缓衰老、改善皮肤水份的功能，经毒理学试验，未发现本产品有毒性作用和致突变作用。以下结合动物和功能试验来进一步说明其抗氧化、改善皮肤水份功能。
试验1：安全无毒试验
本发明经动物试验证实安全无毒，试验结果与结论如下：
(1)急性经口毒性试验：对雌、雄大小鼠急性经口最大耐受剂量(MTD)均大于22.0g/kg.BW，急性经口毒性属无毒级。
(2)遗传毒性试验：对小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、Ames试验三项结果均为阴性。
(3)30天喂养试验：在试验剂量范围内对试验大鼠的生长发育、血液学、血液生化学及病理学方面各项相关指标的检验均未发现明显不良影响。
试验2：抗氧化人体试食试验
本发明组合物口服液经人体试食试验证明具有抗氧化功能，试验结果与结论如下：
表12对受试者SOD活力的影响
参看表12试验结果表明：试食组连续食用本发明组合物口服液90天后，受试者血清中SOD活力升高，试食前后自身比较及试食后与对照组比较差异均有显著性(p＜0.05)。
表13对受试者MDA含量的影响
参看表13试验结果表明：试食组连续食用本发明90天后，受试者血清中MDA含量降低，试食前后自身比较及试食后与对照组比较差异均有显著性(p＜0.05)。
表14对受试者GSH-Px活力的影响
参看表14试验结果表明：试食组连续食用本发明90天后，受试者全血中GSH-Px活力升高，试食前后自身比较及试食后与对照组比较差异均有显著性(p＜0.05)。
表15对受试者血常规指标的影响
参看表15试验结果表明：试食组连续食用本发明90天后，受试者白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白均在正常值范围内。
表16对受试者生化、血压、心率指标的影响
参看表16试验结果表明：试食组连续食用本发明90天后，受试者血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三脂、血糖、血压、心率等各项指标均基本在正常值范围内。
试验3：改善皮肤水份人体试食试验
表17试食前一般资料比较
参看表17，试食前两组性别、年龄、皮肤水份、MDA、SOD、GSH-Px水平均无显著性差异(P＞0.05)，具有可比性。试食期间受试者尿、粪常规、血压、心率无异常，精神正常，睡眠无异常表现，试食前后胸透、腹部B超、心电图均未见异常。
表18对受试者皮肤水份的影响
参看表18，试验结果表明：试食组连续食用本发明45天后，受试者皮肤水份明显改善，试食前后自身比较及试食后与对照组比较差异均有显著性(p＜0.05)。
本发明的人体试食试验表明：试食组连续服用本发明45天后，试食组皮肤水份明显改善，试食前后自身比较及与对照组比较差异均有显著性(p<0.05)。90天后检测结果显示：受试者血清中SOD活力升高，试食前后自身比较及与对照组比较差异均有显著性(p<0.05)；血清中MDA含量降低，试食前后自身比较及试食后与对照组比较差异均有显著性(p<0.05)；全血中GSH-Px活力升高，试食前后自身比较及试食后与对照组比较差异均有显著性(p<0.05)。受试者试食前后红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三脂、血糖、血压各项指标均基本在正常值范围内。受试者试食前后尿、粪常规检查均未见异常。结果判定：本发明组合物口服液对受试者健康无不良影响，具有抗衰老、改善皮肤水份的功效。
本发明在制备技术上利用包埋技术、乳化技术和掩味技术做成口服液，口味酸甜可口，解决了原料不稳定难题，使其功效成分易吸收，提高了生物利用度和产品的质量稳定性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种延缓衰老的组合物，其特征在于，所述组合物由如下重量份数的组分制成：胶原蛋白4-30份、雨生红球藻0.02-2份、银耳多糖0.01-0.5份、针叶樱桃果粉0.01-1份、维生素C0.1-2份、辅料3-10份、纯化水50-98份。
2.根据权利要求1所述的延缓衰老的组合物，其特征在于，所述辅料包括甜味剂、酸味剂、矫味剂及防腐剂。
3.根据权利要求2所述的延缓衰老的组合物，其特征在于，所述组合物由如下重量份数的组分制成：胶原蛋白5-20份、雨生红球藻0.03-1.6份、银耳多糖0.05-0.1份、针叶樱桃果粉0.02-0.8份、维生素C 0.2-1份、甜味剂0.01-6份、酸味剂0.2-1份、矫味剂0.01-0.1份、防腐剂0-0.1份、纯化水60-95份。
4.根据权利要求3所述的延缓衰老的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白、鱼骨胶原蛋白、胶原低聚肽中的一种或几种；所述雨生红球藻为雨生红球藻粉、虾青素微囊粉、雨生红球藻油中的一种或几种；所述针叶樱桃果粉为针叶樱桃果粉、针叶樱桃提取物、针叶樱桃固体饮料中的一种或几种；所述维生素C为L-抗坏血酸、抗坏血酸-6-棕榈酸酯、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的延缓衰老的组合物，其特征在于，所述雨生红球藻的主要有效成分为虾青素，虾青素的含量为1.5％-3.0％。
6.根据权利要求5所述的延缓衰老的组合物，其特征在于，所述虾青素微囊粉是从雨生红球藻中提取出的天然虾青素油经微囊包埋技术制成的微囊粉。
7.根据权利要求1-6任一项所述延缓衰老的组合物口服液的制备技术，其特征在于，包括如下步骤：
a.配置液制备：按组分重量比称取各组分原料，各组分按顺序用2/3配方量的纯化水溶解，搅拌均匀；用纯化水定容至配方量，搅拌均匀，待用；将定容后的各组分溶液用板框过滤机过滤，备用；
b.组合物各组分含量的检测：采用高压液相色谱进行虾青素含量的检测；
c.口服液瓶、盖洗涤：将口服液瓶、盖用饮用水冲洗两次，再用纯化水冲洗两次，75％乙醇浸泡灭菌1h，烘干，备用；
d.制剂灌封：将配置液按产品规格分装于棕色口服液瓶中；
e.灭菌：蒸汽高温灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为30min；
f.包装：检查合格后，包装入库。
8.根据权利要求7所述延缓衰老的组合物口服液的制备技术，其特征在于，所述步骤a中各组分原料按银耳多糖-雨生红球藻-胶原蛋白-针叶樱桃粉的顺序加入纯化水中进行溶解。
9.根据权利要求7所述延缓衰老的组合物口服液的制备技术，其特征在于，所述步骤b中虾青素含量，按如下步骤检测：
a、色谱条件：色谱柱为C18柱，规格为250mm×4.6mm，5μm；柱温为20℃；流动相为甲醇-水-乙酸乙酯；梯度淋洗为0.0min,75:15:10；20.0min,29:1:70；22.0min,29:1:70；24.0min,82:8:10；30.0min,82:8:10；流速为1.2mL/min；检测波长为474nm；进样量为20μL；
b、供试品溶液的制备：取10mL组合物口服液，置于20mL试管中，加入甲醇-二氯甲烷溶液4mL，摇匀，离心，将油层收集至10mL容量瓶中，加入2.8mL 0.1％的氢氧化钠-甲醇溶液，摇匀，置冰箱中皂化3h，加入1.6mL 2％的磷酸-甲醇溶液，用甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即为供试品溶液；
c、对照品溶液的制备：称取5mg的虾青素对照品于50mL容量瓶中，加入甲醇-二氯甲烷溶液，溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1mL所述虾青素对照溶液置10mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即为对照品溶液；
d、在上述色谱条件下，吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到虾青素的含量。
10.根据权利要求9所述延缓衰老的组合物口服液的制备技术，其特征在于，所述步骤b、c中甲醇-二氯甲烷溶液的体积比为3：1。
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