CN108401910A - 一种快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，按照以下步骤进行：1)白芨种子萌芽并诱导白芨愈伤组织；2)培养白芨悬浮细胞；3)白芨悬浮细胞分植并分化生芽；4)诱导生根，长至苗高8‑10cm；5)练苗移栽。本发明解决了目前白芨分株繁殖存在的产量低、周期长、品质退化和有效产量低等问题。本发明可在人工控制条件下获得大量有性繁殖的无病毒苗，与传统繁殖方式相比，产量显著提高，对缓解白芨的市场供需矛盾有积极意义。
Description
技术领域
本发明属于植物快繁技术领域，具体涉及一种快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法。
背景技术
白芨BletillaStriata(Thunb.)Reichb.f.，又名白及、连及草等，为兰科白芨属多年生草本植物，具有收敛止血、消肿生肌的功效，其花大色艳，具有很高的观赏价值。白芨对内治吐血、外伤出血、疮疡肿毒、手足跋裂等有较好疗效，临床应用广泛，其白芨胶广泛应用于食品、医药和日用化学品等领域。近年来，由于白芨野生资源遭遇掠夺式采挖，加上生长环境日益恶化，野生白芨资源濒危，数量急剧下降。目前，分株繁殖仍是主要栽培方式，其产量低、周期长、品质退化的等问题突出，影响白芨大规模人工栽培。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，白芨种苗产量可得到大幅提高，解决分株繁殖存在的产量低、周期长和品质退化等问题。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，按照以下步骤进行：
1)诱导白芨种子萌芽，取种芽并诱导形成白芨愈伤组织；
2)通过白芨愈伤组织培养得到白芨悬浮细胞；
3)使白芨悬浮细胞分植与分化出芽，得到生芽的白芨组培苗；
4)诱导白芨组培苗生根，得到生根的白芨种苗。
优选的，步骤1)中，诱导形成白芨愈伤组织的具体操作方法为：将白芨果的种子取出，置于萌芽培养基中，并在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养7-14d；将萌发的种子取出，切取种芽并接种于愈伤组织诱导培养基中，在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养25-35d。
进一步的，萌芽培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.8-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.2-0.6mg/Kg萘乙酸、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂；
愈伤组织诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.8-1.2mg/Kg6-苄氨基嘌呤、0.9-1.1mg/Kg 2,4-二氯苯氧乙酸、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
优选的，步骤2)中，培养得到白芨悬浮细胞的操作方法为：将白芨愈伤组织置于悬浮细胞培养基中破碎、分散，并在温度25-28℃，转速90-110r/min条件下振摇暗培养15-25d，得到白芨悬浮细胞。
进一步的，悬浮细胞培养基为：改良的1/2MS液体培养基，添加0.1-0.3mg/Kg萘乙酸、0.8-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、1.5-2.5mg/Kg吲哚丁酸、85-110mg/Kg肌醇、0-200mg/Kg磷酸铵、100-300mg/Kg磷酸二氢钾、2500-3500mg/Kg硝酸铵和20-40g/Kg蔗糖。
优选的，步骤3)中，白芨悬浮细胞分植和分化出芽方法为：将白芨悬浮细胞置于分化生芽诱导培养基中，涂布均匀，并在温度23-26℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养40-50d，得到生芽的白芨组培苗。
进一步的，分化生芽诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.9-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.4-0.7mg/Kg噻苯隆、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
优选的，步骤4)中，诱导生根方法为：将生芽的白芨组培苗接种至诱导生根培养基中，并在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养，得到生根的白芨种苗。
进一步的，诱导生根培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.5-0.7mg/Kg萘乙酸、50-100g/Kg香蕉汁、100-150g/Kg土豆汁、5-10g/Kg活性炭、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
优选的，还包括步骤5)：将生根的白芨种苗练苗移栽；操作方法为：将步骤4)得到的生根的白芨种苗置于室内适应性生长5-10d；然后取出白芨苗并种于花盆中，置室内，相对湿度60-80％下适应性生长30-50d；然后将白芨苗移栽至大田。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明采用组织培养的方法，由萌芽的白芨种子诱导为悬浮细胞，再由悬浮细胞分化成白芨种苗，这样既可以克服白芨种子难萌发的问题，而且通过悬浮细胞分化培育，可以极大的提高白芨种苗的产量。本发明可在人工控制条件下获得大量有性繁殖的无病毒白芨种苗，与传统分株繁殖方式相比，产量显著提高，对缓解白芨的市场供需矛盾有积极意义，能够实现工厂化生产大量无病毒白芨苗。本发明解决了分株繁殖存在的产量低、周期长和品质退化等问题，缓解了无性繁殖携带病毒和品种退化等缺陷。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本实施例是从陕南秦巴山区药材种植基地采摘的白芨成熟蒴果，选其颗粒饱满、外壳未见破损的成熟蒴果的种子。符合本发明的快速繁殖大量白芨种苗的方法按照以下步骤进行：
1)诱导白芨愈伤组织：将白芨蒴果消毒、萌芽，并诱导形成愈伤组织。
消毒方法为：常温下，以自然水冲洗、软化白芨蒴果外壳12-24h，用洗衣粉溶液和蒸馏水反复漂洗2-4次，再用75％医用酒精浸泡消毒30-50s，0.1-0.3％升汞溶液浸泡5-15min，并以无菌水冲洗3-5次；
种子萌芽方法为：无菌操作条件下，将蒴果中的种子取出，分散于萌芽培养基，并在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养7-14d，萌芽培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.8-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.2-0.6mg/Kg萘乙酸、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂；
愈伤组织诱导方法为：在无菌操作台中，将萌发的种子取出，无菌水清洗2-4次，切取生长良好的膨大种芽(苗)，接种于愈伤组织诱导培养基中，在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养25-35d，愈伤组织诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.8-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.9-1.1mg/Kg2,4-二氯苯氧乙酸、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
2)培养白芨悬浮细胞，培养的悬浮细胞应为不贴壁的细胞或小细胞团，分散性良好，且操作方法为：在无菌操作台中，选取生长良好、质地松软的白芨愈伤组织，置于悬浮细胞培养基中夹碎、分散，并在温度25-28℃，转速90-110r/min条件下振摇暗培养15-25d，25-30d继代培养一次，悬浮细胞培养和继代培养基为：改良的1/2MS液体培养基，添加0.1-0.3mg/Kg萘乙酸、0.8-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、1.5-2.5mg/Kg吲哚丁酸、85-110mg/Kg肌醇、0-200mg/Kg磷酸铵、100-300mg/Kg磷酸二氢钾、2500-3500mg/Kg硝酸铵和20-40g/Kg蔗糖。
3)白芨悬浮细胞分植与分化出芽，方法为：在无菌操作台中，用已灭菌的吸管吸取生长、分散良好的白芨悬浮细胞培养液0.2-0.4mL，置于分化生芽诱导培养基中，以涂布器涂布均匀，并在温度23-26℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养40-50d，可生芽或长叶片，白芨分化生芽诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.9-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.4-0.7mg/Kg噻苯隆、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
4)诱导生根，方法为：在无菌操作台中，将诱导生芽的白芨组培苗切分，并接种至诱导生根培养基中，并在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养，诱导生根培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.5-0.7mg/Kg萘乙酸、50-100g/Kg香蕉汁、100-150g/Kg土豆汁、5-10g/Kg活性炭、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
5)练苗移栽，操作方法为：将上述生根的白芨培养瓶瓶盖打开，置于室内适应性生长5-10d；取出白芨苗，以自然水冲洗白芨苗根部培养基，用800-1000倍稀释的百菌清液浸泡白芨根部，摘种于花盆中，置室内，相对湿度60-80％下适应性生长30-50d；将组培苗移栽至大田，加强施肥和管理。
表1为实施例1至实施例5中各步骤操作方法、条件和培养基添加比例。
表1
实施例1：
1)诱导白芨愈伤组织：将白芨蒴果消毒、萌芽，并诱导形成愈伤组织。消毒方法为：常温下，以自然水冲洗、软化白芨蒴果外壳12h，用洗衣粉溶液和蒸馏水反复漂洗4次，再用75％医用酒精浸泡消毒50s，0.3％升汞溶液浸泡5min，并以无菌水冲洗5次；种子萌芽方法为：无菌操作条件下，将蒴果中的种子取出，分散于萌芽培养基，并在温度28℃，相对湿度80％，光照时间12h/d，光照强度3000Lx条件下培养7d，萌芽培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.8mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.4mg/Kg萘乙酸、20g/Kg蔗糖和6.0g/Kg琼脂；愈伤组织诱导方法为：在无菌操作台中，将萌发的种子取出，无菌水清洗3次，切取生长良好的膨大种芽(苗)，接种于愈伤组织诱导培养基中，在温度28℃，相对湿度80％，光照时间12h/d，光照强度3000Lx条件下培养25d，愈伤组织诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.8mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.9mg/Kg2,4-二氯苯氧乙酸、20g/Kg蔗糖和6.0g/Kg琼脂。
2)培养白芨悬浮细胞，培养的悬浮细胞应为不贴壁的细胞或小细胞团，分散性良好，且操作方法为：在无菌操作台中，选取生长良好、质地松软的白芨愈伤组织，置于悬浮细胞培养基中夹碎、分散，并在温度28℃，转速90r/min条件下振摇暗培养15d，25d继代培养一次，悬浮细胞培养和继代培养基为：改良的1/2MS液体培养基，添加0.25mg/Kg萘乙酸、0.8mg/Kg6-苄氨基嘌呤、2.5mg/Kg吲哚丁酸、110mg/Kg肌醇、100mg/Kg磷酸铵、200mg/Kg磷酸二氢钾、2500mg/Kg硝酸铵和20g/Kg蔗糖。
3)白芨悬浮细胞分植与分化出芽，方法为：在无菌操作台中，用已灭菌的吸管吸取生长、分散良好的白芨悬浮细胞培养液0.4mL，置于分化生芽诱导培养基中，以涂布器涂布均匀，并在温度26℃，相对湿度80％，光照时间12h/d，光照强度3000Lx条件下培养40d，可生芽或长叶片，白芨分化生芽诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加1.0mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.6mg/Kg噻苯隆、20g/Kg蔗糖和6.0g/Kg琼脂。
4)诱导生根，方法为：在无菌操作台中，将诱导生芽的白芨组培苗切分，并接种至诱导生根培养基中，并在温度28℃，相对湿度80％，光照时间12h/d，光照强度3000Lx条件下培养，诱导生根培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.6mg/Kg萘乙酸、50g/Kg香蕉汁、120g/Kg土豆汁、5g/Kg活性炭、20g/Kg蔗糖和6.0g/Kg琼脂。
5)练苗移栽，操作方法为：将上述生根的白芨培养瓶瓶盖打开，置于室内适应性生长5-10d；取出白芨苗，以自然水冲洗白芨苗根部培养基，用800-1000倍稀释的百菌清液浸泡白芨根部，摘种于花盆中，置室内，相对湿度60-80％下适应性生长30-50d；将组培苗移栽至大田，加强施肥和管理。
实施例2：
1)诱导白芨愈伤组织：将白芨蒴果消毒、萌芽，并诱导形成愈伤组织。消毒方法为：常温下，以自然水冲洗、软化白芨蒴果外壳18h，用洗衣粉溶液和蒸馏水反复漂洗4次，再用75％医用酒精浸泡消毒50s，0.2％升汞溶液浸泡10min，并以无菌水冲洗5次；种子萌芽方法为：无菌操作条件下，将蒴果中的种子取出，分散于萌芽培养基，并在温度26℃，相对湿度80％，光照时间14h/d，光照强度4000Lx条件下培养10d，萌芽培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加1.0mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/Kg萘乙酸、30g/Kg蔗糖和7.0g/Kg琼脂；愈伤组织诱导方法为：在无菌操作台中，将萌发的种子取出，无菌水清洗2次，切取生长良好的膨大种芽(苗)，接种于愈伤组织诱导培养基中，在温度26℃，相对湿度80％，光照时间14h/d，光照强度4000Lx条件下培养28d，愈伤组织诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.9mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、1.0mg/Kg2,4-二氯苯氧乙酸、30g/Kg蔗糖和7.0g/Kg琼脂。
2)培养白芨悬浮细胞，培养的悬浮细胞应为不贴壁的细胞或小细胞团，分散性良好，且操作方法为：在无菌操作台中，选取生长良好、质地松软的白芨愈伤组织，置于悬浮细胞培养基中夹碎、分散，并在温度26℃，转速100r/min条件下振摇暗培养20d，30d继代培养一次，悬浮细胞培养和继代培养基为：改良的1/2MS液体培养基，添加0.3mg/Kg萘乙酸、1.1mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、1.5mg/Kg吲哚丁酸、90mg/Kg肌醇、300mg/Kg磷酸二氢钾、3000mg/Kg硝酸铵和30g/Kg蔗糖。
3)白芨悬浮细胞分植与分化出芽，方法为：在无菌操作台中，用已灭菌的吸管吸取生长、分散良好的白芨悬浮细胞培养液0.2mL，置于分化生芽诱导培养基中，以涂布器涂布均匀，并在温度24℃，相对湿度80％，光照时间14h/d，光照强度4000Lx条件下培养45d，可生芽或长叶片，白芨分化生芽诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.9mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.4mg/Kg噻苯隆、30g/Kg蔗糖和7.0g/Kg琼脂。
4)诱导生根，方法为：在无菌操作台中，将诱导生芽的白芨组培苗切分，并接种至诱导生根培养基中，并在温度26℃，相对湿度80％，光照时间14h/d，光照强度4000Lx条件下培养，诱导生根培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.7mg/Kg萘乙酸、100g/Kg香蕉汁、100g/Kg土豆汁、8g/Kg活性炭、3g/Kg蔗糖和7.0g/Kg琼脂。
5)练苗移栽，操作方法为：将上述生根的白芨培养瓶瓶盖打开，置于室内适应性生长5-10d；取出白芨苗，以自然水冲洗白芨苗根部培养基，用800-1000倍稀释的百菌清液浸泡白芨根部，摘种于花盆中，置室内，相对湿度60-80％下适应性生长30-50d；将组培苗移栽至大田，加强施肥和管理。
实施例3：
1)诱导白芨愈伤组织：将白芨蒴果消毒、萌芽，并诱导形成愈伤组织。消毒方法为：常温下，以自然水冲洗、软化白芨蒴果外壳20h，用洗衣粉溶液和蒸馏水反复漂洗3次，再用75％医用酒精浸泡消毒50s，0.15％升汞溶液浸泡10min，并以无菌水冲洗3次；种子萌芽方法为：无菌操作条件下，将蒴果中的种子取出，分散于萌芽培养基，并在温度26℃，相对湿度70％，光照时间12h/d，光照强度4000Lx条件下培养10d，萌芽培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加1.0mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.5mg/Kg萘乙酸、30g/Kg蔗糖和7.0g/Kg琼脂；愈伤组织诱导方法为：在无菌操作台中，将萌发的种子取出，无菌水清洗3次，切取生长良好的膨大种芽(苗)，接种于愈伤组织诱导培养基中，在温度26℃，相对湿度70％，光照时间12h/d，光照强度4000Lx条件下培养30d，愈伤组织诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加1.0mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、1.0mg/Kg2,4-二氯苯氧乙酸、30g/Kg蔗糖和7.0g/Kg琼脂。
2)培养白芨悬浮细胞，培养的悬浮细胞应为不贴壁的细胞或小细胞团，分散性良好，且操作方法为：在无菌操作台中，选取生长良好、质地松软的白芨愈伤组织，置于悬浮细胞培养基中夹碎、分散，并在温度26℃，转速100r/min条件下振摇暗培养20d，25d继代培养一次，悬浮细胞培养和继代培养基为：改良的1/2MS液体培养基，添加0.2mg/Kg萘乙酸、1.0mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、2.0mg/Kg吲哚丁酸、100mg/Kg肌醇、50mg/Kg磷酸铵、250mg/Kg磷酸二氢钾、3000mg/Kg硝酸铵和30g/Kg蔗糖。
3)白芨悬浮细胞分植与分化出芽，方法为：在无菌操作台中，用已灭菌的吸管吸取生长、分散良好的白芨悬浮细胞培养液0.3mL，置于分化生芽诱导培养基中，以涂布器涂布均匀，并在温度26℃，相对湿度70％，光照时间12h/d，光照强度4000Lx条件下培养40d，可生芽或长叶片，白芨分化生芽诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加1.0mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.5mg/Kg噻苯隆、30g/Kg蔗糖和7.0g/Kg琼脂。
4)诱导生根，方法为：在无菌操作台中，将诱导生芽的白芨组培苗切分，并接种至诱导生根培养基中，并在温度26℃，相对湿度70％，光照时间12h/d，光照强度4000Lx条件下培养，诱导生根培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.5mg/Kg萘乙酸、75g/Kg香蕉汁、150g/Kg土豆汁、10g/Kg活性炭、30g/Kg蔗糖和7.0g/Kg琼脂。
5)练苗移栽，操作方法为：将上述生根的白芨培养瓶瓶盖打开，置于室内适应性生长5-10d；取出白芨苗，以自然水冲洗白芨苗根部培养基，用800-1000倍稀释的百菌清液浸泡白芨根部，摘种于花盆中，置室内，相对湿度60-80％下适应性生长30-50d；将组培苗移栽至大田，加强施肥和管理。
实施例4：
1)诱导白芨愈伤组织：将白芨蒴果消毒、萌芽，并诱导形成愈伤组织。消毒方法为：常温下，以自然水冲洗、软化白芨蒴果外壳20h，用洗衣粉溶液和蒸馏水反复漂洗3次，再用75％医用酒精浸泡消毒40s，0.1％升汞溶液浸泡15min，并以无菌水冲洗4次；种子萌芽方法为：无菌操作条件下，将蒴果中的种子取出，分散于萌芽培养基，并在温度25℃，相对湿度75％，光照时间12h/d，光照强度2000Lx条件下培养14d，萌芽培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.9mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.6mg/Kg萘乙酸、40g/Kg蔗糖和8.0g/Kg琼脂；愈伤组织诱导方法为：在无菌操作台中，将萌发的种子取出，无菌水清洗4次，切取生长良好的膨大种芽(苗)，接种于愈伤组织诱导培养基中，在温度25℃，相对湿度75％，光照时间12h/d，光照强度2000Lx条件下培养35d，愈伤组织诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加1.1mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.9mg/Kg2,4-二氯苯氧乙酸、40g/Kg蔗糖和8.0g/Kg琼脂。
2)培养白芨悬浮细胞，培养的悬浮细胞应为不贴壁的细胞或小细胞团，分散性良好，且操作方法为：在无菌操作台中，选取生长良好、质地松软的白芨愈伤组织，置于悬浮细胞培养基中夹碎、分散，并在温度25℃，转速100r/min条件下振摇暗培养25d，30d继代培养一次，悬浮细胞培养和继代培养基为：改良的1/2MS液体培养基，添加0.1mg/Kg萘乙酸、0.9mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、2.0mg/Kg吲哚丁酸、85mg/Kg肌醇、200mg/Kg磷酸铵、100mg/Kg磷酸二氢钾、2800mg/Kg硝酸铵和40g/Kg蔗糖。
3)白芨悬浮细胞分植与分化出芽，方法为：在无菌操作台中，用已灭菌的吸管吸取生长、分散良好的白芨悬浮细胞培养液0.3mL，置于分化生芽诱导培养基中，以涂布器涂布均匀，并在温度23℃，相对湿度75％，光照时间12h/d，光照强度2000Lx条件下培养50d，可生芽或长叶片，白芨分化生芽诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加1.1mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.7mg/Kg噻苯隆、40g/Kg蔗糖和8.0g/Kg琼脂。
4)诱导生根，方法为：在无菌操作台中，将诱导生芽的白芨组培苗切分，并接种至诱导生根培养基中，并在温度25℃，相对湿度75％，光照时间12h/d，光照强度2000Lx条件下培养，诱导生根培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.5mg/Kg萘乙酸、80g/Kg香蕉汁、140g/Kg土豆汁、10g/Kg活性炭、40g/Kg蔗糖和8.0g/Kg琼脂。
5)练苗移栽，操作方法为：将上述生根的白芨培养瓶瓶盖打开，置于室内适应性生长5-10d；取出白芨苗，以自然水冲洗白芨苗根部培养基，用800-1000倍稀释的百菌清液浸泡白芨根部，摘种于花盆中，置室内，相对湿度60-80％下适应性生长30-50d；将组培苗移栽至大田，加强施肥和管理。
实施例5：
1)诱导白芨愈伤组织：将白芨蒴果消毒、萌芽，并诱导形成愈伤组织。消毒方法为：常温下，以自然水冲洗、软化白芨蒴果外壳24h，用洗衣粉溶液和蒸馏水反复漂洗2次，再用75％医用酒精浸泡消毒30s，0.15％升汞溶液浸泡15min，并以无菌水冲洗3次；种子萌芽方法为：无菌操作条件下，将蒴果中的种子取出，分散于萌芽培养基，并在温度27℃，相对湿度60％，光照时间10h/d，光照强度2000Lx条件下培养12d，萌芽培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.3mg/Kg萘乙酸、20g/Kg蔗糖和6.0g/Kg琼脂；愈伤组织诱导方法为：在无菌操作台中，将萌发的种子取出，无菌水清洗3次，切取生长良好的膨大种芽(苗)，接种于愈伤组织诱导培养基中，在温度27℃，相对湿度60％，光照时间10h/d，光照强度2000Lx条件下培养30d，愈伤组织诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、1.1mg/Kg2,4-二氯苯氧乙酸、20g/Kg蔗糖和6.0g/Kg琼脂。
2)培养白芨悬浮细胞，培养的悬浮细胞应为不贴壁的细胞或小细胞团，分散性良好，且操作方法为：在无菌操作台中，选取生长良好、质地松软的白芨愈伤组织，置于悬浮细胞培养基中夹碎、分散，并在温度27℃，转速110r/min条件下振摇暗培养20d，28d继代培养一次，悬浮细胞培养和继代培养基为：改良的1/2MS液体培养基，添加0.2mg/Kg萘乙酸、1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、1.8mg/Kg吲哚丁酸、100mg/Kg肌醇、150mg/Kg磷酸铵、150mg/Kg磷酸二氢钾、3500mg/Kg硝酸铵和20g/Kg蔗糖。
3)白芨悬浮细胞分植与分化出芽，方法为：在无菌操作台中，用已灭菌的吸管吸取生长、分散良好的白芨悬浮细胞培养液0.4mL，置于分化生芽诱导培养基中，以涂布器涂布均匀，并在温度25℃，相对湿度60％，光照时间10h/d，光照强度2000Lx条件下培养45d，可生芽或长叶片，白芨分化生芽诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.5mg/Kg噻苯隆、20g/Kg蔗糖和6.0g/Kg琼脂。
4)诱导生根，方法为：在无菌操作台中，将诱导生芽的白芨组培苗切分，并接种至诱导生根培养基中，并在温度27℃，相对湿度60％，光照时间10h/d，光照强度2000Lx条件下培养，诱导生根培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.6mg/Kg萘乙酸、60g/Kg香蕉汁、100g/Kg土豆汁、7g/Kg活性炭、20g/Kg蔗糖和6.0g/Kg琼脂。
5)练苗移栽，操作方法为：将上述生根的白芨培养瓶瓶盖打开，置于室内适应性生长5-10d；取出白芨苗，以自然水冲洗白芨苗根部培养基，用800-1000倍稀释的百菌清液浸泡白芨根部，摘种于花盆中，置室内，相对湿度60-80％下适应性生长30-50d；将组培苗移栽至大田，加强施肥和管理。
本发明采用组织培养技术，通过白芨悬浮细胞分化培育白芨种苗技术可靠性强，白芨种苗产量可得到大幅提高，可满足白芨大规模人工栽培的要求，且其为有性繁殖的无病毒苗，本发明可以解决分株繁殖存在的产量低、周期长和品质退化等问题，缓解无性繁殖携带病毒和品种退化等缺陷。
Claims (10)
1.一种快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
1)诱导白芨种子萌芽，取种芽并诱导形成白芨愈伤组织；
2)通过白芨愈伤组织培养得到白芨悬浮细胞；
3)使白芨悬浮细胞分植与分化出芽，得到生芽的白芨组培苗；
4)诱导白芨组培苗生根，得到生根的白芨种苗。
2.根据权利要求1所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，步骤1)中，诱导形成白芨愈伤组织的具体操作方法为：将白芨果的种子取出，置于萌芽培养基中，并在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养7-14d；将萌发的种子取出，取种芽并接种于愈伤组织诱导培养基中，在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养25-35d。
3.根据权利要求2所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，萌芽培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.8-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.2-0.6mg/Kg萘乙酸、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂；
愈伤组织诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.8-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.9-1.1mg/Kg 2,4-二氯苯氧乙酸、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
4.根据权利要求1所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，步骤2)中，培养得到白芨悬浮细胞的操作方法为：将白芨愈伤组织置于悬浮细胞培养基中破碎、分散，并在温度25-28℃，转速90-110r/min条件下振摇暗培养15-25d，得到白芨悬浮细胞。
5.根据权利要求4所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，悬浮细胞培养基为：改良的1/2MS液体培养基，添加0.1-0.3mg/Kg萘乙酸、0.8-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、1.5-2.5mg/Kg吲哚丁酸、85-110mg/Kg肌醇、0-200mg/Kg磷酸铵、100-300mg/Kg磷酸二氢钾、2500-3500mg/Kg硝酸铵和20-40g/Kg蔗糖。
6.根据权利要求1所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，步骤3)中，白芨悬浮细胞分植和分化出芽方法为：将白芨悬浮细胞置于分化生芽诱导培养基中，涂布均匀，并在温度23-26℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养40-50d，得到生芽的白芨组培苗。
7.根据权利要求6所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，分化生芽诱导培养基为：改良的MS固体培养基，添加0.9-1.2mg/Kg 6-苄氨基嘌呤、0.4-0.7mg/Kg噻苯隆、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
8.根据权利要求1所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，步骤4)中，诱导生根方法为：将生芽的白芨组培苗接种至诱导生根培养基中，并在温度25-28℃，相对湿度60-80％，光照时间10-14h/d，光照强度2000-4000Lx条件下培养，得到生根的白芨种苗。
9.根据权利要求8所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，诱导生根培养基为：改良的1/2MS固体培养基，添加0.5-0.7mg/Kg萘乙酸、50-100g/Kg香蕉汁、100-150g/Kg土豆汁、5-10g/Kg活性炭、20-40g/Kg蔗糖和6.0-8.0g/Kg琼脂。
10.根据权利要求1所述的快速提高白芨种苗培育数量的白芨种苗组织培养方法，其特征在于，还包括步骤5)：将生根的白芨种苗练苗移栽；操作方法为：将步骤4)得到的生根的白芨种苗置于室内适应性生长5-10d；然后取出白芨苗并种于花盆中，置室内，相对湿度60-80％下适应性生长30-50d；然后将白芨苗移栽至大田。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180817 |
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