CN108396073B - 一种鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及种苗繁育技术领域，涉及一种鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法，先提取油棕种苗的DNA，再进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色，即可根据电泳条带鉴别出将来果实发育正常的油棕种苗和会产生Mantled畸形的油棕种苗。本发明所述的鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法，无需等到油棕树结果，在苗期即可准确鉴定出将来会产生Mantled畸形的油棕种苗，鉴定准确率高，能够保证油棕种苗的纯度，避免Mantled畸形产生的经济损失，对于油棕种苗质量控制具有重要意义。

Description

一种鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法
技术领域
本发明属种苗繁育技术领域，涉及一种鉴定方法，具体是一种利用分子标记鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法。
背景技术
油棕(Elaeis guineensis)是世界上生产效率最高的产油植物，新鲜果肉约含49％的棕榈油，果仁则含有约50％的棕榈仁油，每公顷年产油量可高达6-8吨，是花生的5-6倍、大豆的9-10倍，有“世界油王”之称。虽然油棕的自然寿命可达100多年，但经济寿命一般为20-30年，在商业种植模式中的更新周期一般为25年，因此，在育苗阶段把控种苗质量至关重要。
Mantled变异是油棕雌花心皮发育异常引起的一种变异，果实的外围分裂为斗篷状或花瓣状，从而导致油棕果实发育畸形、含油量大幅降低，在实际生产中的商业价值很低。油棕种苗定植后一般需要生长3-4年结果，而结果性状稳定或出现Mantled变异通常需要6-8年，显现Mantled变异的时间较慢，而且植株管理过程中需要花费大量的人力、物力和财力，从而造成经济损失，并且可能引发种植户或投资者对Mantled畸形种苗流入的担忧，进一步挫伤其积极性，阻碍油棕种植业发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法，应用分子标记在育苗阶段对Mantled变异进行早期鉴定并剔除，对于油棕种苗质量控制以及种植业发展具有重要意义，在油棕种苗繁育领域应用前景广阔。
本发明所采用的技术方案：
一种鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法，其具体步骤如下：
1、提取油棕种苗DNA；
2、对所提取的DNA进行PCR扩增；
3、PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色、拍照；
4、根据电泳图中的条带情况对油棕种苗进行Mantled畸形鉴定：电泳凝胶上在400bp和380bp处各显示1条条带的是将来会产生Mantled畸形的油棕种苗，相同位置无条带出现的为正常油棕种苗。
所述步骤2中的PCR扩增，所用引物为：正向引物序列：CTAACCTGATTTGACCTAGCCC(5'-3')；反向引物序列：CCGAAATACTCGATTTGGTTTC(5'-3')。或者由该引物序列衍生的序列。
本发明的有益效果：
优质种苗是发展种植业的重要前提和保障。油棕从种苗定植到结果需3-4年时间，而等到结果性状稳定并发现导致含油量大幅下降的Mantled变异植株可能需要6-8年。植株管理过程中需要花费大量的人力、物力和财力，从而给种植园造成经济损失，并且可能引发种植户或投资者对Mantled畸形种苗流入的担忧，进一步挫伤其积极性，阻碍油棕种植业发展。本发明采用分子标记技术鉴别油棕种苗Mantled变异，可以在育苗阶段将变异种苗分离开来，无需等到多年以后发现果实畸形时再剔除高大的成年植株，从而避免了前期种植过程中人力、物力和财力的浪费，对于油棕种苗质量控制及油棕种植业发展具有重要意义，在油棕种苗繁育领域应用前景广阔。
附图说明
图1是油棕果实性状及对应的PCR电泳图。
a：油棕果实及剖面，N为正常，M为Mantled变异。
b：油棕DNA扩增后的电泳图，N为正常，M为Mantled变异。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按制造厂商所建议的条件。
实施例一
(1)合成用于鉴别油棕种苗Mantled畸形的分子标记引物，其中正向引物序列为：CTAACCTGATTTGACCTAGCCC(5'-3')，反向引物序列为：CCGAAATACTCGATTTGGTTTC(5'-3')。
(2)种苗叶片的DNA提取参考CTAB法，具体操作为：
取适量油棕种苗叶片，在研体中加入液氮迅速研磨成粉末，加入缓冲液离心，弃去上清液，重复操作一次；加入裂解缓冲液后水浴，加入氯仿：异戊醇抽提液，抽提2次后离心；取上清液加入预冷的乙酸钠和异丙醇，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗2-3次，加75％酒精浸泡过夜；加入75％酒精再次清洗后，加TE溶解DNA，加入RNA酶水浴加热，加入酚：氯仿：异戊醇抽提，上清液再加入氯仿：异戊醇抽提，再加入预冷的乙酸钠和无水乙醇，缓慢摇匀至DNA沉淀析出；沉淀用75％酒精清洗3次，在超净工作台中自然风干，加入TE溶解，即可得到油棕种苗DNA。
(3)使用步骤(1)所述的引物，对步骤(2)所得的DNA进行PCR扩增；PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。
(4)PCR扩增产物使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带；电泳条件为6％PAGE，150V、400mA、30W，电泳时间为1h 20min；使用硝酸银进行染色并拍照。
(5)根据电泳图中的条带情况对油棕种苗进行Mantled畸形鉴定：电泳凝胶上大约400bp和380bp处各显示1条条带的是将来会产生Mantled畸形的油棕种苗，相同位置无条带出现的为正常油棕种苗。
鉴别效果：
实验材料：已经出现Mantled变异的油棕树叶片及果实样品10份(来源于尼日利亚油棕研究所、加纳油棕研究所)，未出现Mantled变异的正常油棕树叶片及果实样品10份(来源于海南省文昌市中国热带农业科学院椰子研究所)。
实验方法：1、将油棕果实进行整体形状对比及剖开对比；2、采用本发明所述的鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法(取油棕叶片提取DNA，进行PCR扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色、拍照)。
实验结果：1、正常油棕果实和出现Mantled变异的果实对比，结果见图1-a。2、正常油棕叶片和出现Mantled变异的叶片的DNA，经扩增后电泳检测，结果见图1-b。鉴别实验结果如表1所示。
表1油棕种苗Mantled畸形的鉴别效果
样品数量 发育状态 鉴定结果 畸形数量 准确率
10 Mantled畸形 Mantled畸形 10 100％
10 正常 正常 10 100％
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种鉴别油棕种苗Mantled畸形的方法，其特征在于，其具体步骤如下：
(1)提取油棕种苗的DNA；
(2)对所提取的DNA进行PCR扩增；
所用引物为：正向引物序列为：5'-CTAACCTGATTTGACCTAGCCC-3'；
反向引物序列为：5'-CCGAAATACTCGATTTGGTTTC-3'；
(3)PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色、拍照；
(4)根据电泳图中的条带情况对油棕种苗进行Mantled畸形鉴定：电泳凝胶上在400bp和380bp处各显示1条条带的是将来会产生Mantled畸形的油棕种苗，相同位置无条带出现的为正常油棕种苗。
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