CN108387725A - 一种脊髓灰质炎病毒ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型d抗原预包被联合检测方法及其检测试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预包被的可进行批量生产的脊髓灰质炎病毒（Polio virus）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原检测方法，采用牛（兔、羊）抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体包被微孔板，并通过保护剂对包被板和包被抗体进行保护后制备成预包被板，同时配套辣根过氧化物酶标记的牛（兔、羊）抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒酶标抗体和其他试剂。该方法（试剂）可以对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原进行特异性的定性和定量检测，对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型C抗原和其他肠道病毒无交叉，是一种特异性高、灵敏高，使用方便、用途广泛的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原联合检测法，在IPV疫苗生产检定中有较高的应用价值。

Description

一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原预包被联合检测方 法及其检测试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原预包被联合检测方法及其检测试剂盒和应用。

背景技术

脊髓灰质炎病毒(polio virus)属于小核糖核酸病毒科、肠道病毒属，分3个血清型，其主要侵犯脊髓前角灰质区运动神经元，临床特征为弛缓性肌肉麻痹，多发生在5岁以下儿童，尤其是婴幼儿，故亦称小儿麻痹症，是WHO继天花之后要消灭的第二种传染病的主要病原体。脊髓灰质炎病毒感染后没有特效的治疗手段，只能通过疫苗进行预防，目前用于预防控制脊灰流行的疫苗有两种：脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)和灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV) ，OPV因易于接种，成本相对较低而一度被广泛使用，但在长期使用过程中发现，其可能引起脊灰疫苗相关麻痹(VAPP)病例和疫苗衍生株脊灰病毒VDPV) ，IPV则能有效避免VAPP和VDPV的发生。因此，彻底消灭脊灰病毒最终需要用IPV全部取代OPV进行预防控制。

脊髓灰质炎病毒共有3个血清型，分别为PolioⅠ、Ⅱ、Ⅲ型、Polio Ⅱ型和Polio Ⅲ型，3个型别的病毒颗粒均有2种形式，分别为具有感染性的完整病毒颗粒形式的D抗原和不具有感染性的空心颗粒C抗原。C抗原通过D抗原感染细胞过程、加热、紫外线照射、碱变性、毒力降解而产生，其VP4消失而无感染性。 D抗原具有免疫原性，可诱导机体产生保护性中和抗体，从而预防脊髓灰质炎的发生，而C抗原虽有组特异性，但免疫血清尚不能中和病毒，由于D抗原含量与灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV)接种后机体产生免疫效力之间具有较好的一致性，因此，D抗原作为IPV疫苗的主要成分抗原，其含量是IPV疫苗体外效力的关键指标，对IPV疫苗生产质控具有重要意义。

D抗原检测在IPV疫苗生产、质量控制过程中时常用到，单价原液检测、半成品配制、三价半成品检测、成品检定都有涉及脊灰病毒D抗原检测的项目，由于D抗原含量是IPV疫苗质量的一个重要标准，直接影响疫苗的保护效果，因此D抗原检测方法的优劣和便捷在一定程度上可以直接影响到疫苗的生产进程和质量标准。

由于脊灰病毒抗体用于实验后发现其包被微孔板稳定性差，不能制备成预包被板成品，只能使用前包被，包被完毕需及时进行检测，否则检测结果会出现较大差异，因此目前市场上并没有商售的脊灰病毒D抗原检测试剂盒。现有的D抗原检测方法（试剂）无法批量制备，每次使用前包被导致检测周期长，至少3天才能完成一个检测，并且对检测人员的操作技能要求高，换操作人员即有可能导致人员操作偏差出现，不利于疫苗质量的稳定性。基于市场的需求和疫苗生产检定的要求，申请人研发了一种Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原定性或定量快速联合检测的方法，可以进行预包被，批量生产，全部检测时间从3天缩短为3.5小时，有效提高了疫苗的检定工作效率和检测结果的稳定性。

发明内容

基于上述现有技术存在的缺陷和不足，本发明旨在提供一种脊髓灰质炎病毒（Polio virus）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合检测方法，该方法可以同时对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原进行高特异性的精准定性和定量检测。本发明还提供了一种预包被的可以进行批量生产的脊髓灰质炎病毒（Polio virus）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原检同时测试剂盒。

一方面，一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，用于非临床疾病诊断治疗和非健康状况判断用途，包括以下步骤：

S1、分别对动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒单价抗体进行制备并纯化，得动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的各型单价纯化抗体；

S2、用辣根过氧化物酶通过高碘酸钠法分别对动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的单价纯化抗体进行标记，得动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的检测用酶标抗体，制成单价酶标抗体使用液；

S3、以动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原单价纯化抗体分别进行酶标检测板的预包被处理，预包被处理中加入保护剂进行封闭保护；所述保护剂包括但不限于以下成分：BSA、明胶，血清、酪蛋白、白蛋白、海藻糖、磷酸盐、碳酸盐中的一种或多种，在载体板上标示三种不同的颜色分别对应各型脊髓灰质炎病毒D抗原，用不同颜色对加入的抗体型别进行区分，制得预包被载体，所得预包被载体能批量制作且能满足检测条件指标下实现长期存放；

S4、采用各型预包被载体捕获相应待检抗原形成抗原抗体复合物，再与同型酶标记抗体结合，通过底物催化酶显色，根据显色结果完成对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ各型D抗原的联合定性检测或定量检测。

进一步的，步骤S3中所述保护剂为：每1000ml保护剂包含7~13g BSA，7~13海藻糖、3~7g明胶，1~2g酪蛋白，30~70mMol磷酸盐溶液；所述预包被载体使用抽真空包装后存放。

进一步的，纯化抗体的制备步骤包括：

1）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原抗血清制备：将灭活脊髓灰质炎病毒分别通过10-30%蔗糖密度梯度离心4-8小时，收集D抗原层，经电镜检测确认后用于免疫血清制备；试验动物牛或兔或羊，首免，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型单价灭活病毒D抗原与福氏佐剂等量混匀，皮下注射免疫，每个型的抗原免疫1-2只动物，避免交叉，进行3次加强免疫后采血，分离血清，采用微量中和试验进行血清中和抗体滴度测定；

2）牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原单价纯化抗体制备：取蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；将抗血清与平衡液等体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，保留目的蛋白；用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，脱盐后备用；用lowry法测定蛋白含量，得各型牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体，-20℃以下保存待用，各个型别的免疫血清分开进行纯化，不可交叉，纯化产物不可混淆。

进一步的，所述S2步骤包括：将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后，加入 NaIO4，静置，加入乙二醇溶液，静置，再与步骤S1所得纯化抗体混合，透析过夜；加硼氢化钠，静置，加饱和硫酸铵，离心；取沉淀溶解后透析过夜；得到单价牛、兔、羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原酶标抗体，低温保存备用，标记过程各型抗体分开进行。

进一步的， S3步骤包括：

1）酶标检测板包被：将纯化好的各牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的单价纯化抗体分别通过试验确认包被条件，按条件稀释抗体至0.1-15µg/ml后，50-150µl/孔加至酶标专用检测板中，2～8℃过夜，洗板；每块板每个型别加3条24孔，用不同颜色对加入的抗体型别进行区分；

2）酶标检测板封闭：以150-250µl/孔的量加入保护剂，2～8℃过夜，洗板，晾干，真空包装后冰箱保存备用。

进一步的，所述S4中定性或定量检测包括以下步骤：

1）将待检的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原样品及其他待检样品系列稀释后分别按型加入预包板检测孔中，定量样品及含量参考品复孔加样，定性检测样品原倍加入，50-150µl/孔；同时分别对应型加入Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原阳性及阴性对照对照各2孔，设空白孔1孔；37℃孵育1-3小时，洗板3-5次；

2）在1）已洗好的酶标检测板中50-150µl/孔加入同型酶标抗体使用液，空白孔不加，37℃孵育0.5-3小时，洗板3-5次；

3）在2）已洗好的酶标检测板中加入TMB显色液，混匀，放入湿盒中，37℃孵育5-15分钟；

4）使用终止终止反应；

5）在检测450nm 波长，630校正波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即可得定性或根据抗原含量参考品计算得定量的检测结果。

上述一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法在IPV疫苗分型及D抗原检测的各类样本开发及其质量检定中的应用。

上述一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法在制备脊髓灰质炎病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明的另一方面，提供了一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测用的试剂盒，包括以下试剂组分：脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合检测板，牛、兔或羊抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原酶标记抗体使用液、牛、兔或羊抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原酶标记抗体使用液、牛、兔或羊抗脊髓灰质炎病毒Ⅲ型D抗原酶标记抗体使用液，保护剂，TMB显色液A、显色液B，浓缩洗液， 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原阳性对照及含量参考品、脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原阳性对照及含量参考品、脊髓灰质炎病毒Ⅲ型D抗原阳性对照及含量参考品, 脊髓灰质炎病毒 D抗原阴性对照。

进一步的，所述脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合检测板的制备方法为：

1）将纯化好的牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体通过试验确认包被条件，按条件稀释抗体至0.1-15µg/ml后，50-150µl/孔加至酶标专用检测板中，每块板每个型别加3条24孔，在酶标板上标示三种不同的颜色，用不同颜色对加入的抗体型别进行分区，2～8℃过夜，洗板；

2）酶标检测板封闭：以150-250µl/孔的量加入保护剂，2～8℃过夜，洗板，晾干，真空包装后冰箱保存备用；所述保护剂包括：5%BSA、5%明胶，3%酪蛋白、3%白蛋白、15%海藻糖、20%~30%磷酸盐或碳酸盐。

与现有技术相比本发明具有下列优点和效果：

（1）采用预包被牛（兔、羊）抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体，以单价辣根过氧化物标记牛（兔、羊）抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体作放大系统，能高特异性地检测Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型髓灰质炎病毒D抗原，提高灵敏度。

（2）采用密度梯度离心分离获得的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒颗粒（D抗原，不含有C抗原成分），既有特异性高、灵敏度好、能批量制备、减少检测及操作误差、检测时间短的优点。

（3）本发明解决了细胞培养病变法不能检测灭活病毒的难题，为相关疫苗的研究开发和疫苗质量检定工作提供有力的技术保障。

（4）本发明采用保护剂对包被抗体进行预包被保护，免疫动物获得的抗体包被并经保护剂保护，将原本传统检测过程需要持续不可断的状态形成了可终断分割步骤的方式，实现了可以长期保存的预包被检测板，可间断的检测方式减少免疫检测中的制备准备步骤，直接使用制备好的预包被板从而缩短检测时间，将一般检测时间从3天缩短为3-4小时，解决了脊灰病毒抗体包被后不能长期保存的问题，使检测试剂可以批量制备、存放的同时提高了检测效率。

（5）本发明制备的预包被板稳定性好，检测结果满足ELISA实验需求，在-20℃长期保持也有良好的稳定性，最长保存时间18个月，检测灵敏度、线性（R2）、精密性 (CV)满足疫苗检测及ELISA检测试剂的要求。本发明的预包板检测试剂可以进行批量生产并可以长期保存。并且本发明的检测板制备方式为3合1包被方式：将三个型的抗体包被在一块酶标板上，用颜色分区分来区别不同的型别，并且通过加入对应的同型单价酶标记抗体来实现在一块酶标板上检测3个型的D抗原，可以减少使用单位的试剂购入成本，节约实验时间和经费，方便基层单位和科研工作者的使用。实现制备、检测可分割的检测方法，其另一个突出效果是能对检测试剂进行阶段质控，便于实际制备、检测过程中对于差错的纠察和控制，方便操作并减少人员误差，不仅在制备、检测中提高了效率，还保证了检测结果的重复性和疫苗质量的稳定性，达到对制备质量、检测质量的双重可控性和保障性。即在实际使用中能有效减少Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测中的实验试剂及操作误差，有利于提高工作效率。

（6）常规脊髓灰质炎病毒D抗原检测方法：牛（兔、羊）抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒纯化抗体包板，吸附过夜；洗板，加封闭液孵育1小时，洗板后加待检样品，吸附过夜；洗板，加二抗，2.5小时；洗板，加酶标抗体，孵育1.5小时；洗板，加TMB-显色液显色，450nm检测结果；本发明的检测程序与之相比较操作简单耗时少。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原抗血清制备

将灭活脊髓灰质炎病毒分别通过10-30%蔗糖密度梯度离心4-8小时，收集D抗原层，经电镜检测确认后用于免疫血清制备；试验动物（牛、兔、羊均可），首免，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型单价灭活病毒D抗原10-20ml与福氏完全佐剂等量混匀，皮下注射免疫，每个型的抗原免疫1-2只动物，避免交叉，然后进行3次加强免疫后采血，分离血清，采用微量中和试验进行血清中和抗体滴度测定.。

实施例2 牛（兔、羊）抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒抗原单价纯化抗体（简称抗IPV-IgG）的制备

1、取蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；2、将抗血清与平衡液等体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；3、用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，脱盐后备用；4、用lowrry法测定蛋白含量，得各型牛（兔、羊） 抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型单价IPV-IgG，-20℃以下保存待用；不同型别的血清纯化分开进行，避免血清及纯化产物交叉，所述洗液、平衡液均为现有技术的常规用液。

实施例3 酶标记抗体制备

将辣根过氧化物酶10mg用注射用水溶解后，加入0.2ml NaIO4，静置0.1-1小时，加入0.5ml乙二醇溶液，静置0.1-1小时，再与步骤二所得纯化抗体1ml混合，透析过夜；加硼氢化钠0.5ml，静置，加饱和硫酸铵，15000离心30-60分钟；取沉淀溶解后透析过夜；得到牛（兔、羊）抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型单价脊髓灰质炎病毒-IgG-HRP ，低温保存备用。标记过程中不同型的抗体分开标记，避免混淆及交叉。以上所用溶液均为现有技术的常规用溶液。

实施例4 预包被酶标板的制备

1）酶标板包被：将牛（兔、羊）抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原单价纯化抗体稀释至0.1-15µg/ml，按50～150µl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，每块板每个型别的抗体占三分之一块板，并在微孔板定端用三种不同颜色（常规颜色标记方法）进行标记，不同颜色对应不同型别的包被抗体，三个型别的抗体正好包被在一块板上，2～8℃过夜，洗板3～5次；

2）酶标板封闭：按150～250µl/孔的量加入保护剂封闭，2～8℃过夜，对酶标板进行封闭保护, 洗板3～5次，晾干，真空包装后冰箱保存备用，所述保护剂按每1000ml保护剂包含7~13g BSA，7~13海藻糖、3~7g明胶，1~2g酪蛋白，30~70mMol磷酸盐溶液制成；或保护剂按包括：5%BSA、5%明胶，3%酪蛋白、3%白蛋白、15%海藻糖、20%~30%磷酸盐或碳酸盐制成。

实施例5 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原联合检测

1、将待检的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原单价样品、混合抗原、或通过其他方法分离获得的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒单价及混合抗原，及其他样品系列稀释后分别按型别加入预包板检测孔中，定量样品及含量参考品复孔加样；定性检测样品原倍直接加入，50-150µl/孔，同时分别对应型别加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原阳性及阴性对照，设空白孔1孔，37℃孵育0.5-3小时，洗板5次；

2、在步骤1已洗好的酶标检测板中加入对应型别的酶标抗体使用液，50-150µl/孔，空白孔不加，37℃孵育0.5-3小时，洗板5次；

3、在步骤2已洗好的酶标检测板中加入TMB显色液50-150µl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃孵育5-15分钟；

4、终止液终止反应；

5、在检测450nm 波长，630校正波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果；

6、结果判定：

1）Cutoff值 =阴性对照平均值×2.1，（阴性对照的平均A值小于等于0.05，按实际值计算），三个型别的Cutoff值分别用对应型别的阴参进行计算。

2）按照样品A值≥Cutoff值，该样品判定为该型脊髓灰质炎病毒D抗原阳性样品，样品A值＜ Cutoff值，为阴性，该样品判定为该型脊髓灰质炎病毒D抗原阴性样品。

3）将系列稀释的定量检测样品A值与抗原含量参考品A值带入对应的公式进行计算，即可获得待检样品的含量，不同型别的样品分别对应不同型别的参考品。

以上实验中的待检样品包含Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原，C抗原及其他肠道病毒，脊髓灰质炎病毒D抗原含量参考品，精密性参考品等，对本实施例做精密性、线性、灵敏度、重复性性能指标检测，结果如表1所示，

表1 Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原预包被快速检测法性能指标

从检测试剂的性能指标看，本发明的平均精密性、灵敏度及线性均满足ELISA检测试剂要求，可以用于疫苗检测。检测方法灵敏度分析，用本发明对Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型IPV-D抗原含量参考品进行联合检测，检测下限均能测到0.125 DU/ml。检测方法精密性分析，本发明试验CV均小于15%，满足ELISA试验要求。

对本实施例的检测方法做特异性实验，结果如表2所示, 对非目标型脊髓灰质炎病毒D、C抗原，目标型别的C抗原和其他肠道病毒进行交叉试验，特异性显示无交叉情况出现。

表2 Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原联合预包被快速检测试剂特异性试验

实施例6 Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原预包被板相关性能检测

步骤1.按实施例3中的方法制备预包被板；其中：保护剂按每1000ml封闭液含10g BSA，10g海藻糖、5g明胶，1g酪蛋白，50mMol磷酸盐溶液制成；

步骤2.将预包被板分别存放于37℃作3、5、8天加速破坏实验；结果见表3；

步骤3.预包被板存于4℃及-20℃以下做6、9、12、18个月的长期稳定性试验；结果见表5；

步骤4.稳定性试验的预包被板在不同温度放置到期后带入精密性参考品，含量参考品按照标准检测程序进行检测。

表3 Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原联合预包被板快速检测试剂37℃稳定性试验结果

表4 Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原联合预包被板快速检测试剂-20℃稳定性试验结果

如表3、4所示，本发明制备的预包被板在37℃加速破坏实验条件下有较好的稳定性，检测结果满足ELISA实验需求，在-20℃长期保持也有良好的稳定性，最长保存时间18个月，检测灵敏度、线性（R2）、精密性 (CV)满足疫苗检测及ELISA检测试剂的要求。样品检测实施列种的样品含量检测结果波动在95%可信限范围，符合ELISA检测试剂要求（表5），本发明的预包板检测试剂可以进行批量生产并可以长期保存，并且本发明的检测板制备方式为3合1包被方式：将三个型的抗体包被在一块酶标板上，用颜色分区分来区别不同的型别，并且通过加入对应的同型单价酶标记抗体来实现在一块酶标板上检测3个型的D抗原，可以减少使用单位的试剂购入成本，节约实验时间和经费，方便基层单位和科研工作者的使用。

在实际使用中能有效减少Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测中的实验试剂及操作误差，有利于提高工作效率。

样品检测实施例

用三批联合检测试剂对7个样品按标准程序进行联合检测，结果如表5所示：

表5Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原联合预包被快速检测法样品检测结果

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，用于非临床疾病诊断治疗和非健康状况判断用途，其特征在于，包括以下步骤：

S1、分别对动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒单价抗体进行制备并纯化，得动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的各型单价纯化抗体；

S2、用辣根过氧化物酶通过高碘酸钠法分别对动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的单价纯化抗体进行标记，得动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的检测用酶标抗体，制成单价酶标抗体使用液；

S3、以动物抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原单价纯化抗体分别进行酶标检测板的预包被处理，预包被处理中加入保护剂进行封闭保护；所述保护剂包括但不限于以下成分：BSA、明胶，血清、酪蛋白、白蛋白、海藻糖、磷酸盐、碳酸盐中的一种或多种，在载体板上标示三种不同的颜色分别对应各型脊髓灰质炎病毒D抗原，用不同颜色对加入的抗体型别进行区分，制得预包被载体，所得预包被载体能批量制作且能满足检测条件指标下实现长期存放；

S4、采用各型预包被载体捕获相应待检抗原形成抗原抗体复合物，再与同型酶标记抗体结合，通过底物催化酶显色，根据显色结果完成对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ各型D抗原的联合定性检测或定量检测。

2.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，

步骤S3中所述保护剂为：每1000ml保护剂包含7~13g BSA，7~13海藻糖、3~7g明胶，1~2g酪蛋白，30~70mMol磷酸盐溶液；所述预包被载体使用抽真空包装后存放。

3.根据权利要求2所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，纯化抗体的制备步骤包括：

1）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原抗血清制备：将灭活脊髓灰质炎病毒分别通过10-30%蔗糖密度梯度离心4-8小时，收集D抗原层，经电镜检测确认后用于免疫血清制备；试验动物牛或兔或羊，首免，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型单价灭活病毒D抗原与福氏佐剂等量混匀，皮下注射免疫，每个型的抗原免疫1-2只动物，避免交叉，进行3次加强免疫后采血，分离血清，采用微量中和试验进行血清中和抗体滴度测定；

2）牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原单价纯化抗体制备：取蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；将抗血清与平衡液等体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，保留目的蛋白；用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，脱盐后备用；用lowry法测定蛋白含量，得各型牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体，-20℃以下保存待用，各个型别的免疫血清分开进行纯化，不可交叉，纯化产物不可混淆。

4.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，所述S2步骤包括：将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后，加入NaIO4，静置，加入乙二醇溶液，静置，再与步骤S1所得纯化抗体混合，透析过夜；加硼氢化钠，静置，加饱和硫酸铵，离心；取沉淀溶解后透析过夜；得到单价牛、兔、羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原酶标抗体，低温保存备用，标记过程各型抗体分开进行。

5.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，所述S3步骤包括：

1）酶标检测板包被：将纯化好的各牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的单价纯化抗体分别通过试验确认包被条件，按条件稀释抗体至0.1-15µg/ml后，50-150µl/孔加至酶标专用检测板中，2～8℃过夜，洗板；每块板每个型别加3条24孔，用不同颜色对加入的抗体型别进行区分；

2）酶标检测板封闭：以150-250µl/孔的量加入保护剂，2～8℃过夜，洗板，晾干，真空包装后冰箱保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法，其特征在于，所述S4中定性或定量检测包括以下步骤：

1）将待检的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原样品及其他待检样品系列稀释后分别按型加入预包板检测孔中，定量样品及含量参考品复孔加样，定性检测样品原倍加入，50-150µl/孔；同时分别对应型加入Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原阳性及阴性对照对照各2孔，设空白孔1孔；37℃孵育1-3小时，洗板3-5次；

2）在1）已洗好的酶标检测板中50-150µl/孔加入同型酶标抗体使用液，空白孔不加，37℃孵育0.5-3小时，洗板3-5次；

3）在2）已洗好的酶标检测板中加入TMB显色液，混匀，放入湿盒中，37℃孵育5-15分钟；

4）使用终止终止反应；

5）在检测450nm 波长，630校正波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即可得定性或根据抗原含量参考品计算得定量的检测结果。

7.权利要求1-6任意一项所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法在IPV疫苗分型及D抗原检测的各类样本开发及其质量检定中的应用。

8.权利要求1-6任意一项所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测方法在制备脊髓灰质炎病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

9.一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测用的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂组分：脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合检测板，牛、兔或羊抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原酶标记抗体使用液、牛、兔或羊抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原酶标记抗体使用液、牛、兔或羊抗脊髓灰质炎病毒Ⅲ型D抗原酶标记抗体使用液，保护剂，TMB显色液A、显色液B，浓缩洗液， 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原阳性对照及含量参考品、脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原阳性对照及含量参考品、脊髓灰质炎病毒Ⅲ型D抗原阳性对照及含量参考品, 脊髓灰质炎病毒 D抗原阴性对照。

10.根据权利要求9所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合快速定性、定量检测用的试剂盒，其特征在于，所述脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型D抗原联合检测板的制备方法为：

1）将纯化好的牛或兔或羊抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体通过试验确认包被条件，按条件稀释抗体至0.1-15µg/ml后，50-150µl/孔加至酶标专用检测板中，每块板每个型别加3条24孔，在酶标板上标示三种不同的颜色，用不同颜色对加入的抗体型别进行分区，2～8℃过夜，洗板；

2）酶标检测板封闭：以150-250µl/孔的量加入保护剂，2～8℃过夜，洗板，晾干，真空包装后冰箱保存备用；所述保护剂包括：5%BSA、5%明胶，3%酪蛋白、3%白蛋白、15%海藻糖、20%~30%磷酸盐或碳酸盐。