CN108359706A - 一种用于快速检测耐乙酸乳杆菌的培养基及其制备方法 - Google Patents

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王培武
张晓辉
罗娜
钟葵章
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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测耐乙酸乳杆菌的培养基以及该培养基的制备方法,该培养基的液体配方如下：在1L的添加量如下：MRS粉末52‑72g，啤酒450‑550ml，麦芽糖3‑8g，蒸馏水450‑550ml，pH值4.5‑4.9。本发明通过控制培养基的麦芽糖含量、啤酒含量达到缩短了耐乙酸乳杆菌的检出时间，提高了检出准确率，大幅提高了生产检验效率，而且培养基所需成本低，制作方法简单能够有效降低企业生产成本。

Description

一种用于快速检测耐乙酸乳杆菌的培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种培养基的制作，具体涉及一种用于快速检测耐乙酸乳杆菌的培养基及其制备方法。
背景技术
啤酒行业采用英国进口MRS培养基检测包括乳酸杆菌和四联球菌在内的典型啤酒有害菌。在检出时间上，不同种属的啤酒有害菌在培养基上所需的生长时间不同，容易生长的啤酒有害菌，可2-3天检出，而部分对啤酒有严重危害却难培养的厌氧菌和微好氧菌，则需要7以上甚至更长的培养时间。如耐乙酸乳杆菌是近期国内常见的啤酒腐败菌，它的检出时间有时需高达20天以上。耐乙酸乳杆菌特性是耐低PH,耐低酒精度，耐低苦味值，此菌存在可以导致啤酒沉淀，酸败，严重影响啤酒风味。
不同类型的有害菌，其培养基的成份存在很大差异，通常针对不同啤酒有害菌的生长特性，需要开发相应的培养基。而目前，通常是采用MRS作为耐乙酸乳杆菌的培养基。然而，现有的MRS培养基对耐乙酸乳杆菌等难培养的菌种检出时间过长甚至检不出，检测结果不能真实反应产品的真实微生物状况，检验准确率不高。同时，过长的检出时间也制约了啤酒的发货时间，增加了成品库存时间，提高了仓储成本。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种检出时间短，检出率高的培养基。
本发明的另一目的是提供一种上述检出时间短，检出率高的培养基的制备方法。
为实现上述目的，本发明按以下技术方案予以实现的：
10.一种用于快速检测耐乙酸乳杆菌的培养基,每升该培养基的配方如下：每升该培养基的液体配方如下：MRS粉末52-72g，啤酒450-550ml，麦芽糖3-8g，蒸馏水450-550ml,每升该培养基的液体pH值为4.5-4.9。
进一步地，所述啤酒优选10°P。
进一步地，所述啤酒优选500ml。
进一步地，所述蒸馏水优选500ml。
进一步地，本发明还提供了一种上述培养基的制备方法，包括步骤：
在所述蒸馏水中将所述麦芽糖、所述MRS粉末溶解，形成混合溶液；在溶剂液中加入所述啤酒；加入啤酒后，采用HCl或NaOH调节pH至4.5-4.9，完成培养液体基制作。
进一步地，在形成所述混合溶液的过程中，先将所述麦芽糖溶解在一定量的所述蒸馏水中，形成麦芽糖溶液，然后将剩余的所述蒸馏水加热至95℃时，将所述MRS粉末和所述麦芽糖溶液加入所述剩余的蒸馏水中，均匀搅拌形成所述混合溶液。
进一步地，加入啤酒时的混合溶液的温度55℃。
进一步地，在混合溶液温度为40℃-50℃时，所述培养基液体分装到无菌容器。
进一步地，所述混合溶液制作完成后，将所述混合溶液分装到无菌容器，密封后,蒸汽灭菌，冷却后获得固体培养基。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的培养基，本发明通过控制培养基的麦芽糖含量、啤酒含量达到缩短了培养基对耐乙酸乳杆菌的检出时间，提高了检出准确率，大幅提高了生产检验效率，缩短产品出货周期，能够有效降低企业生产成本。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：
图1显示的是耐乙酸乳杆菌在两种培养基上培养3天的结果；
图2显示的是耐乙酸乳杆菌在本发明的培养基中4天和MRS培养基14天平板上的菌落形态。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
一种用于快速检测耐乙酸乳杆菌的培养基,该培养基的液体配方如下：
在1L的添加量如下：MRS粉末52-72g，啤酒450-550ml，麦芽糖3-8g，pH值4.5-4.9，蒸馏水440-550ml。其中MRS培养基的成份如为(每L的含量)：
蛋白胨10.0g；牛肉粉4.0g，酵母粉4.0g，吐温-80 1ml；磷酸二氢钾2.0g，乙酸钠5.0g，葡萄糖20g，柠檬酸铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉10g，蒸馏水1000ml，培养基pH6.0-6.4。由MRS培养基干燥可得MRS粉末。
在配置本发明的培养基时，采用以下工艺：
以配置1L的培养基为例：
1.称取52-72g MRS粉末培养基和3-8g麦芽糖，量取500ml蒸馏水。
2.在所述蒸馏水中溶解所述麦芽糖、所述MRS粉末，形成混合溶液；在混合溶液中加入所述啤酒；加入啤酒后，采用HCl或NaOH调节pH至4.5-4.9，完成培养基液体制作。
具体的在行程所述混合溶液时，先麦芽糖用适量蒸馏水溶解，将剩余的蒸馏水进行加热，待温度升至95℃时，加入已称好的MRS粉末和麦芽糖溶液。注意要一边加入，一边均匀搅拌，防止MRS粉末和麦芽糖沉淀在容器底部形成结焦。
具体地，在将麦芽糖溶液和MRS分粉末加入到95℃的蒸馏水后，继续加热，在80-85℃保持2-3分钟，使粉末完全溶解。
具体地，当MRS粉末溶解后，停止加热，在上述溶液中加入500ml啤酒，搅拌混合均匀,优选混合温度约为55℃左右。
具体地，加入啤酒后，用2.5mol HCl或NaOH调整pH至4.5-4.9。
具体地，在完成pH的调节后，将培养基分装入已灭菌的瓶子里，塞上塞子，包扎好，121℃蒸汽灭菌15min，分装时温度最好控制在40-50℃。分装冷却后获得固体培养基。
将所配制的培养基应置于阴凉干燥处保存，保存期为2个月。
本发明的培养基的最佳成分为：52-72gMRS粉末，麦芽糖3-8克，pH值为4.5-4.9，啤酒含量为50％(体积)，蒸馏水50％(体积)。在采用其进行耐乙酸乳杆菌培养时，最佳培养温度为25-27℃，厌氧培养。
实施例一：
一种用于快速检测耐乙酸乳杆菌的培养基,该培养基的液体配方如下表1所示：
实验方条件：将耐乙酸乳杆菌菌株活化，得到浓度约108个/ml的菌悬液,再稀释制得浓度约为101个/ml、100个/ml两个菌悬液。
其中100个/ml：表示每毫升菌悬液约含有1-10个菌，101个/ml：表示每毫升菌悬液约含有10-99个菌。
不同浓度菌悬液分别吸取1mL接种于表1中按序号1-25不同参数组合配制的培养基中，同样条件下培养；厌氧培养，培养温度25-27℃，培养20天，每天记录结果。如下表1所示。
表1：比较耐乙酸乳杆菌检出效果的参数配比实验
本发明通过大量实验发现确定麦芽糖添加量、啤酒添加比例和培养基的pH值这三个因素对耐乙酸乳杆菌的生长具有促进作用后，进一步经过配比试验筛选出最佳参数组合。
由表1中可以看出，培养基的成分(每L)为：MRS粉末52-72g，啤酒450-550ml，麦芽糖3-8g，pH值4.5-4.9，蒸馏水440-550m时，均可在3-4天就检测细菌。尤其是培养基液体(每L)成分为中：啤酒为50％(体积比)，麦芽糖为3-8g，pH值为4.5-4.9时，效果最优，其只需要培养3-4天，耐乙酸乳杆菌就有大菌落在培养基上生长，易于检出。
纠其原因是耐乙酸乳杆菌的特性是：革兰性阳性菌，不产生孢子，能在低pH值生长，兼性厌氧菌，过氧化氢酶阴性。3-8g/L的麦芽糖提供的碳源适宜，4.5-4.9的pH提供的酸碱环境是适宜，50％的添加比例既能控制一定酒精度又能模拟微生物在实际啤酒中的生长环境，三者的协同作用，提供了非常适宜于耐乙酸乳杆菌的生长环境，因此，可以快速将耐乙酸乳杆菌检出。
反之，麦芽糖浓度过高10-20g/L带来的过多碳源反而不利于耐乙酸乳杆菌的培养和检出，麦芽糖浓度过低0-2g/L，则不能提供耐乙酸乳杆菌生长所需的足够碳源。pH值过高(5.0-5.5)或过低(3.9-4.4)都不利于菌的生长，特别是在菌浓低(100)时可能检不出，导致结果误判。而在实际大生产中，如果啤酒受耐乙酸乳杆菌的污染，其初始浓度往往是很低的(接近100)，不能检出会提高啤酒微生物污染风险性。
啤酒添加比例过高(75％)导致培养基酒精度过高，不利于微生物的生长，而量太低(25％)则啤酒本身能提供的营养物质太少。具体实施中，啤酒优选选择是10°的啤酒，以纯生或雪堡系列啤酒最好。
实施例二
实验条件：
不同浓度菌悬液分别吸取1mL接种于本发明的培养基和MRS培养基，同样条件下培养；厌氧培养，培养温度25-27℃，培养20天，每天记录结果。如下表2所示。
表2位本发明的培养基和现有的MRS培养基对乙酸乳杆菌的检出时间对照表。
由表2可知，本发明的培养基中对耐乙酸乳杆菌的检出优势是很突出的，由以前的14-20天不等，缩短至3-5天检出，检出天数比MRS培养基缩短了10天以上，很大程度提高了检出速率。
图1、图2为采用102浓度(约100-999个/ml)的耐乙酸乳杆菌菌悬液1mL接种于本发明的培养基和MRS培养基上的菌落生长对照效果图。
如图1A所示，本发明的培养基培养3天时，菌落已很明显，菌落已大于100，且菌落形态大，易观察，图1B所示，MRS培养基培养3天时基本没有无观察到菌落。如图2A所示，本发明的培养基培养4天时菌落已很大且呈现明显乳白色。如图2B所示，MRS培养基培养14天时才观察到菌落，菌落较小。由此可见，相比于传统的MRS培养基，本发明的培养基，不仅仅促进耐乙酸乳杆菌生长不仅仅体现在菌落数量上，而且在也体现在菌落形态上，从而大大缩短了耐乙酸乳杆菌的检出时间，本发明的培养基可将耐乙酸乳杆菌的常规检出时间缩短达3倍以上。
实施例三
实验条件：
同一样品经富集处理后分别在本发明的培养基和MRS培养基培养，培养条件一致：厌氧培养，培养温度25-27℃，培养20天，每天记录结果。如下表3所示。
表3本发明的培养基和现有MRS培养基的批量检测试验对照表
表3为本发明的培养基和现有MRS培养基的批量检测试验对照表。由表中可以看出，250批样品中，本发明的培养基检出率为14.4％，MRS培养基检出率8.8％，对检出菌作鉴定，本发明的养基检出菌均是啤酒有害菌，MRS培养基检出菌22批中有10批是杂菌，非啤酒有害菌。剔除这10批，MRS检出有害菌率只有4.8％。本发明的培养基对有害菌的检出率和准确率均比MRS培养基高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种用于快速检测耐乙酸乳杆菌的培养基,其特征在于，每升该培养基的液体配方如下：MRS粉末52-72g，啤酒450-550ml，麦芽糖3-8g，蒸馏水450-550ml；每升该培养基的液体pH值为4.5-4.9。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述啤酒优选10°P。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述啤酒优选500ml。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述蒸馏水优选500ml。
5.一种如权利要求1-4项中任一项培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括：在所述蒸馏水中溶解所述麦芽糖、所述MRS粉末，形成混合溶液；在所述混合溶液中加入所述啤酒；加入啤酒后，采用HCl或NaOH调节pH至4.5-4.9，完成培养基液体制作。
6.根据权利要求5所述的培养基的制备方法，其特征在于:在形成所述混合溶液的过程中，先将所述麦芽糖溶解在一定量的所述蒸馏水中，形成麦芽糖溶液，然后将剩余的所述蒸馏水加热至95℃时，将所述MRS粉末和所述麦芽糖溶液加入所述剩余的蒸馏水中，均匀搅拌形成所述混合溶液。
7.根据权利要求6所述的培养基的制备方法，其特征在于：加入啤酒时，所述混合溶液的温度为55℃。
8.根据权利要求7所述的培养基的制备方法，其特征在于：在培养基液体温度为40℃-50℃时，将所述培养基液体分装到无菌容器。
9.根据权利要求5所述的培养基的制备方法，其特征在于：所述培养基液体制作完成后，将所述培养基液体分装到无菌容器，密封后,进行蒸汽灭菌，分装冷却后获得固体培养基。
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