CN108359453A - 一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点及其制备方法，属于化学和材料科学技术领域。是将邻苯二胺固体溶于去离子水中，加入浓酸形成混合反应液；然后在温度160～250℃，密封的条件下充分反应，得到墨蓝色溶液；用0.22μm水系滤头过滤，以除去大尺寸的粒子；然后用分子量为500～3500的渗析袋渗析4～12小时，除去多余的酸，得到红光发射的碳化聚合物点水溶液，冻干后得到固体粉末，即碳化聚合物点。该碳化聚合物点粒径在1～20nm之间，具有明显的晶格结构，半峰宽窄，无激发依赖性。其水溶液中荧光量子产率大于10％，醇溶液中量子效率大于30％，易于实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于化学和材料科学技术领域，具体涉及一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点及其制备方法。
背景技术
碳点通常是指尺寸小于20纳米的、具有荧光性质的含碳纳米颗粒。其化学结构可以是sp2、sp3的杂化碳结构，具有单层或多层石墨结构，也可以是聚合物类的聚集颗粒。一般地，碳点的制备方法主要分为两大类：“自上而下”法和“自下而上”法。前者通常是将宏观碳材料片段通过物理或化学方法切割成碳纳米点；后者则是分子前驱体经微波或水热处理后形成二聚体、寡聚体或聚合物，这些中间体进一步聚合、脱水、碳化形成碳化聚合物点。
近年来，碳点凭借其较高的量子效率、较低的毒性、绿色环境友好的制备方法及良好的稳定性等诸多优异的特性，被广泛应用于光电器件、催化、生物医学等领域。尽管碳点的制备方法众多，但所得到的碳点的最佳发射峰位往往位于蓝绿光区，而红光由于背景光干扰小、组织穿透性强、对生物体的伤害小且作为制备全色显示器件的主要成分之一，一直备受人们的青睐。不过目前已报道的多数红光碳点存在制备过程复杂、水溶性差、荧光效率低、半峰宽宽等缺陷，极大程度上制约了它们在生物医学及光电领域的应用。
此外，恶性脑瘤难治性高、发病率高、复发率高、死亡率高、治愈率低，严重危害人类的健康，常用的放疗、化疗用量大，易产生耐药性，副作用较大，且血脑屏障极大地阻碍各种药物进入脑部肿瘤部位。而目前已报道的绝大多数低毒纳米粒子(量子点、碳点等)均不能通过血脑屏障，因此，对于脑部疾病的诊治仍是医学领域的一大难点。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种由邻苯二胺制备的、具有良好生物相容性的、可通过血脑屏障的、高荧光量子效率的红光碳化聚合物点及其制备方法。
本发明所述的一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点，其荧光发射峰位于600～800nm之间，水溶液中量子效率(绝对量子效率)大于10％，醇溶液中量子效率(绝对量子效率)大于30％。
进一步的，所述碳化聚合物点的粒径在1～20nm之间，平均尺寸5.5nm，具有明显的晶格结构，表面官能团主要为氨基，最佳发射峰位于630nm和670nm左右，整体表现出无激发依赖性的光学性质。
本发明所述的一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点的制备方法，其步骤如下：
(1)将邻苯二胺固体溶于10mL去离子水中，邻苯二胺的浓度范围为2.7～5.4mg/mL，加入浓酸形成混合反应液；
(2)将步骤(1)得到的混合反应液置于不锈钢反应釜中，在160～250℃、密封的条件下充分反应，得到墨蓝色溶液；
(3)将步骤(2)得到的溶液用0.22μm水系滤头过滤，以除去大尺寸的粒子；然后用分子量为500～3500的渗析袋渗析4～12小时，除去多余的酸，得到红光发射的碳化聚合物点水溶液，冻干后得到固体粉末，即本发明所述可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点。
进一步，步骤(1)中所述的浓酸为浓硝酸(质量分数65～68％，北京化工生产)、浓盐酸(质量分数36～38％，北京化工生产)、浓硫酸(质量分数95～98％，北京化工生产)。
进一步，步骤(1)中所述的混合反应液，邻苯二胺与浓酸用量的摩尔比例为1：1.45～2.03。
进一步，步骤(2)中是将所述混合反应液在温度为160～250℃条件下反应5～24小时，从而得到所述墨蓝色溶液；密封的反应器为烘箱、马弗炉、高压微波反应釜等。
再进一步，步骤(2)中是将所述混合反应液在温度为200～250℃条件下反应5～12h，从而得到所述墨蓝色溶液。
本发明的优良效果为：
(1)本发明的具有红光发射的碳化聚合物点具有高荧光量子效率(绝对量子效率可以大于30％)，半峰宽窄(约为40nm)，且荧光发射波长不随激发波长的变化而变化，此碳化聚合物点表现出良好的生物相容性，较强的穿透性(图3和4可以证明生物相容性，图5可以证明穿透性)。且是首个可通过血脑屏障的红光碳化聚合物点，其在光电显示、生物医学，尤其是脑部疾病的诊治方面具有重要的广阔应用前景。
(2)本发明碳化聚合点的制备工艺简单快速，操作方便，成本低廉，产率高，无需对其进行后续修饰处理，也不需要昂贵复杂的设备，易于实现工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：实施例1所制备的红光碳化聚合物点的荧光光谱图，插图为碳化聚合物点水溶液在540nm激光下的光学照片；
图2：实施例1所制备的红光碳化聚合物点的的形貌表征，a、b、c、d、e分别为透射电子显微镜图、高分辨透射电子图、高分辨透射电子图、电子衍射图和粒径统计分布图，f为原子力显微镜图，g为图f中斜线出粒子所对应的高度分布；
图3：将不同浓度(0、100、200、300、400、500、600μg/mL)的实施例1所制备的红光碳化聚合物点分别与小鼠成骨细胞(图a)和骨髓基质干细胞(图b)进行共培养，以探究本发明的碳化聚合物点的细胞毒性；
图4：对实施例1所制备的碳化聚合物点进行体内毒性的评价，主要包括心(Heart)、肾(Kidney)、膀胱(Bladder)、肝(Liver)、肺(Lung)、脾(Spleen)等脏器；
图5：实施例1所制备的红光碳化聚合物点溶于磷酸缓冲盐溶液(以下简称PBS)中，静脉注入裸鼠体内后，所收集的不同实验时间点的实时脑部成像图；
图6：实施例2所制备的红光碳化聚合物点的荧光光谱图；
图7：实施例3所制备的红光碳化聚合物点的荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，显然，，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合实施例的目的是详细地阐释本发明，而不是要以此对本发明进行限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、红光碳化聚合物点的制备
称取邻苯二胺固体(阿拉丁)54mg(0.5mmol)溶解于10mL去离子水中，量取浓硝酸(质量分数65％，北京化工)50μL加入邻苯二胺水溶液里，用玻璃棒搅拌均匀。将液体转移入20mL容积聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，拧紧釜盖，再将反应釜放置于已经升温至200℃的烘箱中，保温10小时后将反应釜取出。使反应釜自然冷却到室温，取上清液用0.22μm水系滤头过滤，以除去大尺寸的粒子，用分子量为3500的渗析袋渗析8小时，除去多余的酸，获得红光发射的碳化聚合物点水溶液，将目标产物放在零下80℃的冻干机中冻干，得到固体粉末保存(质量约为30mg)。对所制备的碳化聚合物点的水溶液进行光学性质的表征，结果如图1所示。其荧光发射峰半峰宽较窄(约40nm)，且荧光发射峰基本不随着激发光波长的变化而变化，即由波长为380～640nm的光所激发出的荧光都主要集中在600～800nm之间，属于红光区，且最佳发射峰位于630和670nm左右。插图结果表明，在540nm激发光下，本发明的碳化聚合物点的水溶液可发出明亮的红色荧光。经透射电子显微镜、高分辨透射和原子力显微镜测试表明，本实施例所获目标产物为碳化聚合物点(图2)，平均尺寸为5.5nm，高度约为4.5nm，具有明显的晶格结构。
2、对实施例1所制备的碳化聚合物点进行细胞毒性的评价
(1)将小鼠成骨细胞(MC3T3细胞，每150μL中含有104个细胞)先在保温箱(37℃，体积分数为5％CO2)中培养24小时，而后在100μL细胞培养基(高糖最低基础培养基，品牌为Gibco，美国赛默飞世尔生产)中,(培养基中含有实施例1所制备的碳化聚合物点，浓度分别为0、100、200、300、400、500、600μg/mL)培养24小时。然后往每个培养池子中加入20μL MTT溶液(5mg/mL)。再培养4小时后，除掉MTT溶液，加入150μL DMSO，在室温下晃动5分钟。细胞活性根据检测混合液在490nm处的吸光度值(OD)和下列方程式计算：
细胞存活率(％)＝(OD实验组/OD对照组)×100％
结果如图3a所示，随着本发明碳化聚合物点浓度的增加，MC3T3细胞的存活率没有明显变化，且当碳化聚合物点浓度为600μg/mL时，细胞存活率仍高于90％，说明本发明的碳化聚合物点的低毒性及良好的生物相容性。
(2)将骨髓基质干细胞(BMSCs细胞，每150μL中含有104个细胞)先在保温箱(37℃，体积分数为5％CO2，)中培养24小时，而后在100μL细胞培养基(低糖最低基础培养基，品牌为Gibco，美国赛默飞世尔生产)中(培养基中含有实施例1所制备的碳化聚合物点，浓度分别为0、100、200、300、400、500、600μg/mL)培养24小时。然后往每个培养池子中加入20μLMTT溶液(5mg/mL)。再培养4小时后，除掉MTT溶液，加入150μL DMSO，在室温下晃动5分钟。细胞活性根据检测混合液在490nm处的吸光度值(OD)和下列方程式计算：
细胞存活率(％)＝(OD实验组/OD对照组)×100％
结果如图3b所示，随着本发明碳化聚合物点浓度的增加，BMSCs细胞的存活率没有明显变化，且当碳化聚合物点浓度为600μg/mL时，细胞存活率仍高于90％，说明本发明的碳化聚合物点的低毒性及良好的生物相容性。
3、对实施例1所制备的碳化聚合物点进行体内毒性的评价
12只ICR雄性小鼠(体重16～20g，ICR：美国癌症研究机构)，随机分为2组：空白对照组和实验组，每组6只(平行试验)。实验组尾静脉注射碳化聚合物点(25mg/kg)，空白对照组给等体积PBS缓冲液，实验组、对照组分别培养1天和7天。采用颈椎脱臼法处死小鼠，收集心(Heart)、肾(Kidney)、膀胱(Bladder)、肝(Liver)、肺(Lung)、脾(Spleen)等脏器。经4％(体积百分数)多聚甲醛固定48小时后，逐级脱水、石蜡包埋、切片及苏木精-伊红(H&E)染色，然后由两名专业的病理科医生在显微镜下观察组织学改变，评价材料植入后对各脏器组织学的影响；接下来选取有代表性的切片，采用奥林巴斯成像系统(DP73，日本)照相。实验结果(图4)表明：与对照组相比，各组的心肌纤维形态正常，核呈现椭圆形，可见肌纤维呈带状，肌纤维互相吻合；肾脏内肾单位结构正常，肾小体和肾小管结构清晰，未见异常病理形态；膀胱结构层次清楚，可见正常的黏膜层皱壁形成；肝脏内肝小叶结构正常，以中央静脉为中心，肝细胞形成清晰的条索状结构；肺脏内可见正常的肺泡管和肺泡囊结构，肺泡由单层肺泡上皮构成，基膜完整，相邻肺泡间由薄层肺泡间隔；脾脏结构正常，可见正常的淋巴细胞形态和脾小体结构；因此，1天和7天的实验组各脏器(心、肝、脾、肺、肾、膀胱)均无明显的组织学异常表现，从而进一步证明了本发明的碳化聚合物点的低毒性及良好的生物相容性，可安全的应用于活体实验及相关应用中。
4、对实施例1所制备的碳化聚合物点进行脑部成像实验
18只裸鼠(体重16～20g)，随机分为空白对照组(3只)和实验组(15只)。实验组将实施例1所制备的红光碳化聚合物点通过尾静脉注射裸鼠体内(25mg/kg)，空白对照组给等体积PBS缓冲液(pH为7.2～7.4)。实验组15只裸鼠随机分成5组，每组3只(平行试验)；分别在处死小鼠前20、3.0、1.5、1.0、0.5小时时静脉注射碳化聚合物点，对照组于处死小鼠前20小时注射同等剂量的PBS溶液(参照注射碳化聚合物量计算PBS体积)，然后同时麻醉18只裸鼠，分组处理各裸鼠的大脑，采集脑部图像如图5所示。结果表明：静脉注射碳化聚合物点0.5、1.0、1.5、3.0小时时，大脑表现出清晰、较强的荧光信号，证明本发明制备的碳化聚合物点具有较强的穿透性。随着时间的延长，荧光信号逐渐减弱，进一步表明实施例1所制备的红光碳化聚合物点可随血液流通至脑部，并轻易地通过血脑屏障，且随着时间的延长，逐渐被代谢出体外。
实施例2
称取邻苯二胺固体(阿拉丁)54mg(0.5mmol)溶解于10mL去离子水中，量取浓硝酸(质量分数65％，北京化工)60μL加入邻苯二胺水溶液里，用玻璃棒搅拌均匀。将液体转移入20mL容积聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，拧紧釜盖，再将反应釜放置于已经升温至200℃的烘箱中，保温10小时后将反应釜取出。使反应釜自然冷却到室温，取上清液用0.22μm水系滤头过滤，以除去大尺寸的粒子，用分子量为3500的渗析袋渗析8小时，除去多余的酸，获得红光发射的碳化聚合物点水溶液，将目标产物放在零下80℃的冻干机中冻干，得到固体粉末保存(质量约为32mg)。
本实施例所获碳点的荧光光谱图如图6所示，其荧光发射峰半峰宽较窄(约40nm)，且荧光发射峰基本不随着激发光波长的变化而变化，荧光峰位都主要集中在600～800nm之间，属于红光区。
实施例3
称取邻苯二胺固体(阿拉丁)54mg(0.5mmol)溶解于10mL去离子水中，量取浓硝酸(质量分数65％，北京化工)50μL加入邻苯二胺水溶液里，用玻璃棒搅拌均匀。将液体转移入20mL容积聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，拧紧釜盖，再将反应釜放置于已经升温至200℃的烘箱中，保温10小时后将反应釜取出。使反应釜自然冷却到室温，取上清液用0.22μm水系滤头过滤，以除去大尺寸的粒子，用分子量为3500的渗析袋渗析8小时，除去多余的酸，获得红光发射的碳化聚合物点水溶液，将目标产物放在零下80℃的冻干机中冻干，得到固体粉末保存(质量约为33mg)。
本实施例所获碳点的荧光光谱图如图7所示，其荧光发射峰半峰宽较窄(约40nm)，且荧光发射峰基本不随着激发光波长的变化而变化，荧光峰位都主要集中在600～800nm之间，属于红光区。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点的制备方法，其步骤如下：
(1)将邻苯二胺固体溶于10mL去离子水中，邻苯二胺的浓度范围为2.7～5.4mg/mL，加入浓酸形成混合反应液；
(2)将步骤(1)得到的混合反应液在温度160～250℃，密封条件下充分反应，得到墨蓝色溶液；
(3)将步骤(2)得到的溶液用0.22μm水系滤头过滤，以除去大尺寸的粒子；然后用分子量为500～3500的渗析袋渗析4～12小时，除去多余的酸，得到红光发射的碳化聚合物点水溶液，冻干后得到固体粉末，即为可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点。
2.如权利要求1所述的一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的浓酸为质量分数65～68％的浓硝酸、质量分数36～38％的浓盐酸或质量分数95～98％的浓硫酸。
3.如权利要求1所述的一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点的制备方法，其特征在于：步骤(1)中邻苯二胺与浓酸用量的摩尔比例为1：1.45～2.03。
4.如权利要求1所述的一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点的制备方法，其特征在于：步骤(2)中是在温度为160～250℃条件下反应5～24小时，得到墨蓝色溶液。
5.如权利要求1所述的一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的密封条件的反应器为烘箱、马弗炉或高压微波反应釜。
6.如权利要求4所述的一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点的制备方法，其特征在于：是在温度为200～250℃条件下反应5～12h，得到墨蓝色溶液。
7.一种由邻苯二胺制备的可通过血脑屏障的高荧光量子效率的红光碳化聚合物点，其特征在于：是由权利要求1～6任何一项所述的方法制备得到。
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