CN108350008A

CN108350008A - 一种新型的无环核苷类似物及其药物组合物

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Publication number: CN108350008A
Application number: CN201780003928.7A
Authority: CN
Inventors: 王义汉; 赵九洋
Original assignee: Shenzhen Targetrx Inc
Current assignee: Shenzhen Targetrx Inc
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: WO2017157137A1; CN108350008B

Abstract

本发明提供了一种新型的无环核苷类似物及其药物组合物，所述新型的无环核苷类似物如为式（I）所示的化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、前药、立体异构体、水合物或溶剂化合物。本发明的化合物可抑制核苷类逆转录酶活性，同时具有更好药效学/药代动力学性能，化合物的适用性好、安全性高，可用于制备治疗病毒感染相关疾病的药物。

Description

一种新型的无环核苷类似物及其药物组合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种新型的无环核苷类似物及其药物组合物，其可用于治疗病毒感染的相关疾病。

背景技术

艾滋病，是由HIV感染引起的严重疾病，自1981年首例艾滋病案被报道以来，全球累计已有近7000万人被艾滋病病毒所感染，2000多万人死于艾滋病。在过去的20年里，虽然有效的药物治疗曾使艾滋病的死亡率有所下降，但每年仍新增数以百万的人被艾滋病毒感染，全球艾滋患者的数目一直呈上升趋势。

乙型肝炎(hepatitis B)是一种发病率高、感染力强、严重危害人类健康的世界性流行性传染病。目前，全世界约有20亿人感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)，其中3.5亿人成为慢性HBV携带者，全球每年约100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。我国是乙型肝炎的高发区，根根据2002年全国HBV感染者血清流行病学调查，HBsAg的流行率为9.09％，约有1.2亿人携带HBV。其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者3000多万。慢性乙肝患者中有15％-25％的危险死于HBV相关性肝脏疾病，包括慢性重型肝病、肝硬化及肝细胞癌，肝硬化失代偿的年发生率约3％，5年累计发生率约16％，其中6％-15％可发展为肝细胞癌(hepatic cell carcinoma,HCC)。慢性乙肝、代偿期和失代偿期肝硬化的5年病死率分别为0％-2％、14％-20％和70％-86％。我国每年有30万人以上死于乙肝相关性并发症。此外，婴儿时期感染HBV者，90％以上成为慢性HBV携带者，并且随着年龄的增长演变为慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。HBV的持续复制是造成慢性乙肝患者肝脏炎症持续发展，并导致肝硬化和肝癌发生的重要因素。

近十几年来，抗人类免疫缺陷病毒(human im-munodeficiency virus,HIV)药物研究取得了巨大进展。目前，美国食品及药品管理局已经批准了至少27种用于治疗HIV感染的抗病毒药物。抗HIV药物主要包括4大类:核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、蛋白酶抑制剂(PIs)和HIV整合酶抑制剂，其中NRTIs是应用最早、品种最多的一类，主要包括齐多夫定(AZT)，拉米夫定、去羟基酐、斯坦福定、阿巴卡韦和替诺福韦。

核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)，是合成HIV的DNA逆转录酶底物脱氧核苷酸的类似物，在体内转化成活性的三磷酸核苷衍生物，与天然的三磷酸脱氧核苷竞争性与HIV逆转录酶(RT)结合，抑制RT的作用，阻碍前病毒的合成。NRTIs的结构与核苷类似，为双脱氧核苷衍生物，可与细胞内核苷竞争性地结合逆转录酶，从而终止逆转录反应。

HIV和HBV感染导致的病毒性疾病传染性很强，严重威胁着人类的健康，在过去的几十年里，基于HIV/HBV的抗病毒药物不断被开发出来，Tenofovir(GS-1278，(R)-PMPA)及其前药TDF是其中重要的成员。虽然TDF是目前抗逆转录病毒效果最好的药物之一且许多国家的抗病毒指南已经推荐其作为抗HIV/HBV的一线用药，但是它仍然存在一定的缺陷，主要包括靶细胞吸收效率低、耐药和潜在的肾毒性风险。因此，本领域仍需要开发对核苷类逆转录酶有抑制活性或更好药效学性能的化合物。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种核苷类逆转录酶抑制剂、药物组合物及其应用，其具有更好的核苷类逆转录酶抑制活性和/或具有更好药效学/药代动力学性能。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种核苷类逆转录酶抑制剂，如式(I)所示新型的无环核苷类似物，或其晶型、药学上可接受的盐、前药、立体异构体、水合物或溶剂化合物，

其中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地为氢、氘或卤素；

X选自“氢(H)、氘(D)、烷基(C_nH_2n+1，n<17)、一次或多次氘代的烷基(C_nH_2n+1，n<17)”；

作为本发明的进一步改进，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、 R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶和X中至少一个是氘代的或含氘。

作为本发明的进一步改进，R¹和R²各自独立地为氘或氢。

作为本发明的进一步改进，R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地为氘或氢。

作为本发明的进一步改进，R⁹和R¹⁰各自独立地为氘或氢。

作为本发明的进一步改进，R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地为氘或氢。

作为本发明的进一步改进，X是烷基、一次或多次氘代的烷基(C_nH_2n+1，n<17)。

作为本发明的进一步改进，所述化合物可选自下述化合物或其药学上可接受的盐，但不局限于下列化合物：

采用此技术方案，氘在药物分子中的形状和体积与氢基本上相同，如果药物分子中氢被选择性替换为氘，氘代药物一般还会保留原来的生物活性和选择性。同时发明人经过实验证实，碳氘键的结合比碳氢键的结合更稳定，可直接影响一些药物的吸收、分布、代谢和排泄等属性，从而提高药物的疗效、安全性和耐受性。

优选的，氘在氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量(0.015％)，较佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于 99％。

具体地说，在本发明中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶和X各氘代位置中氘同位素含量至少是5％，较佳地大于10％，更佳地大于15％，更佳地大于20％，更佳地大于25％，更佳地大于30％，更佳地大于35％，更佳地大于40％，更佳地大于45％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。

在另一优选例中，式(I)中化合物的R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶和X，至少其中一个R/X含氘，更佳地两个R/X含氘，更佳地三个R/X含氘，更佳地四个R/X含氘，更佳地五个R/X含氘，更佳地六个R/X含氘，更佳地七个R/X含氘，更佳地八个R/X含氘，更佳地九个R/X含氘，更佳地十个R含氘，更佳地十一个R/X含氘，更佳地十二个R/X含氘，更佳地十三个R/X含氘，更佳地十四个R/X含氘，更佳地十五个R/X含氘，更佳地十六个R/X含氘。

在另一优选例中，所述化合物不包括非氘代化合物。

本发明还公开了一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体和如上所述的所述的核苷类逆转录酶抑制剂，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物、立体异构体、前药或同位素变体的药物组合物。

作为本发明的进一步改进，所述药学上可接受的载体包括助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂中的至少一种。

作为本发明的进一步改进，所述药物组合物为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球或气溶胶。

给予本发明药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。优选口服给药或注射给药。

本发明的药物组合物可以采用本领域周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。

本发明还提供了一种制备药物组合物的方法，包括步骤：将药学上可接受的载体与如上所述的核苷类逆转录酶抑制剂，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物进行混合，形成药物组合物。

作为本发明的进一步改进，其还包含其他活性化合物，所述活性化合物为免疫调节剂或抗病毒药物化合物，可选自拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、司他夫定、扎西他滨、去羟肌苷、恩曲他滨、替诺福韦、地拉韦啶、依法韦仑、依曲韦林、奈韦拉平、氨普那韦、阿扎那韦、地瑞那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、替拉那韦、马拉韦罗、恩夫韦肽和雷特格韦。

本发明的活性成分也可与其他活性成分联合使用。这种组合的选择基于治疗的情况、成份的交叉反应性和联合的药学性质。还可能使本发明的任意化合物联合一种或多种其他活性成分，以单一剂型同时或连续对患者给药。联合治疗可以同时或连续给药方案给药。当连续给药时，联合可以两次或更多次给药施用。联合治疗可提供“增效作用”或“协同作用”，换言之，当活性成分一起使用获得的效果大于分开使用化合物所得效果之和。当活性成分：(1)被共同配制和给药或以组合制剂形式同时递送；(2)作为独立的制剂交替给药或平行给药；或(3)通过一些其他给药方案时，可获得协同作用。当以交替治疗递送时，当化合物序贯给药或释放，例如以独立的片剂、丸剂或胶囊剂，或通过单独注射器的不同注射，可获得协同作用。通常，在交替治疗期间，每种活性成分有效剂量被序贯，即连续地给予，而在联合治疗中，两种或更多种活性成分的有效剂量共同给予。

本发明还公开了一种如上所述的取代的无环核苷类似物作为核苷类逆转录酶抑制剂的用途，即本发明化合物可有利地适用作治疗如艾滋病和乙型肝炎的病状的治疗剂。

本发明中使用的“治疗”适用于获得有益的或需要的结果(包括临床结果)的途径。为了本发明的目的，有益的或需要的结果包括(但不限于)缓解或改善一种或多种症状，减小病变范围，稳定的(即，非恶化的)疾病状态，预防疾病扩散，延缓或减慢疾病进展，疾病状态的改善或环节和减轻(无论是局部的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本文中，如无特别说明，“卤素”指F、Cl、Br、和I。更佳地，卤原子选自F、Cl和Br。

本文中，如无特别说明，“氘代”指化合物或基团中的一个或多个氢被氘所取代；氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。术语“一个或多个氘代的”与“一次或多次氘代”可互换使用。

本文中，如无特别说明，“非氘代的化合物”是指含氘原子比例不高于天然氘同位素含量(0.015％)的化合物。

本发明的组合物任选包含这里化合物的盐，特别是药学上可接受的无毒的盐，含有，例如，Na⁺、Li⁺、K⁺、Ca⁺²和Mg⁺²。这些盐可包括通过适宜的阳离子，例如碱和碱土金属离子或铵和四价氨基离子和酸阴离子部分，典型的是羧酸的结合而衍生的盐。如想获得水溶性盐，则优选一价盐。金属盐典型地通过使金属氢氧化物与本发明的化合物反应制备。在这种方法制备的金属盐的实施例是含有Li⁺、Na⁺和K⁺的盐。通过添加适宜金属化合物，更不溶性金属盐可从更可溶性盐溶液中沉淀出来。另外，盐可以由添加某些有机酸和无机酸形成，例如，HCl、HBr、H₂SO₄、H₃PO₄或有机磺酸，到碱性中心，典型的是胺，或到酸性基团而形成。最后，可以理解，此处的组合物包含以它们未电离的，以及两性离子形式存在的本发明化合物，和与如水合物中的化学计算量的水组合。在本发明范围内也包括母体化合物与一种或多种氨基酸的盐。上述的任意一种氨基酸都是适宜的，特别是作为蛋白质成分发现的天然发生的氨基酸，尽管该氨基酸典型地是一种带有具有碱性或酸性基团的侧链的氨基酸，例如，赖氨酸、精氨酸或谷氨酸，或带有具有中性基团的侧链的氨基酸，例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。

本发明化合物可具有手性中心，例如，手性碳或磷原子。本发明化合物因此包括所有立体异构体的外消旋混合物，包括对映体、非对映体和阻转异构体。另外，本发明化合物包括在任意或全部不对称手性原子上的富集的或拆分的旋光异构体。换句话说，从描述中显而易见的手性中心被作为手性异构体或外消旋混合物提供。外消旋混合物和非对映的混合物，以及实质上不含它们的对映或非对映的配偶体、分离或合成的单独旋光异构体，全部落在本发明的保护范围内。通过已知技术，例如，分离用旋光活性的助剂例如，酸或碱形成的非对映的盐，接着转回为旋光活性物质，外消旋混合物被分离成他们的单个的、实质上光学纯的同分异构体。在大多数情况下，想得到的旋光异构体是通过立体特异反应，从希望的原料的适宜立体异构体开始进行合成的。

在某些情况中，本发明化合物也可能以互变异构体的形式存在。尽管仅有一种非定域共振结构可能被描述，但设想所有的这类形式都落在本发明的保护范围内。例如，对于嘌呤、嘧啶、咪唑、胍、脒和四唑系统而言，烯-胺互变异构体可能存在，并且所有它们可能的互变异构形式都落在本发明保护范围内。

术语“溶剂合物”指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定比例的配合物。“水合物”是指本发明化合物与水进行配位形成的配合物。

本发明所用的“人免疫缺陷病毒”(或“HIV”)包括其所有的亚型，包括HIV的A、B、C、D、E、F、G和O亚型以及HIV-2。

本发明所用的“乙型肝炎病毒”(或“HBV”)包括其所有的亚型(adw、adr、ayw和ayr)和/或基因型(A、B、C、D、E、F、G和H)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的化合物对核苷类逆转录酶具有优异的抑制性；通过氘化这一技术改变化合物在生物体中的代谢，使化合物具有更好的药代动力学参数特性。在这种情况下，可以改变剂量并形成长效制剂，改善适用性；用氘取代化合物中的氢原子，由于其氘同位素效应，提高化合物在动物体内的药物浓度，提高了药物疗效；用氘取代化合物中的氢原子，可以抑制某些代谢产物，提高了化合物的安全性。

具体实施方式

下面更具体地描述本发明式(I)结构化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。

通常，在制备流程中，各反应通常在惰性溶剂中，在室温至回流温度(如0℃～100℃，优选0℃～80℃)下进行。反应时间通常为0.1小时-60小时，较佳地为0.5-24小时。

实施例1制备(R)-9-{2-[(十六烷氧基-d6-丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤，即化合物 T-1，具体合成步骤如下：

步骤1 (R)-9-(2-羟基丙基)腺嘌呤(化合物3)的合成。

在反应瓶中加入腺嘌呤(4.0g，29.6mmol)和(R)-碳酸丙烯酯(3.45g，33.8mmol)，加入4.5mL DMF溶解，加热至130℃反应过夜，TLC检测反应完全后，降温至100℃，加入14mL甲苯和0.47g甲磺酸(保持内温在100-110℃)，再加入11mL甲苯得到一个均相混悬液，逐渐降温至室温，再降温至0℃保持1小时，过滤的白色固体，真空干燥得5.77g产物，收率100％。LC-MS(APCI):m/z＝194.3(M+1)⁺。

步骤2 二乙基[[(对甲苯磺酰基)氧基]甲基]磷酸酯(化合物5)的合成。

在反应瓶中加入羟甲基磷酸二乙酯(3.85g，22.89mmol)，加入30mL无水乙醚溶解，滴加三乙胺(3.38mL，24.04mmol)，加毕，降温至-10℃，滴加对甲苯磺酰氯(4.58g，24.04mmol)的10mL乙醚溶液，加毕，0℃下搅拌反应3小时，再升至室温反应过夜。加入少量乙醚稀释，过滤除去无机盐，滤液浓缩，硅胶柱层析纯化，真空干燥得产物5.4g，收率73.2％。LC-MS(APCI):m/z＝323.1(M+1)⁺。

步骤3 (R)-9-[2-(二乙基磷酰甲氧基)丙基]腺嘌呤(化合物6)的合成。

将化合物3(1.0g，5.17mmol)用40ml无水DMF溶解，降温至0℃，氮气保护下加入NaH(233.3mg)低温下反应40分钟，加入化合物5(1.75g，5.44mmol)的10mL无水DMF溶解，升至室温反应18小时，TLC检测反应完毕后浓缩除去溶剂，硅胶柱层析纯化，蒸干后得产物0.88g，收率50％。LC-MS(APCI):m/z＝344.5(M+1)⁺。

步骤4 (R)-9-[2-(磷酰甲氧基)丙基]腺嘌呤(化合物7)的合成。

在干燥的反应瓶中加入化合物6(2.276g，6.63mmol)，加入20mL无水DMF溶解，室温下加入TMSBr(3.76g，24.57mmol)，搅拌反应20小时，TLC检测反应完成后，浓缩除去溶剂，加入氨水调PH至8.0，浓缩得油状液体，用稀盐酸调PH至3.0，再次蒸干，加入异丙醇析出黄色固体，过滤，用异丙醇/水(3:1)重结晶得白色固体0.57g，收率30.1％。LC-MS(APCI):m/z＝286.7(M-1)^-。

步骤5 3-十六烷氧基-1,2,3-d6-1-丙醇(化合物9)的合成。

在反应瓶中加入溴代十六烷(619.9mg，2.03mmol)和d6-1,3-丙二醇(500mg，6.09mmol)，加入3mL二甲基亚砜和3mL四氢呋喃溶解，加入氢氧化钠(324.8mg，8.12mmol)室温下反应24小时。加入5mL水稀释，用2M稀盐酸调PH至中性，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶柱层析纯化得化合物0.60g，收率：96％。LC-MS(APCI):m/z＝307.5(M+1)⁺。

步骤6 (R)-9-{2-[(十六烷氧基-d6-丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤(化合物T-1)的合成。

在反应瓶中加入化合物7(240mg，0.836mmol)、化合物9(306.5mg，1.00mmol)和10mL DMF，加热至85℃，加入三乙胺(104mg，1.03mmol)，升温至100℃，加入二环己基碳二亚胺(DCC，281mg，1.36mmol)，再升至120℃搅拌反应16小时。TLC检测原料消失后降温至室温，过滤除去不溶物，用少量DMF洗涤滤饼，滤液浓缩，硅胶柱层析纯化得到250mg产物，收率52.5％。LC-MS(APCI):m/z＝576.5(M+1)⁺。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.38(s,1H),8.20(s,1H),4.35(d,J＝13.4Hz,1H),3.99(s,1H),3.74(s,1H),3.30(s,2H),3.02(q,J＝7.3Hz,1H),2.85(q,J＝7.2Hz,1H),1.49(s,2H),1.24(t,J＝7.1Hz,26H),0.86(t,J＝6.9Hz,3H)。

实施例2制备(R)-9-{2-[(十六烷氧基-2-d2-丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤，即化合物T-2，具体合成步骤如下：

步骤1 2-d2-丙二酸二乙酯(化合物11)的合成。

在微波反应瓶中加入丙二酸二乙酯(4.0g，25mmol)、碳酸钾(345mg，2.5mmol)和15mL重水，密闭后置于微波反应器中加热至85℃反应45分钟。降至室温，加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩柱层析纯化得到目标产物3.63g，收率90.7％。LC-MS(APCI):m/z＝163.1(M+1)⁺。

步骤2 2-d2-1,3-丙二醇(化合物12)的合成。

在反应瓶中加入化合物11(2.26g，13.94mmol)，用50mL无水四氢呋喃溶解，冰浴下，分批加入氢化锂铝(1.06g，27.88mmol)，加毕，升至室温搅拌反应过夜。冰浴条件下加入少量十水和硫酸钠淬灭反应，过滤除去不溶物，滤液浓缩得到目标产物粗品，真空干燥得到612mg，收率56.2％。LC-MS(APCI):m/z＝79.1(M+1)⁺。

步骤3 3-十六烷氧基-2-d2-1-丙醇(化合物13)的合成。

在反应瓶中加入溴代十六烷(496.7mg，1.63mmol)和化合物12(381mg，4.88mmol)，加入2mL二甲基亚砜和2mL四氢呋喃溶解，加入氢氧化钠(261mg，6.52mmol)室温下反应24小时。加入5mL水稀释，用2M稀盐酸调PH至中性，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶柱层析纯化得化合物0.41g，收率：83.2％。LC-MS(APCI):m/z＝303.5(M+1)⁺。

步骤4 (R)-9-{2-[(十六烷氧基-2-d2-丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤(化合物T-2)的制备。

在反应瓶中加入化合物7(253.2mg，0.88mmol)、化合物13(320mg，1.06mmol)和10mL DMF，加热至85℃，加入三乙胺(109mg，1.08mmol)，升温至100℃，加入DCC(296mg，1.43mmol)，再升至120℃搅拌反应16小时。TLC检测原料消失后降温至室温，过滤除去不溶物，用少量DMF洗涤滤饼，滤液浓缩，硅胶柱层析纯化得到273mg产物，收率54.2％。LC-MS(APCI):m/z＝572.7(M+1)⁺。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.38(s,1H),8.21(s,1H),4.34(d,J＝12.9Hz,1H),3.89(s,3H),3.75-3.68(m,1H),3.39-3.27(m,4H),3.07-2.80(m,2H),1.48(s,2H),1.24(s,26H),1.14(s,3H),0.87(t,J＝6.6Hz,3H)。

实施例3制备(R)-9-{2-[(十六烷氧基-1,3-d4-丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤，即化合物T-3，具体合成步骤如下：

步骤1 1,3-d4-1,3-丙二醇(化合物14)的合成。

在反应瓶中加入丙二酸二乙酯(1.0g，6.24mmol)，用20mL无水四氢呋喃溶解，冰浴下，分批加入氘代氢化锂铝(0.52g，12.5mmol)，加毕，升至室温搅拌反应过夜。冰浴条件下加入少量十水和硫酸钠淬灭反应，过滤除去不溶物，滤液浓缩得到目标产物粗品，真空干燥得到263mg，收率52.6％。LC-MS(APCI):m/z＝81.1(M+1)⁺。

步骤2 3-十六烷氧基-1,3-d4-1-丙醇(化合物15)的合成。

在反应瓶中加入溴代十六烷(334.2mg，1.1mmol)和化合物14(263mg，3.284mmol)，加入2mL二甲基亚砜和2mL四氢呋喃溶解，加入氢氧化钠(175.2mg，4.38mmol)室温下反应24小时。加入5mL水稀释，用2M稀盐酸调PH至中性，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶柱层析纯化得化合物0.32g，收率：95.5％。LC-MS(APCI):m/z＝305.5(M+1)⁺。

步骤3 (R)-9-{2-[(十六烷氧基-1,3-d4-丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤(化合物T-3)的合成。

在反应瓶中加入化合物7(55.05mg，0.192mmol)、化合物15(70mg，0.23mmol)和5mLDMF，加热至85℃，加入三乙胺(24mg，0.24mmol)，升温至100℃，加入DCC(64.6mg，0.31mmol)，再升至120℃搅拌反应16小时。TLC检测原料消失后降温至室温，过滤除去不溶物，用少量DMF洗涤滤饼，滤液浓缩，硅胶柱层析纯化得到73mg产物，收率66.4％。LC-MS(APCI):m/z＝574.2(M+1)⁺。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.38(s,1H),8.20(s,1H),4.35(d,J＝13.4Hz,1H),3.99(s,1H),3.74(s,1H),3.30(s,2H),3.02(q,J＝7.3Hz,1H),2.85(q,J＝7.2Hz,1H),1.77(s,2H),1.49(s,2H),1.24(t,J＝7.1Hz,26H),0.86(t,J＝6.9Hz,3H)。

实施例4制备(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基}-2,8-d2-腺嘌呤，即化合物 T-4，具体合成步骤如下：

步骤1 2,8-d2-腺嘌呤(化合物16)的合成。

在微波反应瓶中加入腺嘌呤(1.0g，7.4mmol)，重水(10mL)和Pd/C(100mg)，置换氢气，密封后置于微波反应器中160℃反应1.5-2小时，降至室温，加入0.65mL浓盐酸，加热至60℃使产物溶解，趁热过滤，滤液用氨水调PH至8.0，冰浴冷却并保持0.5小时，过滤得白色固体，真空干燥得0.8g产物，收率：80％。LC-MS(APCI):m/z＝138.3(M+1)⁺。

步骤2 (R)-9-(2-羟基丙基)-2,8-d2-腺嘌呤(化合物17)的合成。

在反应瓶中加入化合物16(2.465g，17.97mmol)和(R)-碳酸丙烯酯(2.093g，20.5mmol)，加入3mLDMF溶解，加热至130℃反应过夜，TLC检测反应完全后，降温至100℃，加入8.5ml甲苯和0.3g甲磺酸(保持内温在100-110℃)，再加入7mL甲苯得到一个均相混悬液，逐渐降温至室温，再降温至0℃保持1小时，过滤的白色固体，真空干燥得3.76g产物，收率100％。LC-MS(APCI):m/z＝196.3(M+1)⁺。

步骤3 (R)-9-[2-(二乙基磷酰甲氧基)丙基]-2,8-d2-腺嘌呤(化合物18)的合成。

将化合物17(1.0g，5.17mmol)用40mL无水DMF溶解，降温至0℃，氮气保护下加入NaH(233.3mg)低温下反应40分钟，加入化合物3(1.75g，5.44mmol)的10mL无水DMF溶解，升至室温反应18小时，TLC检测反应完毕后浓缩除去溶剂，硅胶柱层析纯化，蒸干后得产物0.89g，收率51％。LC-MS(APCI):m/z＝346.5(M+1)⁺。

步骤4 (R)-9-[2-(磷酰甲氧基)丙基]-2,8-d2-腺嘌呤(化合物19)的合成。

在干燥的反应瓶中加入化合物18(2.276g，6.63mmol)，加入20mL无水DMF溶解，室温下加入TMSBr(3.76g，24.57mmol)，搅拌反应20小时，TLC检测反应完成后，浓缩除去溶剂，加入氨水调PH至8.0，浓缩得油状液体，用稀盐酸调PH至3.0，再次蒸干，加入异丙醇析出黄色固体，过滤，用异丙醇/水(3:1)重结晶得白色固体0.62g，收率32.1％。LC-MS(APCI):m/z＝288.6(M-1)^-。

步骤5 3-十六烷氧基-1-丙醇(化合物21)的合成。

在反应瓶中加入溴代十六烷(1.52g，5mmol)和1,3-丙二醇(1.14g，15mmol)，加入5mL二甲基亚砜和5mL四氢呋喃溶解，加入氢氧化钠(800mg，20mmol)室温下反应24小时。加入10mL水稀释，用2M稀盐酸调PH至中性，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩，硅胶柱层析纯化得化合物1.0g，收率：66.7％。LC-MS(APCI):m/z＝301.3(M+1)⁺。

步骤6 (R)-9-{2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基}-2,8-d2-腺嘌呤(化合物T-4)的合成。

在反应瓶中加入化合物19(296mg，1.023mmol)、化合物21(370mg，1.23mmol)和10mL DMF，加热至85℃，加入三乙胺(127.3mg，1.26mmol)，升温至100℃，加入DCC(344.6mg，1.67mmol)，再升至120℃搅拌反应16小时。TLC检测原料消失后降温至室温，过滤除去不溶物，用少量DMF洗涤滤饼，滤液浓缩，硅胶柱层析纯化得到263mg产物，收率44.9％。LC-MS(APCI):m/z＝572.6(M+1)⁺。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.34(d,J＝14.0Hz,1H),4.04(s,1H),3.88(d,J＝6.1Hz,2H),3.80(s,1H),3.31(dd,J＝19.6,12.9Hz,6H),1.76(s,2H),1.48(s,2H),1.27(d,J＝13.0Hz,26H),1.15(d,J＝5.6Hz,3H),0.86(d,J＝6.9Hz,3H)。

实施例5制备(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基)磷酸-d2-甲氧]丙基}腺嘌呤，即化合物T-5，具体合成步骤如下：

步骤1 二乙基[[(对甲苯磺酰基)氧基]-d2-甲基]磷酸酯(化合物22)的合成。

在微波反应瓶中加入化合物5(1.0g，3.1mmol)，无水碳酸钾(42.8mg，0.31mmol)加入10mL重水，密封后置于微波反应器中加热至80℃反应1小时，降至室温后，加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用水和饱和食盐水洗涤两次，浓缩，硅胶柱层析纯化，真空干燥得产物0.86g，收率85％。LC-MS(APCI):m/z＝325.1(M+1)⁺。

步骤2 (R)-9-[2-(二乙基磷酰-d2-甲氧基)丙基]腺嘌呤(化合物23)的合成。

将化合物3(1.0g，5.17mmol)用40mL无水DMF溶解，降温至0℃，氮气保护下加入NaH(233.3mg)低温下反应40分钟，加入化合物22(1.75g，5.44mmol)的10mL无水DMF溶解，升至室温反应18小时，TLC检测反应完毕后浓缩除去溶剂，硅胶柱层析纯化，蒸干后得产物0.91g，收率51.7％。LC-MS(APCI):m/z＝346.5(M+1)⁺。

步骤3 (R)-9-[2-(磷酰-d2-甲氧基)丙基]腺嘌呤(化合物23)的合成。

在干燥的反应瓶中加入化合物23(2.276g，6.63mmol)，加入20mL无水DMF溶解，室温下加入TMSBr(3.76g，24.57mmol)，搅拌反应20小时，TLC检测反应完成后，浓缩除去溶剂，加入氨水调PH至8.0，浓缩得油状液体，用稀盐酸调PH至3.0，再次蒸干，加入异丙醇析出黄色固体，过滤，用异丙醇/水(3:1)重结晶得白色固体0.76g，收率40.1％。LC-MS(APCI):m/z＝288.2(M-1)^-。

步骤4 (R)-9-{2-[(十六烷氧丙基)磷酸-d2-甲氧]丙基}腺嘌呤(化合物T-5)的合成。

在反应瓶中加入化合物24(200mg，0.696mmol)、化合物21(256mg，0.83mmol)和5mL DMF，加热至85℃，加入三乙胺(86.6mg，0.856mmol)，升温至100℃，加入DCC(233mg，1.13mmol)，再升至120℃搅拌反应16小时。TLC检测原料消失后降温至室温，过滤除去不溶物，用少量DMF洗涤滤饼，滤液浓缩，硅胶柱层析纯化得到182mg产物，收率45.5％。LC-MS(APCI):m/z＝572.3(M+1)⁺。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.38(s,1H),8.20(s,1H),4.37(d,J＝14.0Hz,1H),4.04(s,1H),3.87(d,J＝6.1Hz,1H),3.37-3.29(m,6H),1.76(s,2H),1.48(s,2H),1.27(d,J＝13.0Hz,26H),1.15(d,J＝5.6Hz,3H),0.86(d,J＝6.9Hz,3H)。

生物活性测试。

(1)检测化合物体外抗HIV活性

化合物处理：待测化合物和参考化合物将用DMSO倍比稀释好后加入细胞培养板中。待测化合物和参考化合物将测试8个浓度，两个复孔。

病毒感染和细胞处理：将HIV-1和MT-4细胞于37℃，5％CO₂培养箱中共培养1h。随后将感染细胞以一定密度接种于细胞培养板中。细胞培养基中DMSO终浓度为0.5％。将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中培养5天。细胞毒性测试实验的细胞为未感染的MT-4细胞，其它实验条件和抗病毒活性实验一致。

细胞活性检测：细胞活性由细胞活性检测试剂CellTiter-Glo(Promega)测定。原始数据用于化合物抗HIV-1活性和细胞毒性计算。化合物剂量反应曲线及其EC₅₀和CC₅₀值将由GraphPad Prism软件分析后得到，其中，A表示EC₅₀<30nM，B表示30nM≤EC₅₀≤100nM，C表示100nM<EC₅₀≤500nM，D表示EC₅₀>500nM；F表示CC₅₀>50000nM(如下表1所示)。

(2)检测化合物体外抗HBV活性

实验方法：用Bright-Glo(Promega)检测荧光素酶测定化合物抗丙型肝炎病毒活性。采用GraphPad Prism软件分析数据，拟合曲线并计算EC₅₀和CC₅₀值。

实验步骤：

抗细胞活性实验：在HepG2.2.15细胞中检测20个化合物的体外抗乙肝病毒活性，TDF作为阳性对照化合物。第一天种细胞到96孔板，第二天加入化合物处理细胞，第五天更换新的含化合物的培养液。第八天收集上清提取DNA。用定量PCR检测HBV DNA的含量。待测化合物和TDF均3倍系列稀释，8个浓度点，平行测定2复孔。培养液中DMSO的终浓度为0.5％。抑制百分比计算公式如下：

％抑制率＝(1-样品中HBV的拷贝数/DMSO对照组中HBV的拷贝数)×100

EC₅₀由Graphpad Prism软件(four parameter logistic equations)分析，其中I表示EC₅₀<20nM，II表示20nM≤EC₅₀≤50nM，III表示50nM<EC₅₀≤100nM，IV表示EC₅₀>100nM(如下表1所示)。

细胞毒性实验：化合物排板、化合物处理流程与与抗HIV活性检测一致。化合物处理细胞六天后，测定细胞活性。每孔加入Cell-titer Blue试剂，37℃孵育3小时，读取荧光值(560Ex/590Em)；分析数据和计算相对细胞活力：

应用如下公式计算细胞活性百分比：％细胞活力＝(样品荧光读数–培养液对照的荧光读数)/(DMSO对照的荧光读数-培养液对照的荧光读数)×100。最后使用GraphPad Prism软件计算化合物的CC₅₀值，V表示CC₅₀>100000nM(如下表1所示)。

表1实施例化合物HBV活性和HIV活性

实验结果表明，本发明化合物具有很强的抗HIV活性和HBV活性(均达到纳摩尔水平)，与ContraVir制药公司正在开发的高效的抗HBV药物(CMX157)相比，本实施例化合物的抗HIV活性和抗HBV活性均与其相当，其中，实施例化合物T-1、T-2和T-5的抗HBV活性表现出优于CMX157的抗HBV活性，而实施例化合物T-2和T-5则在抗HIV活性极佳的活性。此外，在所测的细胞系中，本发明化合物没有显示毒性(最优的CC₅₀>100000nM)。

(3)代谢稳定性评价。

微粒体实验：人肝微粒体：0.5mg/mL，Xenotech；大鼠肝微粒体：0.5mg/mL，Xenotech；辅酶(NADPH/NADH)：1mM，Sigma Life Science；氯化镁：5mM，100mM磷酸盐缓冲剂(pH为7.4)。

储备液的配制：精密称取一定量的实施例化合物粉末，并用DMSO分别溶解至5mM。

磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.4)的配制：取预先配好的0.5M磷酸二氢钾150mL和700mL的0.5M磷酸氢二钾溶液混合，再用0.5M磷酸氢二钾溶液调节混合液pH值至7.4，使用前用超纯水稀释5倍，加入氯化镁，得到磷酸盐缓冲液(100mM)，其中含100mM磷酸钾，3.3mM氯化镁，pH为7.4。

配制NADPH再生系统溶液(含有6.5mM NADP，16.5mM G-6-P，3U/mL G-6-P D，3.3mM氯化镁)，使用前置于湿冰上。

配制终止液：含有50ng/mL盐酸普萘洛尔和200ng/mL甲苯磺丁脲(内标)的乙腈溶液。取25057.5μL磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL离心管中，分别加入812.5μL人肝微粒体，混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的肝微粒体稀释液。取25057.5μL磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL离心管中，分别加入812.5μL SD大鼠肝微粒体，混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的肝微粒体稀释液。

样品的孵育：用含70％乙腈的水溶液将相应化合物的储备液分别稀释至0.25mM，作为工作液，备用。分别取398μL的人肝微粒体或者大鼠肝微粒体稀释液加入96孔孵育板中(N＝2)，分别加入2μL 0.25mM的的工作液中，混匀。

代谢稳定性的测定：在96孔深孔板的每孔中加入300μL预冷的终止液，并置于冰上，作为终止板。将96孔孵育板和NADPH再生系统置于37℃水浴箱中，100转/分钟震荡，预孵5min。从孵育板每孔取出80μL孵育液加入终止板，混匀，补充20μL NADPH再生系统溶液，作为0min样品。再向孵育板每孔加入80μL的NADPH再生系统溶液，启动反应，开始计时。相应化合物的反应浓度为1μM，蛋白浓度为0.5mg/mL。分别于反应10、30、90min时，各取100μL反应液，加入终止板中，涡旋3min终止反应。将终止板于5000×g，4℃条件下离心10min。取100μL上清液至预先加入100μL蒸馏水的96孔板中，混匀，采用LC-MS/MS进行样品分析。

数据分析：通过LC-MS/MS系统检测相应化合物及内标的峰面积，计算化合物与内标峰面积比值。通过化合物剩余量的百分率的自然对数与时间作图测得斜率，并根据以下公式计算t_1/2和CL_int，其中V/M即等于1/蛋白浓度。

表2实施例化合物的肝微粒代谢评价

实验结果如上表2所示，同CMX157相比，本发明化合物的半衰期较长，清除率较小，在人肝微粒体与大鼠肝微粒体实验中都表现出较优的代谢稳定性，更适合作为抗HIV或HBV的药物。

(4)大鼠药代动力学实验。

实验目的：研究大鼠给予(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤、实施例化合物后，考察本发明化合物的药代动力学行为。

实验动物：

种类及品系：SD大鼠等级：SPF级

性别及数量：雄性，6只

体重范围：180～220g(实际体重范围为187～197g)

来源：上海西普尔必凯实验动物有限公司

实验及动物合格证号：SCXK(沪)2013-0016。

实验过程：

在血样采集之前，预先在EDTA-K2抗凝管中加入20L的2M氟化钠溶液(酯酶抑制剂)，于80度烘箱内烘干后，置于4度冰箱存放。

大鼠，雄性，体重187～197g，随机分为2组，于实验前一天下午开始禁食过夜但可自由饮水，给药后4h给食物。A组给予(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤3mg/kg，B组给予实施例化合物3mg/kg，分别于给药后15min、30min、1、2、3、5、8、10h从大鼠眼眶静脉取血100-200L左右，置于经EDTA-K2抗凝的0.5mL的Eppendorf管中，立即混匀，抗凝后，尽快将试管轻轻颠倒混匀5-6次后,血取好后放置在冰盒中，30min内把血样本在4000rpm，10min，4℃条件下离心分离血浆，收集全部血浆后立即于-20℃保存。所有时间点样品采集后测定每个时间点的血浆中的血药浓度。

根据上述所得的给药后平均血药浓度-时间数据，采用Winnonin软件，按非房室统计矩理论求算雄性SD大鼠分别i.g给予(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤(3mg/kg)、实施例化合物(3mg/kg)后的药代动力学相关参数。

实验表明，与(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基)磷酸甲氧]丙基}腺嘌呤相比，本发明化合物具有更优的活性，并且具有优异的药代动力学性质，因此更适合作为抑制核苷类逆转录酶的化合物，进而适合制备治疗抗病毒感染的药物。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比为重量份和重量百分比。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

一种核苷类逆转录酶抑制剂，其特征在于：如式(I)所示的新型的无环核苷类似物，或其晶型、药学上可接受的盐、前药、立体异构体、水合物或溶剂化合物，

其中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地为氢、氘、卤素；

X选自“氢(H)、氘(D)、烷基(C_nH_2n+1，n<17)、一次或多次氘代的烷基(C_nH_2n+1，n<17)”；

附加条件是R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶和X中至少一个是氘代的或含氘。
根据权利要求1所述的核苷类逆转录酶抑制剂，其特征在于：R¹和R²各自独立地为氘或氢。
根据权利要求1所述的核苷类逆转录酶抑制剂，其特征在于：R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地为氘或氢。
根据权利要求1所述的核苷类逆转录酶抑制剂，其特征在于：R⁹和R¹⁰各自独立地为氘或氢。
根据权利要求1所述的核苷类逆转录酶抑制剂，其特征在于：R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地为氘或氢。
根据权利要求1所述的核苷类逆转录酶抑制剂，其特征在于：X是烷基、一次或多次氘代的烷基(C_nH_2n+1，n<17)。
根据权利要求1所述的核苷类逆转录酶抑制剂，其特征在于：所述化合物可选自下述化合物或其药学上可接受的盐：
一种药物组合物，其特征在于：其含有药学上可接受的载体和如权利要求1～7任意一项所述的核苷类逆转录酶抑制剂，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物、立体异构体、前药或同位素变体的药物组合物。
根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：其还包含其他活性化合物，所述活性化合物为免疫调节剂或抗病毒药物化合物，可选自拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、司他夫定、扎西他滨、去羟肌苷、恩曲他滨、替诺福韦、地拉韦啶、依法韦仑、依曲韦林、奈韦拉平、氨普那韦、阿扎那韦、地瑞那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、替拉那韦、马拉韦罗、恩夫韦肽和雷特格韦。
一种如权利要求1～7任意一项所述的核苷类逆转录酶抑制剂的用途，其特征在于：用于制备治疗病毒感染的疾病的药物，如艾滋病、乙肝。
一种在受试者中治疗和/或预防与病毒相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者给药如权利要求1～7任意一项所述的式(I)化合物或其多晶型、药学上可接受的盐、前药、立体异构体、同位素变体、水合物或溶剂化合物，或者权利要求8或9中任一项的药物组合物。