CN108348559B - 用于生产共轭亚油酸的副干酪乳杆菌、含有其的营养制剂和药物制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够将亚油酸转化成共轭亚油酸的属于副干酪乳杆菌种的新菌株。本发明涉及包含副干酪乳杆菌菌株的药物组合物，其用于治疗和/或预防与共轭亚油酸缺乏相关的病理和/或生理状态中，或者用于在使用益生菌是有益的情况中。

Description

用于生产共轭亚油酸的副干酪乳杆菌、含有其的营养制剂和 药物制剂及其用途
背景技术
本发明涉及能够将亚油酸(LA)转化成共轭亚油酸(CLA)的属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌种的新菌株(称为LMG S-26420)，其用于治疗和预防与共轭亚油酸缺乏相关的疾病和/或生理状态或用于推荐使用益生菌的情况中、本发明还涉及获得它的方法以及含有它的药物组合物。
副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420也可用于治疗和预防其中摄入益生菌是有益的所有疾患，例如恢复和维持肠道细菌菌群平衡。
术语CLA是指亚油酸(LA)的位置和几何异构体的混合物，其中双键在各种位置共轭，从而产生顺式和反式异构体。
至少16种CLA异构体是已知的，主要生物学感兴趣的异构体是异构体c9-t11和t9-t11。异构体c9-t11是膳食中的主要异构体，并且已被证明是重要的，因为它涉及许多生物学过程，并被掺入到进食CLA异构体混合物的动物的组织的磷脂部分中。
人机体中基本上不涉及CLA的产生，因此其供应依赖于乳制品和饮食中肉类的摄取或含有益生菌的补充剂。
反刍动物生产的食品是人类主要的CLA来源。它们是亚油酸生物氢化作用的中间体，人们普遍认为反刍动物中的CLA来源于瘤胃细菌对亚油酸不饱和酸的不完全生物氢化作用。
CLA通过具有牛奶、鱼、肉类和乳制品的饮食而被引入生物体中，其有益效果与约3g/天的日常摄入(assumption)水平相关。不平衡的饮食给出了0.35g/天的平均CLA摄入，考虑到其对机体的有益作用，这种缺乏必须通过摄入将LA转化成CLA的益生菌来补偿以提供有用的剂量。
共轭亚油酸的生物学活性主要归因于异构体c9-t11和t10-c12的作用；与抗癌作用相关的主要生物学活性归因于异构体c9-t11，而异构体t10-c12参与人体的脂质代谢。
CLA具有重要的生物学性质，对人和动物健康有用，如，例如，在肠道炎性病理、腹泻和结肠炎症中、在增加体质量、在增加生热、在氧化应激保护、在肿瘤预防、在自身免疫性疾病、炎性疾病、糖尿病和动脉粥样硬化中是有用的。
Ecker J.等人在Biochem.Bioph.Res.Comm.388,2009,660-666中报告异构体c9-t11激活参与动脉粥样硬化发生和进展的靶基因LXR。Ogawa J.等人在Appl.Env.Microbiol2001,67,1246中描述了在微需氧的条件下由乳杆菌，嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)从亚油酸生产特定的CLA异构体，推定羟基酸10-羟基-顺-12-十八烷酸(octadecanoid)是该转化的中间体，转换涉及多于一个步骤。
Ogawa J.等人在J.Bioscience Bioeng.100(4),355(2005)中报告了由双歧杆菌和乳杆菌将LA转化成CLA，获得异构体混合物。当使用双歧杆菌时，CLA异构体的产量在每升培养物约3至约400mg变化，而当使用乳杆菌时，产量在每升培养物约100mg至约4g变化。当使用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)时，每升培养物的产量不会超过1克。
Rosberg-Cody E.等人在Appl.Env,Microbiol 70(8)4635,2004中描述了从新生儿粪便材料中分离双歧杆菌菌株，可用于生产CLA，并建议将这些细菌用于具有坏死性小肠结肠炎危险的新生儿的补充剂中。
还有Coakley M.等人在J.Appl.Microbiol.94,138(2003)中描述了乳杆菌、乳球菌和双歧杆菌将LA转化成CLA的能力，并且证明双歧杆菌菌株具有更高的将LA转化成CLA的能力，转化百分比高达几乎65％。
Alonso L.等人在J Diary Sci.86,1941(2003)中描述了在添加有不同浓度的亚油酸的培养基中由人肠来源的干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)将LA转化成CLA。在0.02％的亚油酸浓度下，用干酪乳杆菌获得的最大CLA浓度为每升培养物约110mg，并且生物感兴趣的异构体c9-t11的量在每升培养物60至85mg的范围内。
Gustavo A.等人在Biosci.Biotechnol.Biochem.,77(3),648-650,2013中描述了一种快速和简单的方法筛选从牛奶分离的生产共轭亚油酸(CLA)的细菌。一种类似副干酪乳杆菌的菌株以大于85％的百分比将游离亚油酸转化成总CLA。然而，生物感兴趣的CLA异构体c9、t11的转化率百分比只有约18％。
Oguz Gursoy等人在International Journal of Food Sciences andNutrition,63(5),610-615中描述了使用不同的益生菌培养物对奶酪的共轭亚油酸浓度和脂肪酸组成的影响。他们报告，益生菌的差异和储存过程在统计学上不影响样品的CLA含量。乳酪样品中CLA含量的增加是由于乳酸菌对游离亚油酸的脂解作用。
包含乳杆菌的益生菌产品的摄入对于维持肠道细菌菌群平衡也是有用的，并且一般来说其是预防和治疗生态失调的有用工具，其中双歧杆菌和乳杆菌之间的平衡是重要的。
考虑到饮食中引入的CLA的量少，以及与CLA缺乏相关的所有病理和疾患中有用的剂量，需要有可用的将LA转化成CLA的细菌，以获得对于个体健康和治疗所有病理有用的每日剂量，其中CLA异构体是有益的。
双歧杆菌将LA转化成CLA，但双歧杆菌培养物具有生产率低的缺点，意味着每升培养物中许多细菌，因此在工业规模的生产过程中不容易大量获得它们。
因此，需要有能够将LA转化成CLA的细菌菌株，其可通过细菌培养物以高产量获得CLA，以用于在治疗或预防与CLA缺乏相关的所有疾患和病理中有用的药物或营养制剂。
还需要有属于乳杆菌属的细菌菌株，其能够将LA转化成对人或动物有益的CLA异构体。此外，还需要有针对与身体表面上微生物失衡相关的所有疾患或病理的乳杆菌。属于乳酸菌属的菌株可以与双歧杆菌属的细菌一起摄入以促进人或动物菌群的微生物平衡。
属于乳杆菌属的细菌属于具有最高产量的细菌，因此其优于属于将LA转化成CLA的双歧杆菌属的那些细菌。乳杆菌可以通过工业方法以比双歧杆菌更高的产率获得，并且可以用于生产在人或动物中用于施用的药物组合物。
其中，优选能够比其它异构体更大程度地将LA转化成CLA的异构体c9-t11和t9-t11的乳杆菌。c9-t11是主要的异构体，因为它包括在细胞膜磷脂中，是膳食中的主要异构体。这些异构体对人类和动物有益，特别是异构体t9-t11具有抗增殖和抗癌性质。Ecker J等人在Biochem.Biophysical.Res.Comm.388,660,2009中报告CLA的异构体t9-t11是与炎症诱导过程相关的巨噬细胞LXR的强效激动剂，并且在减少动物模型的动脉硬化过程中具有重要作用。
本发明描述属于乳杆菌属的菌株，命名为副干酪乳杆菌LMG S-26420，其能够将LA转化成CLA，转化百分比高于本领域已知的其它乳杆菌菌株。此外，本发明的菌株LMG S-26420的特征在于将LA转化成CLA，其中异构体c9-t11和t10-c12的混合物与其它异构体相比更为普遍。
菌株通过特征在于每升培养物的产量高于4g的细菌培养物获得，并且其可以以冻干形式获得。
该菌株是稳定的，并且细菌培养物的产物可以以冻干形式在低于0℃的温度下长期储存，或者在4℃下储存超过6个月的时间。菌株LMG S-26420可以包含在用于治疗和/或预防与CLA缺乏相关的疾患或病理、以及其中益生菌摄入对人或动物是有益的所有疾患中的药物组合物中。
概要
本发明描述了属于乳杆菌属的新菌株，命名为副干酪乳杆菌，于2011年4月15日在比利时微生物协调保藏中心BCCM/LMG细菌收集-微生物实验室-根特大学提交，保藏编号LMG S-26420。
副干酪乳杆菌LMG S-26420的特征在于其以高于30％的百分比将亚油酸转化成共轭亚油酸。
副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的特征在于，与起始LA相比，其以高于30％的百分比将亚油酸(LA)转化成共轭亚油酸(CLA)，其中与其它CLA异构体相比具有生物学活性的生物异构体c9-t11和t9-t11的百分比高于30％。
副干酪乳杆菌LMG S-26420的特征在于产生高浓度的CLA。
通过特征在于每升培养物的产量高于4g、菌落形成单位(CFU)的产率高于每毫升培养物1×109的细菌培养物获得副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420。
副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的特征在于稳定性：其可以在低于0℃的温度下储存以及在4℃以冻干形式储存超过6个月的时间。
冻干形式的菌株副干酪乳杆菌LMG S-26420的特征在于活性细胞的量高于1×1010，特别是约1×10 10至约7×10 10单位/克的冻干产品。
本发明的目的是在细菌培养物中生产副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的方法，其中菌株LMG S-26420的接种物在培养基中具有0.1-10％(v/v)的浓度、在30℃至37℃之间的温度下、在4.5和7.5之间的pH值持续培养6至15小时之间的时间。分离生物质，并且可以在低于4℃的温度下保存或进行冻干处理。
所描述的方法导致获得副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420，其中菌落形成单位数为每毫升培养物1x10 9至5x10 9CFU，并且生物质的量为10至20克/升培养物。
包含冻干的方法导致获得固体形式的菌株LMG S-26420。在存在冷冻保护剂的情况下，菌株以菌落形成单位(CFU)高于50％的产率获得，而冻干菌株LMG S-26420包含高于每克冻干产品1×1010个的细胞数量。
本发明的目的是营养或食品制剂和药物组合物，其包含一定量的冻干形式的副干酪乳杆菌LMG S-26420，对应于约1×108至约5×1011的活细胞的量。
包含副干酪乳杆菌LMG S-26420的营养或食品制剂和药物组合物可以是小袋、片剂或胶囊的形式。营养或食品制剂和药物组合物可以包含益生元、维生素、矿物盐和药物或营养赋形剂。
益生元包含在副干酪乳杆菌LMG S-26420组合物中，选自低聚果糖、菊糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖和维生素，所述维生素选自E和B复合物的维生素。
包含副干酪乳杆菌LMG S-26420的营养或食品制剂和药物组合物可包含双歧杆菌。
包含副干酪乳杆菌LMG S-26420的药物组合物可用于治疗和预防与共轭亚油酸缺乏相关的病理和/或生理状态，并且可用于其中益生菌的使用是有用的并且具有有益效果的所有其它情况。
特别地，包含副干酪乳杆菌LMG S-26420的药物组合物可用于治疗和预防与CLA缺乏相关的病理和/或生理状态，如，例如，在肠道炎性病理中，如腹泻和结肠炎症；在增加体质量、在增加生热、在氧化应激保护、在肿瘤预防、在自身免疫性疾病、糖尿病和动脉粥样硬化中是有用的。
包含副干酪乳杆菌LMG S-26420与双歧杆菌的药物组合物，作为本发明的目的，在治疗与细菌性生态失调相关的所有疾患中是有用的。
包含副干酪乳杆菌LMG S-26420的药物组合物在其中人和动物的肠道细菌菌群平衡必须保持不变的所有生理状态中是有用的。
本发明的描述
属于副干酪乳杆菌的菌株的纯细菌培养物在比利时微生物协调保藏中心BCCM/LMG细菌收集-微生物实验室-根特大学提交，保藏编号LMG S-26420。
本发明涉及一种副干酪乳杆菌LMG S-26420的新菌株、包含所述菌株的药物组合物、及其在治疗和预防与共轭亚油酸缺乏相关的病理和/或生理状态或者建议使用益生菌时的病理和/或生理状态中的用途。
已经从健康女性的阴道细菌菌群中分离了副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420，该菌株从相同来源同时分离的许多其它乳杆菌菌株中选择、和从其它类型的生物样品、和同一物种的其它菌株中选择，因为它已经显示了将亚油酸(LA)转化成共轭亚油酸(CLA)的能力。这种特征使这种菌株成为一种对人和动物使用有用的益生菌剂。
副干酪乳杆菌LMG S-26420的特征在于以高于30％的百分比将LA转化成CLA，通过色谱方法测定。
副干酪乳杆菌LMG S-26420将LA转化成具有生物学活性的CLA异构体，特别是异构体c9-t11和t9-t11。在本发明的一个具体方面，副干酪乳杆菌LMG S-26420以高于30％的百分比将LA转化成CLA的异构体c9-t11和t9-t11。
为了评估副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420将LA转化成CLA的能力，使用三种不同的方法：Ogawa方法、Liu方法和色谱方法。
使用在Appl.Environ.Microbiol 67(3):1246-1252,2001中描述的Ogawa.J方法允许通过将LA添加到细菌培养物中以新陈代谢地调整细胞来测定副干酪乳杆菌菌株LMGS-26420在合适的培养基中将LA转化成CLA的能力。
在第一种情况下，将0.01mg/ml至1mg/ml范围内的可变浓度的LA添加到菌株LMGS-26420的一系列细胞培养物中，并将细胞在30℃到40℃温度下孵育1至4天的时间。将最终产物离心，并将等于5mg/ml的恒定浓度的LA添加到细胞中。将细胞培养物在30℃至40℃范围的温度下培养40至80小时的时间，然后离心除去上清液。为了评估菌株将LA转化成CLA的能力，将细胞重悬于水中，并通过分光光度法测定CLA。
在第二种情况下，将等于5mg/ml的恒定浓度的LA添加到一系列副干酪乳杆菌LMGS-26420的细胞培养物中，并将培养结束时获得的生物质与0.05mg/ml至0.4mg/ml范围的可变浓度的LA孵育。
在这两种情况下，副干酪乳杆菌LMG S-26420均显示有效地将LA转化成CLA，特别是以高于30％的百分比。
使用在Biomed.&Biotechnol.12811,923-930,2011中描述的Liu P.方法包括在LA浓度为0.05至1mg/ml的适当培养基中接种菌株LMG S-26420。将培养物在30℃至40℃的温度下孵育1至3天的时间，然后离心。通过分光光度法测定CLA浓度。
根据Ogawa和Liu方法进行的试验显示了副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420将LA转化成CLA的能力。然而，用这些方法不可能评估转化成CLA异构体的百分比，特别是该菌株是否能够将LA转化成具有最强生物学活性的CLA异构体。
反过来，色谱方法允许分离和定量CLA几何异构体、异构体反式-反式、反式-顺式和顺式-顺式，特别是异构体顺式9-反式11、反式10-顺式12和反式9-反式11。
通过使用银离子高压液相色谱(HPLC)与二极管阵列检测器和234nm处的UV检测器测定所获得的CLA异构体。
色谱方法表明菌株LMG S-26420以高于30％的百分比将LA转化成CLA。
色谱方法表明菌株LMG S-26420以30％至50％的百分比将LA转化成CLA，其中具有生物学活性的异构体c9-t11和t9-t11的百分比与其它异构体相比更为普遍。特别地，菌株LMG S-26420将LA转化成CLA异构体c9-t11和t9-t11，其中它们的百分比比所有其它CLA几何异构体高40％。
通过特征在于给出每毫升高于1×109个的菌落形成单位(CFU)数和每升培养物高于4g的固体质量的量的细胞培养物获得菌株LMG S-26420。获得的新菌株在低于4℃的温度下稳定地持续较长时间，并且其可以用显著保持细胞活力的方法冻干。冻干产品在4℃和25℃的温度下稳定地持续超过3个月的时间。
副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420产生的冻干生物质的量高于每升培养物4g，特别是每升培养物10至20g。考虑到该菌株以高于30％的百分比将LA转化成CLA的能力，可以认为副干酪乳杆菌新菌株LMG S-26420能够产生显著浓度的CLA。例如，向包含浓度约500mg/升亚油酸的溶液中添加副干酪乳杆菌LMG S-26420导致获得高于250mg/升共轭亚油酸的浓度。
本发明的另一个优点是具有属于乳杆菌属的新菌株，其以高的转化产率将LA转化成CLA异构体，可用于包含在药物组合物中。
副干酪乳杆菌新菌株LMG S-26420可包含在也包含属于相同属或属于不同属的其它细菌菌株(如双歧杆菌)的组合物中。
包含LMG S-26420和其它细菌菌株的组合物有利地产生对于维持肠道细菌菌群平衡有用的异源益生菌群。
本发明的细菌培养物目标首先以实验室规模生产，然后以工业规模生产。通过发酵方法在6至12小时的时间内、在范围30℃至40℃的温度下、在名称为
Figure GDA0003195774080000091
的培养基(De Man,Rogosa&Sharpe)中获得LMG S-26420的细菌培养物，所述名称为
Figure GDA0003195774080000092
的培养基含有作为主要成分的酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖的混合物以及钾盐、铵、镁和锰。
从原始培养物开始，进行许多扩增阶段以增加每体积纯菌株的培养物的细胞数目，以获得所谓的“母培养物”，其被用作工业生产益生菌LMG S-26420的细菌培养物的接种物。
用于生产副干酪乳杆菌LMG S-26420的工业方法包括以下步骤：
-以0.1至10％的体积百分比用母培养物的体积接种菌株LMG S-26420，并在37℃和pH4.5至7.5的培养物的适当培养基中发酵8至15小时的时间；
-通过离心从培养物肉汤中分离细菌生物质。
可将生物质冷冻或在加入合适的冷冻保护剂之后进行冻干方法，所述冷冻保护剂选自可用于在冻干方法中维持细胞活力的可溶性碳水化合物。
通过特征在于每毫升培养物生产高于109个的活细胞的活细胞数和每升培养物高于4g的乳杆菌生物质的发酵方法获得菌株LMG S-26420。
以每毫升培养物1×10 9至7×10 9个活细胞的产量获得菌株LMG S-26420，其具有每升10至20克的干产品的产率。
使用本领域技术人员已知的细菌计数方法测定细胞活力。
从所述培养物获得的菌株LMG S-26420可以被冻干以易于储存并包含在滋养、食品或药物制剂中。
在冷冻保护剂的存在下进行冻干方法，所述冷冻保护剂选自可溶性碳水化合物，如，例如海藻糖(trealose)和环糊精或它们的混合物。所描述的冻干方法的特征在于获得冻干菌株LMG S-26420，其中活细胞产率比冻干方法之前高50％。菌株LMG S-26420的特征在于每克冻干产品包含差不多高于1×1010活细胞量，特别是每克冻干产品包含差不多1×1010至差不多7×1010的活细胞量。这证实副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的特征在于高产量、可以冻干和作为确保保持细胞活力的冻干产品维持。
用所描述的细胞培养物获得并在选自可溶性碳水化合物或其混合物的冷冻保护剂存在下冻干的副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的特征在于，水活性(aw)低于0.6，在低于该值时大部分细菌和霉菌的增殖被抑制。水活性是通过测量物质中的部分蒸汽压力除以水的部分压力获得的值，并且可以通过直接给出这些值的检测器获得。
如Ryser,E.T.等人在Listeria,Listeriosis and Food Safety(第三版).CRCPress.173-174,(2007)中所述，低于0.6的水活性值确保冻干制剂可以被储存，因为它不会因微生物增殖而降解，而微生物增殖是滋养物或食品改变的最危险的原因之一。
菌株LMG S-26420的冻干产品的特征在于每克冻干产品具有增加的活细胞数并具有低的水活性含量，可用于储存组合物的制剂或含有不同益生菌量的不同形式的制剂，没有限制。
进行冻干方法的溶液中的LMG S-26420细菌菌株的特征在于玻璃化转变温度的值(Tg)高于100℃，并且在可溶性碳水化合物(如，例如，海藻糖)存在时，玻璃化转变温度的值在100℃至120℃的范围内。这些数值证实，这种菌株可以进行冻干和真空干燥方法，直至100℃的温度，而不会使产品转化成玻璃状态，从而丧失其性质。
与待冻干制剂相关的冷冻溶液的玻璃化转变温度Tg'在-15℃至-30℃的范围内，并且在可溶性碳水化合物(如，例如，海藻糖)的存在下，玻璃化转变温度在-20至-30℃的范围内。
在存在选自可溶性碳水化合物，特别是海藻糖的冷冻保护剂的情况下，实施例3中描述的副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的冻干方法的特征在于，在低于-30℃的温度下进行冷冻步骤，在低于100℃的温度下进行二次干燥。所述方法导致获得冻干形式的菌株LMG S-26420，其特征在于保持其生物学性质。
特别地，如果与冻干前的细胞活力相比，本发明中所述的在海藻糖存在下所述副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的冻干方法维持细胞活力高30％，特别是高30％至60％。
所述的副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的冻干组合物包含可溶性碳水化合物，如海藻糖和甘露醇；后者可以在需要高冻干质量时加入到含有海藻糖的冻干制剂中，特别是用于具有低剂量益生菌菌株的制剂中。
包含待冻干的副干酪乳杆菌LMG S-26420的溶液可包含选自由甜菜碱、肌氨酸、甘油、赤藓糖醇的渗透物；选自乙酸盐、甲酸盐或铵盐的盐，用于在冻干方法中将pH值保持在4至8之间。
冻干副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420在4℃的温度下稳定地持续超过3个月的时间。在特定的方面，副干酪乳杆菌LMG S-26420在4℃的温度下6个月后维持其70％以上的细胞活力，并且水活性保持低于0.6％的值。
因此可以大量制备冻干产品，并将其储存为不同益生菌剂量的固体或悬浮形式的组合物的制剂。
本发明的一个方面涉及药物组合物、营养或食品制剂，其包含可变量的冻干形式的菌株LMG S-26420，其量为20至2500mg的范围。这些组合物的特征在于每克冻干产品包含1×10 9至1×10 11的量的LMG S-26420活细胞。
制剂可以是对于口服施用有用的形式，如，例如，小袋、片剂、胶囊或液体悬浮液的形式。
片剂或胶囊形式的组合物可包含范围从20至800mg的副干酪乳杆菌LMG S-26420的量，和用于液体悬浮液的小袋组合物可包含范围从20mg至10克的副干酪乳杆菌LMG S-26420的量。药物或营养组合物可以包含范围从约1×109至1×1011个细胞单位的副干酪乳杆菌LMG S-26420的量。
包括副干酪乳杆菌LMG S-26420的药物、营养或食品组合物任选地包含但不限于，选自低聚果糖、菊糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、抗性糊精、聚葡萄糖、阿拉伯半乳聚糖、抗性淀粉、右旋糖酐、瓜耳胶的益生元；氨基酸；蛋白质；抗氧化剂；选自E和B复合物维生素的维生素，以及可用于制备所需形式的药学上可接受的盐。
包含副干酪乳杆菌LMG S-26420的药物、营养或食品组合物还可以包含能够将LA转化成CLA的其它细菌，特别是属于双歧杆菌属的那些细菌。这些组合物增加LA向CLA的转化，并有利于肠道细菌菌群平衡。
通过混合冻干产品形式的副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420与选定的赋形剂(如，例如，选自低聚果糖、菊糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖和之前已过筛的香料的低聚糖)制备小袋形式的组合物。然后将均质混合物分成小袋。
可以在被加入到选择用于制备所期望的固体形式的药物赋形剂之前研磨或粒化冻干形式。
片剂形式的组合物可以包含稀释剂、配体、崩解剂、润滑剂、助流剂，并根据本领域技术人员已知的技术制备。
任选地，组合物可以包含防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
包含副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的本发明组合物在4℃和25℃的温度下稳定地持续1、3和6个月，其中活细胞完全恢复。
本发明的另一方面涉及包含副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的药物组合物用于治疗和预防其中益生菌是有用的病理和/或生理状态的用途。这些药物组合物用于预防和治疗与CLA缺乏相关的病理和/或生理状态，如，例如，在肠道炎性病理中、腹泻和结肠炎症中、在增加体质量、在增加生热、在氧化应激保护、在肿瘤预防、在自身免疫性疾病、炎性疾病、糖尿病和动脉粥样硬化中是有用的。
包含副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的药物组合物在治疗和预防与微生物失衡相关的所有疾患或病理中是有用的。
包含副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的药物组合物也可用作所有肉类或乳制品缺乏的膳食中的滋养补充剂，以获得对人有益的CLA浓度。
实施例
实施例是指副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420，其正对应于在比利时微生物协调保藏中心BCCM，LMG细菌收集，微生物实验室，根特大学提交的菌株，证实了该菌株的纯度和生存力并且其注册编号LMG S-26420。具体而言，这些实施例涉及菌株LMG S-26420的表征、其将LA转化成CLA的能力、其工业规模的生产方法以及含有其的组合物。
实施例1
测定菌株将亚油酸(LA)转化成共轭亚油酸(CLA)的能力
为了测定副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420将LA转化成CLA的能力，已经评估了其中在LA存在下制备接种物、以刺激细菌细胞预适应的条件，以及不存在LA的条件。
a)根据Ogawa方法进行测定
根据在Appl.Envr.Microbiol.2001,67,1246中描述的Ogawa方法进行定量测定副干酪乳杆菌LMG S-26420将LA转化成CLA的能力。
该方法基于在
Figure GDA0003195774080000131
(Man,Rogosa,Sharpe)培养基中接种菌株，所述
Figure GDA0003195774080000132
培养基包含18g/l蛋白胨混合物；酵母提取物4g/l；葡萄糖20g/l；Tween-80 1ml/l；磷酸钾2g/l；柠檬酸三铵2g/l；无水乙酸钠3g/l；七水硫酸镁0.2g/l；无水硫酸镁0.034g/l；琼脂12g/l。
将浓度为1％的副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420接种于含有0.01至0.4mg/ml浓度的LA的15ml
Figure GDA0003195774080000133
中，并将溶液在37℃下保持3天，缓慢搅拌。将培养物离心并除去上清液。将沉淀用无菌水洗涤，将约20mg的细胞团块用1ml磷酸钾缓冲液100mM，pH6.5的溶液再悬浮，将5mg LA与牛血清白蛋白(BSA)的复合物加入到细胞悬浮液，其比例对应于0.2mgBSA/mg LA。然后将培养物孵育48和72小时，然后离心除去上清液。将细胞重悬于水中，通过在Appl.Environment Microbiol.73(7),2333,(2007)中描述的Barret方法分光光度法地测定CLA浓度。该方法包括通过向1ml样品中加入2ml异丙醇来提取脂肪酸级分。剧烈搅拌溶液，静置3分钟，然后加入1.5ml己烷。分离有机相并用无水硫酸钠脱水，并且通过分光光度计读数在233nm下测定CLA量。通过用相同波长下不同浓度的CLA异构体c9-t11获得的校准曲线测定浓度。
表1报告了通过副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420将LA转化成CLA的转化百分比，其中在不同浓度的LA中进行菌株预孵育，用5mg/ml的LA进行洗涤后细胞的孵育。表1显示，在报告的条件下LA转化成CLA的转化百分比范围为1％至7％。
表1
Figure GDA0003195774080000141
在表2报告的条件下，CLA不存在于上清液中。
表2报告了将LA转化成CLA的结果。用浓度0.05mg/ml的LA进行预孵育，并在不同浓度的LA中孵育洗涤的细胞团块。在上清液和细胞沉淀物上测定CLA。
表2
Figure GDA0003195774080000151
b)根据Liu方法测定
在Biomed.Biotechnol.12811,923(2011)中描述了Liu方法。
表3报告了根据Liu P等人在Biomed.Biotechnol.12811,923,2011中描述的方法，由副干酪乳杆菌LMG S-26420将LA转化成CLA的相关数据。
该方法基于在含有0.05至0.5mg/ml不同浓度的LA的
Figure GDA0003195774080000162
培养基中在培养物上清液中测定CLA的量。将培养物在30℃和37℃的温度下孵育24和96小时的时间。通过如实施例1.a中所述的Barret方法测定由LA转化获得的CLA。
表3
Figure GDA0003195774080000161
Figure GDA0003195774080000171
c)根据色谱方法(HPLC)测定
色谱方法允许根据a)和b)中描述的、报告在表2和3中的方法在细胞悬液和培养物上清液中测定CLA几何异构体、异构体c9-t11、异构体反式10-顺式12和异构体反式9-反式11。
如Kramer J.等人在Am.J.Clin.79,1137S 2004中所述将样品甲基化，通过银离子高压色谱法(HPLC)分离所获得的甲酯。使用三个4.6mm×250mm的CHromSpher脂质柱(串联连接，具有5μ大小的颗粒)分离CLA异构体。异构体用己烷-乙腈：99-1的溶液洗脱，并用二极管阵列检测器和UV检测器在234nm处串联检测。通过使用已知CLA异构体浓度的溶液进行定量测定。
表4a报告了在沉淀样品中测定CLA异构体，所述沉淀样品来自用浓度0.05mg/ml的LA预孵育的培养物、和在不同浓度的LA中孵育洗涤细胞的培养物，所述培养物在37℃下在72小时的孵育时间培养，如在a)中，Ogawa方法。
表4a
Figure GDA0003195774080000172
Figure GDA0003195774080000181
*具有生物学活性的异构体
表4b报告了如b)，Liu方法中所报告的，在来自不同浓度的LA孵育的培养物上清液样品中，CLA异构体的浓度。
表4b
Figure GDA0003195774080000182
*具有生物学活性的异构体
实施例2
用于制备副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的发酵方法。
在Sartorius发酵罐中进行发酵。将相当于40ml的1％的副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的接种物在37℃的温度下在4升
Figure GDA0003195774080000183
培养基中培养8小时。
通过不同的发酵获得的细胞团块通过离心浓缩并用无菌水洗涤。通过分光光度法在625nm处测定细胞团块的水悬浮液的光密度，并通过十进制平板计数法测定菌落形成单位(CFU)。
用不同的发酵参数进行一些制备以确定对于副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的最佳细菌生长条件。
表5报告了在不同的二氧化碳压力、搅拌速度和pH下与发酵相关的参数。表5还报告了通过在8小时后发酵结束时测量生物质的光密度和CFU数获得的结果。
表5
Figure GDA0003195774080000191
n.c.:未控制
培养结束时，副干酪乳杆菌LMG S-26420的CFU数量在每毫升培养物1.9×109至2.6×109范围内，生产的生物质为每升培养物8至16克。
通过细胞团块的系列稀释铺板和微生物菌落计数，在培养皿(Petri dish)上进行CFU测量。
细胞团块可以保持在低于0℃的温度，或者直接冻干以固体形式保存或用于药物/营养制剂。
实施例3
制备冻干形式的副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420。
将由实施例2中所述制备得到的产物(制剂6)冻干。
为了评价冷冻保护剂对副干酪乳杆菌LMG S-26420冻干的影响，在环糊精、海藻糖和甘露醇的存在下进行冻干方法。
将细胞沉淀悬浮于水中，以10％(p/V)的量加入环糊精。
溶液分为三部分：
溶液A：环糊精10％(w/V)
溶液B：环糊精10％(w/V)+海藻糖20％(w/V)
溶液C：环糊精10％(w/V)+甘露醇15％(w/V)。
表6报告了溶液A和B的冻干方法参数。
表6
Figure GDA0003195774080000201
表7报告了溶液C冻干方法的参数。
表7
Figure GDA0003195774080000211
将获得的冻干副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420储存在4℃的瓶子或小袋中。
实施例4
测定玻璃化转变温度Tg、T'g
使用Diamond DSC仪器通过差示扫描量热仪，应用如表8中所报告的冷冻/加热循环，测定冻干之前溶液A和B的玻璃化转变温度Tg和T'g。
表8
步骤 温度1(℃) 温度2(℃) 速度(℃/分钟)
1 25 -60 10
2 -60 25 40
3 25 100 10
4 100 -50 50
5 -50 170 40
将表9中报告的循环用于溶液C。
表9
Figure GDA0003195774080000212
Figure GDA0003195774080000221
表10中报告了溶液Tg和冷冻水溶液的玻璃化转变温度值，待冻干的溶液A、B和C的T'g。
表10
Figure GDA0003195774080000222
Figure GDA0003195774080000231
实施例5
冻干副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的表征。
a)菌株生存力测定
为了测定根据实施例3制备的溶液A、B和C的冻干方法之后副干酪乳杆菌菌株LMGS-26420的产率和生存力，在冻干方法之前和之后通过培养皿计数测定菌株的CFU。测定在以下基础上进行：将对应于0.5克的冻干产品的量悬浮在49.5克稀释缓冲液
Figure GDA0003195774080000233
中，并作为系列稀释液稀释直至达到可用于计数的那些。然后将稀释的产品沉积在事前在高压灭菌器中灭菌的含有20mL
Figure GDA0003195774080000234
琼脂培养基的培养皿中，并在厌氧中在37℃下孵育72小时。
在由溶液A、B和C制成的许多冻干制剂上进行测定，结果报告于表11。
表11
Figure GDA0003195774080000232
Figure GDA0003195774080000241
表11证实了在冻干方法中海藻糖的作用，其导致CFU中的回收率高于30％。
如果需要更大的冻干质，特别是对于小剂量的副干酪乳杆菌LMG S-26420，可以将甘露醇加入到海藻糖中。
实施例6
通过干燥冻干副干酪乳杆菌LMG S-26420测定水活性和重量缺失。
a)水活性(aw)的测定
水活性的测定对应于测定根据实施例3制备的溶液A、B和C的副干酪乳杆菌LMG S-26420的冻干制剂中的游离水。通过将约1克的各冻干产品的样品放置在Aqualab VSADecagon仪器中进行测定，所述Aqualab VSA Decagon仪器用湿度电解检测器测量样品的水活性，直接给出与水摩尔数除以样品摩尔数成正比的量度，所得值报告于表12中。
表12
Figure GDA0003195774080000242
Figure GDA0003195774080000251
所有得到的冻干样品都具有低于0.6的aw值，证实其可以长期储存而没有降解的风险。
b)水含量缺失(LOD)的测定
冻干样品的湿度含量使用thermoscales Mettler获得，值报告于表13。
表13
Figure GDA0003195774080000252
Figure GDA0003195774080000261
Figure GDA0003195774080000262
实施例7
测定副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的冻干制剂的稳定性。
将副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的冻干制剂置于4℃，通过在时间0(T0)、3个月和6个月时测量细菌电荷(bacterial charge)和水活性(aw)，来测定其稳定性。所得结果报告于表14中。
表14
Figure GDA0003195774080000263
Figure GDA0003195774080000271
该表显示，在存在海藻糖的情况下获得的冻干产品在4℃下稳定持续6个月，并且水活性(aw)总是低于0.6。
实施例8
小袋中的包含副干酪乳杆菌LMG S-26420的组合物
小袋中的制剂包含如实施例2制备的冻干产品(制剂B)800mg和500mg的量，分别相当于约3×1010和2×1010个副干酪乳杆菌LMG S-26420的活细胞。
将冻干产品与赋形剂混合，预先过筛，将均质混合物分装在小袋中。表15中报告了单位组成。
在所描述的组合物中，一种包含菊糖，另一种包含低聚木糖，而另外的为与葡萄糖分子结合的果糖分子链形成的低聚果糖的混合物(Actilight 950P)。
表15
Figure GDA0003195774080000272
Figure GDA0003195774080000281
该组合物可以包含维生素，如，例如维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B16。
小袋中的组合物可以悬浮在水溶液或半固体食品中。
实施例9
片剂中的包含副干酪乳杆菌LMG S-26420的组合物
含有250mg冻干产品的量(对应于约1×1010个副干酪乳杆菌LMG S-26420的活细胞)的片剂制剂通过混合冻干样与预先在800微米网上过筛的赋形剂而获得。然后通过施加约13KN的压缩力在Ronchi压缩机或类似的机器中压缩混合物。
表16中报告了片剂的单位组成。
表16
成分 量(mg)
副干酪乳杆菌LMG S-26420 250(1x10<sup>10</sup> CFU)
异麦芽糖(Isomalto) 278.0
交联甲羧纤维素(Croscarmellose) 9.9
滑石 5.5
二氧化硅 3.8
硬脂酸镁 2.8
总重量 550

Claims (13)

1.一种属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌种的细菌菌株，其在微生物保藏中心BCCM/LMG细菌收集-微生物实验室-根特大学保藏，注册编号为LMG S-26420，其中所述细菌菌株的特征在于其以高于30％的百分比将亚油酸转化成共轭亚油酸。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌细菌菌株LMG S-26420，其特征在于其将亚油酸转化成共轭亚油酸具有生物学活性的异构体c9-t11和t9-t11，其中如果与其它异构体相比其总和的百分比高于30％。
3.一种生产如权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的母培养物的方法，其特征在于以下步骤：
-以0.1至10％的体积百分比用副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420接种在适当的培养基中，在30℃至37℃的温度下、在4.5至7.5的pH值下、持续6至15小时的时间；
-通过离心从培养物肉汤中分离细菌生物质；
-将生物质在低于0℃的温度下储存，或冻干所述生物质，由此获得副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的母培养物。
4.根据权利要求3所述的用于生产副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的母培养物的方法，其包括在选自可溶性碳水化合物的冷冻保护剂的存在下的冻干步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其在海藻糖存在下生产冻干副干酪乳杆菌细菌菌株LMGS-26420的冻干培养物。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述副干酪乳杆菌菌株LMG S-26420的培养物以每毫升培养物高于109菌落形成单位的数量、每升培养物高于4克的量的生物质获得。
7.一种营养或食品或药物组合物，其为片剂、用于小袋的颗粒、胶囊或液体悬浮液的形式，包含1x10 8至5x10 11的副干酪乳杆菌细菌菌株LMG S-26420的活细胞量、以及可接受的赋形剂。
8.根据权利要求7所述的营养或食品或药物组合物，其包含益生元、维生素、矿物盐。
9.根据权利要求8所述的营养或食品或药物组合物，其中所述益生元选自低聚果糖、菊糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖，以及所述维生素选自包含维生素E和B的组。
10.根据权利要求7所述的营养或食品或药物组合物，其还包含双歧杆菌。
11.包含副干酪乳杆菌细菌菌株LMG S-26420的药物组合物，用于治疗和/或预防炎性疾病、肠道炎性病理、增加体质量、增加生热、氧化应激保护、肿瘤预防、自身免疫性疾病、糖尿病和动脉粥样硬化。
12.根据权利要求7所述的药物组合物，其还包含属于不同菌株的乳杆菌和/或双歧杆菌。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗与细菌生态失调相关的疾病。
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