CN108342328A - 从海藻中筛选的抑草真菌、其提取物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从海藻中筛选的抑草真菌、其提取物及应用，属于真菌提取物领域。从海藻中筛选的抑草真菌具有除草活性，可作为高效除草剂在大田中应用，尤其是对以反枝苋为代表的双子叶杂草的种子和茎叶具有高度的除草活性。从海藻中筛选的抑草真菌为杂色曲霉Aspergillus versicolor D5,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号是CGMCC 15386。

Description

从海藻中筛选的抑草真菌、其提取物及应用
技术领域
本发明涉及真菌提取物领域，尤其涉及一种从海藻中筛选的抑草真菌、其提取物及应用。
背景技术
目前，共有30000余种杂草广泛分布于世界各地，其中有1800余种对庄稼作物的生长造成危害。若不加控制这些杂草可造成全世界粮食减产10％—15％，严重者甚至会减产超过50％。杂草不但与农作物争夺正常生长所需要的营养成分，而且许多杂草还是病虫害传播的中间寄主，大多数越年生、宿根生杂草是越冬性病虫的越冬场所，这样极大地影响农作物的产量和质量。
过去的半个世纪以来，化学除草剂由于其作用迅速，使用方便等特点，得到迅速发展，挽回了约50％的粮食产量损失，同时大大减轻了劳动强度，提高了工作效率。然而，化学除草剂的广泛使用造成了一系列的问题，如环境污染、农药残留，特别是抗除草剂杂草的出现更使研究新型环境友好型除草剂迫在眉睫。同时，除草剂对农作物的药害问题也造成较大损失，因此研制新型高效低毒的除草剂成了科研工作者十分关注的问题。
海藻中的真菌由于能够产生结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物而引起了人们的关注。自2007年以来，每年从海洋真菌中获得的新化合物数目在100个以上，仅2015年，就报道了400多个新的海洋真菌次级代谢产物。这些化合物当中很多都具有诸如抗菌、抗炎、抗癌、酶抑制等显著地生物活性。然而对于海藻中的真菌应用除草方面的研究还很少，目前并没有对于海藻中的真菌的次级代谢产物防治杂草的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从海藻中筛选的抑草真菌、其提取物及应用，从海藻中筛选的抑草真菌具有除草活性，可作为高效除草剂在大田中应用。
本发明一方面提供了一种从海藻中筛选的抑草真菌，该抑草真菌为杂色曲霉Aspergillus versicolor D5,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号是CGMCC 15386，保藏日期为2018年2月6日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明另一方面提供了上述从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，提取物的提取方法包括以下步骤：
在菌种培养基中对杂色曲霉Aspergillus versicolor D5进行培养，转入发酵培养基中进行发酵，将所得发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩；发酵菌体用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩与发酵液提取物合并，干燥，得到提取物。
作为优选技术方案，所述菌种培养基为马铃薯葡萄糖平板培养基，在菌种培养基中28℃培养7-15天。
作为优选技术方案，所述马铃薯葡萄糖平板培养基配比为：马铃薯5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、粗海盐25-30g/L，其余为去离子水。
作为优选技术方案，所述发酵培养基为马铃薯葡萄糖水液体培养基，1000mL锥形瓶中加入马铃薯浸出粉5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、粗海盐25-30g/L,水350-400mL，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。
作为优选技术方案，将所得发酵液用乙酸乙酯萃取3次，发酵菌体用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡2次。
本发明的再一方面提供了从海藻中筛选的抑草真菌的提取物的应用，所述提取物用于农田杂草的防治。
本发明的又一方面提供了一种真菌除草剂，其有效成分为从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，还包括溶剂或助剂。
作为优选技术方案，所述真菌除草剂为将上述从海藻中筛选的抑草真菌的提取物溶解于水和助剂制得，从海藻中筛选的抑草真菌的提取物的浓度为1.0-10.0mg/mL。
与现有技术相比，本发明所具有的优势及有益效果在于：
1、本发明首次从海藻中发现了抑草真菌Aspergillus versicolor D5，其发酵粗提物的除草活性，除草活性高、效果好，专一性强，低浓度下可发挥优异的除草性能；
2、本发明的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，可作为除草剂主要成分，并且对反枝苋等杂草的种子萌发和根茎生长防治效果显著，并对反枝苋为代表的双子叶植物茎叶具有很强的毒性；
3、本发明的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物可以通过真菌发酵进行大规模生产，成本低，制备效率高，不受资源限制，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的从海藻中筛选的抑草真菌的形态图；
图2为本发明实施例所提供的抑草真菌提取物浓度为10.0mg/mL，5.0mg/mL，1.0mg/mL时，采用茎叶处理法和离体叶片法对反枝苋的除草效果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一实施例提供了一种从海藻中筛选的抑草真菌，该抑草真菌为杂色曲霉Aspergillus versicolor D5,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号是CGMCC 15386，保藏日期为2018年2月6日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
该杂色曲霉Aspergillus versicolor D5在PDA平板培养基上28℃培养5天，菌落直径为3cm，菌丝为橙黄色，表面呈絮状，边缘呈白色。分生孢子头初呈辐射形，顶囊稍长形或稍呈椭圆形，产孢结构双层，分生孢子球，参见图1。
该杂色曲霉Aspergillus versicolor D5菌株的18S rDNA基因序列已提交到GenBank数据库中，登录号为MG827180(由于该基因序列已提交至GenBank数据库，因此不再提供序列表)。
本发明的另一实施例提供了上述从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，提取物的提取方法包括以下步骤：在菌种培养基中对杂色曲霉Aspergillus versicolor D5进行培养，转入发酵培养基中进行发酵，将所得发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩；发酵菌体用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩与发酵液提取物合并，干燥，得到提取物。本步骤中，从海藻中筛选的抑草真菌经过菌种活化和发酵扩大培养后能够产生代谢产物，利于提取物的制备，发酵后的发酵液经过乙酸乙酯萃取，菌体经过甲醇：二氯甲烷体积比为1:1的溶液浸泡后浓缩，所得含水提取物采用乙酸乙酯萃取，并与发酵液萃取物合并，能够充分提取其中的次级代谢产物。乙酸乙酯的萃取能够保证提取物活性的基础上进行浓缩和提纯。
在一优选的实施例中，所述菌种培养基为马铃薯葡萄糖平板培养基，在菌种培养基中28℃培养5-7天；其中，马铃薯葡萄糖平板培养基配比为：马铃薯5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、粗海盐25-30g/L，其余为去离子水。本实施例中，可以理解的是，菌种的培养温度可以在28℃左右，培养的时间可以根据培养的情况进行略微调整。培养基中马铃薯和葡萄糖的配比是针对Aspergillus versicolor D5进行了优化和选择的，能够有效的促进的生长。
在一优选的实施例中，所述发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，1000mL锥形瓶中加入马铃薯浸出粉5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、粗海盐25-30g/L,水350-400mL，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。本实施例中，可以理解的是，菌种的发酵温度可以在28℃左右，具体发酵的时间可以根据发酵的情况进行缩短或延长。发酵培养基中培养基的浓度是针对Aspergillus versicolor D5进行了优化和选择的，能够有效的促进Aspergillusversicolor D5的菌丝生长和次生代谢产物的产生。
在一优选的实施例中，将所得发酵液用乙酸乙酯萃取3次，发酵菌体用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡2次，所得含水提取物采用乙酸乙酯萃取，并与发酵液萃取物合并。本实施例中，萃取3次，浸泡2次能够充分提取，可以理解的是，浸泡和萃取多次也可以充分提取，但是比较费时。
本发明的再一实施例为上述从海藻中筛选的抑草真菌的提取物的应用，所述提取物用于农田杂草的防治。本实施例中，上述海洋真菌提取物对于反枝苋等种子萌发和根茎生长具有一定的抑制作用，同时对反枝苋为代表的双子叶植物的茎叶具有很强的毒性。
本发明的又一实施例提供了一种真菌除草剂，其有效成分为上述从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，还包括溶剂或助剂。本实施例中，以上述从海藻中筛选的抑草真菌的提取物为有效成分，可配合其他的溶剂或助剂配制成为具有优异除草效果的除草剂。其中溶剂可以为能够有效溶解上述提取物的任意溶剂，助剂包括能够促进该提取物发挥除草作用的有效助剂以及在具体施用过程中促进施用除草剂效果的有效助剂，另外，本领域常见的除草剂配合助剂也可用于本发明的除草剂中，例如表面活性剂、分散剂、润湿剂、增稠剂、消泡剂、填料等。
在一优选的实施例中，上述真菌除草剂为将上述从海藻中筛选的抑草真菌的提取物溶解于水和助剂制得，从海藻中筛选的抑草真菌的提取物的浓度为1.0-10.0mg/mL。本实施例中，所述除草剂的浓度可以为上述浓度范围内的任意取值，具体应用过程中可以根据草害程度以及实施方式具体选择上述的浓度，例如，可以选择的浓度可以为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0mg/mL。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的从海藻中筛选的抑草真菌、其提取物及应用，以下将结合具体实施例进行说明。
实施例1从海藻中筛选抑草真菌Aspergillus versicolor D5
用自来水将海藻冲洗干净，称取5g，在无菌条件下用75％酒精浸泡1min，用无菌水冲洗干净，把样品剪成小块，用灭菌研钵研磨样品，加适量无菌水后吸取100微升，用涂布棒在PDA培养基上涂布均匀，28℃培养箱进行培养72小时。
根据菌落颜色、菌丝长短等特征命名不同菌株并且重新接种到新的PDA平板上进行纯化，纯化后的菌株进行遗传学鉴定，测试种子萌发、根茎生长抑制和茎叶损伤过程中菌株的抑草活性，筛选出抑草真菌Aspergillus versicolor D5。
实施例2抑草真菌Aspergillus versicolor D5的培养和发酵
(1)抑草真菌Aspergillus versicolor D5的菌种培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，含有马铃薯5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、琼脂18-20g/L，粗海盐25-30g/L，其余为水，使用时制成平板培养基，菌株在28℃下培养7-10天；
(2)抑草真菌Aspergillus versicolor D5的发酵培养采用马铃薯葡萄糖液体培养基，1000mL锥形瓶中加入马铃薯浸出粉5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、粗海盐25-30g/L,水350-400mL，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。
将所得发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩；发酵菌体用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩与发酵液提取物合并，干燥，得到抑草真菌提取物。
实施例3抑草真菌提取物的除草活性试验
种子萌发法：
将反枝苋种子用3％-5％次氯酸钠(NaClO)溶液消毒5-15min，用无菌水冲洗几次，除去次氯酸钠。采用24孔板进行实验。
将实施例2的抑草真菌提取物用100％甲醇溶解，配制成1.0mg/mL的溶液。
在24孔板中放入滤纸，每孔加入200μL或400μL提取物溶液，待溶剂挥发后，每孔加入200μL或400μL无菌水，密封后放入光照培养箱28℃，12h光照，12h黑暗培养。4天后统计发芽率和根(芽)抑制率，参见表1。草甘膦作为阳性对照。
根(芽)抑制率(％)＝[(对照组根(芽)长－处理组根(芽)长)÷对照组根(芽)长]×100
表1发芽率和根芽抑制率结果表
从上述表1可以看出，本发明的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物针对反枝苋类杂草的根和芽均有显著的抑制率，除草效果明显，能够有效抑制此类杂草的根芽生长。
茎叶处理法：
将反枝苋种子种于边长为10×10cm的塑料盒中，每盒20粒，在光照培养箱中25℃，12小时光照培养一周。
将实施例2的抑草真菌提取物用蒸馏水溶解，配制成100mL的溶液，溶液中加入5mL甲醇，0.2mL农乳1602助溶剂，溶解的抑草真菌提取物浓度分别为10.0，5.0，1.0mg/mL的溶液，喷雾于叶片和茎上，每盆喷5mL，对照喷蒸馏水，七天后观察生长情况，结果参见图2。
结果表明，参见图2(a)-(d)，从左至右，分别为茎叶处理法10.0，5.0，1.0mg/mL浓度下对反枝苋的除草效果和空白对照对反枝苋的除草效果，从图中可以看出，表明该真菌提取物对反枝苋的茎叶有明显抑制作用，具有很强的除草效果。
离体叶片法：
在9cm培养皿中放入同等大小的滤纸，并加入4mL无菌水润湿。取长势良好的反枝苋叶片3片，放入培养皿中。在用解剖针在叶片上刺一个小孔；
将实施例2的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物用100％甲醇溶解，配制成1.0mg/mL的溶液；蒸馏水为对照。
取20μL配好的提取物溶液和滴入小孔中，于光照培养箱中24h光照培养5-7天，观察叶片情况，结果参见图2(e)，图2(f)为空白对照，从图2看出，相对于空白对照，本发明的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物对离体的叶片具有明显的除草活性。

Claims (10)

1.从海藻中筛选的抑草真菌，其特征在于，该抑草真菌为杂色曲霉Aspergillusversicolor D5,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号是CGMCC 15386。
2.权利要求1所述的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，其特征在于，所述提取物的提取方法包括以下步骤：
在菌种培养基中对杂色曲霉Aspergillus versicolor D5进行培养，转入发酵培养基中进行发酵，将所得发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩；发酵菌体用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩与发酵液提取物合并，干燥，得到提取物。
3.根据权利要求2所述的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，其特征在于，所述菌种培养基为马铃薯葡萄糖平板培养基，在菌种培养基中28℃培养10-15天。
4.根据权利要求3所述的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖平板培养基配比为：马铃薯5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、琼脂18-20g/L，粗海盐25-30g/L,其余为去离子水。
5.根据权利要求2所述的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，其特征在于，所述发酵培养基为马铃薯葡萄糖水液体培养基，1000mL锥形瓶中加入大米马铃薯浸出粉5-6g/L、葡萄糖15-20g/L、粗海盐25-30g/L,水400mL，接种真菌后，28℃发酵培养30-40天。
6.根据权利要求2所述的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，其特征在于，将所得发酵液用乙酸乙酯萃取3次，发酵菌体用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡2次。
7.权利要求2所述的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物的应用，其特征在于，所述提取物用于农田杂草的防治。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述农田杂草为双子叶杂草。
9.真菌除草剂，其特征在于，所述真菌除草剂的有效成分为权利要求2-8任意一项所述的从海藻中筛选的抑草真菌的提取物，所述真菌除草剂还包括溶剂或助剂。
10.根据权利要求9所述的真菌除草剂，其特征在于，所述除草剂为所述从海藻中筛选的抑草真菌的提取物溶解于水和助剂所得，从海藻中筛选的抑草真菌的提取物的浓度为1.0-10.0mg/mL。
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