CN108315346B

CN108315346B - 一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用

Info

Publication number: CN108315346B
Application number: CN201810175634.9A
Authority: CN
Inventors: 范晓荣; 陈景光; 刘书华
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2038-03-02
Also published as: CN111850000A; CN111850000B; CN108315346A

Abstract

本发明公开了一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用。一种重组表达载体，其特征在于含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1；所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1，水稻基因OsNAR2.1核苷酸序列为SEQ ID NO.2。本发明所述的重组表达载体在减少水稻田甲烷排放中的应用。本发明首次报道，表达水稻基因OsNAR2.1基因启动子启动基因OsNAR2.1能减少水稻根际土壤产甲烷菌含量，增加甲烷氧化菌含量，降低稻田甲烷的排放方面的应用。

Description

一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用。

背景技术

甲烷(CH₄)是全球主要的温室气体之一，在全球变暖温室效应中的能力比二氧化碳高出 25倍。此外，CH₄还影响大气的化学和氧化能力(IPCC.Changes in atmosphericconstituents and in radiative forcing.Pp.2.9.2–2.9.3in S.Solomon,D.Qin,andM.Manning,et al.eds.Climate change 2007:the physical sciencebasis.Contribution of Working Group I to the Fourth Assessment Report of theIntergovernmental Panel on Climate Change. 2007.Cambridge Univ.Press,Cambridge,U.K.)。

稻田是大气CH₄的主要排放源之一，占总排放量的5％～19％。我国水稻种植面积占全球水稻种植面积的23％，为保障农业生产产量，我国水稻田大量使用氮肥，造成温室气体的排放增加，影响了一系列环境生态效应(Frolking S,Qiu J J,Boles S,etal.Combining remote sensing and ground census data to develop new maps of thedistribution of rice agriculture in China.Global BiogeochemicalCycles.2002.16(4):38-1–38-10.)。有研究表明，稻田施尿素可以增加CH₄的排放(Hu RG，Hatano R，Kusa K，et al.Effect of nitrogen fertilization on methane flux in astructured clay soil cultivated with onion in Central Hokkaido,Japan.SoilScience&Plant Nutrition,2002,48(6):797-804)。尿素的施加能改变水稻根系微生物的丰度(X Fan,H Yu,Q Wu,J Ma,H Xu.et al.Effects of fertilization on microbialabundance and emissions of greenhouse gases(CH₄and N₂O) in rice paddyfields.Ecology and Evolution,2016,6(4):1054)稻田土壤中甲烷产生的唯一生物产生源是产甲烷菌。产甲烷菌的mcrA基因控制CH4产生的最后一步，甲烷氧化菌的pmoA基因则是编码利用CH₄的第一个关键酶，将CH₄氧化为甲醇。

表达水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsNAR2.1能够显著增加水稻田土壤甲烷氧化菌pmoA基因的表达丰度，减少产甲烷菌mcrA基因的表达丰度，从而降低水稻田甲烷的排放。

发明内容

本发明的目的是提供一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体。

本发明的另一目的是提供该重组表达载体的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种重组表达载体，其特征在于含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1；所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1，水稻基因OsNAR2.1核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的重组表达载体的出发载体为pTCK303载体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的重组表达载体中所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1通过相应酶切位点连接形成pOsNAR.1:OsNAR2.1重组片段导入到出发载体中。

本发明所述的重组表达载体在减少水稻田甲烷排放中的应用；优选在减少水稻根际土壤产甲烷菌含量，增加甲烷氧化菌含量，降低稻田甲烷的排放方面的应用。

有益效果：

1、通过系统研究，首次提供了水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsNAR2.1的生物学功能，可以增加水稻田土壤甲烷氧化菌pmoA基因的表达丰度，降低产甲烷菌mcrA基因的表达丰度(图1)。

2、本发明人首次提供水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsNAR2.1的转基因植株，在水稻田表现出显著降低水稻田甲烷的排放产量33％～90％(图3-5)。

附图说明

图1：水稻基因OsNAR2.1启动子启动OsNAR2.1载体示意图。

图2：水稻根际土甲烷菌拷贝数分析。

a：产甲烷菌(mcrA)含量。b：甲烷氧化菌(pmoA)含量。

图3：不同时间稻田甲烷排放量分析

图4:不同时间稻田甲烷排放量分析

图5:不同时间稻田甲烷排放量分析

具体实施方案

一、水稻基因OsNAR2.1启动子序列的克隆

1)水稻基因组DNA的提取

水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，称取0.1g左右叶片，用液氮研碎，研磨充分加入2ml离心管，迅速加入1ml DNA提取液(购自TIANGEN,中国)，充分摇匀振荡后，抽提水稻基因组DNA。

2)OsNAR2.1基因全长的克隆

通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到水稻的NAR2.1(AP004023.2)基因的启动子，用软件Primer 5.0设计引物序列(如下)，从水稻基因组DNA中扩增NAR2.1基因的启动子序列。

P1:5’-TGCTGACAAACCAAACCGACT-3’(SEQ ID NO.3)

P2:5’-CCCCACCTCTCCCACCTCAC-3’(SEQ ID NO.4)

以步骤1)获得的水稻基因组DNA为模板，用高保真酶(Prime Star HS DNApolymerase 购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体(购自Takara公司)，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻基因OsNAR2.1的启动子序列(SEQ ID NO.1)。

二、水稻基因OsNAR2.1序列的克隆

1)总RNA的提取

水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，用0.2mM硝态氮进行处理6小时后立即取根迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右根，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1ml Trizol试剂(购自Invitrogen,USA)，充分摇匀振荡后，抽提总RNA。

2)OsNAR2.1基因全长的克隆

利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到水稻的NAR2.1 基因系列OsNAR2.1(AP004023.2)。设计引物(如下)从组织cDNA库中钓出OsNAR2.1的全长序列。

P3:5’-CAATGGCGAGGCTAGCCGGCGTT-3’(seq id no.5)

p4:5’-CGATCTACTTGTCCTTCTTGCGCTTCT-3’(SEQ ID NO.6)

以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶(PrimeStar HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-18载体(购自Takara公司)，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNAR2.1的全长序列(SEQ ID NO.2)。

三、表达水稻基因OsNAR2.1启动子启动OsNAR2.1转基因株系的获得

1)水稻基因OsNAR2.1启动子启动OsNAR2.1载体的构建

根据步骤一中获得的水稻基因OsNAR2.1启动子序列，见SEQ ID NO.1的序列，用软件 Primer 5.0设计引物序列(如下)：

P5:5’-GAGGCGCGCCTGCTGACAAACCAAACCGACT-3’(ASC I)(SEQ ID NO.7)

P6:5’-CATTAATTAACCCCACCTCTCCCACCTCAC-3’(Pac I)(SEQ ID NO.8)

以步骤一中获得的克隆OsNAR2.1启动子的pMD-18载体为模板，用高保真酶(PrimeStar HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回获得F端和R端分别添加酶切位点Asc I和Pac I的OsNAR2.1启动子的 PCR产物。将回收产物用限制性内切酶Asc I和Pac I进行双酶切，同时用Asc I和Pac I 双酶切植物过量表达载体pTCK303质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体。回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4℃下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a 感受态细胞中，涂在含有卡那霉素50μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落, 提取质粒经Asc I和Pac I双酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆命名为pOsNAR2.1-pTCK303。

根据步骤二中获得的水稻基因OsNAR2.1基因全长序列，见SEQ ID NO.2的序列，用软件Primer 5.0设计引物序列(如下)：

P7:5’-GAGAATTCCAATGGCGAGGCTAGCCGGCGTT-3’(ECOR I)(SEQ ID NO.9)

P8:5’-GAGGCGCGCCCGATCTACTTGTCCTTCTTGCGCTTCT-3’(Asc I)(SEQ ID NO.10)

以步骤二中获得的克隆OsNAR2.1基因全长的pMD-18载体为模板，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后获得F端和R端分别添加酶切位点EcoR I和Asc I的OsNAR2.1基因全长的PCR产物。将回收产物用限制性内切酶EcoR I和Asc I进行双酶切，同时用EcoR I 和Asc I双酶切pOsNAR2.1-pTCK303质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体。回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在4℃下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a 感受态细胞中，涂在含有卡那霉素50μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落, 提取质粒经EcoR I和Asc I双酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆命名为pOsNAR2.1-OsNAR2.1-pTCK303。即为表达载体，载体示意图见图1)。

转基因植株的获得

获得的转有上述载体的农杆菌，侵染水稻愈伤组织，共培养60小时，经过选择培养、分化、生根、炼苗得到T₀代转基因植株。对所有转基因材料都进行了两次扩繁，得到了稳定遗传的T1代和T2代材料。

通过提取水稻根际土壤DNA进行甲烷拷贝数鉴定，发现与WT相比，表达水稻基因OsNAR2.1 启动子启动OsNAR2.1转基因株系的根际土中产甲烷菌(mcrA)减少18.5％，甲烷氧化菌(pmoA) 增加125.4％(图2)，最终导致甲烷排放量减少30％～90％(图3-5)。

综上所述，本发明发现表达水稻基因OsNAR2.1启动子启动OsNAR2.1能显著减少水稻根际土中产甲烷菌(mcrA)含量，增加甲烷氧化菌(pmoA)含量，降低稻田甲烷的排放；可利用本发明 OsNAR2.1启动子启动OsNAR2.1表达载体，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。表达该载体可以减少水稻根际土中产甲烷菌含量，增加甲烷氧化菌含量，降低稻田甲烷的排放。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种含水稻基因OsNAR2.1及其启动子的重组表达载体及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1698

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

gattccccac ctctcccacc tcactcctac ctcactccta gtcctctgcc gaaagtactt 60

cctccgtttc acaatgtaag tcattctaat atttttcaca ttcatattga tgtttgaatc 120

tagattgata tatatgttta gattcgttag catcgatatg aatatgggaa atgctagaat 180

gacttatatt gtgaaacaga gtgagtatca tgtaaaagtt agaaggaaaa aaatagagct 240

gtttgtgatg atatgggtgt ggttgtgttg tgtgagccga tgtccattgt actgtactca 300

ttttaaatgt acgtaccgtt aacttatata gttatatgcg tttgatcatt tgtcaaaatt 360

tagtgaaact ttaaaattta ttatacttaa agtatattta atgataaatt taaaataaaa 420

taaactttca gctgttatgt tcaaaatcaa catcgtcaga tattttaaat taaaggtagt 480

acttttaaaa aaaggatttt tgcggtgtgt cgtggcgaaa ctgctaccaa gtttcaatga 540

tcatatgcca tttcatagga taattactct catcgtggta agtaagaatc gattgcctat 600

tttcggcagg ctgttgtttc aaagcatcga tctgcttgga caacttgagc aaagctagct 660

agaactgggt cgatataatt gcagcactag gcaatcaaga gacggagctg ccaccagcta 720

gctgagctga gctgatatga tcaacacagt gcagacttgg tcgtgttcga gttcgatcga 780

cggatggctg tcctgctctt gcgctcatgc atgtcatctc ttcggaagta ggagtacagc 840

agtacttgag gaatattatt agagagtaag ttgaactgtt ttcaatagtt cagggtgtaa 900

actaagctga ggaattgtta ggaggttaaa tgctgtggca aaatagtttg gaggagcgaa 960

atgatttttt tttcatatga aaaacatcta aatttatttt ttgccaaaac actagtatat 1020

catcaaattt tcatccatta agaacgcctt ctcaatatta ataattccaa tgtgatatct 1080

taatgctcaa tgaacctaaa atagtttgga tgagtgaaat ggactctttt tgagtttttt 1140

tccatatgaa aacatctaaa tttatttttt tttgccaaaa cactggtata tcatcaaatt 1200

ttcctccatt aagaacgcct tctcaacgtt aataactcca atgttattat cttaatgcca 1260

aatgaaccta ccatgaacgt catgctcaca atttaattaa caacaaccgg gcactcaaga 1320

tcattcgcgg ttgccgcttc tcaccggttg cctgaaccct tgggacccct ccaaaagctt 1380

aattaccccc aaaaccgcat gatctctctc ttctcttctc ttctcacacg tcgtcaaagc 1440

ctctgacttt ggatatcccc gaccccacta aacttaatca acttgatcat tacaacaatt 1500

aagttgcctc ttgaatccaa cgaagtagct ggtcaactct ccgagctcta gcctcgctct 1560

cccgcctata aattcaccga tcgatcgatc gatcgatctc agcatcagca gcagcagcag 1620

attcatttct tggtcttcgt ctccgtctcc gtccttgggt tgatatccag aatcagtcgg 1680

tttggtttgt cagcaatg 1698

<210> 2

<211> 621

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atggcgaggc tagccggcgt tgctgctctc tcgttggtgc tcgtcttgct cggcgccggc 60

gtgccccggc cggcggccgc cgccgcggcg aagacgcagg tgttcctctc caagctgccc 120

aaagcgctcg tcgtcggcgt ctcgcccaag cacggtgaag tcgtgcacgc cggcgagaac 180

acggtgacgg tgacgtggtc gctgaacacg tcggagccgg cgggcgccga cgcggcgttc 240

aagagcgtga aggtgaagct gtgctacgcg ccggcgagcc ggacggaccg cgggtggcgc 300

aaggcctccg acgacctgca caaggacaag gcgtgccagt tcaaggtcac cgtgcagccg 360

tacgccgccg gcgccggcag gttcgactac gtggtggcgc gcgacatccc gacggcgtcc 420

tacttcgtgc gcgcctacgc ggtggacgcg tccggcacgg aggtggccta cgggcagagc 480

tcgccggacg ccgccttcga cgtcgccggg atcaccggca tccacgcctc cctcaaggtc 540

gccgccggcg tcttctccac cttctccatc gccgcgctcg ccttcttctt cgtcgtcgag 600

aagcgcaaga aggacaagta g 621

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgctgacaaa ccaaaccgac t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccccacctct cccacctcac 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caatggcgag gctagccggc gtt 23

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgatctactt gtccttcttg cgcttct 27

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggcgcgcc tgctgacaaa ccaaaccgac t 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cattaattaa ccccacctct cccacctcac 30

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagaattcca atggcgaggc tagccggcgt t 31

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaggcgcgcc cgatctactt gtccttcttg cgcttct 37

Claims

1.一种重组表达载体在减少水稻田甲烷排放中的应用; 其特征在于所述的重组表达载体含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsNAR2.1；所述的水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1，水稻基因OsNAR2.1核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的重组表达载体在减少水稻根际土壤产甲烷菌含量，增加甲烷氧化菌含量，降低稻田甲烷的排放方面的应用。