CN108300806A - 一种快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速检测Ferlavirus病毒的RT‑PCR引物及其应用，属于动物细菌学及分子生物学技术领域。所述RT‑PCR引物由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成；上述引物用于制备检测Ferlavirus病毒的RT‑PCR试剂盒。该试剂盒提供的RT‑PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，快速准确的获得检测结果，同时价格低廉、操作简便，解决了传统鉴别方法分离率低，耗时费力等不足，适合基层使用，可作为Ferlavirus病毒实验室快速检测和大规模流行病学调查的一种快速、准确、简便的检测工具。

Description

一种快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物及其应用

技术领域

本发明涉及动物细菌学及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、简便、低成本检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物及其应用。

背景技术

在1972年瑞士的一个蛇类展览馆的矛头蛇（Ferdelance）出现呼吸困难、嗜睡、神经症状，死亡率达30%，此后D.W.Folsch从一条矛头蛇分离到一株副黏病毒，这是第一次从爬行动物分离到副黏病毒的报道。由于是从矛头蛇分离的缘故，故将病毒株命名为Fer-de-Lance(FDLV)。2011年，国际病毒分类委员会同意以FDLV为代表的代表毒株增加一个新的副黏病毒属--Ferlavirus的提议。

Ferlavirus主要引起蛇呼吸系统疾病，临床特征主要表现不同程度的呼吸困难、口腔有粘液、饮水增多，部分蛇出现头震颤等神经症状；病理变化主要表现为肺水肿、充血、出血，严重的肺表面产生大量分泌物呈豆腐渣样或干酪样，气管有大量痰液，肝、脾肿大，胰腺坏死、出血，肠道出血等。由Ferlavirus引起的蛇肺炎是人工养殖蛇最常见疾病之一，目前缺乏对防治该病毒的相关疫苗和药物，所以一旦发病往往引起高的发病率和死亡率，给养殖户带来巨大的损失。因此由Ferlavirus感染引起的蛇肺炎是制约养蛇行业持续健康发展的巨大障碍。

对于Ferlavirus的检测目前有多种方法，包括病毒分离、电子显微镜技术、免疫组化学技术、原位杂交技术、血凝抑制反应（HI）、红细胞凝集反应（HA）、RT-PCR技术。虽然病毒分离、电子显微镜技术、免疫组化学技术、原位杂交技术都能够检测组织样本中是否有Ferlavirus病毒，但是这些检测方法在仪器设备要求上比较苛刻、技术繁琐、成本高、时间长等特点，难以在临床上对大规模的样本进行快速检测。临床对于Ferlavirus上用得较多的是HI、HA、RT-PCR方法。由于Ferlavirus病毒能够凝集红细胞，所以用HA可以快速、简单的检测样本中的Ferlavirus病毒，但是该方法在特异性和敏感性存在的严重的缺陷。用HA方法进行病毒检测易产生假阳性；相比敏感性，其远远低于RT-PCR反应。在临床上已经存在商业HI试剂盒对Ferlavirus病毒进行快速检测，但是目前对于Ferlavirus病毒的血清型分类目前尚未弄清楚 ，国外多位学者在用不同的毒株作为抗原检测临床样本时，结果差异较大。 所以血清型的差异，用HI检测Ferlavirus病毒可能会存在漏检。RT-PCR方法具有快速、特异性高、成本低、可操作性强等特点，是临床检测Ferlavirus病毒的主要方法。目前有根据Ferlavirus的F、HN、U等为靶基因设计的引物进行RT-PCR检测,但是由于Ferlavirus至少存在着三个亚组，这些方法大多局限在某一亚组上，敏感性上还存在不足。因此能够设计出一对保守性强、特异性高、敏感性好的引物对于采用RT-PCR检测多样性的Ferlavirus十分有必要。

发明内容

本发明目的是提供低成本、快速、准确地检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物及其应用。为实现本发明目的，使用如下的技术方案：

一种快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物，所述RT-PCR引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成，引物序列为：

引物上游序列L-F： 5'-GCAGAGATTTTCTCTTTCTT-3' SEQ ID NO:1

引物下游序列L-R： 5'-AGCTCTCATTTTGTATGTCAT-3' SEQ ID NO:2

优选的，所述的RT-PCR引物是依据Ferlavirus病毒L基因进行设计，扩增的目的片段大小为627 bP，扩增序列（627bp） 为：

5'-AGCTCTCATTTTGTATGTCATTTTGGCAAATAGCCTCCCTGCTTGTTTGATCTCTTTCTCCTTGAGGCTATAAGATATGTTAAAATCTTGGTCAGCTAAGTAACTACCTGAAGTGACATAATCTATAATGTCCTGAGGATTGAACTCCATGTCTTCTAGGAACACATCAACTAGCCTCCTGCTAGTAGAGCTTTTACCAGGGGAGTATTGCATGTTCTCTTGCGGATATACGGTATCCCACTCAGATTTGATAGGGGACAATGCTTTATCTTTCATGAATATAGTTAGGTCCTCATCAAGATTGACCTCCTCAAACTTATCGAATCTGAATCCCACAAAAGATTCCCAGTGGTTGACACTCAACTCATACGGGATAGCAGCATGATTTGCCGCAACTGCCTTTAACTCTGGAGAAGCATAATCAGGAAGAGAGCACGGTGGCCAAGACCCTCCATGCCTTTCCCTGAATCCATTGATTATCATTGAACAGAATACAGCATGCCCTTTTTGAAGAACCTCATAATCTAAGATCTTAGGTTTACACATATGATCCCTCACCTTGTCTGCCGCCGTAACAGCCTCGAGGATAGGGTGACCGAAAGATCTAAAGAAAGAGAAAATCTCTGC-3'

优选的，所述的RT-PCR引物在制备检测Ferlavirus病毒试剂盒的应用。

本发明还提供一种快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR试剂盒，包括具有SEQ IDNO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。

优选的，所述RT-PCR剂盒还包括RT-PCR预混液和去离子水；所述的RT-PCR预混液由5×RTBuffer、dNTPs、反转录酶组成。

优选的，所述RT-PCR试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25pmol。

优选的，所述的RT-PCR试剂盒中RT-PCR反应程序为94℃ 2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 60s；最后72℃ 延伸5min。

试剂盒的使用方法包括如下步骤：

<1>进行RT反应：提取组织RNA样本，进行反转录（RT），获取cDNA。

<2> PCR反应：取步骤<1>所得cDNA样本作为模板进行PCR扩增，同时以去离子水为阴性对照样本进行PCR扩增；

PCR反应结束后，取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪凝胶成像系统观察结果。

PCR反应的反应体系和反应条件分别为：

<1>RT反应

反应体系：RT反应总体系20μl，其中dNTP Mix 4μl，通用引物Primer Mix 2μl，RNA模板4μl，缓冲液5×RTBuffer 4μl，反转录酶SupperRT(200U/μl) 1μl，去离子水5μl。

反应程序：42℃孵育40min，85℃孵育5min，反应结束后置于冰上冷却。

<2>PCR反应

反应体系：PCR反应体系为25 μl，其中10×PCR缓冲液2.5μl、25mM MgCl₂ 4μl、dNTPs 1μL、引物L-F、L-R各1μl、待检样本3μl及去离子水12.5μl。

反应程序：94℃ 2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 60s；最后72℃ 延伸5min。

（5）结果判定

所述的结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从样品中扩增出了627 bp的特异性条带，则说明该样品存在测Ferlavirus病毒；如果样品没有扩增出627bp的特异性条带，则说明该样品不含有测Ferlavirus病毒。

本发明的实质性特点和显著的进步是：

本发明根据Ferlavirus病毒的L基因组序列，设计了1对可扩增L基因的特异性引物，建立了RT-PCR快速检测方法。本发明PT-RCR具有以下优点，

1）特异性强

本发明提供的测Ferlavirus病毒的RT-PCR扩增引物具有高度特异性，特异性检测出测Ferlavirus病毒，所检测的阴性对照病原菌如禽流感病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和水对照均无阳性结果。

2）灵敏度高，检测结果准确

使用传统方法检测Ferlavirus病毒—体外分离培养，当样品的测Ferlavirus病毒含量较低时，或者样品在保存运输不当时导致病原菌失活，会出现分离不到病原菌的情况，因而做出该样品不存在测Ferlavirus病毒的误判。

本发明提供的测Ferlavirus病毒的RT-PCR扩增引物具有灵敏度高的特点，最低检测限为5fg/μl的cDNA。即使样品中测Ferlavirus病毒含量低或已经失活，使用本发明的RT-PCR扩增引物进行扩增也可以检测到，因而做出正确的判定。

3）耗时少，迅速获得结果

传统方法检测鉴别测Ferlavirus病毒的方法为：病原菌分离鉴定，测Ferlavirus病毒在血平板上需要20小时以上才长出明显菌落。生化试验通常耗时24-72小时，做出正确的鉴定将花费3-4天时间，该方法耗时费力，且分离率低，不能很好的确定样品中是否存在测Ferlavirus病毒。利用本发明提供的测Ferlavirus病毒RT-PCR扩增引物所建立的检测方法，在时间成本、工作量等方面具有明显的优势，从核酸提取到琼脂糖凝胶电泳进行结果分析判定，可在5小时内完成。

附图说明

图1是Ferlavirus病毒三个不同亚组毒株RT-PCR电泳图，其中M是Marker 2000，1、2、3分别是Ferlavirus病毒三个不同亚组RT-PCR结果，4是阴性对照。

图2是RT-PCR退火温度优化的电泳图，其中Marker 2000，1~9分别对应退火温度40℃、41 ℃、43 ℃、45℃、47℃、49℃、51℃、52℃。

图3是RT-PCR特异性试验的电泳图，其中M是Marker 2000，1是Ferlavirus病毒，2~7分别是禽流感病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、阴性对照。

图4是RT-PCR敏感性试验的电泳图，其中Marker 2000，1~9分别是50 ng/ μlcDNA、 5ng/ μl cDNA、500pg/ μl cDNA、50pg/ μl cDNA、5pg/ μl cDNA、500fg/ μl cDNA、50fg/ μl cDNA、5fg/ μl cDNA、500ag/ μl cDNA。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 RT-PCR快速检测方法构建

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

1.1.1.1 毒株

Ferlavirus病毒的三个不同亚组（A、B、C）毒株由广西大学动物科学技术学院药理实验室保存，禽流感、犬细小病毒、犬瘟热病毒是市售疫苗，新城疫病毒由广西大学动物科学技术学院禽病研究室提供，呼肠孤病毒由广西兽医研究所提供。

1.1.1.2 主要仪器和试剂

日本TaKaRa公司梯度PCR仪，美国Alpha Inotech公司凝胶成像系统，美国Thermo公司微量紫外分光光度计。病毒基因组RNA提取试剂盒、PCR 试剂、DNA Marker 2000、反转录试剂盒、pUC-T TA连接试剂盒、DH5α感受态细胞、质粒提取试剂盒均购买于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.1.3 引物设计

根据GenBank收录Ferlavirus的基因，应用引物设计软件DNA STAR和Oligo 6.0选择L基因作为引物设计区域，引物序列L-F为5'-GCAGAGATTTTCTCTTTCTT-3'和L-R为5'-AGCTCTCATTTTGTATGTCAT-3'，扩增片段长度为627bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.1.2 方法

1.1.2.1 病毒RNA模板的制备

本实验采用病毒基因组RNA提取试剂盒抽提病毒RNA，提取方法按说明书进行。

1.1.2.2 cDNA的构建

对上一步获得的RNA为模板，用反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，反应体系和反应条件如下：

RT反应总体系20μl，其中dNTP Mix 4μl，通用引物Primer Mix 2μl，RNA模板4μl，缓冲液5×RTBuffer 4μl，反转录酶SupperRT(200U/μl) 1μl,去离子水5μl。将反应物置于42℃孵育40min，85℃孵育5min，反应结束后置于冰上冷却。

1.1.2.3 基因的扩增、克隆、含有目的基因质粒构建

采用通用引物RT反应获取的cDNA进行PCR扩增，PCR产物于2%的琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。PCR产物与pUC-T载体过夜连接后转化大肠杆菌DH5α。用小量质粒提取试剂盒提取转化长出的菌落质粒。

1.1.2.4测序鉴定

对获得质粒经PCR和双酶切鉴定，对含有目的基因的质粒送至北京华大基因测序有限公司测序。

1.1.2.5 RT-PCR条件优化

对不同退火温度（40 ℃、41 ℃、43 ℃、45℃、47℃。49℃、51℃、52℃）在梯度PCR仪上进行PCR扩增，摸索PCR的最佳反应条件。

1.1.2.6 RT-PCR方法的特异性

特异性试验毒株进行检测，评价RT-PCR方法的特异性,具体操作如下：

<1>制备RNA样本：禽流感病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒RNA按照病毒基因组RNA提取试剂盒进行提取；

<2>RT反应获取cDNA,反应同上。

<3> PCR反应：取步骤<2>所得cDNA样本作为模板进行PCR扩增，去离子水为阴性对照样本进行PCR扩增；PCR反应的反应体系和反应程序分别为：

PCR反应体系为25μl，其中10×PCR缓冲液2.5μl、25mM MgCl₂ 4μl、dNTPs 1μl、引物L1和L2各1μl、cDNA 3μl及去离子水12.5μl。

反应程序：94℃ 2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃ 30s，45℃ 30 s，72℃ 60s；最后72℃延伸5min。

PCR反应结束后，取10μl PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪凝胶成像系统拍照判断结果。

1.1.2.7 RT-PCR方法敏感性试验

将50ng/ μl的含有目的基因cDNA进行10倍梯度稀释至500ag/ μl，用优化的PCR方法分别对其进行检测，评价RT-PCR方法的敏感性。具体如下:

<1>制备Ferlavirus病毒的RNA样本,方法同上。

<2>RT反应获取cDNA,反应同上。

<3>用紫外分光光度计测量cDNA浓度，将其浓度调整为50ng/μl。

<4>RT-PCR敏感性检测：将50ng/ μl的含有目的基因的cDNA进行10倍梯度稀释至500ag/ μl，用优化的RT-PCR方法分别对其进行检测，评价RT-PCR方法的敏感性。

实施例2 实验结果

2.1 目的基因的扩增、克隆和测序

采用设计的特异性引物对Ferlavirus病毒三个亚组（A、B、C）毒株的RNA进行RT-PCR扩增，如图1所示，RT-PCR产物电泳后出现与预期扩增长度相同的片段。RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和回收后，与pUC-T载体过夜连接并转化大肠杆菌DH5α。获得的阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送北京华大基因测序有限公司测序，测序结果与参考序列完全一致，证实引物可特异性扩增出Ferlavirus病毒的L基因。

2.2 RT-PCR反应条件的优化

如图2所示，对RT-PCR退火温度进行优化，获得了RT-PCR扩增Ferlavirus病毒L基因的最佳反应条件。从图中可知在40 ℃、41 ℃、43 ℃、45℃、47℃。49℃、51℃、52℃都能扩增出目的大小的基因片段，但是随着温度升高会同时出现200bp的非特异性条带，因此结合PCR反应液温度要求和特异性，确定最优应条件为：94℃ 预变性2min；随后进行35个94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 60s的循环；最后72℃延伸5min。

2.3 RT-PCR方法的特异性试验

RT-PCR方法特异性试验结果如图3所示，对其他五种常见的RNA病毒进行RT-PCR结果都显阴性，可知所建立的方法特异性强。

2.4 RT-PCR方法的敏感性试验

用优化的RT-PCR方法分别对50ng/μl～500ag/μl的含有目的基因的cDNA进行检测，如图4所示，电泳结果表明方法最低检测极限是5fg/μl的cDNA。

本研究利用RT-PCR可以在基因水平上直接进行检测的优点，以Ferlavirus的L基因为靶目标，针对基因特异性区域设计引物进行RT-PCR鉴定。结果表明，本检测方法对三个亚组的Ferlavirus病毒都呈阳性，同时不能检出其他相关病毒，具有较高的特异性和保守性；最低可检测出5fg/μl的cDNA，敏感性好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 1

gcagagattt tctctttctt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 2

agctctcatt ttgtatgtca t 21

Claims (7)

1.一种快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述RT-PCR物由具有SEQID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成。

2.根据权利要求1所述快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述的RT-PCR引物是依据Ferlavirus病毒L基因进行设计，扩增的目的片段大小为627 bP。

3.根据权利要求1或2所述快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述的RT-PCR引物在制备检测Ferlavirus病毒试剂盒的应用。

4.一种如权利要求1所述快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。

5.根据权利要求4所述快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒还包括RT-PCR预混液和去离子水；所述的RT-PCR预混液由5×RTBuffer、dNTPs、反转录酶组成。

6.根据权利要求4所述快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒的SEQ ID NO:1引物和SEQ ID NO:2引物使用浓度为25 pmol。

7.根据权利要求4所述快速检测Ferlavirus病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒中RT-PCR反应程序为94℃ 2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃30s，45℃ 30s，72℃ 60s；最后72℃ 延伸5min。