CN108276390A - 一种逆转肿瘤细胞耐药的嘧啶衍生物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种逆转肿瘤细胞耐药的嘧啶衍生物及其应用。该嘧啶衍生物包括由以下通式(I)表示的化合物

Description

一种逆转肿瘤细胞耐药的嘧啶衍生物及其应用

技术领域

本发明具体涉及一种逆转肿瘤细胞耐药的嘧啶衍生物及其应用。

背景技术

Aurora激酶属于苏氨酸/丝氨酸激酶家族，包括Aurora A(AURKA)，Aurora B(AURKB)及Aurora C(AURKC)三个成员。其中AURKA激酶调节复杂的生物学过程，涉及到磷酸化/去磷酸化、降解与转录调控，并在细胞分裂期发挥重要的生理功能，还对维持细胞增殖与稳定细胞周期发挥关键作用。

在肿瘤细胞中，AURKA激酶的过度表达可引发纺锤体的多极化，造成染色体分离异常，产生非整倍体细胞。反之，抑制AURKA激酶的表达可导致肿瘤细胞纺锤体的单极化，进而阻滞细胞周期，最终引发凋亡。在许多部位的实体瘤，如乳腺癌、胃癌、肝癌、食管癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌及血液系统肿瘤，均发现AURKA的基因扩增、突变或蛋白高表达。初步临床研究证实，AURKA可作为一项与肿瘤发生、恶化密切相关的分子标记，高表达AURKA往往预示了不良的预后。研究报道在肿瘤细胞中，AURKA过表达可抑制细胞凋亡；AURKA缺失可增加细胞对化疗药物(如顺铂)的敏感性；在骨髓瘤患者中，即使在高剂量化疗药物的作用下，AURKA高表达的患者仍然显示出较差的生存率，提示肿瘤中过表达的AURKA激酶可能是导致临床上药物敏感性低、疗效差的原因之一。随着对AURKA激酶活性位点晶体结构的阐明，一些世界顶尖的抗癌药物生产商纷纷致力于AURKA激酶小分子靶向药物的研发，然而对AURKA在生命活动中的功能和机制的认识尚需进一步深入。

近年来的研究提示了肿瘤的恶性细胞群体起源于肿瘤干细胞群。肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性降低，更易产生耐药现象，从而导致肿瘤患者的复发。肿瘤干细胞导致的耐药复发具有多方面的原因。目前，更多的研究关注于肿瘤干细胞如何通过基因异常表达或突变获得自我更新能力而导致耐药复发。研究发现多种信号通路如Notch、Shh和Wnt/β-catenin参与调节肿瘤干细胞的自我更新，其中STAT5信号的激活与肿瘤干细胞密切相关。白血病中的不同融合基因均能使STAT5在胞内异常活化。慢性髓系白血病细胞常伴随BCR/ABL融合基因的出现，这一融合基因表达会使STAT5磷酸化而持续激活。急性髓系白血病细胞中常出现的FLT3-ITD融合基因也使得STAT5被激活，使白血病细胞具有超常的生存能力。同样的，具有TEL-JAK2和TEL-PDGFβR融合基因的白血病细胞，也会使STAT5信号通路持续活化。研究表明，STAT5主要通过作用于下游的自我更新基因调控肿瘤干细胞/白血病干细胞。

新近研究发现AURKA激酶在肿瘤干细胞富集的细胞群(包括卵巢癌、乳腺癌、急性髓系白血病等)中高表达，暗示了AURKA激酶在肿瘤细胞干性(导致肿瘤形成、耐药、转移等)中扮演重要角色。相较于健康人的造血干细胞，AURKA在白血病干细胞中异常高表达。但是对于AURKA激酶在白血病的发生发展中的功能和机制，目前的认识尚不完善。实验证明，在白血病细胞中抑制AURKA激酶的活性，应用蛋白组学等方法鉴定出多个靶蛋白，包括PI3K/Akt/mTOR、p38 MAPK和AMPK等多条复杂的信号通路。STAT5是多个白血病信号通路的聚合点，STAT5高表达导致耐药性的发生，其是白血病预后不良的标志。而AURKA激酶与上述信号通路均有交汇，其可调控上述信号通路的活性。鉴于AURKA在肿瘤干细胞中富集，其可能成为抑制肿瘤干细胞的重要靶点，因此，抑制AURKA具有抑制激活型STAT5信号通路的潜在可行性。但是由于细胞信号途径的复杂性，以及机理尚未研究透彻等原因，很多作为AURKA激酶抑制剂而筛选出来的嘧啶衍生物，无法克服STAT5高表达引起的耐药性，可能由于其靶向性不高，存在严重脱靶性，在肿瘤干细胞中未能发挥抑制作用。

所以，寻找逆转肿瘤细胞耐药的AURKA激酶抑制剂具有重大意义，是目前重要的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种逆转肿瘤细胞耐药的嘧啶衍生物及其应用。

本发明的有益效果是：

一种具有Aurora激酶抑制活性且能逆转STAT5信号通路激活引起的肿瘤细胞耐药性的嘧啶衍生物，该嘧啶衍生物包括以下通式(I)表示的化合物，或其药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药；

一种药物组合物，该药物组合物包括上述嘧啶衍生物。

上述嘧啶衍生物，或者上述药物组合物在制备抑制Aurora激酶活性和STAT5信号通路激活引起的肿瘤细胞耐药性的药物中的应用。

优选的，Aurora激酶为Aurora A激酶。

上述嘧啶衍生物或药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

优选的，肿瘤为血液系统肿瘤。

上述嘧啶衍生物或药物组合物在制备治疗耐药性白血病药物中的应用。

优选的，耐药性是STAT5信号通路激活引起的。

优选的，嘧啶衍生物或药物组合物可以连同常规的肿瘤药物(比如阿糖胞苷)共同作用于耐药性白血病。

上述嘧啶衍生物或药物组合物和常规肿瘤药物的联合应用在制备治疗耐药性白血病药物中的应用。

优选的，常规肿瘤药物包括化疗药物或靶向小分子抑制剂。

优选的，常规肿瘤药物包括阿糖胞苷。

本发明的有益效果是：

由各种原因导致的STAT5信号通路的激活常见于各种类型的白血病，并常常导致患者对常规化疗药物或靶向小分子抑制剂耐药性的出现。本发明所公开的嘧啶衍生物作为Aurora抑制剂可逆转STAT5信号通路激活引起的耐药，因此可用于耐药性、复发性白血病的治疗。

本发明建立了STAT5高表达细胞模型，所述抑制实验都是基于此模型而展开，本发明所筛选的嘧啶衍生物(记名为25i)除了具有AURKA激酶的抑制活性，还具有逆转STAT5信号通路激活导致的耐药的功能，预示着良好的应用潜力，可以克服现有技术中的不足。因此本发明的嘧啶衍生物25i相较于现有技术中的嘧啶衍生物(绝大多数不能克服STAT5激活所引起的耐药性)，具有更广阔的前景以及更优越的治疗效果。

目前，有不少的STAT5抑制剂处于研发阶段。在白血病的研究中，Pimozide相关的报道较多，然而我们通过对比试验发现，STAT5抑制剂Pimozide在2.5μM时对于STAT5高表达细胞模型的抑制效果并不理想。此外，白血病常规化疗药物阿糖胞苷对STAT5高表达细胞模型也同样缺乏有效的干预作用。本发明的嘧啶衍生物25i对于白血病细胞，特别是STAT5信号通路高度激活的白血病耐药细胞具有明显的抑制效果，其在0.156μM能完全抑制白血病细胞的增殖及克隆形成能力，其分子机制主要通过阻滞细胞周期于G2/M期，抑制白血病干性及耐药调控基因的表达，并导致细胞的分化。体内实验表明25i能明显抑制白血病细胞荷瘤裸鼠的成瘤能力，并且对小鼠的体重及正常生活无影响，表明其具有安全性。

此外，本发明的嘧啶衍生物25i或相关药物组合物可以连同常规的肿瘤药物(比如阿糖胞苷)共同作用于耐药性白血病，以取得更好的治疗效果。

附图说明

图1为化合物25i抑制细胞AURKA激酶活性图；

图2为化合物25i抑制细胞活力图；

图3为化合物25i促进细胞凋亡图；

图4为高表达STAT5的细胞模型构建图；

图5为化合物25i抑制细胞增殖图；

图6为化合物25i导致细胞周期阻滞图；

图7为化合物25i抑制细胞克隆形成图；

图8为化合物25i抑制白血病细胞的形态学分析图；

图9为化合物25i对耐药蛋白的抑制图；

图10为化合物25i体内抑制白血病作用图；

图11为STAT5抑制剂抑制细胞增殖图；

图12为化疗药物阿糖胞苷抑制细胞活力图。

具体实施方式

下面结合具体实验对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

化合物25i的合成

化合物25i的合成路线如下：

。

上述合成路线中中间体C的合成方法：称取2,4,6-三氯嘧啶A(1.83g,10mmol)，3-氨基-5-甲基吡唑B(0.97g,10mmol)溶于100mL无水乙醇中，加入1.4mL三乙胺，0℃下搅拌反应12h。停止反应后，往反应溶液中加入150mL水，立即析出大量的白色固体，抽滤，并依次用50mL冰水和20mL冰甲醇洗涤，干燥后得到白色固体C(1.82g,产率75％)。固体C无需柱色谱纯化，可直接用于下一步反应。

所得到的白色固体C的核磁数据为¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.21(s,1H),10.63(s,1H),7.74and 6.76(m,1H),6.38and 5.78(m,1H),2.21(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:161.1,159.7,158.4,147.1,139.0,102.6,95.2,10.4ppm。由该数据可知，所得到的白色固体具有如上化合物C的结构。

上述合成路线中中间体D的合成方法：室温下，称取化合物C(2.441g,10mmol)、4-氟-3-氯苯胺(1.456g,12mmol)、一水合对甲苯磺酸(1.536g,8.0mmol)，溶于20mL正丁醇中，140℃下回流16小时，反应完全后旋干溶剂，加入适量饱和碳酸氢钠溶液调节pH值至7～8，用少量乙酸乙酯萃取(100mL×3)。合并有机相，旋干溶剂，柱色谱纯化(PE:EA＝3:1～1:2)得到目标物D(2.895g，产率82％)。

所得到的化合物D的核磁数据为¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.09(s,1H),9.93(s,1H),9.88(s,1H),8.11(d,J＝10.2Hz,1H),7.42(s,2H),6.29(s,2H),2.23(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:160.9,158.6,158.3,155.8,147.6,141.0,140.9,138.7,129.9,115.7,110.7,110.6,107.0,106.7,96.0,10.6ppm。由该数据可知，所得到的目标物具有如上化合物D的结构。

上述合成路线中化合物25i的合成方法：称取化合物D(1.05g,3mmol)溶于1-甲基哌嗪(3mL,10mmol)中，120℃下回流12小时，反应完全旋干溶剂，柱色谱分离(二氯甲烷:甲醇＝30:1～20:1)2次，得目标物25i(780mg,产率48％)。

所得到的化合物25i的核磁数据为¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:11.83(s,1H),8.95(s,1H),8.88(s,1H),8.14(d,J＝5.1Hz,1H),7.56(s,1H),7.25(t,J＝8.9Hz,1H),6.08(s,2H),4.78-4.50(m,1H),3.47(s,4H),2.38(s,4H),2.21(s,3H),2.19(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ:163.6,161.1,158.9,153.0,150.6,139.3,119.8,119.2,119.0,118.8,118.7,116.8,116.6,100.0,95.2,77.8,54.7,46.2,44.3,11.6ppm。所得到的目标物25i高分辨质谱数据为HRMS(ESI-TOF):m/z calcd.for C₁₉H₂₃ClFN₈[M+H]⁺:417.1713,found:417.1717。由该数据可知，所得到的目标物25i具有如上结构。

对化合物25i进行相关的活性实验。

实验1

Aurora激酶活性测试通过Caliper Mobility Shift Assay方法测定。将化合物从10μM开始依次三倍稀释，总共得到10个浓度，并加入Aurora激酶、FAM标记多肽和ATP，25℃下反应60分钟后加入终止液终止反应；最后采用Caliper读取转化率数据，换算成抑制率数据后通过Xlfit统计软件计算获得IC₅₀数据。

实验1的结果如表1所示。

表1实施例化合物25i的Aurora激酶抑制活性

由表1可知：25i抑制AURKA的IC₅₀为7.1nM，抑制AURKB的IC₅₀为25.7nM，证明25i在体外能特异靶向抑制AURKA激酶的活性。

实验2

嘧啶化合物25i溶于DMSO(100mM)作为存储液，实验时进行稀释。分别取不同浓度的嘧啶化合物25i对白血病细胞U937进行处理，48小时后收集细胞，Western blot检测细胞中磷酸化AURKA(T288)的表达。具体步骤为收集经过药物处理的细胞，充分裂解细胞；以4℃14000转离心15分钟，取上清。蛋白含量测定采用Bradford蛋白定量法。取蛋白样品60μg，进行SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至NC膜，后进行抗体孵育及化学发光显影。

实验2的结果如图1所示。在白血病细胞U937中，随着药物剂量的增加，磷酸化AURKA的表达呈剂量依赖性降低，证明25i在体内能特异靶向抑制AURKA激酶的活性。

实验3

嘧啶化合物25i溶于DMSO(100mM)作为存储液，实验时进行稀释，加于培养液中。细胞培养于96孔板中，分别采用不同浓度的嘧啶化合物25i处理各白血病细胞，48小时后加入CCK-8，37℃继续培养4小时，用450nm检测OD值，各图中横坐标为化合物的浓度，纵坐标为细胞相对生存率。

实验3的结果如图2所示。如图2a所示，25i(浓度为0μM、0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM和5.0μM)对U937细胞的活力具有剂量依赖性的抑制作用；如图2b所示，25i(浓度为0μM、0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM和5.0μM)对HL-60细胞的活力具有剂量依赖性的抑制作用。实验结果表明25i可抑制白血病细胞的活力并呈剂量依赖作用。

实验4

采用不同浓度的嘧啶化合物25i对白血病细胞进行处理。实验48小时后收集细胞，AnnexinV/PI染色，流式细胞仪检测凋亡细胞群。

实验4的结果如图3所示。在白血病细胞U937中，在所示浓度范围内25i可促进细胞凋亡，表现为早期凋亡(AnnexinV+/PI-)及晚期凋亡(AnnexinV+/PI+)的细胞数明显增加。

实验5

通过逆转录病毒表达系统构建高表达STAT5突变激活型(cS5^RF)的白血病细胞株。收集细胞，Western blot检测细胞中STAT5的表达，GAPDH作为内参，验证细胞株的成功建立。具体步骤为收集逆转录病毒表达系统构建的细胞，充分裂解细胞；以4℃14000转离心15分钟，取上清。蛋白含量测定采用Bradford蛋白定量法。取蛋白样品20μg，进行SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至NC膜，后进行抗体孵育及化学发光显影。

实验5的结果如图4所示。在白血病细胞U937及HL-60中，cS5细胞(高表达突变激活型STAT5)比对照GFP细胞(高表达pMSCV-IRES-GFP空载体)表达更高水平的STAT5蛋白，证明成功构建STAT5高表达细胞模型。

本发明建立了STAT5高表达细胞模型，如无特殊说明，后续抑制实验都是基于此模型而展开。

实验6

嘧啶化合物25i溶于DMSO(100mM)作为存储液，实验时进行稀释，加于培养液中。相同数量的细胞分别培养于6孔板中，分别采用不同浓度的嘧啶化合物25i处理各构建的白血病细胞，48小时后采用台盼蓝染色，进行细胞计数。各图中横坐标为化合物的浓度，纵坐标为细胞的数量。

实验6的结果见图5。如图5a所示，25i(浓度为0μM、0.039μM、0.078μM、0.156μM、0.312μM和0.625μM)对STAT5高表达细胞模型U937(cS5及对照GFP细胞)的增殖具有剂量依赖性的抑制作用；如图5b所示，25i(浓度为0μM、0.039μM、0.078μM、0.156μM、0.312μM和0.625μM)对STAT5高表达细胞模型HL-60(cS5及对照GFP细胞)的增殖具有剂量依赖性的抑制作用。实验结果表明25i对对照细胞及高表达STAT5的细胞均显示同样的抑制效果，提示25i可抑制白血病耐药细胞的增殖并呈剂量依赖作用。

实验7

分别取不同浓度的嘧啶化合物25i对白血病细胞进行处理，48小时后收集细胞，70％乙醇固定后用50μg/mL PI染色，采用流式细胞仪进行细胞周期检测。

实验7的结果如图6所示。在白血病细胞U937中，25i在所示浓度范围内均能明显导致cS5及对照GFP细胞的细胞周期阻滞于G2/M期，并出现多倍体现象，表明25i通过抑制AURKA导致细胞周期阻滞，进而抑制细胞的增殖。重要的是，25i对对照细胞及高表达STAT5的细胞均显示同样的抑制效果。

实验8

嘧啶化合物25i抑制白血病细胞的克隆形成。将白血病细胞培养于甲基纤维素中，并进行不同浓度的嘧啶化合物25i处理。10天后，显微镜下观察计算克隆形成的情况。

实验8的结果如图7所示。在白血病细胞中，0.156μM的25i能完全抑制白血病细胞(cS5及对照GFP细胞)的克隆形成能力，结果表明25i对对照细胞及高表达STAT5的细胞均显示同样的抑制效果，进一步提示该化合物具有抑制白血病干细胞自我更新的功能，并能逆转白血病干细胞引起的耐药。

实验9

嘧啶化合物25i抑制白血病细胞的形态学分析。将分别取不同浓度的嘧啶化合物25i对白血病细胞进行处理，48小时后收集细胞进行细胞涂片，瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观察细胞形态的变化。

实验9的结果如图8所示。在白血病细胞U937中，25i在所示浓度范围内均能显著促进cS5及对照GFP细胞产生多倍体，并出现分化现象，表明25i通过抑制AURKA进而促进细胞的分化。

实验10

分别取不同浓度的嘧啶化合物25i对白血病细胞进行处理，48小时后收集细胞，Western blot检测细胞中β-catenin的表达，GAPDH作为内参。具体步骤为收集经过药物处理的细胞，充分裂解细胞；以4℃14000转离心15分钟，取上清。蛋白含量测定采用Bradford蛋白定量法。取蛋白样品40μg，进行SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至NC膜，后进行抗体孵育及化学发光显影。

实验10的结果如图9所示。在cS5及对照GFP细胞中，25i能明显抑制白血病干细胞干性及耐药重要调控蛋白β-catenin的表达，证明25i能通过抑制β-catenin的表达抑制细胞的增殖及逆转耐药。

实验11

嘧啶化合物25i抑制白血病细胞的体内成瘤实验。将白血病细胞U937(5×10⁶)接种到裸鼠体内，待小鼠成瘤后，通过腹腔注射连续给予50mg/kg、100mg/kg剂量的25i处理8天。

实验11的结果如图10所示。如图10a与b，与对照组相比，25i处理组小鼠肿瘤体积明显小于对照组，如图10c，25i处理组小鼠肿瘤重量明显小于对照组，且差异具有显著统计学差异。如图10d，实验组与对照组小鼠体重并无明显差异，提示25i在体内有明显的肿瘤抑制作用，而对小鼠具有安全性。

上述所有抑制实验是基于本发明所建立的STAT5高表达细胞模型，因此本发明所筛选的嘧啶衍生物25i除了具有抑制AURKA活性，还具有逆转激活型STAT5引起的细胞耐药，预示着良好的预后潜力，可以克服现有技术中的不足，用于治疗难治性白血病，具有良好的市场前景。

对比实验1

STAT5抑制剂Pimozide溶于DMSO(100mM)作为存储液，实验时进行稀释，加于培养液中。相同数量的细胞分别培养于6孔板中，分别采用不同浓度的Pimozide处理各构建的白血病细胞，48小时后采用台盼蓝染色，进行细胞计数。各图中横坐标为化合物的浓度，纵坐标为细胞的数量。

结果如图11所示。STAT5抑制剂Pimozide(浓度为0μM、0.625μM、1.25μM和2.50μM)对U937(cS5及对照GFP细胞)的增殖没有明显的抑制作用，实验结果表明25i比现有的STAT5抑制剂具有更明显的抑制白血病细胞增殖的作用。

对比实验2

化疗药物阿糖胞苷溶于DMSO(100mM)作为存储液，实验时进行稀释，加于培养液中。细胞分别培养于96孔板中，分别采用不同浓度的阿糖胞苷处理各白血病细胞，48小时后加入CCK-8，37℃继续培养4小时，用450nm检测OD值，各图中横坐标为化合物的浓度，纵坐标为细胞相对生存率。

结果如图12所示。阿糖胞苷(浓度为0μM、0.1μM、0.5μM和1.0μM)对HL-60GFP细胞的活力具有一定的抑制作用；而对HL-60cS5细胞的活力不具有抑制作用。实验结果表明常规化疗药物不能有效抑制STAT5高表达细胞的活力，进一步证明STAT5高表达导致白血病细胞对化疗药物产生耐药。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有Aurora激酶抑制活性且能逆转STAT5信号通路激活引起的肿瘤细胞耐药性的嘧啶衍生物，其特征在于：该嘧啶衍生物包括以下通式(I)表示的化合物，或其药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药；

2.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物包括权利要求1所述的嘧啶衍生物。

3.权利要求1所述的嘧啶衍生物，或者权利要求2中所述的药物组合物在制备抑制Aurora激酶活性和STAT5信号通路激活引起的肿瘤细胞耐药性的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：Aurora激酶为Aurora A激酶。

5.权利要求1所述嘧啶衍生物或权利要求2中所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：肿瘤为血液系统肿瘤。

7.权利要求1所述嘧啶衍生物或权利要求2中所述的药物组合物在制备治疗耐药性白血病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：耐药性是STAT5信号通路激活引起的。

9.权利要求1所述嘧啶衍生物或权利要求2中所述的药物组合物和常规肿瘤药物的联合应用在制备治疗耐药性白血病药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：常规肿瘤药物包括化疗药物或靶向小分子抑制剂。