CN108244402A - 一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂及其制备方法，以新鲜贻贝肉为原料，制成肉浆液后进行辐照处理，初步降解蛋白质，然后在酶解助剂的作用下，依次进行碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解、木瓜蛋白酶酶解，蛋白质基本降解为较小分子量的肽和氨基酸，分离除去大分子物质（多糖以及残留的少量蛋白质等），肽酶进一步酶解，基本降解为小分子量的氨基酸（富含L‑半胱氨酸，含有巯基，特别有助于螯合重金属），与亚铁离子和钙离子螯合反应即可，所得螯合物特别适用于贻贝，可以有效进行铅、镉等重金属脱除，同时还不影响贻贝中含有的对人体有益的钙、锌成分。
Description
技术领域
本发明涉及一种重金属脱除剂，具体涉及一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂及其制备方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术
近年来我国养殖区域污染问题日益严重，海产品食用安全问题日显突出，特别是重金属污染已经成为贻贝食品安全的极大隐患，重金属超标会对人体造成暂时或者持久损伤。
贻贝一种双壳类软体动物，生活在海滨岩石上，是一种广受人们喜爱的海鲜品，可以蒸、煮食之，也可剥壳后和其他青菜混炒，味均鲜美。据分析，每百克鲜贝肉含蛋白质10.8克，糖2.4克，灰分2.4克，脂肪1.4克，干制贻贝肉蛋白质含量高达59.3％。贻贝还含有多种维生素及人体必需的锰、锌、硒、碘等多种微量元素。值得一提的是，贻贝的营养价值高还由于它所含的蛋白质有人体需要的缬氨酸、亮氨酸等8种必需氨基酸，其含量大大高于鸡蛋以及鸡、鸭、鱼、虾和肉类等必需氨基酸的含量，被誉为海洋牛奶。另据研究，贻贝脂肪中还含有人体所必需的脂肪酸，其饱和脂肪酸的含量，较猪、牛、羊肉和牛奶等食品为低，不饱和脂肪酸的含量相对较高。被誉为海中鸡蛋。目前贻贝已经广泛人工养殖，产量颇高。
贻贝为典型滤食性贝类，如翡翠贻贝、紫贻贝、厚壳贻贝、隔贻贝等，其利用鳃上的纤毛过滤水中的悬浮颗粒为食，因此需要过滤大量的海水。此外，由于贻贝的生存环境一般是近岸，所以贻贝富集Cd、Pb和Hg等有害重金属和有机化合物的几率也高于其他海洋生物。
重金属污染导致贻贝产品不但无法出口，国内的销售也屡屡受挫，严重影响了贻贝产业的发展和人体食用有害重金属超标的贻贝引发的各种健康问题。因此，脱除贻贝中有害重金属的研究受到广泛关注。净水暂养或净化是一种重金属脱除的常用方法，但是一般耗时较长，而重金属脱除剂使用便捷，不失为一种替代选择。但是目前针对贻贝的重金属脱除剂产品较少，重金属脱除效果也有很大的改良空间。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂。
本发明还提供了上述重金属脱除剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
优选的，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2～3倍重量的氯化钠溶液中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以8～10kGy剂量辐照5～10分钟。
进一步优选的，新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2～3次，沥净水分即可。
进一步优选的，所述粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
进一步优选的，氯化钠溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。
优选的，所述酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：1～2：0.5～0.7。
进一步优选的，所述直链醇选自正十六醇或正十八醇中的任一种。
优选的，碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解的工艺条件为：调整pH至7.5～8.5，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，50～60℃酶解30～40分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入900～1200U。
进一步优选的，木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5～6，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，50～60℃酶解10～20分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入700～900U。
优选的，分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量5～10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
优选的，肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7～8，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，40～50℃酶解10～20分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至70～75℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2000～2500U。
进一步优选的，所述复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.2～1.5。
进一步优选的，离心分离的转速为3000～5000转/分，时间为20～30分钟。
进一步优选的，螯合反应的具体方法是：依次设置pH4、pH6、pH8、pH10四个pH梯度，在每个pH梯度下70～75℃保温反应40～50分钟。
进一步优选的，超声波振荡工艺条件为：频率40～60kHz，功率300～320W。
进一步优选的，采用85～100℃水浴灭酶活10～15分钟。
进一步优选的，利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一种蛋白源重金属脱除剂，是以新鲜贻贝肉为原料，制成肉浆液后进行辐照处理，初步降解蛋白质，然后在酶解助剂的作用下，依次进行碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解、木瓜蛋白酶酶解，蛋白质基本降解为较小分子量的肽和氨基酸，分离除去大分子物质(多糖以及残留的少量蛋白质等)，肽酶进一步酶解，基本降解为小分子量的氨基酸(富含L-半胱氨酸，含有巯基，特别有助于螯合重金属)，与亚铁离子和钙离子螯合反应即可，所得螯合物特别适用于贻贝，可以有效进行铅、镉等有害重金属脱除，同时还不影响贻贝中含有的对人体有益的钙、锌成分。
2、新鲜贻贝肉利用氯化钠溶液制成肉浆液，有助于蛋白质的溶解或析出，进而有利于辐照条件下蛋白质的降解。
3、酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者协同作用，减少酶在贻贝肉原料表面的物理性吸附，促进酶进入贻贝肉内部，提高酶解效率，减少酶的消耗量。
4、当蛋白质基本降解为较小分子量的肽和氨基酸，先分离除去大分子物质，再利用肽酶进一步酶解，可以获得基本降解为小分子量的氨基酸的第三酶解液，第三酶解液中富含有助于螯合重金属的L-半胱氨酸，与亚铁离子和钙离子螯合反应，与单一离子螯合产品相比，具有更好的重金属脱除效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明涉及的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，购自广州大久生物科技有限公司；氨肽酶，购自南京东恒华道生物科技有限公司；羧肽酶，购自北京生东科技有限公司(羧肽酶A，牛胰)。
实施例1：
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2倍重量的氯化钠溶液(0.1mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以8kGy剂量辐照5分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：1：0.5。直链醇为正十六醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至7.5，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，50℃酶解30分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入900U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，50℃酶解10分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入700U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量5kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，40℃酶解10分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至70℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2000U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.2。
离心分离的转速为3000转/分，时间为20分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下70℃保温反应40分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率40kHz，功率300W。
采用85℃水浴灭酶活10分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
实施例2：
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入3倍重量的氯化钠溶液(0.2mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以10kGy剂量辐照10分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤3次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：2：0.7。直链醇为正十八醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至8.5，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，60℃酶解40分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入1200U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至6，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，60℃酶解20分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入900U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至8，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，50℃酶解20分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至75℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2500U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.5。
离心分离的转速为5000转/分，时间为30分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下75℃保温反应50分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率60kHz，功率320W。
采用100℃水浴灭酶活15分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
实施例3：
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2倍重量的氯化钠溶液(0.2mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以8kGy剂量辐照10分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：2：0.5。直链醇为正十八醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至7.5，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，60℃酶解30分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入1200U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，60℃酶解10分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入900U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量5kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至8，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，40℃酶解20分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至70℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2500U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.2。
离心分离的转速为5000转/分，时间为20分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下75℃保温反应40分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率60kHz，功率300W。
采用100℃水浴灭酶活10分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
实施例4：
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入3倍重量的氯化钠溶液(0.1mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以10kGy剂量辐照5分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤3次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：1：0.7。直链醇为正十六醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至8.5，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，50℃酶解40分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入900U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至6，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，50℃酶解20分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入700U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，50℃酶解10分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至75℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2000U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.5。
离心分离的转速为3000转/分，时间为30分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下70℃保温反应50分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率40kHz，功率320W。
采用85℃水浴灭酶活15分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
实施例5：
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2.5倍重量的氯化钠溶液(0.15mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以10kGy剂量辐照8分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：1.5：0.6。直链醇为正十六醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至8，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，55℃酶解35分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入1000U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5.5，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，55℃酶解15分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入800U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7.5，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，45℃酶解15分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至72℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2200U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.4。
离心分离的转速为4000转/分，时间为25分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下72℃保温反应45分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率50kHz，功率310W。
采用90℃水浴灭酶活12分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
对比例1
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，新鲜贻贝肉制成肉浆液的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2.5倍重量的氯化钠溶液(0.15mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：1.5：0.6。直链醇为正十六醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至8，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，55℃酶解35分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入1000U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5.5，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，55℃酶解15分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入800U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7.5，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，45℃酶解15分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至72℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2200U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.4。
离心分离的转速为4000转/分，时间为25分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下72℃保温反应45分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率50kHz，功率310W。
采用90℃水浴灭酶活12分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
对比例2
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2.5倍重量的氯化钠溶液(0.15mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以10kGy剂量辐照8分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至8，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，在超声波振荡处理下，55℃酶解35分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入1000U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5.5，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，55℃酶解15分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入800U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7.5，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，45℃酶解15分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至72℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2200U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.4。
离心分离的转速为4000转/分，时间为25分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下72℃保温反应45分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率50kHz，功率310W。
采用90℃水浴灭酶活12分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
对比例3
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2.5倍重量的氯化钠溶液(0.15mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以10kGy剂量辐照8分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：1.5：0.6。直链醇为正十六醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至8，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，55℃酶解35分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入1000U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5.5，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，55℃酶解15分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入800U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
螯合反应的具体方法是：向透过液中加入氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至72℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2200U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.4。
离心分离的转速为4000转/分，时间为25分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下72℃保温反应45分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率50kHz，功率310W。
采用90℃水浴灭酶活12分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
对比例4
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2.5倍重量的氯化钠溶液(0.15mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以10kGy剂量辐照8分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：1.5：0.6。直链醇为正十六醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至8，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，55℃酶解35分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入1000U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5.5，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，55℃酶解15分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入800U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7.5，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，45℃酶解15分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入氯化钙，搅拌加热至72℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2200U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.4。
离心分离的转速为4000转/分，时间为25分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下72℃保温反应45分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率50kHz，功率310W。
采用90℃水浴灭酶活12分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
对比例5
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
其中，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2.5倍重量的氯化钠溶液(0.15mol/L)中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以10kGy剂量辐照8分钟。新鲜贻贝肉的预处理方法为：将新鲜贻贝肉除去内脏，利用清水洗涤2次，沥净水分即可。粉碎为利用高速组织捣碎机将新鲜贻贝肉捣碎。
酶解助剂为二聚亚油酸共聚物与直链醇的混合物，三者质量比为1：0.6。直链醇为正十六醇。
碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至8，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，55℃酶解35分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入1000U。
木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5.5，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，55℃酶解15分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入800U。
分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7.5，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，45℃酶解15分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至72℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2200U。
复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.4。
离心分离的转速为4000转/分，时间为25分钟。
螯合反应的具体方法是：依次设置pH＝4、pH＝6、pH＝8、pH＝10四个pH梯度，在每个pH梯度下72℃保温反应45分钟。
超声波振荡工艺条件为：频率50kHz，功率310W。
采用90℃水浴灭酶活12分钟。
利用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH。
一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，是通过上述制备方法得到的。
试验例
1、将同一批养殖的贻贝，进行铅、镉染毒，随机分为10组，基础饲料喂食，分别将实施例1～5或对比例1～5的重金属脱除剂与基础饲料以2g/kg的比例混合进行日常饲养，饲养周期为10天，检测养殖前后的钙、锌、铅、镉平均含量，结果见表1。
表1.养殖前后重金属含量比较
由表1可知，实施例1～5的重金属脱除剂有效进行铅、镉等重金属脱除，同时还不影响贻贝中含有的对人体有益的钙、锌成分。对比例1不进行辐照处理，对比例2未添加酶解助剂，对比例3略去了肽酶处理步骤，对比例4仅仅螯合钙离子，对比例5的酶解助剂略去了烷基酚聚氧乙烯醚，铅、镉等重金属脱除效果均明显变差，钙、锌含量也或多或少受到影响。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
新鲜贻贝肉制成肉浆液后进行辐照处理；
在酶解助剂的作用下，先碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，再木瓜蛋白酶酶解；
分离除去大分子物质，肽酶进一步酶解，与亚铁离子和钙离子进行螯合反应。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，辐照处理的具体方法是：将预处理的新鲜贻贝肉，粉碎后倒入2～3倍重量的氯化钠溶液中，搅拌混匀得到肉浆液，然后边搅拌边以8～10kGy剂量辐照5～10分钟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解助剂为二聚亚油酸共聚物、烷基酚聚氧乙烯醚与直链醇的混合物，三者质量比为1：1～2：0.5～0.7。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解的工艺条件为：调整pH至7.5～8.5，加入质量比1：1的碱性蛋白酶和胰蛋白酶的混合蛋白酶，并加入酶解助剂，在超声波振荡处理下，50～60℃酶解30～40分钟，灭酶活，得到第一酶解液；混合蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入900～1200U。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，木瓜蛋白酶酶解的工艺条件为：调整pH至5～6，向第一酶解液中加入木瓜蛋白酶，在超声波振荡处理下，50～60℃酶解10～20分钟，灭酶活，得到第二酶解液；木瓜蛋白酶的加入量为每克肉浆液中加入700～900U。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，分离除去大分子物质的具体方法是：经陶瓷膜滤清得清液，然后将清液经截留分子量5～10kDa的超滤膜膜进行分离，得到透过液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，肽酶酶解以及螯合反应的具体方法是：调整透过液的pH至7～8，加入复合肽酶，在超声波振荡处理下，40～50℃酶解10～20分钟，灭酶活，得到第三酶解液，离心，除去不溶物；然后加入质量比1:1.2的氯化亚铁和氯化钙，搅拌加热至70～75℃，采用pH梯度调节法进行螯合反应，反应结束后浓缩至膏状，加无水乙醇沉淀，抽滤即得；复合肽酶的加入量为每克肉浆液中加入2000～2500U。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述复合肽酶为氨肽酶和羧肽酶的混合物，两者的质量比为1：1.2～1.5。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，螯合反应的具体方法是：依次设置pH=4、pH=6、pH=8、pH=10四个pH梯度，在每个pH梯度下70～75℃保温反应40～50分钟。
10.一种适用于贻贝的蛋白源重金属脱除剂，其特征在于，是通过权利要求1～9中任一项所述的制备方法得到的。
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