CN108220250A - 一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法 - Google Patents

一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，包括毒源病毒的制备、病毒的临时保存病毒的人工接种、病毒的采收几个步骤，接种病毒前首先对毒源病毒提纯，病毒的临时保存方法为病毒多角体配制成1.2×104个/毫升～1.4×104个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵1∶0.8～1.2∶0.8～1.2的配比，24～26℃室温条件保存1～2小时，接种病毒的时间选择为家蚕五龄饷食后4～8小时，接种病毒后90～100小时采收病毒。本申请提供的扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，生产工艺简单，生产成本低，扩繁效益高，对环境的要求也低，是生产家蚕血液型脓病灭活疫苗首选的病毒扩繁方案。

Description

一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法
技术领域
本申请涉及一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，属于灭活疫苗制备技术领域。
背景技术
灭活疫苗是指先对病毒或细菌进行培养，然后用加热或化学试剂(通常是福尔马林)将其灭活，从而得到的疫苗。目前，国内使用的灭活疫苗有百白破疫苗、流行性感冒疫苗、狂犬病疫苗和甲肝灭活疫苗等，在家畜及家禽生产方面，研发的灭活疫苗更是不计其数，为控制传染性疾病的流行，发挥了重要的作用。生产上病原的扩繁，一般采用先行繁殖宿主活体细胞，然后再人工接种病原，等到宿主细胞形态发生显著变化后再收获病原，因此，病原的大规模扩繁是灭活疫苗生产的前提条件。
家蚕血液型脓病是由家蚕核型多角体病毒侵染引起的急性传染病，生产上，其发病急，传染快，损失大，一般可引起20％左右的产量损失，重灾农户甚至可导致颗粒无收。对家蚕血液型脓病的防治，目前主要采用的以消毒防病为主的预防措施，也有科研部门研发其灭活疫苗，取得了一些进展。对于家蚕核型多角体病毒，中国专利CN1410541A公开了可用克隆的昆虫卵巢细胞进行扩繁，存在着生产场所条件要求高，生产工艺繁杂，生产成本高的缺陷，直接进行家蚕活体接种进行病毒扩繁，成为优先采用的手段。在用教科书《蚕病学》(浙江省嘉兴农业学校主编，农业出版社，1995年5月出版)中公开的方法进行人工接种扩繁病毒时，存在着家蚕细菌性病害发病率高、真菌性病害发病率高、病毒性病害发病率低的现象，进而导致扩繁效率低下。本发明提出了一种新的家蚕核型多角体病毒的人工扩繁方法，旨在为进一步研发家蚕血液型脓病灭活疫苗打下基础。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，采取的技术方案是：
一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，包括毒源病毒的制备、病毒的临时保存、病毒的人工接种、病毒的采收几个步骤，其特征是：病毒的临时保存方法为病毒多角体配制成1.2×104个/毫升～1.4×104个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶0.8～1.2∶0.8～1.2的配比，24～26℃室温条件保存1～2小时。
进一步的优选方案是：病毒的保存方法为病毒多角体配制成1.3×104个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶1∶1的配比，25℃室温条件保存1.5小时。
所述毒源病毒的制备包括以下步骤：病蚕收集、研磨、双层纱布过滤、离心提纯，具体为，病蚕的收集为选取家蚕血液型脓病典型症状的体节肿胀，血液呈乳白色的蚕儿，经1％有效氯漂白粉水溶液体表消毒后放入粉碎机中，加入等量的无菌水磨碎，再后用双层纱布过滤，滤去杂质，滤液移入离心机中，3500转/分的转速离心5分钟，倒掉上层澄清液，取下层沉淀，加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，再倒掉上层澄清液，取下层沉淀，再加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，倒掉上层澄清液，最后显微镜检查多角体密度，配制成1.2×104个/毫升～1.4×104个/毫升浓度备用。
所述病毒的人工接种方法为穿剌接种，接种时，取接种针先进行酒精灯火焰灼烧消毒，再用接种针醮取病毒临时保存液，沿与家蚕身体长度平行方向，从倒数第二腹节的节间膜处，由后往前，剌穿家蚕体壁，接种时间选择在家蚕五龄饷食后4～8小时。
所述病毒的采收时间为，按种病毒后25℃室温条件饲养家蚕90～100小时。
本申请的家蚕核型多角体病毒的毒源病毒由中国农业科学院蚕业研究所蚕病研究室提供，下表所述的“组合物扩繁”指按本申请提出的病毒临时保存在病毒多角体配制成1.3×104个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵1∶1∶1配比配制，25℃室温条件保存1.5小时。常规扩繁是指按教科书《蚕病学》(浙江省嘉兴农业学校主编，农业出版社，1995年5月出版)第188～189页中公开的方法进行人工接种扩繁。所用的氟派酸为市售吉林敖东集团大连药业股份有限公司生产产品，多菌灵为市售山东丰倍尔生物科技有限公司生产产品。
本发明不同接种方法几类病害发病率调查情况如表1。
表1：不同接种方法几类病害发病率调查(单位：％)
注：表格中数据后“*”为实验组与对照组差异显著，“**”为实验组与对照组差异极显著。表格中乘余比例为健康蚕比例。
从表1调查数据看出，组合物扩繁，无论是在春季，还是在晚秋，还是在中秋，都能显著地提高病毒病的发病率，降低细菌病与真菌病的发病率，从而提高了病毒扩繁的效率。
本发明不同季节不同接种方法病程调查情况如2。
表2：不同接种方法病程调查(单位：小时)
分区 春季 中秋 晚秋
组合物扩繁 97* 91.7* 96.57*
常规扩繁 103 88.5 102.5
注：表格中数据后“*”为实验组与对照组差异显著，“**”为实验组与对照组差异极显著。
从表2中资料看出，春季和晚秋能相对延长病程，而中秋高温季节又能相对缩短病程，从而保证了病毒在家蚕体内充分增殖，进而提高了扩繁的效率。
综上所述，本申请提供的一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，生产工艺简单，生产成本低，扩繁效益高，对环境的要求也低，是生产家蚕血液型脓病灭活疫苗时首选的病毒扩繁方案。
具体实施方式
实施例1：
按下列方法扩繁家蚕核型多角体病毒。包括毒源病毒的制备、病毒的临时保存、病毒的人工接种、病毒的采收几个步骤。
所述毒源病毒的制备包括以下步骤：病蚕收集、研磨、双层纱布过滤、离心提纯，具体为，病蚕的收集为选取家蚕血液型脓病典型症状的体节肿胀、血液呈乳白色的蚕儿，经1％有效氯漂白粉水溶液体表消毒后放入粉碎机中，加入等量的无菌水磨碎，再后用双层纱布过滤，滤去杂质，滤液移入离心机中，3500转/分的转速离心5分钟，倒掉上层澄清液，取下层沉淀，加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，再倒掉上层澄清液，取下层沉淀，再加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，倒掉上层澄清液，最后显微镜检查多角体密度，配制成1.2×104个/毫升浓度备用。
病毒的临时保存方法是：病毒多角体配制成1.2×104个/毫升，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶0.8～1.2∶0.8～1.226℃室温条件保存1小时。
优选病毒的保存方法为：病毒多角体配制成1.3×104个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶1∶1，25℃室温条件保存1.5小时。
病毒的人工接种方法为穿剌接种，接种时，取接种针先进行酒精灯火焰灼烧消毒，再用接种针醮取病毒临时保存液，沿与家蚕身体长度平行方向，从倒数第二腹节的节间膜，由后往前，剌穿家蚕体壁，接种时间选择在家蚕五龄饷食后8小时。
病毒的采收时间为，按种病毒后25℃室温条件饲养家蚕90小时。
实施例2：
按下列方法扩繁家蚕核型多角体病毒。包括毒源病毒的制备、病毒的临时保存、病毒的人工接种、病毒的采收几个步骤。
所述毒源病毒的制备包括以下步骤：病蚕收集、研磨、双层纱布过滤、离心提纯，具体为，病蚕的收集为选取家蚕血液型脓病典型症状的体节肿胀，血液呈乳白色的蚕儿，经1％有效氯漂白粉水溶液体表消毒后放入粉碎机中，加入等量的无菌水磨碎，再后用双层纱布过滤，滤去杂质，滤液移入离心机中，3500转/分的转速离心5分钟，倒掉上层澄清液，取下层沉淀，加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，再倒掉上层澄清水，取下层沉淀，再加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，倒掉上层澄清液，最后显微镜检查多角体密度，配制成1.4×104个/毫升浓度备用。
病毒的临时保存方法是：病毒多角体配制成1.2×104个/毫升～1.4×104个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶0.8～1.2∶0.8～1.2 24℃室温条件保存2小时。
优选病毒的临时保存方法为：病毒多角体配制成1.3×104个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶1∶1，25℃室温条件保存1.5小时。
病毒的人工接种方法为穿剌接种，接种时，取接种针先进行酒精灯火焰灼烧消毒，再用接种针醮取病毒临时保存液，沿与家蚕身体长度平行方向，从倒数第二腹节的节间膜，由后往前，剌穿家蚕体壁，接种时间选择在家蚕五龄饷食后4小时。
病毒的采收时间为，按种病毒后25℃室温条件饲养家蚕100小时。

Claims (5)

1.一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，包括毒源病毒的制备、病毒的临时保存、病毒的人工接种、病毒的采收几个步骤，其特征是：病毒的临时保存方法为病毒多角体配制成1.2×104个/毫升～1.4×104个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶0.8～1.2∶0.8～1.2的配比，24～26℃室温条件保存1～2小时。
2.根据权利要求1所述的一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，包括毒源病毒的制备、病毒的临时保存、病毒的人工接种、病毒的采收几个步骤，其特征是：病毒的保存方法为病毒多角体配制成1.3×104个/毫升，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶1∶1的配比，25℃室温条件保存1.5小时。
3.根据权利要求1或2任一项所述的一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，特征是毒源病毒的制备包括以下步骤：病蚕收集、研磨、双层纱布过滤、离心提纯，具体为，病蚕的收集为选取家蚕血液型脓病典型症状的体节肿胀、血液呈乳白色的蚕儿，经1％有效氯漂白粉溶液体表消毒后放入粉碎机中，加入等量的无菌水磨碎，再后用双层纱布过滤，滤去杂质，滤液移入离心机中，3500转/分的转速离心5分钟，倒掉上层澄清液，取下层沉淀，加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，再倒掉上层澄清水，取下层沉淀，再加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，最后显微镜检查沉淀物中多角体密度，配制成1.2×104个/毫升～1.4×104个/毫升浓度。
4.根据权利要求1或2任一项所述的一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，特征是：病毒的人工接种方法为穿剌接种，接种时，取接种针先进行酒精灯火焰灼烧消毒，再用接种针醮取病毒临时保存液，沿与家蚕身体长度平行方向，从倒数第二腹节的节间膜，由后往前，剌穿家蚕体壁，接种时间选择在家蚕五龄饷食后4～8小时。
5.根据权利要求1或2任一项所述的一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，特征是：所述病毒的采收时间为，按种病毒后25℃室温条件饲养家蚕90～100小时。
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