CN108217973A - 一种磺胺嘧啶的高效降解方法 - Google Patents

一种磺胺嘧啶的高效降解方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效降解磺胺嘧啶的方法，所述方法是将黄孢原毛平革菌加入到磺胺嘧啶溶液中形成培养体系进行生物降解。本发明提供了一种高效、低成本又安全的磺胺嘧啶的降解途径。与现有技术相比，本发明的方法具有安全性高、不会给水体等带来二次污染，具有成本低和降解速度快、所使用的黄孢原毛平革菌具有易得和易于扩大培养，价格便宜等优点。使用本发明的方法，最快3天之内的降解率达100％，很好地解决了磺胺类抗生素在环境中降解的难题，具有广泛适用的意义。本发明的方法用于环境中存在的降解磺胺嘧啶抗生素，减少其在环境中如水体和土壤中的残留量，使用本发明的方法处理土壤或水体，可以保护生态环境，减少耐受性细菌的产生，从而保护人类健康。

Description

一种磺胺嘧啶的高效降解方法
技术领域
本发明涉及一种抗生素的降解技术领域，尤其涉及自然界中难以降解的磺胺嘧啶的高效降解方法，属于生物技术领域。
背景技术
磺胺嘧啶(英文名sulfadiazine，缩写SDZ)是一种人工合成的，被广泛应用于临床、畜牧业及水产养殖业中的广谱抗菌药。该类药物使用后大部分以原型或代谢物的形式进入环境，导致天然水体及土壤中检测到其残留。这不仅可以破坏生态环境，引起耐药菌的产生，还可以通过食物链富集作用而危害到人体健康。因而，磺胺类抗生素具有疗效良好、使用方便、性质稳定、价格低廉等优点，在水产养殖的疾病控制中起着不可替代的作用。但是，同样由于其广泛使用，造成磺胺类抗生素对海水养殖生态环境造成严重破坏。因此，探索一种可高效降解磺胺嘧啶的方法显得至关重要。
目前降解磺胺嘧啶的方法包括γ-辐射降解法、超声波去除法(去除率最高仅达到83％)、二氧化硅纳米微球表面负载具有催化作用的无机纳米粒子作为催化剂的催化降解法、含有钯离子的化学试剂法、光催化催化降解法、细胞色素P450酶降解法。除前述这些技术之外，目前国内外关于利用生物降解抗生素的研究报道较少，磺胺类抗生素的有效去除成为亟待解决的难题。而现有的这些方法要么具有辐射性、或者去除率达不到要求，要么催化剂或酶的制备或提取方法非常复杂、成本颇高、在制备过程中产生更多的污染物，导致这些方法的应用受到很大局限性。
黄孢原毛平革菌是白腐菌的一种，主要通过分泌非专一性胞外木质素降解酶对目标产物进行降解。虽然已有研究表明，黄孢原毛平革菌对类似木质素结构的芳香化合物有良好的降解效果，包括氯代苯胺类化合物、多氯联苯、多环芳烃和硝基苯等，但尚未发现将其应用于降解磺胺嘧啶及具体的降解方法和操作条件的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种高效降解磺胺嘧啶的方法，所述方法安全性、操作简单、成本低、可快速且几乎100％地高效率去除磺胺嘧啶的方法，适于推广应用在废水处理中。
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：一种高效降解磺胺嘧啶的方法，所述方法是将黄孢原毛平革菌加入到磺胺嘧啶溶液中形成培养体系进行生物降解。
优选的，所述黄孢原毛平革菌尺寸为3mm～10mm的菌丝球，优选为尺寸为5mm的菌丝球。
优选的，所述培养体系的初始pH值为4.6～7之间，更优选为4.79～6.8。
优选的，所述培养体系的初始pH为5.79～5.82。
优选的，所述培养体系的温度环境为26℃、30℃或37℃，更优选为37℃。
优选的，每10mg/L的磺胺嘧啶溶液中加入所述黄孢原毛平革菌的添加量为2g±10％。
优选的，还包括向磺胺嘧啶溶液中加入所述黄孢原毛平革菌代谢液。优选的，添加量为每10mg/L的磺胺嘧啶溶液加入5mL±10％的黄孢原毛平革菌代谢液。
优选的，所述方法还包括黄孢原毛平革菌的培养步骤：将黄孢原毛平革菌接种于固体培养基，28℃～32℃培养2～5天；然后取一定量孢子采用液培法进行扩大培养，28℃～32℃培养4～7天，得尺寸3mm～10mm的黄孢原毛平革菌菌丝球及其代谢液。
其中，所述固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，所述液培法使用的培养基为无机盐培养基。
优选的，所述无机盐培养基为如下组分：
在每1L去离子水中加入：葡萄糖10g、KH2PO4 2g±10％、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl20.1g、MnSO4 0.03g、NaCl 0.06g、FeSO4·7H2O 6mg、CoCl2 6mg、ZnSO4·7H2O 6mg、CuSO46mg、AlK(SO4)2·12H2O 0.6mg、H3BO3 0.6mg、Na2MoO4·2H2O 0.6mg、酵母浸提液0.012g±10％、酒石酸铵0.2g±10％、维生素B1 1mg、藜芦基醇0.07g和Tween 80乳化剂0.5g，pH自然。
本发明还提供一种高效降解磺胺嘧啶的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：培养黄孢原毛平革菌：将黄孢原毛平革菌接种于固体培养基，28℃～32℃培养2～5天；然后取一定量孢子采用液培法进行扩大培养，28℃～32℃培养4～7天，得尺寸3mm～10mm的黄孢原毛平革菌菌丝球及其代谢液；
S2：降解磺胺嘧啶：按每10mg/L的磺胺嘧啶溶液中加入2g±10％黄孢原毛平革菌和5mL±10％的黄孢原毛平革菌代谢液形成降解培养液，将温度保持在26℃或37℃，初始pH值调节至5.79～5.82之间，培养3～7天。
优选的，所述步骤S2中，降解培养液初始pH值调节为5.79，温度保持在37℃，培养时间为3天。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种高效、低成本又安全的磺胺嘧啶的降解途径。与γ-辐射降解法比较，本发明安全性高；相对于超声波法降解率显著提高，相对于钯金催化剂法，不会给水体带来二次污染，相对于二氧化硅纳米微球表面负载无机纳米粒子催化剂法，本发明具有成本低和降解速度快(最快3天去除达100％)的功效；与细胞色素P450酶法比较，本发明所使用的黄孢原毛平革菌具有易得和易于扩大培养，价格便宜等优点。本发明利用黄孢原毛平革菌降解磺胺嘧啶的方法，很好地解决了磺胺类抗生素在环境中降解的难题，具有广泛适用的意义。
本发明的方法用于环境中存在的降解磺胺嘧啶抗生素，减少其在环境中如水体和土壤中的残留量，使用本发明的方法处理土壤或水体，可以保护生态环境，减少耐受性细菌的产生，从而保护人类健康。
附图说明
图1表示本发明实施例1降解磺胺嘧啶时的初始pH对磺胺嘧啶降解率的影响。
图2表示本发明实施例2降解磺胺嘧啶时的温度环境对磺胺嘧啶降解率的影响。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明所提供的技术方案包括：
一种高效降解磺胺嘧啶的方法，所述方法是将黄孢原毛平革菌加入到磺胺嘧啶溶液中形成培养体系进行生物降解。
优选的，所述黄孢原毛平革菌尺寸为3mm～10mm的菌丝球，优选为尺寸为5mm的菌丝球。
优选的，所述培养体系的初始pH值为4.6～7之间，优选为4.79～6.8。
优选的，所述培养体系的初始pH为5.79～5.82。
优选的，所述培养体系的温度环境为26℃或37℃，优选为37℃。
优选的，每10mg/L的磺胺嘧啶溶液中加入所述黄孢原毛平革菌的添加量为2g±10％。
优选的，还包括向磺胺嘧啶溶液中加入所述黄孢原毛平革菌代谢液。优选的，添加量为每10mg/L的磺胺嘧啶溶液加入5mL±10％的黄孢原毛平革菌代谢液。
优选的，所述方法还包括黄孢原毛平革菌的培养步骤：将黄孢原毛平革菌接种于固体培养基，28℃～32℃培养2～5天；然后取一定量孢子采用液培法进行扩大培养，28℃～32℃培养4～7天，得尺寸3mm～10mm的黄孢原毛平革菌菌丝球及其代谢液。
本发明还提供另一种技术方案：
一种高效降解磺胺嘧啶的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：培养黄孢原毛平革菌：将黄孢原毛平革菌接种于固体培养基，28℃～32℃培养2～5天；然后取一定量孢子采用液培法进行扩大培养，28℃～32℃培养4～7天，得尺寸3mm～10mm的黄孢原毛平革菌菌丝球及其代谢液；
S2：降解磺胺嘧啶：按每10mg/L的磺胺嘧啶溶液中加入2g±10％黄孢原毛平革菌和5mL±10％的黄孢原毛平革菌代谢液，将温度保持在26℃或37℃，初始pH值调节至5.79～5.82之间，培养3～7天。
优选的，所述步骤S2中，初始pH值调节为5.79，温度保持在37℃，培养时间为3天，溶液中磺胺嘧啶的降解率即可达到100％。
以下结合具体实验，对本发明的技术方案及技术效果进行详细说明。
实验菌种、试剂与仪器
黄孢原毛平革菌(购自广东省微生物菌种保藏中心)、磺胺嘧啶(SDZ，99％)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)、无机盐培养基(1L去离子水中:葡萄糖10g；KH2PO42g；MgSO4·7H2O 0.5g；CaCl20.1g；MnSO40.03g；NaCl 0.06g；FeSO4·7H2O 6mg；CoCl26mg；ZnSO4·7H2O 6mg；CuSO46mg；AlK(SO4)2·12H2O 0.6mg；H3BO30.6mg；Na2MoO4·2H2O 0.6mg；酵母浸提液0.012g；酒石酸铵0.2g；维生素B11mg；藜芦基醇0.07g；Tween 80乳化剂0.5g，pH自然)。
恒温振荡器、安捷伦高效液相色谱仪。
实施例一
实施例一的实验步骤和测试条件如下：
(11)菌种培养
将黄孢原毛平革菌接种于PDA培养基中，30℃培养3天；然后取一定量的黄孢原毛平革菌孢子采用液体培养基进行扩大培养，30℃培养5～7天，得尺寸平均约3～10mm左右的黄孢原毛平革菌菌丝球及其代谢液。
(12)降解磺胺嘧啶的培养
采用甲醇和二甲基亚砜1:1的混合液配制磺胺嘧啶储备液【由于高浓度磺胺嘧啶在水中的溶解度较差，故采用甲醇和二甲基亚砜1:1的混合液配制磺胺嘧啶储备液。由于在高溶解度时使用本发明方法具有很高的降解功效，也能证明本发明方法对水中较低浓度的磺胺嘧啶同样具有较显著的降解效果】，使磺胺嘧啶浓度为10mg/mL。本实施例中设置七个实验组，使用7个50mL锥形瓶，并分别命名为E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7。各个实验组的操作如下：
E3组：取(11)中得到的黄孢原毛平革菌菌丝球约2g和代谢液5mL和15ml无机盐培养液到50mL的锥形瓶中，再加入10mg/ml的磺胺嘧啶20ul，使得锥形瓶中磺胺嘧啶的浓度为10mg/L，此时测得锥形瓶中培养液的自然pH约4.79，再用1mol/L的HCl水溶液调节培养液的pH值使其为2.94。
E4组:按照与E3完全相同的操作，不同之处在于最后使用HCL调节培养液pH调节为3.74。
E5组：按照与E3完全相同的操作，不同之处在于最后不调节锥形瓶中培养液的pH，使之保持自然pH约4.79(培养基的自然pH值)。
E6组:按照与E3完全相同的操作，不同之处在于最后使用NaOH调节培养液pH调节为5.82。
E7组:按照与E3完全相同的操作，不同之处在于最后使用NaOH调节培养液pH调节为6.73。
E1为空白对照组：在空白的50mL锥形瓶中加入10mg/ml的磺胺嘧啶20ul，加入去离子水调节锥形瓶中磺胺嘧啶的浓度为10mg/L。保持自然pH约4.79。E1组不加菌丝球和代谢液，但后续以与E3-E7相同的方式培养，目的是观察SDZ的自然分解。
E2为高温灭活对照组：按照与E3完全相同的操作，保持自然pH约4.79。不同之处在于，用高压灭菌锅灭菌30min，此时黄孢原毛平革菌菌丝球被灭活；但后续以与E3-E7相同的方式培养，目的是观察菌丝球对SDZ的吸附作用。
以上各组培养液配制完成后，以相同的方式培养：即都用无菌膜封住锥形瓶口后在恒温培养箱温度为30℃，恒温振荡器转速150rmp，培养6天。每组实验均设有三个重复，每天测定培养基中残余SDZ的浓度，计算降解率。
(13)降解率测试方法
从各锥形瓶中取出1mL培养液于离心管中离心后取上清液，并用0.22um的水系滤膜过滤。采用高效液相色谱法测定培养液中的SDZ的浓度。色谱柱选择安捷伦C18反相柱(4mm*10cm，3.5um)，流动相为0.02mol/l的磷酸与乙腈比例为80：20的混合液，紫外检测器，测试波长为270nm，SDZ的保留时间为1.937min。
实验结果如图1或下表所示：
由此可见，空白对照组E1，高温灭活对照组E2、pH分别为2.94和3.74四组实验在6天内的降解率稳定在20％以内。pH＝5.82时，第3天降解率即达到90％以上，pH＝4.79和5.82的两组在6天的时候降解率均达到100％。由此可见，30℃时，pH＝5.82为最优的初始pH。不过在30℃培养环境下，初始pH6.73和pH4.79也同样均具有较理想的降解效果。
实施例二
实施例二的实验步骤和测试条件如下：
(11)菌种培养
将黄孢原毛平革菌接种于PDA培养基中，30℃培养3天；然后取一定量的黄孢原毛平革菌孢子采用液体培养基进行扩大培养，30℃培养5天，得尺寸平均约4～6mm左右的黄孢原毛平革菌菌丝球及其代谢液。
(12)降解磺胺嘧啶的培养
采用甲醇和二甲基亚砜1:1的混合液配制磺胺嘧啶储备液，使磺胺嘧啶浓度为10mg/mL。本实施例中设置五个实验组，使用5个50mL锥形瓶，并分别命名为X1、X2、X3、X4、X5。各个实验组的操作如下：
X3、X4、X5实验组：分别取(11)中得到的黄孢原毛平革菌菌丝球约2g和代谢液5mL和15ml无机盐培养液到50mL的锥形瓶中，再加入10mg/ml的磺胺嘧啶20ul，使得锥形瓶中磺胺嘧啶的浓度为10mg/L，此时测得锥形瓶中培养液的自然pH约4.79，再用1mol/L的NaOH水溶液调节培养液的pH值使其为5.79。
X1为空白对照组：在空白的50mL锥形瓶中加入10mg/ml的磺胺嘧啶20ul，加入去离子水调节锥形瓶中磺胺嘧啶的浓度为10mg/L，用1mol/L的NaOH水溶液调节培养液的pH值使其为5.79。X1组不加菌丝球和代谢液，目的是观察SDZ自然分解。
X2为高温灭活对照组：按照与X3完全相同的操作，不同之处在于，用高压灭菌锅灭菌30min，此时黄孢原毛平革菌菌丝球被灭活，初始pH值5.79。目的是观察菌丝球对SDZ的吸附作用。
培养条件：
X3、X4、X5组培养液配制完成，均用无菌膜封住锥形瓶口，并分别在恒温培养箱温度设置为26℃、30℃和37℃条件下，恒温振荡器转速150rmp，培养6天。X1、X2组培养液配制完成，用无菌膜封住锥形瓶口后，在恒温培养箱温度为30℃，恒温振荡器转速150rmp，培养6天。
每组实验均设有三个重复，每天测定培养基中残余SDZ的浓度，计算降解率。
(13)降解率测试方法
从各锥形瓶中取出1mL培养液于离心管中离心后取上清液，并用0.22um的水系滤膜过滤。采用高效液相色谱法测定培养液中的SDZ的浓度。色谱柱选择安捷伦C18反相柱(4mm*10cm，3.5um)，流动相为0.02mol/l的磷酸与乙腈比例为80：20的混合液，紫外检测器，测试波长为270nm，SDZ的保留时间为1.937min。
实验结果如图2或下表所示：
由此可见，在上述实验中，X1组的空白对照和X2组高温灭活对照在6天的降解率均在10％以内，因此SDZ的自然降解率和菌丝球对SDZ的吸附作用可忽略不计。通过以上对比可发现，在pH5.79时，温度26℃、30℃和37℃的培养条件下，6天的培养时间结束后，磺胺嘧啶的降解率降解率都接近100％。而在培养2天时，温度26℃和37℃时两组实验，磺胺嘧啶的降解率都超过80％。通过对比每天的降解率和降解速度,可知37℃最有利于SDZ的降解。但26℃、30℃和37℃也都是较为理想的温度。
通过实施例1-2得出结论，将黄孢原毛平革菌及其代谢液加入到磺胺嘧啶溶液中，进行共培养时，培养条件为初始pH＝5.79～5.82、温度为37℃、黄孢原毛平革菌菌球尺寸在3～10mm左右并加入一定量的代谢液时，培养液中SDZ的降解率最高且降解速度最快，在3天之内降解率即可达100％。因此，黄孢原毛平革菌对磺胺嘧啶具有非常明显的降解作用，其降解速度快速且十分高效，适用于对含有磺胺嘧啶的大量含磺胺嘧啶抗生素的工业、渔业或农业废水和土壤进行无害化处理。

Claims (10)

1.一种高效降解磺胺嘧啶的方法，其特征在于，所述方法是将黄孢原毛平革菌加入到磺胺嘧啶溶液中形成培养体系进行生物降解。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄孢原毛平革菌尺寸为3mm～10mm的菌丝球。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养体系的初始pH值为4.79～6.8。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养体系的初始pH为5.79～5.82。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养体系的温度环境为26℃、30℃或37℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，每10mg/L的磺胺嘧啶溶液中加入所述黄孢原毛平革菌的添加量为2g±10％。
7.根据权利要6所述的方法，其特征在于，还包括向磺胺嘧啶溶液中加入所述黄孢原毛平革菌代谢液，按每10mg/L的磺胺嘧啶溶液加入5mL±10％的黄孢原毛平革菌代谢液。
8.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括黄孢原毛平革菌的培养步骤：将黄孢原毛平革菌接种于固体培养基，28℃～32℃培养2～5天；然后取一定量孢子采用液培法进行扩大培养，28℃～32℃培养4～7天，得尺寸3mm～10mm的黄孢原毛平革菌菌丝球及其代谢液。
9.一种高效降解磺胺嘧啶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：培养黄孢原毛平革菌：将黄孢原毛平革菌接种于固体培养基，28℃～32℃培养2～5天；然后取一定量孢子采用液培法进行扩大培养，28℃～32℃培养4～7天，得尺寸3mm～10mm的黄孢原毛平革菌菌丝球及其代谢液；
S2：降解磺胺嘧啶：按每10mg/L的磺胺嘧啶溶液中加入2g±10％黄孢原毛平革菌和5mL±10％的黄孢原毛平革菌代谢液形成降解培养液，将温度保持在26℃或37℃，初始pH值调节至5.79～5.82之间，培养3～7天。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中降解培养液的初始pH值调节为5.79，温度保持在37℃，培养时间为3天。
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