CN108186772A - 一种柠檬外泌体的修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种柠檬外泌体的修饰方法,该方法包括以下步骤:(1)按NHS‑PEG‑VS︰cRGD=5︰1的质量比取NHS‑PEG‑VS和cRGD溶于DMF中,然后按NHS‑PEG‑VS与cRGD的质量之和︰TEA=6mg︰1μl的质量体积比加入TEA,室温反应2h,所得反应产物用乙醚洗涤3次,静置沉淀,取沉淀物真空干燥,得到cRGD‑PEG‑VS;(2)按cRGD‑PEG‑VS︰柠檬外泌体=1mg︰500μl的质量体积比取cRGD‑PEG‑VS与浓度为500μg/ml的柠檬外泌体混合,加入的碳酸钠缓冲液调节为PH值为9.0,然后按步骤(1)所用cRGD︰EDC︰NHS=1︰1︰1的摩尔比加入EDC和NHS,反应过夜,得到PEG‑cRGD‑柠檬外泌体。本方法所得到的PEG‑cRGD‑柠檬外泌体可用于制备治疗脑胶质瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及DNA重组,具体涉及植物来源的外泌体及其修饰。
背景技术
脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,占原发性恶性脑肿瘤的46.6%,主要为胶质母细胞瘤,多发生于额叶、颞叶和顶叶,五年生存率仅为5.5%。脑胶质瘤具有高度弥散和浸润性生长的特点,与周围正常脑组织无明显分界线,存在手术难以完全切除和术后易复发的问题,目前临床上脑胶质瘤的标准治疗方案是在最大范围手术全切除的基础上辅以放射治疗和(或)药物化疗,但总体预后并无显著改善,临床疗效不甚理想。由于血脑屏障的存在,应用于脑胶质瘤治疗的药物较少,因此亟待开发更多的能够穿越血脑屏障治疗脑胶质瘤的新型药物,这对于延长患者生存期和提高生活质量,具有重要的临床应用前景和社会意义。
外泌体(exosomes)是由多种活细胞分泌的囊泡小体,具有脂质双分子层结构,可携带大量蛋白质、脂质、mRNA和siRNA,且易与受体细胞融合,研究报道发现外泌体可参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生、免疫反应等过程。外泌体的纳米尺寸使其在肿瘤部位有增强渗透和滞留效应(EPR)和被动靶向性,同时外泌体在血液循环中性质结构稳定,可应用于肿瘤治疗的研究。目前已经针对动物来源的外泌体开展了广泛的研究,但是动物细胞来源的外泌体提取工艺复杂、成本高、收率低,而且这些外泌体含有与供体细胞一致的脂质、核酸、蛋白和细胞膜受体等,因此在应用过程中也可能引起副反应,存在一定的安全性问题。相比较而言,多汁植物来源的外泌体产量更高,且生物相容性和安全性更为可靠。目前,美国路易斯维尔大学研究团队Huang-Ge Zhang等人研究发现西柚果汁提取的外泌体产量高达2.21±0.044g/kg,其研究结果表明西柚来源的外泌体可携带miRNA或化疗药物,经鼻内给药可有效抑制小鼠颅内胶质瘤的生长,延长小鼠的生存期(参见Wang,Q.,et al.,Deliveryof therapeutic agents by nanoparticles made of grapefruit-derivedlipids.Nature Communications,2013.4:p.1867.),这说明植物来源的外泌体能够穿越血脑屏障,实现脑部药物输送。在目前外泌体应用于脑胶质瘤治疗的各项研究中,其给药方式多为原位给药和鼻内给药,但是鼻内给药存在操作困难、给药剂量较少难以达到治疗剂量和易吸入肺等的问题,这些缺点严重限制了鼻内给药方式在动物实验及临床治疗中的应用。同时有研究发现外泌体经尾静脉注射后,大部分蓄积在肝脏、脾脏等部位,而很少富集在肿瘤组织,这说明外泌体对肿瘤组织缺乏主动靶向能力,因此提高外泌体的靶向性,增加其通过静脉给药途径穿越血脑屏障的能力显得尤为重要。
柠檬是一种来源广泛的天然可食用的多汁水果,不仅能为人体提供必需的氨基酸、蛋白质、维生素、矿质元素等营养物质,而且含有丰富的生物活性物质,具有消炎、杀菌、降血压、降血脂、抗氧化和抗癌等功效。印度学者Stefania Raimondo等人研究发现柠檬来源的外泌体可抑制慢性粒细胞白血病细胞的增殖,在慢性粒细胞白血病皮下瘤模型小鼠的肿瘤部位聚集,并抑制其肿瘤的生长(参见Raimondo,S.,et al.,Citrus limon-derivednanovesicles inhibit cancer cell proliferation and suppress CML xenograftgrowth by inducing TRAIL-mediated cell death.Oncotarget,2015.6(23):p.19514-27.),这说明柠檬来源的外泌体可以抑制肿瘤细胞的生长,具有一定的治疗作用,但是对于脑胶质瘤来说必须要具有穿越血脑屏障的能力才能抑制肿瘤细胞的生长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种柠檬外泌体的修饰方法,该方法修饰的柠檬外泌体可穿越血脑屏障,具有靶向治疗脑胶质瘤的生物活性。
本发明解决上述问题的技术方案如下:
一种柠檬外泌体的修饰方法,该方法包括以下步骤:
(1)按N-羟基琥珀酰亚胺-乙烯基砜聚乙二醇︰肿瘤靶向环肽cRGD=5︰1的质量比取N-羟基琥珀酰亚胺-乙烯基砜聚乙二醇(NHS-PEG-VS)和肿瘤靶向环肽cRGD溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后按N-羟基琥珀酰亚胺-乙烯基砜聚乙二醇与肿瘤靶向环肽cRGD的质量之和︰三乙胺=6mg︰1μl的质量体积比加入三乙胺(TEA),室温反应2h,所得反应产物用乙醚洗涤3次,静置沉淀,取沉淀物真空干燥,得到cRGD-PEG-VS;
(2)按cRGD-PEG-VS︰柠檬外泌体=1mg︰500μl的质量体积比取cRGD-PEG-VS与浓度为500μg/ml的柠檬外泌体混合,加入的碳酸钠缓冲液调节为PH值为9.0,然后按步骤(1)所用肿瘤靶向环肽cRGD︰1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺︰N-羟基琥珀酰亚胺=1︰1︰1的摩尔比加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),反应过夜,得到修饰的柠檬外泌体PEG-cRGD-柠檬外泌体。
本发明人研究发现,上述方法所得到的PEG-cRGD-柠檬外泌体可透过血脑屏障,而且具有靶向肿瘤细胞抑制其生长与增殖的活性。因此,本发明所述方法修饰的柠檬外泌体可用于制备治疗脑胶质瘤的药物。
附图说明
图1为柠檬来源外泌体的粒径和透射的电镜图。
图2为柠檬外泌体经PEG-cRGD靶向性修饰后的粒径和透射的电镜图。
图3为柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体对胶质瘤细胞U87和U251生长影响的电泳图。
图4为柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体浓度对胶质瘤细胞U87和U251存活率影响的曲线图。
图5为用流式细胞仪检测DiI分别标记的柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体在人胶质瘤细胞U87和U251的细胞摄取情况的条形图
图6为柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体在脑胶质瘤u87原位动物模型体内分布的条形图。
图7为柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体对脑胶质瘤u87原位动物模型生存期影响的曲线图。
具体实施方式
实施例1(制备PEG-cRGD-柠檬外泌体)
1、提取柠檬外泌体
购买新鲜柠檬去皮榨汁,取果汁用PBS缓冲液稀释,差速离心(500g离心10min,2000g离心20min,5000g离心30min,10000g离心1h取上清,上清液100000g离心2h取沉淀)获得外泌体沉淀,PBS缓冲液重悬沉淀,蔗糖密度梯度离心的方法(8%,30%,45%,60%蔗糖分别溶于20mM Tris.Cl中)提纯外泌体,动态光散射和透射电镜鉴定外泌体的粒径分布和形貌表征,如图1所示。采用BCA蛋白定量方法测定外泌体中的蛋白含量,得到的外泌体存放于-80℃备用。
2、(修饰柠檬外泌体)
(1)取25mg的N-羟基琥珀酰亚胺-乙烯基砜聚乙二醇(NHS-PEG-VS)与5mg肿瘤靶向环肽cRGD溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,加入5μl的三乙胺(TEA),室温反应2h,所得反应产物用乙醚反复洗涤3次,静置沉淀,取沉淀物真空干燥,得到cRGD-PEG-VS;
(2)取100μl浓度为500μg/ml的步骤1所制备的柠檬外泌体与0.2mg cRGD-PEG-VS混合,加入的碳酸钠缓冲液调节为PH值9.0,然后加入0.01mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.005mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),反应过夜,得到修饰的柠檬外泌体PEG-cRGD-柠檬外泌体,加入100μl PBS,保存于-20℃备用。
3、PEG-cRGD-柠檬外泌体的鉴定
(1)用CBQCA蛋白定量试剂盒(C-6667)定量PEG-cRGD-柠檬外泌体,用酶标仪检测标准品和样品荧光值(激发/发射波长为465/550nm),绘制标准曲线为y=12.5813x-318.6018,其中x为荧光值,y为蛋白浓度(μg/ml),根据测得荧光值即可得知PEG-cRGD-柠檬外泌体浓度,为587.73μg/ml,说明得到的反应产物PEG-cRGD-柠檬外泌体上含有PEG-cRGD。
(2)动态光散射和透射电镜鉴定PEG-cRGD-柠檬外泌体的粒径和形貌特征,如图2所示。用动物细胞来源外泌体标志物TSG101和Alix检测柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体蛋白成分,同时用内质网标志蛋白calnexin作为对照,结果显示柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体均表达外泌体标志蛋白TSG101,但是不表达另外一种动物来源的外泌体Alix,说明植物来源外泌体与动物来源外泌体有相似性和差异性,但是并没有内质网标志蛋白calnexin的表达,说明柠檬外泌体是来源于细胞质,且PEG-cRGD-柠檬外泌体并没有改变外泌体的特征,结果如图3所示。
实施例2(药效实验)
(1)对胶质瘤细胞生长的影响
在细胞对数生长期,分别将人胶质瘤细胞U87和U251的细胞悬液接种于96孔板,每孔细胞约为3500个,将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养12h,设5个外泌体浓度梯度进行加药,最高浓度为20μg/ml,依次倍比稀释直至浓度为0,每个浓度设5个复孔,加药后将96孔板置于37℃、5%CO2培养48h,然后加入MTT继续培养4h,酶标仪检测吸光度值(OD值)(检测波长490nm),分别计算各药物浓度下细胞相对存活率,结果如图3所示。细胞相对存活率(%)=(OD实验组均值/OD对照组均值)×100%。
由图4可知,柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体对胶质瘤细胞U87和U251均有杀伤作用,且PEG-cRGD-柠檬外泌体好于没有进行靶向修饰的柠檬外泌体。
(2)流式检测胶质瘤细胞对柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体的摄取
在细胞对数生长期,分别将人胶质瘤细胞U87和U251的细胞悬液接种于6孔板,每孔细胞约为40万个,将6孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养12h,分别加入相同浓度的荧光染料DiI标记的柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体,继续培养4h后将细胞消化下来并用PBS清洗两遍,流式细胞仪分别检测胶质瘤细胞对柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体的摄取情况,结果如图5所示。
图5的结果显示两株胶质瘤细胞对PEG-cRGD-柠檬外泌体的摄取优于柠檬外泌体,表明PEG-cRGD-柠檬外泌体具有一定的靶向性。
(3)PEG-cRGD-柠檬外泌体在脑胶质瘤原位瘤动物模型体内生物分布
从广东省医学实验动物中心购买5只6周龄裸鼠,将实验裸鼠置于独立通气笼盒SPF条件下适应性驯养1周。裸鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,在裸鼠颅内接种8μl的表达萤光素酶的U87细胞悬液(含8×105个对数生长期的细胞)。3天后,种瘤的裸鼠经腹腔注射萤光素酶底物后,用小动物成像仪观察裸鼠成瘤情况。待小鼠颅内肿瘤长到一定大小,尾静脉注射适量的荧光染料DID标记柠檬外泌体和PEG-cRGD-柠檬外泌体,分别在给药后30min、3h、6h、12h和24h用小动物成像仪观察小鼠体内荧光分布情况,在给药后60h杀鼠取内脏组织观察荧光分布情况。结果如图6所示。
图6的结果表明柠檬外泌体并没有聚集在活体动物脑部,而PEG-cRGD-柠檬外泌体可穿过血脑屏障,在肿瘤部位聚集,并有显著性差距(***P<0.001)。
(4)PEG-cRGD-柠檬外泌体对脑胶质瘤原位瘤动物模型生存期的影响
从广东省医学实验动物中心购买21只6周龄裸鼠,将实验裸鼠置于独立通气笼盒SPF条件下适应性驯养1周。裸鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,在裸鼠颅内接种8μl的表达萤光素酶的U87细胞悬液(含8×105个对数生长期的细胞)。3天后,种瘤的裸鼠经腹腔注射萤光素酶底物后,用小动物成像仪观察裸鼠成瘤情况及肿瘤大小。将成瘤裸鼠分为3组,分别为生理盐水、柠檬外泌体组及PEG-cRGD-柠檬外泌体组,每组7只,对照组尾静脉注射PBS,exosomes组尾静脉注射4mg/kg柠檬外泌体和同等剂量的PEG-cRGD-柠檬外泌体,每隔1天给药1次,监测裸鼠的生存时间。结果如图6所示。
由图7可知,PEG-cRGD-柠檬外泌体组裸鼠的生存期明显延长,好于单一柠檬外泌体和对照组(*P<0.05),而柠檬外泌体组裸鼠的生存期较对照组无差异。
实验结果表明,柠檬来源的外泌体可在体外抑制胶质瘤细胞的生长,PEG-cRGD-柠檬外泌体可在体内延长脑胶质瘤原位瘤裸鼠的生存期。因此,PEG-cRGD-柠檬外泌体体可用于胶质瘤的治疗。
Claims (2)
1.一种柠檬外泌体的修饰方法,该方法包括以下步骤:
(1)按N-羟基琥珀酰亚胺-乙烯基砜聚乙二醇︰肿瘤靶向环肽cRGD=5︰1的质量比取N-羟基琥珀酰亚胺-乙烯基砜聚乙二醇和肿瘤靶向环肽cRGD溶于N,N-二甲基甲酰胺中,然后按N-羟基琥珀酰亚胺-乙烯基砜聚乙二醇与肿瘤靶向环肽cRGD的质量之和︰三乙胺=6mg︰1μl的质量体积比加入三乙胺,室温反应2h,所得反应产物用乙醚洗涤3次,静置沉淀,取沉淀物真空干燥,得到cRGD-PEG-VS;
(2)按cRGD-PEG-VS︰柠檬外泌体=1mg︰500μl的质量体积比取cRGD-PEG-VS与浓度为500μg/ml的柠檬外泌体混合,加入的碳酸钠缓冲液调节为PH值为9.0,然后按步骤(1)所用肿瘤靶向环肽cRGD︰1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺︰N-羟基琥珀酰亚胺=1︰1︰1的摩尔比加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺,反应过夜,得到修饰的柠檬外泌体PEG-cRGD-柠檬外泌体。
2.权利要求1所述方法制得的PEG-cRGD-柠檬外泌体在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
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