CN108179172B - 一种牛支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断试剂及制备方法，具体涉及一种牛支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法。本发明提供了一种牛支原体药敏快速检测试剂盒，所述试剂盒包括牛支原体培养液、药敏板和抗生素药物。所述牛支原体培养液包括以下成分及含量：PPLO粉10～15g，短肽2～4g，莫诺苷100～500mg，酵母粉2～6g，葡萄糖1～3g，丙酮酸钠1.5～4.5g，MEM培养基80～120mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清100～300mL，30万单位青霉素和ddH2O 700～800mL。本发明培养液能快速促进牛支原体生长，20‑24h内即可完成检测，且性能稳定，特异性强。

Description

一种牛支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂及制备方法，具体涉及一种牛支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
牛支原体(mycoplasma bovis)是引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎的重要病原之一，有较强的传染性，并常与其他病原菌混合感染，严重威胁牛群健康，给养牛业造成了巨大的经济损失。牛支原体在1961年首次于患有乳腺炎牛的牛乳中分离得到，我国自2008年首次报道了牛支原体肺炎之后，不断有各地牛场发生犊牛支原体肺炎死亡和成母牛支原体乳腺炎的病例。该病发病率高，犊牛治疗不当或造成死亡，常与其他细菌或病毒混合感染时临床症状复杂多样，故仅通过临床症状和用药情况，不能准确判断是否发生支原体感染。另外，由于支原体没有细胞壁，多数抗生素对牛支原体无治疗效果，牧场长期不规范用药也使得少数有效抗生素也存在耐药菌株。即使确定为支原体感染，也不能盲目用药，合理的药敏试验是指导临床用药的重要参考依据。然而，目前在牛支原体药敏试验方面，尚没有国家标准或专利可以参考，还未有商品化试剂盒。
发明内容
本发明主要目的是提供一种牛支原体药敏快速检测试剂盒，帮助疾控部门和牛场及时发现支原体感染，制定有效治疗方案，提升病牛治愈率，减少经济损失。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
第一个方面，本发明提供一种牛支原体药敏快速检测试剂盒，所述试剂盒包括牛支原体培养液、药敏板和抗生素药物。
第二个方面，本发明提供一种所述牛支原体药敏快速检测试剂盒的制备方法，包括下述步骤：
(1)牛支原体培养液的制备：将PPLO粉12g，短肽3g，莫诺苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠3.5g，溶于750mL ddH2O中，加入MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，116℃灭菌20min后，加入56℃灭活的马血清150mL和30万单位青霉素，调节PH值为7.6～7.8，分装至15mL培养管，9mL/管。
(2)药敏板的制备：
S1.将96孔板经粗洗、精洗、40℃恒温烤干备用；
S2.将红霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素、替米考星、泰拉霉素、加米霉素和四环素溶解到1-5mL缓冲液中，依次稀释至128μg/mL～0.125μg/mL；
S3.用加样器分别吸取各浓度药物添加到相对应的96孔板中，静置30分钟后，吸出弃去。
本发明优化了牛支原体培养液的成分和用量。短肽α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，也是蛋白质水解的中间产物。支原体基因组小，自身合成能力较弱，本发明技术人员发现，在牛支原体培养液中加入肽链为Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala的低聚短肽后，能快速促进牛支原体的生长。
莫诺苷(分子式：C17H26O11，CAS号：25406-64-8)从山茱萸干燥成熟果肉中提取得到，研究表明莫诺苷具有保护细胞免于H2O2诱导的细胞毒性和细胞凋亡的作用。本发明技术人员发现在一定浓度范围内莫诺苷能够延长支原体稳定期，减慢了支原体凋亡的速度。
本发明技术人员将短肽和莫诺苷配合加入牛支原体培养液中，并添加MEM培养基，各成分相互作用，极大促进牛支原体细胞的生长和代谢。8-12h即可观察到颜色变化，20-24h已完全变黄。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明培养液能快速促进牛支原体生长，缩短了显色时间，20-24h内即可完成检测。
(2)本发明检测试剂盒性能稳定，特异性强，减少检测过程中假阴性的出现，提升检测方法的准确度；按本发明药敏检测结果，用于牛支原体的治疗，有效率高达97％以上。
附图说明
图1为药敏板示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
为实现牛支原体药敏快速检测，本发明提供了一种牛支原体药敏快速检测试剂盒，所述试剂盒包括牛支原体培养液、药敏板和抗生素药物。
进一步地，所述牛支原体培养液包括以下成分及含量：PPLO粉10～15g，短肽2～4g，莫诺苷100～500mg，酵母粉2～6g，葡萄糖1～3g，丙酮酸钠1.5～4.5g，MEM培养基80～120mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清100～300mL，30万单位青霉素和ddH2O 700～800mL。
进一步地，所述牛支原体培养液由以下成分及含量组成：PPLO粉12g，短肽3g，莫诺苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠3.5g，MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清150mL，30万单位青霉素和ddH2O 750mL。
进一步地，所述短肽为由3-9个氨基酸残基组成的短链肽。
更进一步地，所述肽链为Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala的低聚短肽。
进一步地，所述药敏板为96孔培养板，标有A～H号，每个号的1～11孔药物浓度依次为128μg/mL～0.125μg/mL。
进一步地，所述药敏板96孔培养板A-H号包被8种治疗牛支原体药物，这些药物从以下大类药物中筛出：大环内酯类、氯霉素类，氟喹诺酮类、氨基酸糖苷类和四环素类。
进一步地，筛选的8种治疗牛支原体药物分别为红霉素、泰拉霉素、加米霉素、替米考星、氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素和四环素。
第二个方面，本发明提供一种所述牛支原体药敏快速检测试剂盒的制备方法，包括下述步骤：
(1)牛支原体培养液的制备：将PPLO粉12g，短肽3g，莫诺苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠3.5g，溶于750mL ddH2O中，加入MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，116℃灭菌20min后，加入56℃灭活的马血清150mL和30万单位青霉素，调节PH值为7.6～7.8，分装至15mL培养管，9mL/管。
(2)药敏板的制备：
S1.将96孔板经粗洗、精洗、40℃恒温烤干备用；
S2.将红霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素、替米考星、泰拉霉素、加米霉素和四环素溶解到1-5mL缓冲液中，依次稀释至128μg/mL～0.125μg/mL；
S3.用加样器分别吸取各浓度药物添加到相对应的96孔板中，静置30分钟后，吸出弃去。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1一种牛支原体培养液
所述牛支原体培养液由以下成分及含量组成：PPLO粉10～15g，短肽2～4g，莫诺苷100～500mg，酵母粉2～6g，葡萄糖1～3g，丙酮酸钠1.5～4.5g，MEM培养基80～120mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清100～300mL，30万单位青霉素和ddH2O 700～800mL。
所述肽链为Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala的低聚短肽。
实施例2一种牛支原体培养液
所述牛支原体培养液由以下成分及含量组成：PPLO粉10～15g，短肽2～4g，莫诺苷100～500mg，酵母粉2～6g，葡萄糖1～3g，丙酮酸钠1.5～4.5g，MEM培养基80～120mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清100～300mL，30万单位青霉素和ddH2O 700～800mL。
所述肽链为Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala的低聚短肽。
实施例3一种牛支原体培养液
所述牛支原体培养液由以下成分及含量组成：PPLO粉12g，短肽3g，莫诺苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠3.5g，MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清150mL，30万单位青霉素和ddH2O 750mL。
所述肽链为Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala的低聚短肽。
实施例4一种牛支原体药敏快速检测试剂盒
所述试剂盒包括牛支原体培养液、药敏板和抗生素药物。
所述牛支原体培养液如实施例1～3所述。
所述药敏板为96孔培养板，标有A～H号，每个号的1～11孔药物浓度依次为128μg/mL～0.125μg/mL。所述药敏板96孔培养板A-H号包被8种治疗牛支原体药物，这些药物从以下大类药物中筛出：大环内酯类、氯霉素类，氟喹诺酮类、氨基酸糖苷类和四环素类。筛选的8种治疗牛支原体药物分别为红霉素、泰拉霉素、加米霉素、替米考星、氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素和四环素。具体如图1所示。
实施例5一种牛支原体药敏快速检测试剂盒的制备方法
所述牛支原体药敏快速检测试剂盒的制备方法，包括下述步骤：
(1)牛支原体培养液的制备：将PPLO粉12g，短肽3g，莫诺苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠3.5g，溶于750mL ddH2O中，加入MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，116℃灭菌20min后，加入56℃灭活的马血清150mL和30万单位青霉素，调节PH值为7.6～7.8，分装至15mL培养管，9mL/管。
(2)药敏板的制备：
S1.将96孔板经粗洗、精洗、40℃恒温烤干备用；
S2.将红霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素、替米考星、泰拉霉素、加米霉素和四环素溶解到1-5mL缓冲液中，依次稀释至128μg/mL～0.125μg/mL；
S3.用加样器分别吸取各浓度药物添加到相对应的96孔板中，静置30分钟后，吸出弃去。
对比例1
与实施例3的区别在于，不含莫诺苷，其它均与实施例3相似。
对比例2
与实施例3的区别在于，不添加MEM培养基，增加PPLO用量至17g，其它均与实施例3相似。
对比例3
所述培养基由以下成分及含量组成：葡萄糖2.5g，PPLO粉21.0g，酵母粉2.5g，丙酮酸钠3.0g，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清150mL和30万单位青霉素。
试验例一牛支原体在不同培养液中生长情况
牛支原体可利用葡萄糖，葡萄糖分解时产生H+，使培养基变酸性，并使培养基的酚红指示剂从红色变成黄色，因而被检出；并且可由颜色变黄的速度判定牛支原体的生长和代谢速度。
分别用实施例1-3及对比例1-3培养液培养牛支原体，并记录传代稳定后各培养物的颜色变化。实验结果如表1所示。
表1不同培养基中颜色变化情况
Figure GDA0002413940130000061
注：“-”表示未生长；“+，++，+++，++++”分别表示培养基颜色变黄的程度。
由表1可知，实施例3培养液培养牛支原体8h后，即可观察到颜色变化，20h已完全变黄；实施例1～2培养液分别培养12h后可观察到颜色变化，24h后颜色完全变黄，由此可知，本发明实施例3为最佳实施例。本发明实施例培养基培养牛支原体，颜色变化均早于对比例1～3培养基。
试验例二不同培养液检测特异性
采集山东、内蒙古、甘肃、河北、江苏、四川等地的177个疑似支原体感染样品，其中乳房炎样品78份、关节炎样品13份和肺炎样品86份，采用特异性PCR和培养法检测，结果如下表2所示：
表2不同培养液特异性检测
Figure GDA0002413940130000062
Figure GDA0002413940130000071
由表2可知，以特异性PCR检测方法为参考，本发明实施例3培养液在临床分离牛支原体时，特异性为93.55％，均高于其他牛支原体培养基，更适于本药敏试剂盒的开发。
试验例三牛支原体药敏检测
2016年11月份，采自山东、内蒙古、甘肃、河北、江苏、四川等地的86个犊牛鼻拭子中分离得到6株牛支原体(支9、甘4、004、57、6073、314)，并通过16s测序和特异性PCR进行确定。随后对不同地域分离株采用本发明涉及的药敏试剂盒进行药敏试验，实验方法如下：
1.支原体的分离培养
1.1疑似支原体感染样品的处理
鼻拭子：用2mL生理盐水浸润拭子后，8000rpm离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用；
1.2液体培养
将1mL处理好的样品上清液加入到含9mL实施例3培养液的15mL离心管中，吸取100微升加入药敏孔中，培养20小时。若第12孔液体培养基由红色变为黄色且透亮的培养液判为疑似支原体阳性，若无变色且透亮，盲传1次后再次判定。
1.3药敏试验结果判定：
对于支原体阳性的样品，培养48小时后，从右到左，红色首孔所对应的药物浓度即为药物的最小抑菌浓度。例：当第12孔变为黄色时，8—11孔为黄色，1-7孔为红色，则第7孔为红色首孔，其所对应的药物浓度为2μg/mL，即为该药物的最小抑菌浓度。
实验结果如下表3所示。
表3不同分离株的常用药物敏感性试验
Figure GDA0002413940130000072
Figure GDA0002413940130000081

Claims (6)

1.一种牛支原体药敏快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括牛支原体培养液、药敏板和抗生素药物；所述牛支原体培养液由以下成分及含量组成：PPLO粉10～15g，短肽2～4g，莫诺苷100～500mg，酵母粉2～6g，葡萄糖1～3g，丙酮酸钠1 .5～4 .5g，MEM培养基80～120mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清100～300mL，30万单位青霉素和ddH2O 700～800mL；所述短肽为Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala。
2.根据权利要求1所述牛支原体药敏快速检测试剂盒，其特征在于，所述牛支原体培养液由以下成分及含量组成：PPLO粉12g，短肽3g，莫诺苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2 .5g，丙酮酸钠3 .5g，MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清150mL，30万单位青霉素和ddH2O 750mL。
3.根据权利要求1所述牛支原体药敏快速检测试剂盒，其特征在于，所述药敏板为96孔培养板，标有A～H号，每个号的1～12孔药物浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0 .125、0，单位为μg/mL。
4.根据权利要求1所述牛支原体药敏快速检测试剂盒，其特征在于，所述药敏板96孔培养板A-H号包被8种治疗牛支原体药物，这些药物从以下大类药物中筛出：大环内酯类、氯霉素类，氟喹诺酮类、氨基酸糖苷类和四环素类。
5.根据权利要求4所述牛支原体药敏快速检测试剂盒，其特征在于，筛选的8种治疗牛支原体药物分别为红霉素、泰拉霉素、加米霉素、替米考星、氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素和四环素。
6.根据权利要求1-5任一所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)牛支原体培养液的制备：将PPLO粉12g，短肽3g，莫诺苷300mg，酵母粉4g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠3 .5g，溶于750mL ddH2O中，加入MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，116℃灭菌20min后，加入56℃灭活的马血清150mL和30万单位青霉素，调节PH值为7 .6～7.8，分装至15mL培养管，9mL/管；
(2)药敏板的制备：
S1 .将96孔板经粗洗、精洗、40℃恒温烤干备用；
S2 .将红霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素、替米考星、泰拉霉素、加米霉素和四环素分别溶解到1-5mL缓冲液中，并将每种药物依次稀释至128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0 .125，单位为μg/mL；
S3 .用加样器分别吸取各浓度药物添加到相对应的96孔板中，静置30分钟后，吸出弃去。
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莫诺苷抑制H2 02诱导的神经细胞凋亡;艾厚喜等;《中国中药杂志》;20080915;第33卷(第18期);第2109页摘要 *

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