CN108165638A

CN108165638A - 一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108165638A
Application number: CN201810167543.0A
Authority: CN
Inventors: 李文蓉; 刘书东; 陈磊; 贺三刚; 马燕; 玛依拉; 刘明军
Original assignee: Xinjiang Academy Of Animal Sciences Institute Of Biotechnology (china-Astralia Sheep Research Center Of Xinjiang Academy Of Animal Sciences)
Current assignee: Xinjiang Academy Of Animal Sciences Institute Of Biotechnology (china-Astralia Sheep Research Center Of Xinjiang Academy Of Animal Sciences)
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2018-06-15

Abstract

本发明公开了一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记及其应用。分子标记的序列全长为634bp,在该序列的第315bp处有一个C315‑T315的碱基突变。记为“W”,“W”之后的括号即(C/T)为突变位点。本发明是一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记，可应用于绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记辅助选择。

Description

一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及绵羊的分子标记辅助选择技术领域，具体是一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

绵羊毛是纺织业主要的天然纤维原料，用途广泛，其制品具有自然、舒适、轻薄、柔软、抗静电等特点。羊毛的品质性状决定着羊毛的经济价值和工艺价值。伸直长度是细羊毛的主要物理性质，它在评价羊毛品质和经济价值上占重要地位，并影响羊毛加工过程中的生产工艺设计。在相同细度的情况下，羊毛伸直长度愈长，纺纱性能愈高，羊毛制品的成品品质越好(赵有璋.羊生产学[M].北京：中国农业出版社，1999)。然而，绵羊毛的羊毛长度属于遗传力中等偏低的复杂数量性状，运用常规育种方法需要很长时间才能改善和提高品种的羊毛长度。只有在掌握影响或控制绵羊长度性状的主效基因和遗传标记的基础上，才能将获得的候选基因/标记和设计方法应用于提高羊毛长度性状的选择和遗传改良。因此，对绵羊毛伸直长度相关基因的克隆和鉴定可为解释绵羊毛伸直长度和毛囊发育的遗传机制提供重要线索，并为绵羊的毛品质性状遗传改良提供理论依据。

寻找基因中的多态位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择和改善羊毛长度的前提和基础。MLH1基因在DNA修复方面发挥着重要作用，MLH1蛋白与hPMS2蛋白形成异二聚体hMutLα识别并结合hMutSα(hMSH2-hMSH6复合物)和hMutSβ(hMSH2-hMSH3复合物)两种异源二聚体，参与错配碱基的修复过程(Nijaguna B.Prasad,Helina Somervell,Ralph P.Tufano,AlanP.B.Dackiw,Michael R.Marohn,Joseph A.Califano,Yongchun Wang,William H.Westra,Douglas P.Clark,Christopher B.Umbricht,Steven K.Libutti,and MarthaA.Zeiger.Identification of Genes Differentially Expressed in Benign versusMalignant Thyroid Tumors[J].Clin Cancer Res.2008June 1；14(11)：3327–3337.)。此外，该基因位于绵羊基因组OAR19的10.40MB-10.49MB区域内，与皮肤的生物学发生相关。该基因的突变能引起人类Muir-Torre综合征，该病的主要特点是患者易感皮脂肿瘤(或多发角化棘皮瘤)，皮肤及毛发出现异常，发病时一般先出现皮肤症状(Daniele Castiglia,Elena Pagani,Ester Alvino,Patrizia Vernole,Giancarlo Marra,Elda Cannavò,JosefJiricny,Giovanna Zambruno,Stefania D'Atri.Biallelic somatic inactivation ofthe mismatch repair gene MLH1 in a primary skin melanoma[J].Genes ChromosomesCancer.2003Jun；37(2)：165-75.)。通过全基因组关联分析的方法，对364只美利奴羊细毛羊的50K全基因组SNP芯片的与其羊毛伸直长度构建混合线性模型(Mixed liner model，MLM)。发现s33115.1为与绵羊毛伸直长度性状差异极显著相关的位点(p＝0.05/47025＝1.06×10^-06＝10^-5.97)。该位点位于绵羊基因组3.1版本19号染色体第10480482bp处，这个碱基突变处于MLH1基因内。以上研究证明，MLH1基因参与多种生物学过程，可能与皮肤及毛发的生长相关。

因此，本发明探讨MLH1基因与绵羊毛伸直长度的关系，寻求获得一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于从MLH1基因中克隆一种作为绵羊标记辅助选择的、与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记，揭示其在绵羊毛伸直长度性状关联分析中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

申请人克隆得到与绵羊毛伸直长度性状相关的MLH1基因部分DNA片段。在该片段序列的第315bp处有一个C315-T315的碱基突变，导致MLH1基因多态性。这个碱基突变位于MLH1基因第3内含子中。所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

ATTCCTCCCTTCACTGAGGCACCCACGGTCTAGAGTCCACATCCCACGTGAGAGAAAAGCAGACTGGGGAGGGAGGGGGATTTTGTCCCAGACTTGAGCCTCAGAAACGTGAAGGAAGGAATGTGGTGCCTGGGCCCCAAGGCTGAGAAGGAATTAGGTGGGCAGAAGGGGACCGGGGTGCACAGGGTGCTTCTGGCAGAGGAGAGGATGAGGATACAGGCCCAACCGGGTGGTGGGCAAGGGCTGCAAGATAACAGGTGTTGAGGATCTGAATGCTCAGCGTGCTGTCAGCGTTCTCCATGCTGGCTGCCTGAWGGGAATCACCTGGGCCCTCCCCGAACCAGTAAATCTGTCTCGGGTGGGTCTGGGCGCCGGTAGTTTTTAAAAGCTTGGCCAGGCATGGGCATCCATAGGTGGGGTTAAGCAACACTGGGCATGTGTGAAGGCCTACGCTCACTGCAGAGTTCAGGTCAGTTCGAGGGGTTTTATCAGCAAGGTAAGGAGTGTAGACTTCAGTGTGATGGGAATGGACAGGATCTGGTCTGCATTTTACGGAGAGCTCTCTGGCTGCAGCATGGAAAGCGGATGGAAACCCACAGCGACTTGGGCAAAGTGAGGAGGGAACCTGGACAGA

上述序列中的W是C或T，导致MLH1基因多态性。

一种检测分子标记的引物对，对MLH1基因的序列进行特异性扩增，通过PCR产物纯化和测序，获得如上述序列所示的核苷酸序列，进而对第315位碱基突变进行了检测，实现对上述分子标记的鉴定，引物对核苷酸序列如下所示：

正向引物：5＇-ATTCCTCCCTTCACTGAGGCAC-3＇；

反向引物：5＇-TCTGTCCAGGTTCCCTCCTCAC-3＇。

应用PCR产物测序的方法对上述序列所示的第315位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与绵羊毛伸直长度性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明为一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记，能够通过该位点基因型选择绵羊羊毛的伸直长度，可应用于绵羊毛伸直长度性状相关的分析，并为绵羊羊毛伸直长度性状的选育和改良提供精准的育种方案。

附图说明

图1为本发明的技术的流程图。

图2为本发明中绵羊MLH1基因第3内含子片段正向测序发现的第315bp处C-T的突变，即三种不同基因型(CC、CT、TT)的峰图。

图3为本发明中绵羊MLH1基因第3内含子序列基因组扩增的电泳图谱。图中左侧泳道为DNA分子量标准，右侧泳道为绵羊MLH1基因的克隆片段，其片段长度为634bp。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1绵羊MLH1基因部分序列的扩增及其分子标记检测方法的建立

本发明的分子标记是一种与绵羊毛伸直长度性状相关的标记，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的绵羊毛伸直长度性状相关基因MLH1的部分DNA序列，序列全长为634bp,在该序列的第315bp处有一个C315-T315的碱基突变，记为“W”,“W”之后的括号即(C/T)为突变位点(该扩增的片段的首尾显示的引物序列加粗显示)。

一种检测分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5＇-ATTCCTCCCTTCACTGAGGCAC-3＇；

反向引物：5＇-TCTGTCCAGGTTCCCTCCTCAC-3＇。

本发明的分子标记可用于绵羊标记辅助选择育种；本发明的引物对可用于绵羊MLH1基因序列的扩增、鉴定上述分子标记多态性，获得MLH1基因该位点的基因型。

所述分子标记的鉴定方法，参照GenBank中绵羊MLH1基因全序列(NC_019476.2)为模板设计引物，该引物的DNA序列如下：正向引物5'-ATTCCTCCCTTCACTGAGGCAC-3'，反向引物5'-TCTGTCCAGGTTCCCTCCTCAC-3'；提取实验羊只的基因组DNA，通过PCR扩增的方法、对目的片段进行测序，获得分子标记的核苷酸序列；应用BLAST比对的方法检测到MLH1第315位上存在的碱基突变类型；测定实验羊羊毛纤维伸直长度；在上述工作基础上，对实验羊上述标记位点的基因型与其伸直长度性状进行关联分析，进一步证明了该位点是绵羊的分子标记辅助选择育种的分子标记。如图1，具体包括以下步骤：

(1)绵羊基因组DNA提取：

1)用含有EDTA采血管对颈静脉进行采血，记录样品编号，放入车载冰箱，运回实验室。

2)将血液分装到1.5ml离心管中，用移液枪吸取0.5ml放置于室温直至融化完全，于2000r/min离心10分钟，弃去上层液。

3)向管内加入1ml红细胞裂解液(1×)，弹起管底沉淀，轻柔的摇均10min，于1000r/min离心10min，弃去上层液。

4)再向管内加入1ml红细胞裂解液(1×)，弹起管底沉淀，轻柔的摇均10min，于1000r/min离心10min，弃去上层液。

5)向管内加入600μl的白细胞裂解液，70μl 10％SDS，15μl蛋白分解酶K(20mg/ml)和3μl RNA酶溶液，弹起管底沉淀，并且摇均。

6)置于55℃水浴锅恒温振荡过夜，以裂解白细胞，消化蛋白质和RNA。

7)取出混合液将其冷却至室温，向管内加入600μl Tris-HCl饱和酚溶液，将两相上下轻柔颠倒混匀10min，于1000r/min离心10min。

8)用剪刀将1ml枪头尖部剪为直径大小约0.3cm²圆形，将上层清液小心吸出600μl，移至另一个新的灭菌离心管中，加入1：1的酚/氯仿溶液600μl，轻柔摇均10min，于1000r/min离心10min；

9)将上层液移至另一个新的灭菌管中，加入氯仿溶液600μl，轻轻的摇均10min，于1000r/min离心10min。

10)用直径大小为0.3cm²的左右1ml枪头，移至另一个新的灭菌管中，加入冰无水乙醇1ml，轻柔摇均2min，可看到漂浮的絮状物即为DNA，于1000r/min离心10min；或者加入冰无水乙醇1ml，放置-20℃冰箱30min。

11)将管内的上清混合液弃去，加入70％酒精200μl，弹起管底DNA沉淀，于10000r/min离心5min。

12)将管内的上清液弃去，放置于超净工作台自然风干。

13)向管内加入TE(pH 7.0)溶液，将干燥的DNA弹起混匀，4℃保存直至DNA完全溶解。

14)用分光光度计来检测基因组DNA的浓度和纯度，提取血样基因组DNA。

15)用0.8％的琼脂糖凝胶，紫外灯下检测提取的DNA质量。

(2)引物设计：

以报道GenBank中绵羊MLH1基因全序列(NC_019476.2)为模板，利用生物学引物设计软件Primer Premier 5.0，设计扩增MLM1基因第3内含子的引物，该引物对的DNA序列如下：

MLH1：正向引物：5'-ATTCCTCCCTTCACTGAGGCAC-3'(对应于序列表SEQ ID NO：1的第1-22位)，反向引物：5'-TCTGTCCAGGTTCCCTCCTCAC-3'(对应于序列表SEQ ID NO：1的第613-634位)；

该引物获得的扩增片段的DNA序列长度为634bp。

(3)PCR扩增反应：

PCR反应：反应总体积为50μl，其中上述制备的绵羊DNA模板2.5μl，双蒸水35.0μl，buffer 1μl，Mg²⁺3μl，10mM正向引物和反向引物各1.5μl，dNTP 1μl，Taq酶0.5μl(10U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s，最后72℃延伸5min。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)DNA序列测定：PCR产物的序列测定由上海生工生物工程技术有限公司完成，基因片段进行正、反向两个测序反应。

(5)基因型标记鉴定：序列测定由公司完成，基因片段测正向反应。基于不同碱基所发荧光不同，如图2所示，即可获得MLH1基因部分序列。通过Chromas软件，根据所显示的碱基颜色不同判别基因型类型，即C或T。对于纯合子个体显示单峰(CC或TT)，杂合子个体显示双峰(CT)

实施例2：本发明的分子标记在绵羊羊毛伸直长度关联分析中的应用实例1

本实施例中国美利奴羊(新疆型)148只来自新疆巴音郭楞蒙古自治州种畜场，标准化养殖。羊毛纤维伸直长度的测定，将毛样按照小钢尺的方向同时摆放于黑绒板上，用镊子由毛丛根部抽出纤维，每抽出一丛羊毛纤维后，用镊子夹住纤维丛两端，直到弯曲刚好消失为止，测量长度准确到0.1cm，并记录结果(赵有璋.羊生产学[M].北京：中国农业出版社，1999)。

运用SPSS19.0软件分析，采用LSD法，对MLH1基因第3内含子区C/T多态性位点的基因型效应及其与毛伸直长度性状的进行关联分析。分析结果见表1所述。

表1绵羊MLH1基因第3内含子区A/G多态性位点基因型与中国美利奴羊毛伸直长度关联分析结果

注：^*表示P<0.05。

由表1可知：在中国美利奴羊绵羊群的148个个体中，CC基因型有9个，CT基因型有12个，TT基因型有127个。通过最小二乘均数对CC、CT和TT基因型的个体与其羊毛伸直长度进行两两相关性比较，在中国美利奴羊群体中CC、CT、TT三种基因型与伸直长度的显著性检验结果如表1。基因型CC和CT之间差异显著(P值为0.031)，CC和TT之间差异显著(P值为0.034)，CT和TT之间差异不显著。结果表明，TT基因型和TC基因型个体的羊毛伸直长度显著高于CC型个体。

实施例3：本发明的分子标记在绵羊羊毛伸直长度关联分析中的应用实例2

本实施例绵羊群来自新疆巴音郭楞蒙古自治州种畜场纯种德国美利奴羊(标准化养殖)。测定羊毛纤维伸直长度，测量长度准确到0.1cm，并记录结果(测定方法同实施例2中所述)。

运用SPSS19.0软件分析，采用LSD法，对MLH1基因第3内含子区C/T多态性位点的基因型效应及其与毛伸直长度性状的关系进行方差分析,分析结果见表2所述。

表2绵羊MLH1基因第3内含子区C/T多态性位点基因型与德国美利奴羊毛伸直长度的关联分析结果

注：^**表示P<0.01，^*表示P<0.05。

由表2可知：在德国美利奴羊绵羊群的92个个体中，CC基因型有11个，CT基因型有22个，TT基因型有59个。通过最小二乘均数对CC、CT和TT基因型的个体进行两两比较，在德国美利奴羊群体中CC、CT、TT三种基因型与伸直长度的显著性检验结果如表2。基因型CC和CT之间差异显著(P值为0.039)，CC和TT之间差异极显著(P值为0.006)，CT和TT之间差异不显著。结果表明，TT基因型和TC基因型个体的羊毛伸直长度显著高于CC型个体，TT基因型个体的羊毛伸直长度极显著长于CC基因型个体，TT基因型和TC基因型个体的羊毛伸直长度差异不显著。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。

序列表

<110> 新疆畜牧科学院生物技术研究所（新疆畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心）

<120> 一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记及其应用

<141> 2018-02-28

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1312

<212> DNA

<213> 一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记及其应用(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

attcctccct tcactgaggc acccacggtc tagagtccac atcccacgtg agagaaaagc 60

agactgggga gggaggggga ttttgtccca gacttgagcc tcagaaacgt gaaggaagga 120

atgtggtgcc tgggccccaa ggctgagaag gaattaggtg ggcagaaggg gaccggggtg 180

cacagggtgc ttctggcaga ggagaggatg aggatacagg cccaaccggg tggtgggcaa 240

gggctgcaag ataacaggtg ttgaggatct gaatgctcag cgtgctgtca gcgttctcca 300

tgctggctgc ctgacgggaa tcacctgggc cctccccgaa ccagtaaatc tgtctcgggt 360

gggtctgggc gccggtagtt tttaaaagct tggccaggca tgggcatcca taggtggggt 420

taagcaacac tgggcatgtg tgaaggccta cgctcactgc agagttcagg tcagttcgag 480

gggttttatc agcaaggtaa ggagtgtaga cttcagtgtg atgggaatgg acaggatctg 540

gtctgcattt tacggagagc tctctggctg cagcatggaa agcggatgga aacccacagc 600

gacttgggca aagtgaggag ggaacctgga cagaattcct cccttcactg aggcacccac 660

ggtctagagt ccacatccca cgtgagagaa aagcagactg gggagggagg gggattttgt 720

cccagacttg agcctcagaa acgtgaagga aggaatgtgg tgcctgggcc ccaaggctga 780

gaaggaatta ggtgggcaga aggggaccgg ggtgcacagg gtgcttctgg cagaggagag 840

gatgaggata caggcccaac cgggtggtgg gcaagggctg caagataaca ggtgttgagg 900

atctgaatgc tcagcgtgct gtcagcgttc tccatgctgg ctgcctgatg ggaatcacct 960

gggccctccc cgaaccagta aatctgtctc gggtgggtct gggcgccggt agtttttaaa 1020

agcttggcca ggcatgggca tccataggtg gggttaagca acactgggca tgtgtgaagg 1080

cctacgctca ctgcagagtt caggtcagtt cgaggggttt tatcagcaag gtaaggagtg 1140

tagacttcag tgtgatggga atggacagga tctggtctgc attttacgga gagctctctg 1200

gctgcagcat ggaaagcgga tggaaaccca cagcgacttg ggcaaagtga ggagggaacc 1260

tggacagaat tcctcccttc actgaggcac tctgtccagg ttccctcctc ac 1312

Claims

1.一种与绵羊毛伸直长度性状相关的分子标记，其特征在于，能够通过该位点基因型选择绵羊羊毛的伸直长度，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

上述序列中的W是C或T，导致MLH1基因多态性。

2.一种检测如权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于，对MLH1基因的序列进行特异性扩增从而实现对上述分子标记的鉴定，引物对核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-ATTCCTCCCTTCACTGAGGCAC-3’；

反向引物：5’-TCTGTCCAGGTTCCCTCCTCAC-3’。

3.一种根据权利要求1所述的分子标记在绵羊标记辅助选择中的应用。

4.一种根据权利要求2所述的引物对在绵羊标记辅助选择中的应用。