CN108165614A - 一种育种改进的玉米ssr标记快速银染检测方法 - Google Patents

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract

本发明公开了一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法。涉及玉米育种技术领域。包括玉米种子；玉米种子为28个不同育种单位提供。本发明通过快速银染法将固定和染色两步合二为一，染色后不经洗脱直接显影，显影较快，一般不超过2min即可获得清晰的带型，整个过程不超过10min，且染色背景随着时间的延长有一定程度的加深，长时间的显影不会影响读取的结果。

Description

一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法
技术领域
本发明属于玉米育种技术领域，特别是涉及一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法。
背景技术
分子育种，就是将基因工程应用于育种工作中，通过基因导入，从而培育出一定要求的新品种的育种方法。动物分子育种方法主要是以分子标记为基础进行标记辅助选择，然后以转基因技术为基础进行转基因育种。是按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组技术和DNA转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趋于完善，以创造出新的生物类型的技术体系，亦即基因工程。
现有的玉米玉米育种行业，随着分子育种的应用，玉米的产量呈增长趋势，现有的玉米标记过程时间长，对反应时间有限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法，快速银染法将固定和染色两步合二为一，染色后不经洗脱直接显影，显影较快，一般不超过2min即可获得清晰的带型，整个过程不超过10min，且染色背景随着时间的延长有一定程度的加深，长时间的显影不会影响读取的结果。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法，包括玉米种子：所述玉米种子为28个不同育种单位提供；
一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法，包括如下步骤：
步骤一，取所述玉米种子加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml的离心管中，-20℃冰箱保存；
步骤二，加入600ul65℃的十六烷基三甲基溴化铵混匀并置于65℃的水浴中保温30-60min；
步骤三，取出，冷却，上下摇匀，后加入600ul24：1的氯仿异戊醇；
步骤四，12000转/min离心10min，取上清液与另一个1.5ml的离心管中；
步骤五，加异丙醇，12000转/min离心10min，倒掉上清液；
步骤六，干后用100％的酒精清洗；
步骤七，PCR扩增包括如下步骤：
①取20ul反应液混匀并置于94℃的水浴中保温5min预变性，1个循环；
②依次放置于：94℃的水浴中保温变性40s、60℃的水浴中保温退火35s、72℃的水浴中保温延伸45s，共35个循环；
步骤八，扩增产物电泳分离包括如下步骤：
①准备电极液；
②将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面；
③不预电泳；
④点样，电泳220V；
步骤九，向电泳液中加入染色剂染色5min，再滴入显影液显影。
进一步地，其特征在于，步骤七中所述反应液包括10mmol/L Tris-HCl、50mmol/LKCl、2.5mmol/L MgCl2、0.25umol/L SSR引物。
进一步地，步骤九所述染色剂包括10％乙醇、0.5％乙酸和0.2％AgNO3；所述液显影包括3％NaOH、0.5％甲醛。
本发明具有以下有益效果：
本发明改进的两部快速银染法将固定和染色两步合二为一，染色后不经洗脱直接显影，显影较快，一般不超过2min即可获得清晰的带型，整个过程不超过10min，且染色背景随着时间的延长有一定程度的加深，长时间的显影不会影响读取的结果。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法，包括玉米种子：所述玉米种子为28个不同育种单位提供；SSR简单序列重复标记(Simple sequence repeat,简称SSR标记)，也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸(1－5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上；
一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法，包括如下步骤：
步骤一，取所述玉米种子加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml的离心管中，-20℃冰箱保存；
步骤二，加入600ul65℃的十六烷基三甲基溴化铵混匀并置于65℃的水浴中保温30-60min；
步骤三，取出，冷却，上下摇匀，后加入600ul24：1的氯仿异戊醇；
步骤四，12000转/min离心10min，取上清液与另一个1.5ml的离心管中；
步骤五，加异丙醇，12000转/min离心10min，倒掉上清液；
步骤六，干后用100％的酒精清洗；
步骤七，PCR扩增包括如下步骤：
①取20ul反应液混匀并置于94℃的水浴中保温5min预变性，1个循环；
②依次放置于：94℃的水浴中保温变性40s、60℃的水浴中保温退火35s、72℃的水浴中保温延伸45s，共35个循环；
步骤八，扩增产物电泳分离包括如下步骤：
①准备电极液；
②将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面；
③不预电泳；
④点样，电泳220V；
步骤九，向电泳液中加入染色剂染色5min，再滴入显影液显影，银染法将固定和染色两步合二为一，染色后不经洗脱直接显影，显影较快。
其中，其特征在于，步骤七中所述反应液包括10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、0.25umol/L SSR引物。
其中，步骤九所述染色剂包括10％乙醇、0.5％乙酸和0.2％AgNO3；所述液显影包括3％NaOH、0.5％甲醛。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (4)

1.一种育种改进的玉米SSR标记材料，其特征在于，包括玉米种子：所述玉米种子为28个不同育种单位提供。
2.如权利要求1所述的一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取所述玉米种子加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml的离心管中，-20℃冰箱保存；
步骤二，加入600ul65℃的十六烷基三甲基溴化铵混匀并置于65℃的水浴中保温30-60min；
步骤三，取出，冷却，上下摇匀，后加入600ul24：1的氯仿异戊醇；
步骤四，12000转/min离心10min，取上清液与另一个1.5ml的离心管中；
步骤五，加异丙醇，12000转/min离心10min，倒掉上清液；
步骤六，干后用100％的酒精清洗；
步骤七，PCR扩增包括如下步骤：
①取20ul反应液混匀并置于94℃的水浴中保温5min预变性，1个循环；
②依次放置于：94℃的水浴中保温变性40s、60℃的水浴中保温退火35s、72℃的水浴中保温延伸45s，共35个循环；
步骤八，扩增产物电泳分离包括如下步骤：
①准备电极液；
②将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面；
③不预电泳；
④点样，电泳220V；
步骤九，向电泳液中加入染色剂染色5min，再滴入显影液显影。
3.根据权利要求2所述的一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法，其特征在于，步骤七中所述反应液包括10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、0.25umol/L SSR引物。
4.根据权利要求2所述的一种育种改进的玉米SSR标记快速银染检测方法，其特征在于，步骤九所述染色剂包括10％乙醇、0.5％乙酸和0.2％AgNO3；所述液显影包括3％NaOH、0.5％甲醛。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1002127A1 (en) * 1997-07-02 2000-05-24 University Of Bristol Method of determining the genotype of an organism using an allele specific oligonucleotide probe which hybridises to microsatellite flanking sequences
CN101260433A (zh) * 2008-04-29 2008-09-10 上海交通大学 利用sampl技术进行不结球白菜分子标记的方法
CN102174648A (zh) * 2010-12-17 2011-09-07 北京航空航天大学 石油污染土壤生物修复过程中微生物多样性的pcr-dgge分析方法

Patent Citations (3)

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Non-Patent Citations (1)

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Title
王凤格等: "一种改进的玉米SSR标记的PAGE/快速银染检测新方法", 《农业生物技术学报》 *

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